사워도우의 제조에서 6 개 이상의 젖산균 및/또는비피더스균 종들의 혼합물

사워도우의 제조에서 6 개 이상의 젖산균 및/또는 비피더스균 종들의 혼합물{MIXTURE OF AT LEAST 6 SPECIES OF LACTIC ACID BACTERIA AND/OR BIFIDOBACTERIA IN THE MANUFACTURE OF SOURDOUGH}

본 발명은 베이커리류, 및 보다 일반적으로는 녹말 식품의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 보다 잘 소화되는 베이커리류 및 다른 식품을 제공하며, 이들은 글루텐이 없거나 또는 감소되고 현저하게 가수분해된 글루텐 함량을 가지며 소아 지방변증에 걸린 환자에게 특히 적합하다.

곡류는 매일의 식사에 중요한 성분이다. 그럼에도 불구하고 밀가루 글루텐, 및 특히 글리아딘 분획은 인간의 과민성에 기여한다. 또한 복강 스프루(CS) 또는 글루텐 민감성 장질환이라고도 칭하는 상기 소아 지방변증은 널리 퍼진 식품 과민성 중 하나로서, 유럽과 미국 인구 매 130 내지 300 명당 1 명꼴로 나타난다. 남아메리카, 북아프리카 및 아시아에서는 일반적으로 경시되고 있다(Fasano and Catassi; 2001, Gastroenterology, 120:636-651). CS의 역학적 분포는 1992년 로간에 의해 도입된 빙산 모델(Logan; 1992, Dyn. Nutr. Res. 2:14-24)에 의해 효율적으로 개념화되었는데, 여기에서 상기 질병의 유행은 상기 집단에서 질병 소인이 있는 유전자형의 빈도에 의해 영향을 받는다. 글루텐 섭취를 일평생 피하는 것은 여전히 CS 치료의 기본이다. 국제 식품 당국은 현재 글루텐 비 함유란 용어를 글루텐에 대한 제로 톨로런스(zero tolerance)로서 재정의하고 있는 반면, 국제 식품 규격위원회는 식품당 200 ppm 농도의 글루텐을 허용한다. 곡류에 대한 인간 과민성을 감소시키고자 하는 노력은 의학적, 영양학적 및 경제적으로 대단히 중요하다. 상기는 베이커리 산업이 매우 빠른 기술 공정들을 사용하고 있는 현 상황 하에서 특히 사실이며 이는 CS의 팽창하는 역학에 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 보다 잘 소화되고 허용되는 빵과 베이커리류의 필요성은 절실하다.

CS는 유전적으로 민감한 사람의 소장 점막의 자가면역 질병이다. 글루텐의 섭취 시, 상기 환자는 점진적인 흡수 융모의 상실 및 소낭의 과형성을 특징으로 하는 무제한 계속되는 점막 염증을 앓는다(Silano and De Vincenzi, 1999; Nahrung, 43:175-184). 관내 단백질 분해 소화 중에, 예를 들어 밀의 글리아딘은 T 세포 매개된 면역 반응, 및 보다 일반적으로는 CS의 초기 단계를 특성화하는 염증 상태에 기여하는 Pro- 및 Glu-풍부 올리고펩타이드 부류를 방출한다(Silano and De Vincenzi; 1999). 상기 문헌은 하기의 올리고펩타이드의 확인을 보고한다: A-글리아딘의 31-43 단편(Silano and De Vincenzi; 1999), α2-글리아딘의 62-75 단편(Auricchio, S., et al.; 1996, Scand. J. Gastroenterol., 31:247-253; Picarelli, A., et al.; 1999, Scand. J. Gastroenterol., 34:1099-1102), 에피토프 33-머(상기 α2-글리아딘의 57-89 단편에 상응한다)(Shan, L., et al.; 2002. Science, 297:2275-2279), γ-글리아딘의 134-153 단편(Aleanzi, M., et al.; 2001, Clin. Chem., 47:2023-2028) 및 α9-글리아딘의 57-68 단편(Arentz-Hansen, et al.; 2000, J. Exp. Med., 191:603-612). CS 환자에 의해 허용되지 않는 가루에는 밀, 호밀, 보리, 까뮤, 라이밀 및 스펠트밀이 포함되었다. 귀리에 대해서는 여전히 일부 논쟁의 여지가 있다.

각 전문 분야 협력의 연구 노력들이 CS 관리를 위해 여러 분야에서 수행되고 있다. 연구자들은 글루텐 비 함유 낟알의 공학(Fasano, A., et al.; 2003, Arch. Intern. Med., 163:286-292), 인간에서 CS 유전자에 대한 연구(Fasano, A., et al.; 2003), 일부 보호 물질, 예를 들어 만난 및 N-아세틸글루코스아민의 올리고머의 사용 및 경구 보충 요법으로서 플라보박테리움 메닝고셉티컴(Flavobacterium meningosepticum)으로부터의 세균성 프롤릴-엔도펩티다제의 사용(Shan, et al.; 2002)에 관심을 갖는다.

보다 최근에, 2 개의 논문은 선택된 사워도우 락토바실러스, 예를 들어 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius) 15M, 엘 브레비스(L. brevis) 14G, 엘 산프란시센시스(L. sanfranciscensis) 7A 및 엘 힐가르디(L. hilgardii) 51B에 의한 글리아딘 분획의 광범위한 가수분해(Di Cagno, et al.; 2002, Appl. Environ. Microbiol., 68:623-33), 및 장 침투성에 근거한 급성 생체 내 공격에 의해 측정 시, 특히 2 g의 글루텐을 함유한 빵에 대한 17 명의 CS 환자의 허용성을 제시하였다(Di Cagno, et al.; 2004, Appl. Environ. Microbiol., 70:1088-1096). 상기 결과는, 장려는 하지만, 적어도 증후학적 관점에서 조직병리학적 손상의 역행을 입증하지 않았다.

웨이 등(Wei, J. and Hemmings, GP; Medical Hypotheses, (2005), 64, 547-552)은 소아 지방변증과 정신분열증 간의 유전적 상관관계를 확립하였으며 글루텐 비 함유 식이요법으로 치료한 소아 지방변증 환자에서 정신분열성 증상 역행의 유리한 효과를 보고하였다(De Santis, A., et al.; J. Intern. Med. 1997;242:421-3).

베이커리류의 제조에서 몇몇 젖산균의 용도는 이미 공지되어 있다.

미국 특허 제 4,140,800 호(Kline)에는 락토바실러스 샌프란시스코를 사용하는 동결 건조된 사워도우 베이커리 스타터 조성물의 제조 방법이 개시되어 있으며, 상기의 목적은 프랑스 빵의 제조에 유용한 생성물을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 상기 가루는 글루텐 함량이 높다.

사워도우 젖산균을 사용하여, 다이 카그노 등(Di Cagno et al.)에 의해 제공된 용액은 여전히 해결되지 않은 일부 실제적인 문제점을 갖는다. 특히, (i) 선택된 균주들은 사워도우 젖산균의 상기 종 내에서 균주 수준으로 현저한 차이를 나타내는 매우 장시간이 소요되는 탐색의 결과이고; (ii) 베이커리 설비에서 동일한 결과가 명백하게 재현되지 않으며; 특히 (iii) 상기 선택된 균주는 상업적으로 입수할 수 없다.

다른 참고문헌들은 식품 제조에 있어서 젖산균 및 비피더스균의 용도를 개시한다.

EP 0 856 259는 비피더스균 중에서 선택된 2 개 이상의 세균 종 및 락토바실러스 액시도필루스, 스트렙토코커스 써모필루스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타룸 및 스트렙토코커스 파에시움 중에서 선택된 2 개 이상의 세균 종 및 하나 이상의 올리고사카라이드를 포함하는 동결건조된 생 세균의 혼합물을 함유하는 식품용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물을 액체, 크림 또는 페이스트와 같은 식료품에 첨가하며, 이때 상기 식료품은 우유, 우유 기재 또는 우유에서 유래한 제품, 또는 식물성 생성물 기재 또는 이로부터 유래한 제품이고, 상기 보충을 상기 식료품의 사용시에 수행한다. 상기 생성물은 베이커리에 사용되지 않는다.

WO 03/071883은 젖산균, 프로피오니 박테리아, 효모 및 곰팡이의 종들 중에서 선택된, 인간 및 동물에 대한 자생적 및 타생적 종들로 이루어진 미생물 배양물을 기본으로 하는, 인간 및/또는 동물용 영양학 및/또는 약학 조성물, 및 일반적인 식료품에 관한 것이다. 이들은 인간 또는 동물 숙주의 장 상재균의 평형 작용을 가질 뿐만 아니라 유기물 숙주에 대해 다양한 이익/프로바이오틱 효과를 갖는다. 사용가능한 소아 지방변증에 대한 용도는 개시되어 있지 않다.

US 2004/265291은 환자에게 유익한 세균을 제공하거나 회복시키기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 키트는 상기 환자에서 상기 세균의 성장 및 증식을 촉진하기 위한 식품 또는 영양소 또는 상기 환자에서 바람직하지 않거나 병적인 미생물의 존재를 감소시키기 위한 항균제를 임의로 포함한다.

WO 02/065842는 모든 유형의 곡물에 적합한 스타터 제제, 및 특히 소아 지방변증이 있는 사람들을 위한 글루텐 비 함유 베이커리류의 제조를 위한 효모를 기본으로 하거나 효모를 사용하는 빵 및 베이커리류의 제조를 위한 상기 제제의 용도에 관한 것이다. 젖산균 및 비피더스균의 특정 혼합물은 개시되어 있지 않다.

미국 특허 제 5,185,165 호에는 산성 농축물, 한 가지 유형 이상의 당, 효모, 한 가지 유형 이상의 밀가루, 무 지방 분유, 및 한 가지 유형 이상의 젖산 생산균을 포함하는 베이커리 도우 제품에 사용하기 위한 전구체 베이스, 및 상기 전구체 베이스의 제조 방법이 개시되어 있다. 상기 전구체 베이스는 상기 베이커리 도우 제품의 제조를 위한 우선 반죽 혼합물의 제조에 사용하기 위한 전구체 슬러리(또는 활성 발효 농축물)의 제조 방법에 유용하다. 또한, 상기 전구체 슬러리 및 우선 반죽 혼합물의 제조 방법 및 상기 우선 반죽 혼합물의 제조 장치가 개시되어 있다. 젖산균에 대한 언급은 전적으로 일반적이다.

US 2004/110270에는 락토바실러스 액시도필루스 PTA-4797, 락토바실러스 플란타룸 PTA-4799, 락토바실러스 살리바리우스 PTA-4800, 락토바실러스 파라카제이 PTA-4798, 비피도박테리움 비피듐 PTA-4801 및 비피도박테리움 락티스 PTA-4802로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 포함하는 면역조절 성질을 갖는 세균 조성물이 개시되어 있다.

EP 1 258 526에는 물과 분쇄된 밀 생성물(들)의 혼합물을 락토바실러스 및 효모를 포함하는 접종물과 부분적으로 발효시켜 밀 예비도우 및 밀 사워도우 제조용 스타터를 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 하나 이상의 효모 균주, 하나 이상의 동종발효 락토바실러스 균주 및 하나 이상의 이종발효 락토바실러스 균주를 포함하는 적합한 혼합 균총을 포함하는 접종물을 사용함을 포함한다. 사카로마이세스 스페시즈 DSM 14265, 락토바실러스 폰티스 DSM 14269, 락토바실러스 폰티스 DSM 14272, 락토바실러스 폰티스 DSM 14273, 락토바실러스 폰티스 DSM 14274, 락토바실러스 크리스파투스 DSM 14271, 락토바실러스 플란타룸 DSM 14268 및 락토바실러스 산프란시센시스 DSM 14270의 균주; 사카로마이세스 스페시즈 DSM 14265, 및 락토바실러스 폰티스 DSM 14269, 락토바실러스 폰티스 DSM 14272, 락토바실러스 폰티스 DSM 14273, 락토바실러스 폰티스 DSM 14274, 락토바실러스 크리스파투스 DSM 14271, 락토바실러스 플란타룸 DSM 14268 및 락토바실러스 산프란시센시스 DSM 14270 중 3 개 이상을 포함하는 적합한 혼합 균총을 제공한다. 상기 참고문헌은 베이커리류의 일반적인 기술 분야에 관한 것이며, 특별한 의학적 지적은 없다.

WO 99/09839는 그 자체로서, 및 다양한 식품의 충전, 코팅 또는 다른 성분으로서 사용하기에 적절하고, 상당량의 프로바이오틱을 함유하는 페이스트형 조성물에 관한 것이다. 상기 식품은 바람직하게는 베이커리류, 특히 호밀 함유 빵, 러스크, 비스킷 등이다. 상기 참고문헌은 일반적으로 공지된 프로바이오틱 용도의 태양을 다루고 있다.

용이하고, 재현 가능한 제조 공정으로, 신뢰할만하고 안전하며 상업적으로 입수할 수 있는 물질을 사용하여 수득할 수 있는, 소아 지방변증에 걸린 환자에 적합한 베이커리류는 여전히 당해 분야에서 필요한 것으로 여겨진다.

본 발명은 소아 지방변증에 걸린 환자에게 베이커리류를 제공함으로써 상기 필요성을 충족시킨다. 그러나, 상기 베이커리류는 그의 보다 높은 소화성으로 인해 인간의 음식물에 일반적으로 유용하다.

발명의 요약

본 발명에 이르러 인간 및 우유 기원의 젖산균 및 비피더스균의 몇몇 특정한 혼합물들이 소아 지방변증에 기여하는 글리아딘 및 글루테닌 분획을 가수분해시킬 수 있는 놀라운 성질들을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.

이러한 특정한 혼합물은 사워도우의 제조에 매우 유용하며 잘 한정된 세균 종들을 제공한다.

따라서, 본 발명의 목적은 사워도우의 제조를 위한 젖산균 및 비피더스균의 특정한 혼합물의 용도이다.

본 발명의 또 다른 목적은 일반적으로 보다 잘 소화될 수 있고 특히 CS 환자에 의해 허용될 수 있는 곡류 식품, 특히 베이커리류이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하고 글루텐 비 함유 제품에서 글루텐의 오염을 방지하기에 적합한 곡류 식품, 특히 베이커리류의 제조 방법이다.

본 발명의 추가의 목적은 젖산균 및 비피더스균의 특정 혼합물을 베이커리 산업에 통상적으로 사용되는 미생물 단백질분해 효소를 사용하는 특정한 조건 하에서 사용하는 경우의 글루텐 비 함유 곡류 식품, 특히 밀가루로 제조된 베이커리류이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소아 지방변증에 걸린 환자용 식품으로, 상기 식품은 본 발명에 개시된 젖산균과 비피더스균의 특정 혼합물을 함유한다.

본 발명의 더욱 또 다른 목적은 혈소판 활성화 인자(PAF) 및 다른 염증성 사이토킨의 감소에 유용한 생성물의 제조를 위한 상기 언급한 젖산균 및 비피더스균 의 혼합물의 용도이다.

본 발명에 따른 바람직한 혼합물은 하기의 것들이다:

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스트렙토코커스 써모필루스,

비피도박테리움 인판티스,

비피도박테리움 롱검,

비피도박테리움 브레베,

락토바실러스 액시도필루스,

락토바실러스 플란타룸,

락토바실러스 카제이,

락토바실러스 델브루엑키 서브스페시즈 불가리쿠스.

스트렙토코커스 써모필루스,

비피도박테리움 락티스,

비피도박테리움 브레베,

락토바실러스 액시도필루스,

락토바실러스 플란타룸,

락토바실러스 카제이,

락토바실러스 헬베티쿠스.

상기 널리 공지된 종들의 혼합물을 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 쉽게 제조할 수 있다.

편의상, 상기 혼합물을 동결건조된 형태로 상업적으로 입수할 수 있다.

상기 제형들은 사워도우의 제조에 스타터로서 사용하기에 적합하다.

본 발명에 따라 수득된 곡류 식품, 특히 베이커리류는 일반적으로 보다 소화가 잘되며, 따라서 일반적인 소비자 또는 특히 보다 잘 소화가 되는 식품을 원하거나 필요로하는 사람들에 의해 더욱 허용된다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 곡류 식품, 특히 베이커리류는 소아 지방변증에 걸린 사람들의 식사에 혼입시키기 위해 사용될 수 있는데, 그 이유는 글루텐 농도가 낮은 값으로 감소되고 상기 도우 중에 남아있던 글루텐의 양, 특히 CS에 기여하는 펩타이드 서열이 현저하게 가수분해되기 때문이다.

상기 미생물 혼합물들 중 하나를 충분한 양의 미생물 프로테아제, 예를 들어 200 ppm의 미생물 프로테아제(전형적으로는 아스퍼질러스 스페시즈로부터의)와 본 발명에서 최적화된 조건 하에서 통합시킬 때, 상기 발효된 사워도우는 단클론 항체 R5를 사용하여 측정 시, 200 ppm 미만의 글루텐 농도를 갖는다. 국제식품 규격위원회에 의해 명시된 바와 같이, 상기와 같은 유형의 생성물을 글루텐 비 함유라 정의하며 따라서 소아 지방변증에 적합하다.

미생물 프로테아제는 베이커리에 통상적으로 사용되며, 예를 들어 WO 88/03365, EP 0588426, 미국 특허 제 6,465,209 호, GB 1,196,946을 참조하시오. 상기 프로테아제는 통상적으로 시판되며(예를 들어 Enzyme Development Corporation USA를 참조하시오), 시중에서 입수할 수 있고 베이커리에 통상적으로 사용되는 임의의 생성물을 사용하여 본 발명을 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 미생물 프로테아제는 아스퍼질러스 오리자에로부터의 진균 프로테아제(500,000 HUT/g의 활성; 약 3.0의 최적 pH 및 pH 3.0 내지 6.0 범위의 활성; 약 50 ℃의 최적 온도 및 25 내지 60 ℃ 범위의 활성을 갖는다)이거나; 또는 또 다른 프로테아제는 아스퍼질러스 니거로부터의 산 안정성 프로테아제(3,000 SAPU/g의 활성; 2.0 내지 3.0의 최적 pH 및 pH 2.0 내지 6.0 범위의 활성; 50 내지 60 ℃의 최적 온도 및 30 내지 60 ℃ 범위의 활성을 갖는다)이다. 상기 효소들을 바이오 캣 인코포레이티드(Bio-Cat Inc., Troy, Virginia, USA) 및 다수의 다른 출처로부터 입수할 수 있다.

본 발명은 보다 많은 퍼센트의 밀가루를 사용하여 베이커리류를 제조할 수 있게 하며, 그 결과 보다 호감이 가는 풍미를 갖고 소아 지방변증에 걸린 사람들에게 보다 잘 허용되는 제품이 생성된다. 본 발명은 건강한 사람들을 포함하여 일반적인 소비자들에 대한, 보다 잘 소화될 수 있는 제품도 또한 수득할 수 있게 한다.

보다 넓은 태양에서, 본 발명은 또한 상기 개시된 바와 같은 효소 제제가 임의로 공급된, 젖산균의 혼합물을 포함하는 녹말 제품에 관한 것이다.

가장 광범위한 태양에서, 본 발명은 글루텐 및 글루텐 관련 물질의 소화를 개선시키기 위한 경구 투여용 제품의 제조에 유용한, 미생물 기원의 단백질 분해 효소를 임의로 첨가한, 젖산균과 비피더스균의 혼합물을 제공한다.

본 발명의 특정 혼합물을 포함하는 사워도우는 본 발명의 중요한 태양이다.

상기 사워도우는 베이커리류, 특히 빵의 제조 공정에 유용하지만, 상기를 모든 발효 및 비 발효 제품, 예를 들어 비스킷, 패스트리, 케이크, 파이, 피자, 크래커, 브레드스틱, 스낵 및 당해 분야에 공지된 모든 다른 제품들에 적용한다.

본 발명에 따른 사워도우는 또한 곡류 식품, 특히 베이커리류의 제조, 또한 홈메이드 제조를 위한 제제에 적합하다. 이 경우, 베이커리용 패키지는 특정 제품에 통상적인 성분들 이외에, 본 발명의 특정 혼합물을 포함하는 발효 제제를 포함할 것이다.

본 발명에 따른 발효 제제는 젖산균과 비피더스균의 특정 혼합물과의 조합이거나 또는 젖산균과 비피더스균 혼합물을 별도의 패키지에 제공할 수 있으며 사용 시에, 예를 들어 수중에서 혼합하여 발효 현탁액을 제조할 것이다. 젖산균의 혼합물을 단일 용기에 단독으로 또는 상기 개시한 단백질 분해 효소(프로테아제)와 혼합하여 패키징할 수 있다.

전분 제품은 일반적으로 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 또한 소비자 및 홈메이드 요리에 통상적으로 알려져 있다. 특히, 본 발명을 곡류 제품에 적용한다.

전분 제품의 예는 모든 종류의 파스타, 국수, 예를 들어 튀긴 인스턴트 국수 및 생면, 스낵 제품, 토르틸라, 옥수수 칩, 압출된 곡물 및 쇄단된 곡물이다.

파스타의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Pasta and Semolina Technology, Edited by RC Kill and K. Turnbull, Blackwell Science, 2001] 및 바릴라(Barilla) 소유의 특허를 참조하시오. 아시안 전분 제품의 제조 방법도 또한 널리 공지되어 있으며 단지 예로서 문헌[Asian Food, Science and Technology, Edited by Catharina YW Ang, KeShun Liu and Yao-Wen Huang, Technomic Publishing Company, Inc., 1999] 및 미국 특허 제 20020160093 호(Kao Corporation) 및 WO 99/65331(Societe de Produits Nestle SA)을 참조하시오.

오늘날, 대부분의 파스타는 연속적인 고성능 압출기에 의해 제조되며, 상기 압출기는 혼련과 압출을 단일 공정으로 수행하는 오거 압출 원리로 작동한다. 상기 파스타의 제조는 건조 마카로니, 국수, 및 스파게티 제조를 포함한다.

파스타 제품을 분쇄된 밀, 물, 계란(계란 국수 또는 계란 스파게티의 경우) 및 때때로 임의의 성분들을 혼합하여 제조한다. 이들 성분을 전형적으로는 연속적인 고성능 오거 압출기에 가하며, 상기 압출기에 상기 파스타의 모양을 결정하는 다양한 다이들을 장착할 수 있다. 이어서 상기 파스타를 건조시키고 판매를 위해 포장한다.

파스타 제품은 분쇄된 밀, 물, 및 때때로 계란 및/또는 임의의 성분들을 함유한다. 파스타 제조사는 전형적으로는 파스타 생산에 분쇄된 듀럼밀(세몰리나, 듀럼밀 과립, 및 듀럼밀 가루)을 사용하지만, 곡분 및 보통밀이 때때로 사용되기도 한다. 대부분의 파스타 제조사는 세몰리나를 선호하며, 상기는 균일한 크기의 미세 입자들로 이루어지고 최고 품질의 파스타 제품을 생성시킨다. 파스타 생산에 사용되는 물은 순수하고, 이취가 없으며, 마시기에 적합해야 한다. 또한, 파스타는 저온살균 온도 미만에서 생산되기 때문에, 물은 세균 함량이 낮은 것을 사용해야 한다. 계란(신선한 계란, 냉동 계란, 건조 계란, 난황, 또는 건조된 계란 고형분)을 파스타에 가하여 계란 국수 또는 계란 스파게티를 제조하고 상기 파스타의 영양 품질과 풍부성을 개선시킨다. 소량의 임의의 성분들, 예를 들어 소금, 셀러리, 마늘 및 월계수 잎을 또한 파스타에 가하여 풍미를 향상시킬 수 있다. 인산 이나트륨을 사용하여 조리 시간을 단축시킬 수 있다. 다른 성분들, 예를 들어 글루텐 검, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 난백을 또한 첨가할 수 있다. 모든 임의의 성분들을 포장지에 분명히 표시해야 한다.

듀럼밀을 롤 밀을 사용하여 세몰리나, 듀럼밀 과립, 또는 듀럼밀 가루로 분쇄한다. 세몰리나 분쇄는 그 목적이 가루를 최소로 생성시키면서 과립형 거친 가루를 제조하는 것이라는 점에서 독특하다. 밀 분쇄 후, 상기를 물, 계란, 및 임의의 다른 임의적인 성분들과 혼합한다.

혼합 공정에서, 물을 혼합 통에서 분쇄된 밀에 가하여 수분 함량이 대략 31 퍼센트인 도우를 생성시킨다. 계란 및 임의의 선택적인 성분들을 또한 첨가할 수 있다. 대부분의 현대식 파스타 프레스들은 진공 챔버를 구비하고 있어 압출 전에 상기 파스타로부터 기포를 제거한다. 압출 전에 공기가 제거되지 않으면 작은 기포들이 상기 파스타 중에 형성되어 기계적 강도를 감소시키고 완성품에 백색의 백악질 외관을 제공할 것이다.

상기 도우의 혼합 후에, 상기를 압출기로 운반한다. 상기 압출 오거는 상기 도우를 다이를 통해 강제로 밀어넣을 뿐만 아니라 상기 도우를 균질한 덩어리로 반죽하고, 생산 속도를 조절하며, 완성품의 전반적인 품질에 영향을 미친다. 압출 오거의 구조 및 치수는 장비 제작사에 의해 변화될 수 있지만, 대부분의 현대식 프레스들은 그들의 전체 길이를 통해 균일한 피치를 갖는 예리한 오거를 갖는다. 상기 오거는 홈이 있는 압출 통 내로 맞물려 들어가며, 이는 상기 도우가 전방으로 움직이는 것을 돕고 상기 오거와 상기 통 내부 사이의 마찰을 감소시킨다. 압출 통에는 수 냉각 재킷이 장착되어 있어 상기 압출 공정 중에 발생하는 열을 소산시킨다. 상기 냉각 재킷은 또한 일정한 압출 온도의 유지를 도우며, 상기 온도는 대략 51 ℃(124 ℉)이어야 한다. 상기 도우가 너무 뜨거우면(74 ℃[165 ℉]), 상기 파스타는 손상될 것이다.

상기 압출기를 통한 도우의 균일한 유량이 또한 중요하다. 상기 다이를 통한 도우 유량의 변화는 상기 파스타를 상이한 비율로 압출되게 한다. 불균일한 크기의 제품은 폐기되거나 재가공되며, 이는 상기 제품의 단위 비용을 가중시킨다. 상기 다이의 내부 표면도 또한 제품 외관에 영향을 미친다. 최근까지, 대부분의 다이는 청동으로 제조되었으며, 이는 비교적 연성이고 수리 또는 주기적인 대체를 요하였다. 최근에, 상기 다이의 압출 표면에 테플론(등록상표) 삽입물을 설치함으로써 다이를 개선시켜 상기 다이의 수명을 연장시키고 파스타의 품질을 개선시켰다.

건조는 파스타 생산 공정에서 조절하기가 가장 어렵고 중요한 단계이다. 건조의 목적은 완성품을 단단하고, 그의 모양을 유지하며, 상하지 않게 보관하기 위해서 상기 파스타의 수분 함량을 대략 31%에서 12 내지 13%로 낮추는 것이다.

대부분의 파스타 건조 공정들은 상기 파스타가 서로 들러붙는 것을 방지하기 위해서 압출 직후에 예비 건조기를 사용한다. 예비 건조는 파스타의 내부를 유연하고 가소성으로 유지시키면서 외부 표면은 단단하게 한다. 이어서 최종 건조기를 사용하여 상기 제품으로부터 수분의 대부분을 제거한다.

건조 온도 및 상대 습도 증가는 건조에 중요한 인자이다. 파스타의 외부 표면은 내부보다 더 빠르게 건조하기 때문에, 상기 표면을 가로질러 상기 파스타의 내부로 수분 구배가 발생한다. 파스타는 너무 빨리 건조되는 경우 균열되어 제품에 불량한 외관과 매우 낮은 기계적 강도를 제공한다. 균열은 건조 공정 중에 일어나거나 또는 상기 제품이 건조기를 떠난 후 수 주일 정도로 오래 발생할 수 있다. 상기 파스타를 너무 느리게 건조시키면, 상기는 건조 공정 동안 상하거나 곰팡이가 피게 되는 경향이 있다. 따라서, 상기 건조 주기를 각 제품 유형의 요건에 맞게 조정하는 것이 필수적이다. 상기 건조 주기가 성공적이었다면, 파스타는 단단하지만 절단 전에 상당한 정도로 구부릴 수 있을 만큼 충분히 가요성으로 될 것이다.

포장은 상기 제품을 오염 없이 유지시키며, 파스타를 선적 및 보관 중에 손상으로부터 보호하고, 상기 제품을 보기 좋게 드러낸다. 국수의 주요 포장 재료는 셀로판 주머니이며, 상기는 제품에 방수 보호를 제공하고 자동 포장 기계에서 용이하게 사용되지만, 식료품점 선반에 쌓기가 어렵다. 많은 제조사들은 주머니 대신에 상자를 사용하여 파스타를 포장하는데, 그 이유는 상자가 쌓아놓기 용이하고, 부서지기 쉬운 파스타 제품에 양호한 보호를 제공하며, 주머니보다 읽기다 더 용이한 광고를 인쇄할 기회를 제공하기 때문이다.

파스타의 제조 중에 다양한 원인으로부터 공기 배출이 일어날 수 있다. 미립자 물질(PM) 방출은 주로 고형분의 취급 및 혼합으로부터 발생한다. 파스타 제조의 경우, PM 방출은 밀 분쇄 공정 중에, 원료 성분들을 혼합할 때, 및 가능하게는 포장 중에 발생한다. 밀 분쇄와 관련된 방출 원인은 낟알 수용, 예비세척/취급, 세척 창고, 분쇄 및 상품 적하를 포함한다. 다른 정보를 문헌[DE Walsh and KA Gilles, "Pasta Technology", Elements Of Food Technology, NW Desrosier, Editor, AVI Publishing Company, Inc., 1977]에서 얻을 수 있다.

본 발명을 파스타의 산업적인 제조 및 가정 제조 모두에 적용할 수 있으며, 후자의 경우 계란 파스타의 제조에 유리하다.

본 발명에 따라, 도우의 제조 과정에서, 본 발명에 개시된 젖산균의 혼합물을 사용한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 전형적인 아시아의 곡류 식품을 제공한다. 바람직한 예는 한국에서 라면, 중국에서 라미엔, 및 일본에서 라멘으로서 공지된 일종의 국수이다.

본 발명의 일반적인 수행에서와 같이, 젖산균의 혼합물을 첨가하고 충분한 시간 동안 예비 발효되도록 함으로써 도우를 제조한다.

상기 미생물 프로테아제들의 혼합물이 임의로 첨가된, 본 발명에 따른 젖산균과 비피더스균의 혼합물을 또한 소아 지방변증에 걸린 환자에 의해 소비되는 식품, 특히 글루텐 비 함유 등급 식품의 제조에 사용할 수 있다. 이러한 종류의 식품의 예는 파스타, 시리얼, 타코, 토르틸라, 팝콘이다. 문헌[Practical Gastroenterology - April 2004, pages 86-104] 및 상기 중에 인용된 문헌을 참조하시오.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 사워도우 제제의 첨가를 포함하는 베이커리류의 제조 방법이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

a) 20 내지 50 중량%의 밀가루(전체 혼합물 20 내지 50%의 밀가루 및 80 내지 20%의 물, 도우 g당 본 발명의 혼합물 약 10 ⁹ 세포를 갖는 도우 수율 약 300)를 약 37 ℃에서 약 24 시간 이상, 바람직하게는 약 24 내지 약 31 시간 동안 액체 예비 발효 단계;

b) 발효 후, 상기 도우를 하나 이상의 허용되는 가루, 예를 들어 기장 가루와 혼합하여 약 150의 최종 도우 수율(고체 도우)을 얻고 약 1 중량%의 농도로 상업적인 빵 효모를 첨가하는 단계;

c) 상기 도우를 발효가 완료될 때까지 약 37 ℃에서 약 2 시간 동안 배양하는 단계;

d) 약 250 ℃에서 약 20 분 동안 굽는 단계.

본 발명의 두 번째 실시태양에서, 상기 방법을 하기와 같이 변경시킬 수 있다:

a) 밀가루 20%를, 진균 프로테아제(200 ppm)를 추가로 첨가하여 37 ℃에서 24 내지 31 시간 동안 액체 발효시키고;

b) 발효 후, 글루텐 비 함유 밀가루(<200 ppm의 글루텐)를 갖도록 건조시켜 물을 제거하고;

c) 상기 글루텐 비 함유 밀가루를 곡류 식품, 특히 베이커리류 제조의 기본 성분으로서 사용한다.

이러한 상황 하에서 "약"이란 용어는 본 발명을 통상적으로 수행하는데 포함되는 지정된 값에 가까운 값을 의미하며 측정 장치의 기계 오차 또는 상기 지정된 값에 가까운, 당해 분야의 숙련가에 의해 이루어진 편차에 따라 변할 수 있으나, 본 발명에 의해 획득된 결과에는 영향을 미치지 않는다.

상기 범위는 또한 대략 하한보다 높고 대략 상한보다 낮음을 의미한다. 따라서, 단계 a)의 액체 예비 발효는 약 24 시간 이상 약 31 시간 이하의 시간 동안 약 20 중량% 이상 약 50 중량% 이하의 양의 밀가루를 포함한다.

허용되는 가루의 예시적인 목록은 콩가루, 메밀가루, 아마, 옥수수, 콩류의 가루(갈반조/병아리콩, 렌즈콩, 완두콩), 기장, 줄 풀, 견과류 가루(아몬드, 헤이즐넛, 피칸), 퀴노아, 감자 가루, 고구마 가루, 사고, 종자류 가루(참깨), 수수, 대두, 타피오카, 테프를 포함한다. 기장이 바람직한 허용되는 가루들 중 하나이다.

본 발명의 매우 유리한 실시태양은 허용되는 가루를 함유하는 지의 여부와 관계 없이, 베이커리류에 프리바이오틱(prebiotic)을 포함하는 것이다.

프리바이오틱은 비 소화성 섬유형 물질로서, 그의 예로는 단쇄 및 장쇄 올리고사카라이드, 예를 들어 프럭토 올리고사카라이드, 소이 올리고사카라이드, 자일로 올리고사카라이드 및 아이소말토 올리고사카라이드가 있다.

본 발명의 훨씬 더 유리한 실시태양은 EP 1 010 372에 개시된 것과 같은 베이커리류에 본 발명에 개시된 베이커리류를 포함시킨 것이다. 이러한 실시태양에서, 상기 베이커리류는 동결건조된 생 젖산균을 포함하는 굽지 않은, 필수적으로 수분이 없는 지방계 조성물을 포함한다. 상기 동결건조된 생 젖산균을 포함하는 지방계 조성물을 물론 본 발명의 모든 베이커리류와 배합할 수 있다.

곡류 식품, 특히 베이커리류, 및 본 발명에 따른 곡류 식품, 특히 베이커리류의 제조를 위한 패키지가 소아 지방변증을 앓고 있는 환자에게 투여하기에 적합하다.

상기에서 말한 바와 같이, 본 발명은 또한 전분 식품, 특히 곡류 식품의 일반명으로 공지된 일반적인 식품을 포함한다.

앞서 개시한 바와 같이, 미생물 프로테아제가 임의로 첨가된, 젖산균의 혼합물을 전분 식품, 특히 곡류 식품의 제조에 사용하여 상술한 베이커리류의 실시태양과 동일한 결과 및 이점을 획득한다. 말하자면, 본 발명에 따라 수득된 식품은 소아 지방변증을 앓고 있는 환자 또는 일반적인 소비자, 또한 보다 잘 소화되는 식품을 원하는 건강이 양호한 사람에게 적합하다. 예를 들어 어린이와 노인은 보다 잘 소화되는 식품을 원할 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 소아 지방변증을 앓고 있는 환자의 식사에 상기 개시한 바와 같은 베이커리류 및/또는 전분 식품을 혼입시킴을 포함하는 상기 환자의 치료 방법이다. 상기에서, 본 발명에 따른 베이커리류 및 전분 식품은 "곡류 식품"이란 용어에 포함될 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 곡류 식품, 특히 베이커리류를 또한 글루텐 허용성을 유지하거나 글루텐 허용성을 유도하거나 또는 밀가루 알부민 및 글로불린으로 인한 알러지의 위험성을 감소시키기 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 곡류 식품, 특히 베이커리류는 글루텐의 낮은 농도(<200 ppm)로 인해 소아 지방변증 환자에 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 치료 방법을 또한 소아 지방변증의 다른 의학적 치료와 병용할 수 있다.

상기 보고한 바와 같이, 정신분열성 증상이 소아 지방변증 환자에서 주목되며 정신분열증 환자는 글루텐에 민감한 양상을 보인다. 본 발명에 따른 혼합물은 글루텐 비 함유 식이요법 상품의 제조에 유용하다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 정신분열성 증상의 치료에 유용한 글루텐 비 함유 식이요법 상품의 제조에서 상기 개시한 혼합물의 용도이다. 특히, 상기 증상은 소아 지방변증 또는 비 소아 지방변증 환자에 영향을 미친다.

당해 분야의 또 다른 문제는 장 식이요법용 제제에서 프롤린의 용도이다. 몇몇 환자에서, 프롤린은 가수분해되지 않고 장 식이요법용 용액을 제조하는 화합물은 소화흡수되지 않는다. 또한 알러지 반응들이 프롤린으로 인해 발생할 수 있다. 본 발명에 개시된 젖산균과 비피더스균의 혼합물은 프롤린 또는 프롤린 풍부 펩타이드의 가수분해에 유용하며, 따라서 상기 장 식이요법용 제제를 유효하고 비 알러지성으로 만든다.

본 발명에 개시된 젖산균과 비피더스균의 혼합물은 또한 그의 성질 덕분에 글리아딘-풍부 글루타민 용액을 저자극성으로 만드는데 유용하다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 혼합물을 위장 질병의 치료를 위한 혈소판 활성화 인자(PAF) 및 다른 염증성 사이토킨의 수준을 낮추기 위한 제품의 제조에 사용할 수 있다.

PAF는 일련의 위장병, 특히 염증성 질환에 관련된다. 허혈성 장 괴사(Hsueh W., Gonzalez-Grussi F.; Methods Achiev. Exp. Pathol.; 1988:13; 208-39), 위궤양(Esplugues JV., Whittle BJ, Methods Find.; 1989; Suppl. 1, 61-6), 출혈성 직장결장염(Chaussade S., Denizot Y, Ann. Gastroenterol. Hepatol.(Paris); 1991, May 27(3):117-21), 괴사성 소장결장염(Ewer AK., Acta Pediatr. Suppl.; 2002, 91(437): 2-5; neonatal: Caplan MS., et al., Semin. Pediatr. Surg.; 2005, Aug 14(3):154-51), 염증성 장 질병(Nassif A., et al. Dis. Colon Rectum; 1996, Feb.; 39(2):217-23), 낭염(Rothenberg DA., et al. Ann. Chir.; 1993; 47(10):1043-6)을 들 수 있다.

상기 설명에 비추어, 본 발명에 따른 생성물을 또한 일련의 염증성 질병에 걸릴 수 있는 PAF-하이드롤라제가 결핍된 환자, 특히 일본인에게 보충할 수 있다(Karasawa K.; et al.; Prog. Lipid. Res.; 2003 Mar., 42(2):93-114).

상기 생성물은 상기 개시한 바와 같이 식품, 또는 영양 보충제, 뉴트라슈티칼, 약물의 형태를 취할 수 있다.

영양 보충제 및 뉴트라슈티칼은 당해 분야에 널리 공지된 용어이며(Arvanitoyannis IS, et al.; Crit. Rev. Food Sci. Nutr.; 2005, 45(5):385-404 및 Kalra EK, AAPS PharmSci.; 2003, 5(3); E25) 추가로 정의할 필요는 없다.

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

이제 본 발명의 상기 및 다른 목적들은 상기에서, 및 또한 실시예 및 도면에 의해서 상세히 개시될 것이며, 도면에서:

도 1은 밀가루로 제조된 상이한 도우들의 글리아딘 단백질 분획들의 2DE 분석을 나타낸다. (A) 화학적으로 산성화된 도우(대조용). 프로라민 폴리펩타이드는 번호를 매긴 적색 타원으로 나타내었다. (B) 도우를 하기 실시예의 혼합물 1과 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 프로라민 폴리펩타이드는 번호를 매긴 적색 타원으로 나타내었다. 청색 번호는 폴리펩타이드를 지칭하며 80%를 초과하여 분해되었다. Mr, 분자 질량.

도 2는 혼합물 1(10 ⁹ cfu/㎖)에 의한 33-머 펩타이드의 가수분해를 나타낸다. (A) 미생물 접종물 부재 하에 37 ℃에서 24 시간 배양 후 및 (B) 37 ℃에서 혼합물 1에 의한 24 시간 가수분해 후의 UV 214 ㎚에서 200 μM 33-머의 RP-FPLC 자취.

실시예 1

사워도우 발효 및 전기영동 분석

사용된 밀가루의 특징은 하기와 같다: 수분, 12.8%; 단백질(N x 5.70), 건조물질(dm)의 10.7%; 지방, dm의 1.8%; 회, dm의 0.6%; 및 총 가용성 탄수화물, dm의 1.5%. 밀가루 80 g 및 맹물 190 ㎖(도우의 g 당 약 10 ⁹ cfu의 세포 제제 농도를 함유한다)을 사용하여 도우 270 g(도우 수율, 220)을 제조하였다. 4 개의 도우를 하기 젖산균과 비피더스균의 혼합물을 사용하여 제조하였다.

본 발명에 따른 혼합물 1:

스트렙토코커스 써모필루스,

비피도박테리움 인판티스,

비피도박테리움 롱검,

비피도박테리움 브레베,

락토바실러스 액시도필루스,

락토바실러스 플란타룸,

락토바실러스 카제이,

락토바실러스 델브루엑키 서브스페시즈 불가리쿠스.

본 발명에 따른 혼합물 2:

스트렙토코커스 써모필루스,

비피도박테리움 락티스,

비피도박테리움 브레베,

락토바실러스 액시도필루스,

락토바실러스 플란타룸,

락토바실러스 카제이,

락토바실러스 헬베티쿠스.

혼합물 3

락토바실러스 액시도필루스,

락토바실러스 브레비스,

스트렙토코커스 써모필루스,

비피도박테리움 인판티스.

혼합물 4

락토바실러스 브레비스,

락토바실러스 살리바리우스 스페시즈 살리시니우스,

락토바실러스 플란타룸.

발효를 37 ℃에서 24 시간 동안 수행하였다. 세균 접종물이 없는 도우를 젖산과 아세트산의 혼합물(몰 비 4:1)을 사용하여 pH 4.0으로 화학적으로 산성화시키고 대조용으로 사용하였다. 배양 후에, 글리아딘을 문헌[Osborne, TB; 1970, The proteins of the wheat kernel. Carnegie Institute of Washington publication 84. Judd and Detweiler, Washington, DC]에 원래 개시된 방법에 따라 도우로부터 추출하고 문헌[Weiss et al.; 1993, Electrophoresis, 14:805-816]에 의해 추가로 개질시켰다.

10 내지 20 ㎕의 분액(글리아딘 약 10 ㎍)을 샘플 완충액으로 1:1 희석하고, 100 ℃에서 5 분간 처리하고 문헌[Laemmli; 1970, Nature, 227:680-685]에 개시된 과정에 따라 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하였으며; 상기 젤은 12%의 아크릴아미드를 함유하였고 이는 B10 바이오-세이프 쿠마씨 블루(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 염색되었다. 2 차원 젤 전기영동(2DE)을 문헌[Di Cagno; et al., 2004]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 3 개의 젤을 분석하고, 화학적으로 산성화된 도우(siCAD) 및 사워도우(혼합물 1을 첨가한 것)(siSD)의 반점 농도를 문헌[Bini et al.; 1997, Electrophoresis, 18:2832-2841]에 보고된 바와 같이 표준화하였다. 개별적인 단백질에 대한 가수분해 인자를 [(siCAD - siSD)/siCAD] x 100으로 나타내었다. 모든 가수분해 인자들을 상기 3 개 젤의 반점 농도의 평균을 기준으로 계산하였으며, 표준 편차를 계산하였다. P 값이 <0.05인 통계학적 유의수준을 갖는 가수분해 인자만을 보고하였다.

합성 기질, Pro 풍부 폴리펩타이드의 가수분해 및 RP - FPLC 분석

먼저, 혼합물 1의 프롤린 특이적 펩티다제 활성을 합성 기질, 예를 들어 Pro-p-NA, Leu-p-NA, Ala-p-NA, Leu-Leu, Val-Leu, Pro-Gly, Gly-Pro-Ala, Leu-Leu-Leu, Z-Gly-Pro-p-NA 및 NCBZ-Gly-Gly-Leu-p-NA(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)를 사용하여 특성화하였다. 상기 분석 혼합물은 200 mM 포스페이트 완충액(pH 7.5) 500 ㎕, 기질 150 ㎕(0.2 내지 3 mM, 최종 농도), NaN ₃ 8 ㎕(0.05% 최종 농도) 및 혼합물 1 제제 50 ㎕(5 x 10 ⁹ cuf/㎖, 최종 농도)를 함유하였다. A-글 리아딘(Silano and De Vincenzi; 1999)의 단편 62-75(PQPQLPYPQPQSFP) 및 에피토프 33-머(LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYP-QPQLP-YP-QPQPF)(Shan et al., 2002)를 네오시스템 레보라토리(Neosystem Laboratorie)(Strasbourg, France)에 의해 화학적으로 합성하였다. 단편 62-75의 분석 혼합물은 20 mM 포스페이트 완충액(pH 7.0) 320 ㎕, 기질 150 ㎕(450 μM, 최종 농도), NaN ₃ 8 ㎕(0.05% 최종 농도) 및 혼합물 1 제제 50 ㎕(5 x 10 ⁹ cuf/㎖, 최종 농도)를 함유하였다. 상기 에피토프 33-머의 분석 혼합물은 200 mM 포스페이트 완충액(pH 7.5) 500 ㎕, 기질 150 ㎕(200 μM, 최종 농도), NaN ₃ 8 ㎕(0.05% 최종 농도) 및 혼합물 1 제제 50 ㎕(5 x 10 ⁹ cuf/㎖, 최종 농도)를 함유하였다. 상기 두 혼합물을 모두 37 ℃에서 교반 조건(150 rpm) 하에서 배양하였다. 상기 33-머의 가수분해에 대한 효소 동역학을 라인위버-버크 플롯(Lineweaver and Burk; 1934, J. American Chem. Soc., 56:658-666)을 사용하여 계산하였다.

상기 효소 반응을 0.05%(부피/부피)(최종 농도)의 트라이플루오로아세트산을 가하여 중단시켰다. 펩타이드를 리소스(Resource) II RPC 3 ㎖ 컬럼 및 214 ㎚에서 작동하는 UV 검출기가 있는 FPLC 장비(Amersham Bio-Scences, Upssala, Sweden)를 사용하여 RP-FPLC에 의해 상기 혼합물로부터 분리시켰다. 용출은 0.05% 트라이플루오로아세트산 중의 아세토나이트릴 구배(5에서 100%)를 사용하여 1 ㎖/분의 유속으로 수행하였다. 상기 CH ₃ CN의 농도를 16 내지 62 분간 5에서 46%, 및 62 내지 72 분간 46에서 100%로 선형으로 증가시켰다.

동일한 과정을 사용하여 발효된 도우의 70% 에탄올 용해성 추출물 중에 함유된 올리고펩타이드를 측정하였다.

젖산균 및 비피더스균과 병용된 진균 프로테아제의 용도

글루텐 비 함유 사워도우(<200 ppm)를 제조하기 위해서, 혼합물 1을 베이커리류에 통상적으로 사용되는 진균 프로테아제 200 ppm과 병용하였다. 발효 중에, 상기 세균 및 진균 공급원으로부터의 단백질 분해 활성의 상보적인 활성은 특히 글리아딘 및 글루테닌 분획의 현저한 감소를 제공하였다. 상기 발효된 사워도우의 에탄올 용해성 추출물은 단클론 항체 R5의 사용에 의해 측정 시 200 ppm 미만의 글루텐 농도를 나타내었다.

R5 단클론 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석 및 RAPD PCR 분석

혼합물 1(도우 g 당 약 10 ⁹ cfu)이 있는 발효된 도우(37 ℃에서 24 시간)를 비 단백질 성분들 및 허용되는 가루(예를 들어 기장)와 혼합하여 이탈리안 비스킷을 제조하고 250 ℃에서 15 분간 구웠다. 혼합물 1과의 발효 없이 제조된 이탈리안 비스킷을 대조용으로서 사용하였다. 비스킷을 웨스턴 블럿 R5 단클론 항체 및 RAPD PCR(Centro National de Biotecnologia, Gluten Unit, CNB, 28049 Madrid Spain에서)에 의해 분석하였다. R5 단클론 항체는 잠재적인 독성 소아 지방변증 펩타이드: QQPFP 및 33-머를 인식한다. RAPD PCR을 잠재적인 독성 펩타이드와 관련된 특정한 DNA 서열을 기본으로 수행하였다.

밀가루 염 용해성 단백질(알부민 및 글루불린 )의 가수분해

알부민과 글로불린을 웨이스(Weiss, 1993)의 방법에 의해 밀가루로부터 추출하였다. 상기 분석 혼합물은 50 mM 트리스-HCl(pH 7.0) 중의 알부민/글로불린(약 3 ㎎/㎖) 0.8 ㎖, 혼합물 1 5 x 10 ⁹ cfu/㎖ 및 0.05% NaN ₃ 를 함유하였다. 배양을 교반된 조건 하에서 37 ℃에서 24 시간 동안 수행하였다. 미생물 세포가 없는 대조용을 시험에 포함시켰다. 배양 후에, 상등액을 원심분리에 의해 회수하고 전기영동에 사용하였다. 물/염 용해성 분획(알부민 및 글로불린)으로부터의 단백질을 면역블럿팅(Curioni, A., et al., 1999, Clin. Exp. Allergy, 29:407-413)에 의해 분석하여, 밀 섭취와 관련된 위장 증상을 앓고 있는 것으로 앞서 특성화된 아토피 환자로부터 모은 혈청의 IgE 결합을 검출하였다. 반건조 블럿팅을 사용함으로써, SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질 밴드들을 48 mM 트리스(pH 9.2), 39 mM 글리신, 20% 메탄올 및 0.1% SDS를 함유하는 운반 완충액을 갖는 트랜스-블럿 전지(Bio-Rad Laboratories, Milan, Italy)로 50V의 전압에서 나이트로셀룰로스 시트 상으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 수 분간 판슈(Ponceau) S(3% 트라이클로로아세트산 중의 0.1%)에 침지시켜 블럿팅 밴드들을 가시화하고 물로 탈색시키기 전에 연필로 표시하였다. 멤브레인을 0.05% 트윈 20(TBS-T)을 함유하는 TBS 및 5% 탈지유 분말(M-TBS-T)을 함유하는 TBS로 2 시간 동안 차단하고 TBS-T로 1:20 희석한, 환자로부터 모은 혈청과 밤새 배양하였다. M-TBS-T로 5 회 세척 후에, 블럿들을 M-TBS-T(Curioni, et al.; 1999)로 1:5000 희석한, 단클론 항인간 IgE 퍼옥시다제-접합 항체(Sigma Chemical Co)와 1 시간 동안 배양하였다. M-TBS-T로 4 회 및 TBS로 1 회 세척 후에, 결합된 IgE를 제조사에 의해 제공된 설명서에 따라 수퍼시그날 검출(Supersignal Dectection) 키트(Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL)를 사용하여 화학발광에 의해 가시화하였다. 상기 과정을 실온에서 수행하였다.

대조용에 비해, 상기 4 개의 세포 제제와 발효시킨 도우로부터 추출한 글리아딘 분획의 SDS-PAGE 프로파일은 상기 세포 제제가 모두 글리아딘을 분해하는 동일한 능력을 가진 것은 아님을 보였다. 가수분해는 본 발명의 혼합물 1에 대해 매우 높았으며, 혼합물 2의 경우 단지 약간인 반면, 다른 세포 제제들(혼합물 3 및 4)은 감지할만한 분해를 유발시키지 않았다.

상기 4 개 세포 제제 간의 차이를, 전기영동에 의해 검출할 수 있는 것보다 더 낮은 겉보기 분자 질량을 갖는 올리고펩타이드를 전체적으로 볼 수 있게 한 70% 에탄올 용해성 단백질 분획의 RP-FPLC 분석에 의해 확인하였다.

상기 결과는 글리아딘을 보다 구체적으로 다루어, 단백질 분해 활성을 갖는 것으로 보이는 혼합물 1의 최고 수행성능에 대한 큰 증거를 제공하였다.

혼합물 1을 구성하는 세균 종들을 도우의 g 당 약 10 ⁹ 세포의 동일한 농도로 개별적으로 사용한 경우, 상기 8 개의 종들 중 어느 것도 상기 혼합물에 의해 나타난 바와 같은 현저한 가수분해를 제공하지 않았다. 이는 잘 한정된 비율로 혼합물 1에 사용된 6 개 이상의 균주 종들 간의 상보적인 단백질 분해 활성에 대한 첫 번째 증거였다.

글리아딘 및 관련된 올리고펩타이드는 그들의 서열 내의 프롤린 잔기의 큰 비율을 특징으로 한다(Wieser, 1996, Acta Pediatr. Suppl. 412:3-9). 프롤린은 그의 환상 구조로 인해 20 개 아미노산 중에서 독특하다. 이러한 특정한 형태는 펩타이드와 단백질의 구조적 태양에 많은 제한을 부과하여, 이들을 극단적으로 가수분해 내성으로 만든다. 상기와 같은 펩타이드를 적합하게 다루기 위해서, 프롤린 잔기가 상이한 위치에 잠재적인 기질로서 존재하는 모든 펩타이드 결합을 가수분해하기 위해 일단의 특정한 펩티다제가 필요하다(Cunningham and Connor; 1997, Biochim. Biophys. Acta, 1343:160-186). 먼저, 혼합물 1의 프롤린 특이적 펩티아제 활성을 합성 기질, 예를 들어 Pro-p-NA, Leu-p-NA, Ala-p-NA, Leu-Leu, Val-Leu, Pro-Gly, Gly-Pro-Ala, Leu-Leu-Leu, Z-Gly-Pro-p-NA 및 NCBZ-Gly-Gly-Leu-p-NA를 사용하여 특성화하였으며, 이들은 각각 프롤린 이미노펩티다제, 아미노펩티다제, 다이펩티다제, 프롤리나제, 프롤리다제, 다이펩티딜 펩티다제, 트라이펩티다제, 프롤릴 엔도펩티다제 및 엔도펩티다제 효소에 대해 비교적 특이적이다(표 1).

상기 효소 활성은 모두 혼합물 1 제제 중에 널리 분포되었다. 하나의 미생물 균주가 모든 선행 효소 활성들을 갖는다는 것은 매우 드물기 때문에(Cunningham and O'Connor; 1997; Kunjii, et al.; 1996, Antoine Van Leeuwenhoek 70:187-221; Di Cagno et al.; 2004), 오직 선택된 세균 풀, 예를 들어 혼합물 1에 함유된 것만이 Pro 풍부 올리고펩타이드의 가수분해에 필요한 완벽한 패턴의 펩티다제를 가질 수 있다.

도우 발효 중 혼합물 1 제제에 의한 글리아딘 올리고펩타이드의 가수분해를 2DE 분석에 의해 추가로 특성화하였다. 84 개의 단백질 반점들이 대조용으로서 사용된 화학적으로 산성화된 도우에서 확인되었다(도 1A). 상기 84 개 글리아딘 올리고펩타이드 반점 중 79 개는 대조용에 비해 혼합물 1을 사용한 도우 발효 후 현저하게 분해되었다(도 1B). 표 2는 2DE에 의해 확인된 반점의 가수분해 인자들을 언급한다. 분해된 올리고펩타이드의 대부분(상기 79 개 중 65 개)은 80% 초과의 가수분해 인자를 가지며 단지 8 개만이 40% 미만의 가수분해 인자를 나타내었다.

^a 분석을 이미지 마스터 소프트웨어(Pharmacia)를 사용하여 수행하였다. 독립적인 복제물 중 4 개의 젤을 분석하였다. 반점 정량분석 및 가수분해 인자 계산을 위해서, 물질 및 방법을 참조하시오. 상기 가수분해 인자들을 모두 4 개의 젤 각각의 반점 농도의 평균을 기준으로 계산하였다. ^b 반점 번호는 도 1A 및 1B의 젤의 경우에 상응한다.

상기 결과는 혼합물 1이 글리아딘 올리고펩타이드를 거의 완전히 가수분해시키는 능력을 가짐을 나타내었다.

혼합물 1의 활성을 CS에 크게 기여하는 것으로서 문헌에 보고된 올리고펩타이드들 중 일부에 대해 생체 외에서 추가로 특성화하였다: A-글리아딘의 단편 62-75(Silano and DeVincenzi; 1999) 및 에피토프 33-머(Shan, et al.; 2002). 상기 RP-FPLC 분석에 의해 입증된 바와 같이, A-글리아딘의 단편 62-75는 450 μM의 농도에서 5 x 10 ⁹ cfu/㎖ 세포의 혼합물 1과 6 시간 배양 후 완전히 가수분해되었다. 상기 에피토프 33-머는 200 μM의 농도에서 동일한 세포 농도의 혼합물 1과 24 시간 배양 후 완전히 가수분해되었다(도 2). 상기 33-머의 가수분해 동력학을 0.26 μ몰/밀리리터/분의 V _max 및 216 μM의 K _m 을 나타내는 라인위버 버크 플롯에 의해 측정하였다. 문헌에서 앞서 보고한 바와 같이, 상기 에피토프 33-머는 하기의 성질들을 가짐에 주목해야 한다: (i) 상기는 위 및 췌장 프로테아제에 연장된 노출에도 불구하고 완전하게 유지되고; (ii) 작은 브러시 보더 막 효소와 20 시간 배양하는 동안 20% 미만의 가수분해를 보이고; (iii) 소장에서 장시간(약 24 시간) 동안 완전하게 유지되며 심지어 저 농도에서 T 세포 증식에 대한 잠재적인 항원으로서 작용한다(Shan, et al. 2002). 상기 결과는 혼합물 1이 상기 33 머를 완전히 가수분해시키는데 필요한 효소 활성의 복합 풀을 함유하고 이러한 활성이 위장 수준에 위치한 경우보다 현저하게 더 높음을 입증하였다.

유럽의 글리아딘 기준에 비해, 이탈리안 비스킷의 R5 단클론 항체에 의한 웨스턴 블럿은 완전한 글리아딘의 전형적인 프로파일을 가졌다. 상기 R5 단클론 항체의 주요 이점은 다수의 면역반응성 에피토프 반복부(α-, β-, γ- 및 ω-글리아딘뿐만 아니라 상이한 밀 변종 중에 존재한다)에 상응하는 일치하는 아미노산 서열 QXPW/FP(Osman, et al.; 2001, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 13:1189-1193)를 인식하는 그의 능력이다(Shewry, et al.; 1992, Cereal's proteins and celiac disease. In: Celiac disease, Marsh M.[ed], Oxford, Blackwell Scientific Publications pp. 305-348). 가장 큰 반응성은 QQPFP 아미노산 서열과 관련 있지만, 동종 반복부, 예를 들어 LQPFP, QLPYP, QLPTF, QQSFP, QQTFP, PQPPP, QQPYP 및 PQPFP가 또한 R5 항체에 대한 보다 약한 반응성으로 인식된다(Osman, et al.; 2001). 상기 에피토프들 중 3 개(LQPFP, QLPYP 및 PQPFP)가 상기 A-글리아딘 33-머 펩타이드의, 소아 지방변증 환자의 장 유래된 인간 T 세포 주의 효능 있는 유도인자의 서열 중에 놓인 것은 흥미롭다(Shan, et al.; 2002). 상기 혼합물 1과 함께 발효된 이탈리안 비스킷의 웨스턴 블럿은 R5 단클론 항체에 의해 인식된 α-, β- 및 γ-글리아딘이 거의 분해되었음을 입증하였다.

동일한 결과가 RAPD PCR 분석에 의해 입증되었다.

밀 알부민과 글로불린의 알레르겐 분획의 동정을 위한 예비 실험은 시험된 혈청의 100%가 알부민 및 글로불린 분획에 대해 양성임을 나타내었다. 반응들은 15 내지 70 kDa 범위의 겉보기 분자 질량을 갖는 단백질 성분들에 대한 것으로 밝혀졌으며, 이때 대략 15 내지 45 KDa의 일부 혈청이 강하게 염색되었다. 1 차원 SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이, 혼합물 1 제제에 의해 가수분해된 처리되지 않은 알부민과 글로불린의 비교는 몇몇 잠재적인 알레르겐 폴리펩타이드의 가수분해를 강조하였다.

실시예 2

실시예 1에 따라 제조된 사워도우를 베이커리류의 제조에 사용하였다.

미국 특허 제 6,884,443 호의 실시예에 개시된 바와 같은 베이커리류를 상기 특허의 조성물 대신에 본 발명에 따른 도우 조성물을 사용하여 제조하였다. 발효를 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 37 ℃에서 24 시간 동안 수행하였으며 혼합물 1을 사용하였다.

상기 생성물은 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 3

실시예 1에 따라 혼합물 2를 사용하여 제조한 사워도우를 파스타의 제조에 사용하였다.

상기 파스타는 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 4

실시예 1에 따른 혼합물 1을 US 2002/0160093의 교시에 따라 국수의 제조에 사용하였다.

US 2002/0160093의 실시예 1 내지 4를 반복하였으나, 단 본 발명에 따른 혼합물 1을 함유하는 패킷을 감수 및 가루 혼합물에 가하였다. 혼련 후, 상기 혼합물을 37 ℃에서 24 시간 동안 정치시켰다. 이어서 국수를 상기 참고문헌에 개시한 바와 같이 제조하였다.

상기 생성물은 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 5

실시예 1에 따른 혼합물 2를 WO 99/65331의 교시에 따라 국수의 제조에 사용하였다.

WO 99/65331의 실시예 1 및 2를 반복하였으나, 단 본 발명에 따른 혼합물 2를 함유하는 패킷을 상기 도우용 성분에 가하였다. 혼합 후, 상기 도우를 37 ℃에서 24 시간 동안 정치시켰다. 이어서 국수를 상기 참고문헌에 개시한 바와 같이 제조하였다.

상기 생성물은 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 6

실시예 1에 따른 혼합물 1을 EP 0 614 609의 교시에 따라 빵 유도체의 제조에 사용하였다.

EP 0 614 609의 실시예 1 내지 5를 반복하였으나, 단 본 발명에 따른 혼합물 1을 함유하는 패킷을 도우 제제에 가하였다. 혼련 후, 상기 도우를 37 ℃에서 24 시간 동안 정치시켰다. 이어서 생성물을 상기 참고문헌에 개시한 바와 같이 제조하였다.

상기 생성물은 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 7

실시예 1에 따른 혼합물 2를 EP 1 338 209의 교시에 따라 스파게티의 제조에 사용하였다.

EP 1 338 209의 실시예를 반복하였으나, 단 본 발명에 따른 혼합물 2를 함유하는 패킷을 상기 도우용 성분에 가하였다. 혼합 후, 상기 도우를 37 ℃에서 24 시간 동안 정치시켰다. 이어서 국수를 상기 참고문헌에 개시한 바와 같이 제조하였다.

상기 생성물은 보다 소화가 잘 되고 소아 지방변증에 걸린 환자에게 적합하였다.

실시예 8

라면

조성:

1. 국수

가루: 83-85%

정제유: 15-18%

염: 1%

기타: 0.6-1%

2. 건조 스프 베이스

건조된 쇠고기 플레이크, 간장, 일 나트륨 글루타메이트, 이나트륨 글루타메이트, 풍미 첨가제, 글루코스, 마늘, 양파, 골파, 고춧가루, 기타 풍미 성분

라면의 제조 방법

가루(때때로 전분, 쌀가루, 보리가루를 상이한 비율로 사용할 수 있다)와 물을 제조사의 권장에 따라 혼합한다. 혼합물 1을 도우에 가하고 37 ℃에서 24 시간 동안 정치시켰다.

상기 혼합된 도우를 압착 롤러로 압연하고 이어서 상기 도우를 상기 기계에 통과시켜 개별적인 국수 가닥을 제조하였다. 상기 국수의 모양과 두께는 분쇄기의 슬롯 크기 및 상기 국수를 운반하는 운반 벨트의 속도를 조절함으로써 원하는 두께 및 모양으로 변경시킬 수 있다.

국수를 예비 젤라틴화된 전분(-전분)을 보다 쉽게 소화되도록 유도하기 위해서 100 ℃ 초과의 온도를 갖는 스팀 상자에 통과시킨다.

상기 증기 공정 후에, 국수는 성형 틀에 의해 특정한 모양으로 성형된다.

딥 프라잉(deep frying) 공정: 라면의 유형에 따라, 딥 프라잉 공정을 통해 탈수가 일어난다. 국수를 150 ℃에서 딥 프라잉 공정을 진행시킨다. 일부 라면은 상기 딥 프라잉 공정을 진행시키지 않는다.

상기 딥 프라잉 공정 후에, 상기 라면은 냉각 공정이 진행된다.

본 발명에 따르면, 젖산균과 비피더스균의 특정 혼합물이 곡류 제품, 특히 베이커리류의 제조에 적합하며, 상기 제품들은 CS 환자에게 보다 잘 허용될 수 있다. 특히 하기의 이점들이 제공된다:

(i) 도우 발효 중 글리아딘 올리고펩타이드를 분해시키는 현저한 능력;

(ii) 2DE 분석에 의해 확인된 84 개 글리아딘 올리고펩타이드 중 79 개의 가수분해;

(iii) 상이한 위치에서 프롤린을 포함하는 합성 펩타이드에 대한 상보적이고 큰 효소 활성;

(iv) CS에 기여하는 올리고펩타이드(A-글리아딘 및 에피토프 33-머의 단편 62-75)를 완전하게 가수분해시키는 능력;

(v) R5 단클론 항체와 반응한 α-, β- 및 γ-글리아딘을 현저하게 감소시키는 능력;

(vi) 몇몇 알레르겐 폴리펩타이드를 가수분해시키는 능력;

(vii) 상기 세균의 활성이 진균 프로테아제에 의해 보충되고 액체 발효 하에서 20% 밀가루에 대해 사용될 때, 상기는 글루텐 비 함유 밀가루의 생산을 확실히 증가시킨다.