新規ビフィドバクテリウム属細菌の作出方法

本発明は、新規ビフィドバクテリウム属細菌の作出方法、本作出方法により得られた新規なビフィドバクテリウム属細菌、及びこの細菌の検出方法に関する。

ビフィドバクテリウム属細菌は、ヒトの腸内菌叢における主要細菌であり、便秘や下痢の改善等の整腸作用、血清コレステロール上昇抑制作用、免疫賦活作用等、ヒトの健康に対して有益な作用を有することが知られている。 このため、各種発酵飲食品や生菌製剤等の形態で多数の市販品が販売されており、特に発酵乳飲食品は、優れた嗜好性を有していることから、ビフィドバクテリウム属細菌の継続的な摂取に適している。

ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性菌であり、酸素や低ｐＨ、高酸度に弱く、発酵飲食品においては製造時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困難な点が多い。 ビフィドバクテリウム属細菌の生理効果を得るには、できるだけ多くの菌が生きたまま腸に到達する必要があると考えられており、特に飲食品中での菌の生残性、すなわち飲食後の腸への到達率を高めることが重要なファクターとされている。

かかる問題を解決するため、製造方法の改良や各種生残性改善剤、例えばＮ−アセチルグルコサミン、パントテン酸、ペプチド類、ラクチュロース等の添加により、発酵飲食品レベルでの生残性改善が行われている。 しかしながら、このようなビフィドバクテリウム属細菌の生残性改善剤の添加は、製造コストの上昇を招くうえ、嗜好性の低下等の問題を引き起こすため容易には使用できない。 また、製造直後のビフィドバクテリウム属細菌含有発酵物を酸素不透過性の包剤で構成された容器に充填し、酸素との接触を完全に断つ方法も検討されている。 しかし、酸素不透過性容器に未だ完全なものはなく、成型の自由度が乏しく、さらに複合素材を用いているので廃棄物処理が複雑であり、容器自体も高価である等、その利用に当たっては多くの制約がある。

従って、発酵飲食品等でのビフィドバクテリウム属細菌の生残性を改善する根本的な解決法は、好気的条件や低ｐＨ、高酸度の条件下でも高い生残性を有するビフィドバクテリウム属細菌を作出することにあり、このような菌株の例として、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２０５）（特許文献１）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＳＢＲ ３２１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９１５）（特許文献２）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ ４００２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３８）（特許文献３）等が挙げられる。

しかしながら、これらの生残性改善株は、その作出方法で用いられた環境下でしか生残性の改善効果が期待できないという問題があった。 すなわち、ビフィドバクテリウム属細菌変異株の作出においては、ビフィドバクテリウム属細菌の生育が困難な環境下で継代培養保存を行って生残株を取得する方法が一般的であり、これら菌株の作出段階で用いられた環境下では一定の生残性改善効果が期待できるものの、それ以外の環境下では生残性改善効果が期待できない。 従って、従来の方法で得られたビフィドバクテリウム属細菌は、変異株作出条件とは異なる条件で流通する飲食品には適用することができず、極めて汎用性が低いものであった。

また、原因は不明であるものの、環境要因を悪化させた条件（例えば酸性領域ｐＨ）で継代培養保存を行って得た生残性改善菌株であっても、該菌株をより条件が穏やかな中性領域ｐＨで適用しても生残性改善効果が発揮されないことが分かっており、このことも様々な飲食品に適用可能な汎用性が高い菌株が得られていなかった一因であった。

従って本発明は、環境要因が異なる種々の条件でも生残性に優れるビフィドバクテリウム属細菌の作出方法、本作出方法により得られる新規なビフィドバクテリウム属細菌、及びこの細菌の検出方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、環境要因を異なる条件とした少なくとも２種の系で交互に継代培養保存を２回以上行うことで、交互継代培養保存に用いた全ての条件下での生残性に優れたビフィドバクテリウム属細菌が取得できることを見出した。
そしてさらに、得られた新規ビフィドバクテリウム属細菌の特異的検出法について検討した結果、この細菌のＤＮＡ断片を特異的に増幅できるプライマーを見出し、これを用いればこの細菌が特異的に検出、定量できることを見出した。 さらに、これらのプライマーと膜透過性色素とを組み合わせれば、この細菌の生菌数が定量できることも見出した。

すなわち、本発明は、環境要因を異なる条件とした少なくとも２種の系で交互に継代培養保存を２回以上行うことを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌の作出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記作出方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌を提供するものである。
また、本発明は、前記ビフィドバクテリウム属細菌を含有することを特徴とする飲食品、特に発酵乳飲食品を提供するものである。

また、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片を提供するものである。
また、本発明は、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列を有するビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）用プライマーを提供するものである。
また本発明は、上記のプライマーを使用することを特徴とするビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２の検出方法を提供するものである。
また本発明は、上記のプライマーを使用することを特徴とするビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２の菌数の定量法を提供するものである。
さらに本発明は、膜透過性色素で処理した被検体に対し、上記のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことを特徴とするビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）の生菌数定量法を提供するものである。

本発明のビフィドバクテリウム属細菌の作出方法により、製品や流通条件等の環境要因が異なる条件でも生残性に優れるビフィドバクテリウム属細菌を得ることができる。 該菌株は様々な飲食品に適用でき、かつ、飲食品中での菌の生残性が高いため、ビフィドバクテリウム属細菌が有する生理効果を効果的に発揮させることができる。 また、抗ヘリコバクター・ピロリ作用等の特異的な生理効果を有するビフィドバクテリウム属細菌を、本発明の作出方法によって改良することで、様々な飲食品に利用可能な菌株を作出することができるため、本発明の産業上の利用性は極めて高い。

本発明のＤＮＡ断片を用いれば、飲食品中、糞便中や腸内における前記生残性に優れたビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２を特異的に検出、定量することができる。

ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２に特異的なＲＡＰＤバンドの塩基配列を示す。 ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーの配列を四角で囲んだ。

膜透過性色素処理による定量的ＰＣＲによるＹＩＴ １２２７２の定量値の変化を示す。

ＰＭＡ処理の最適条件を示す。

ＰＭＡ処理による糞便中の加熱処理したＹＩＴ １２２７２の定量値の変化を示す。

糞便に添加した生きたＹＩＴ １２２７２の菌数と定量的ＰＣＲ（ＰＭＡ処理あり）で得られたＹＩＴ １２２７２の定量値の関係を示す。

本発明において、環境要因とは、ビフィドバクテリウム属細菌の増殖や生残性に影響を及ぼすあらゆる要因を指し、培養液や飲食品におけるｐＨ、浸透圧、酸度、培養・保存温度、培養・保存時間、溶存酸素量、光、圧力、水分活性、共存微生物、栄養因子（糖類、蛋白質、ペプチド、乳脂肪分等の脂肪類、ビタミン類、ミネラル類、無脂乳固形分、酵母エキス等のビフィドバクテリウム属細菌の増殖因子等）、抗生物質、培養方法（静置培養、攪拌培養、振とう培養、通気培養等）、殺菌方法、調合方法、充填方法、保存容器の材質等が挙げられ、特にビフィドバクテリウム属細菌の増殖や生残性に影響を及ぼす重要な環境要因であるｐＨ、浸透圧、酸度、培養温度、栄養因子等を用いることが好ましい。 ここで、光とは可視光、非可視光のいずれも含み、酸度とは９ｇの試料を中和するのに必要な１／１０規定水酸化ナトリウム水溶液の量（ｍＬ）を指す。

また、「環境要因を異なる条件とした少なくとも２種の系」とは、ある特定の環境要因の質及び／又は量を変化させた少なくとも２種の系を指し、例えば、培養液や飲食品のｐＨ、浸透圧、酸度、培養温度、栄養因子等を変化させた少なくとも２種以上の系であり、より具体的には、培養液や飲食品のｐＨを、例えば５から３に変化させる、浸透圧を例えば６００ｍＯｓｍ（ミリオズモ）から９５０ｍＯｓｍに変化させる、酸度を例えば６から２０に変化させる、培養液の培養温度を例えば３７℃から３０℃に変化させる、培養液や飲食品中の糖類を例えば消化性糖質から難消化性糖質に変化させる、撹拌により溶存酸素濃度を例えば高める等の手段により変化させた系が挙げられる。

ターゲットとする環境要因やその質及び／又は量の変化に特に制限はないが、本発明の方法で作出するビフィドバクテリウム属細菌を適用したい１以上の培養液や飲食品の環境要因とその条件を考慮し、ビフィドバクテリウム属細菌の増殖や生残性に影響を及ぼす環境要因とその条件を選択して、該環境要因と条件を用いて交互継代培養保存することが好ましい。 ビフィドバクテリウム属細菌の培養条件は菌種によって異なるが、一般的には、無脂乳固形分５〜３０％、乳脂肪分０〜１０％、浸透圧１５０〜１０００ｍＯｓｍ、ｐＨ４．０〜７．０、溶存酸素濃度０〜２ｐｐｍ、培養温度３０〜３９℃程度であり、これらの範囲内での条件変化としてもよく、あるいはこの範囲を超えた条件を設定してもよい。 また、保存条件は培養液や飲食品の種類や形態によって、例えば飲食品の保存温度であれば常温、冷蔵、冷凍といったように異なるため、適用したい培養液や飲食品の環境要因と条件を適宜選択して用いればよい。
また、培養液にシロップ（甘味料）を添加して飲食品とする場合、各種糖を用いることとなるが、この時用いる糖の種類によって浸透圧が上昇する場合、逆に低下する場合があるので、これを変化させる条件としてもよい。
また、飲食品を調合タンクから容器に充填する前に、調合タンク内で飲食品を一定期間保存する場合、充填する前に撹拌して均一化する必要があり、この際に調合タンクのヘッドスペースの酸素を巻き込み溶存酸素濃度が飽和濃度まで上昇する場合があるので、これを変化させる条件としてもよい。

本発明の作出方法に用いることができるビフィドバクテリウム属細菌の種類は特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（ Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（ Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（ Ｂ． ｓｕｉｓ ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（ Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（ Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（ Ｂ． ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（ Ｂ． ｐｓｅ� �ｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（ Ｂ． ｌａｃｔｉｓ ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（ Ｂ． ｇｌｏｂｏｓｕｍ ）等が挙げられる。 中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダムは以前から乳製品に数多く使用され安全性等のデータが積み重ねられており、また、生残性の改善効果も高いため好ましく、特にビフィドバクテリウム・ブレーベが好ましい。

上記のビフィドバクテリウム属細菌を親株とし、環境要因を異なる条件とした少なくとも２種の系で交互に継代培養保存を２回以上行うことにより、交互継代培養保存に用いた全ての条件下での生残性に優れたビフィドバクテリウム属細菌を取得することができる。 具体的には、（１）親株となるビフィドバクテリウム属細菌を環境要因Ａで培養して培養液や飲食品を得、得られた培養液や飲食品を保存して環境要因Ａの条件で生残性が改善した株を濃縮あるいは選抜する。 （２）次に該生残性改善株を環境要因Ｂで培養して培養液や飲食品を得、得られた培養液や飲食品を保存して環境要因Ｂの条件で生残性が改善した株を濃縮あるいは選抜する。 （３）かかる工程を２回以上繰り返し行うことで、環境要因Ａ及びＢでの生残性に優れたビフィドバクテリウム属細菌を取得することができる。

交互に継代培養保存する方法としては、環境要因Ａ及び環境要因Ｂで条件変化させたとき、Ａ→Ｂ→Ａ→Ｂ→Ａ、Ａ→Ａ→Ｂ→Ｂ→Ａ→Ａ→Ｂ→Ｂ→Ａ→Ａ→Ｂ→Ｂといったように任意の組合せ、順序で行うことができるが、交互継代培養保存は２回以上行うことが好ましい。 好ましくは、２〜１００回、より好ましくは４〜１００回、特に好ましくは、４〜５０回である。

設定する環境要因の条件変化は２種以上であればよく、例えば３つの条件変化Ａ、Ｂ、Ｃを設定する場合の交互継代培養保存方法としては、Ａ→Ｂ→Ｃ→Ａ→Ｂ→Ｃ→Ａ→Ｂ→Ｃ、Ａ→Ａ→Ａ→Ｂ→Ｂ→Ｃ→Ａ→Ｂ→Ｂ→Ｂ→Ｃ→Ｃ→Ａ等と任意に行うことができる。

当該環境要因として、ｐＨ、浸透圧、酸度、培養温度、栄養因子から選ばれる１種以上、さらに２種以上、特に３種以上をＡとＢとで変化させるのが好ましい。 ここでこれらの条件の変化の範囲は、ｐＨは、４．０〜７．０の間で０．１〜３の変化、浸透圧は１５０〜１０００ｍＯｓｍの間で１０〜７００ｍＯｓｍの変化、酸度は５〜３０の間で１〜２０の変化、培養温度は３０〜３９℃の間で１〜６℃の変化とするのが好ましい。 栄養因子としては、糖の種類をパラチノースから還元麦芽糖水あめに変化させるのが好ましい。 また、乳脂肪分を０〜１０％の間で０．１〜６％変化させるのが好ましい。 また、無脂乳固形分を５〜３０％の間で０．１〜２０％変化させるのが好ましい。

また、紫外線やニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等突然変異誘導剤等による処理を親株となるビフィドバクテリウム属細菌に施した後、上記の交互継代培養保存を行って、所望の性質を有する菌株を選択することもできる。

ここで、生残性とは、培養液や飲食品の保存後にどの程度生菌が存在しているかを示すものであり、生菌数は常法に従い求めることができる。 例えば、保存に用いた培養液や飲食品を適宜希釈し、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地に塗沫して、３７℃で７２時間嫌気的に培養した後の培地上のコロニーを測定することによって求めることができる。 保存に用いた培養液や飲食品の保存前の生菌数に対する保存後の生菌数の割合によって、生残率を示すことができる。

本発明の作出方法に用いる培養液は、ＧＡＭ培地、ＭＩＬＳ培地（Ｉｗａｔａ ＆ Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｌｅｔｔｅｒ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ９，１６５−１６８，１９８９）、ＴＯＳプロピオン酸培地、豆乳、野菜汁、果汁、麦汁等のビフィドバクテリウム属細菌が生育可能な培地であればいずれの培地も用いることができるが、乳を主成分とする培地が好ましく、乳としては牛乳（全脂乳）及びその加工品である脱脂乳、乳由来ペプチド等が挙げられる。 使用する乳原料とその配合量により、無脂乳固形分や脂肪分を任意に設定することができ、酵母エキス等のビフィドバクテリウム属細菌の増殖因子を加えてもよい。 これら無脂乳固形分、脂肪分、ビフィドバクテリウム属細菌増殖因子等はいずれも環境要因となり得る。

また、乳培地からなる培養液にシロップ等の任意成分を添加した発酵乳飲食品は、その環境要因が最終形態の製品に近く、最終形態の製品で高い生残性を示す菌をより効率的に濃縮することができることから、かかる育種改良には発酵乳飲食品を用いることが好ましい。 かかる発酵乳飲食品には糖類等のシロップ（甘味料）、乳化剤、増粘（安定）剤、ビタミン類、ミネラル類等の任意成分を配合することができ、これらはいずれも環境要因となり得る。 シロップとしては、グルコース、ショ糖、フルクトース、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料が挙げられる。 また、発酵乳飲食品には、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコール等の増粘（安定）剤を配合してもよい。 この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ類等のビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル類、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバー類、ハーブエキス、黒糖エキス等を配合することも可能である。

培養液や発酵飲食品には、ビフィドバクテリウム属細菌以外の微生物を併用することも可能である。 このような微生物としては例えば、ラクトバチルス・カゼイ（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（ Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ）、ラクトバチルス・プランタラム（ Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（ Ｌ． ｂｕｃｈｎｅｒｉ ）、ラクトバチルス・ガリナラム（ Ｌ． ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ）、ラクトバチルス・アミロボラス（ Ｌ． ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ）、ラクトバチルス・ブレビス（ Ｌ． ｂｒｅｖｉｓ ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（ Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ）、ラクトバチルス・ケフィア（ Ｌ． ｋｅｆｉｒｉ ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（ Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ）、ラクトバチルス・クルバタス（ Ｌ． ｃｕｒｖａｔｕｓ ）、ラクトバチル� ��・ゼアエ（ Ｌ． ｚｅａｅ ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（ Ｌ． ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ）、ラクトバチルス・サリバリウス（ Ｌ． ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ）、ラクトバチルス・ガセリ（ Ｌ． ｇａｓｓｅｒｉ ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（ Ｌ． ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ）、ラクトバチルス・ロイテリ（ Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ ）、ラクトバチルス・クリスパータス（ Ｌ． ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ． ブルガリカス（ Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ． デルブルッキィ（ Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（ Ｌ． ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ． ラクチス（ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ． クレモリス（ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ）、エンテロコッカス・フェシウム（ Ｅ． ｆａｅｃｉｕｍ ）等のエンテロコッカス属細菌、バチルス・ズブチリス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、トルラスポラ・デルブルッキィ（ Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ）、キャンジダ・ケフィア（ Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ）等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母が挙げられる。

発酵飲食品の製造は常法に従えばよく、例えば発酵乳飲食品を製造する場合には、殺菌した乳培地に親株となるビフィドバクテリウム属細菌を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳を得る。 次に別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、さらにフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。

上記の方法により、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ ４１２５（ＦＥＲＭ ＢＰ―７８１３）を親株とし、環境要因が異なる条件での生残性が特に優れたビフィドバクテリウム属細菌１菌株を作出し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２０）として、平成２２年２月１６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託した。 ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２は、その親株であるビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ ４１２５と比較して、以下のような菌学的性質を有する。

寒天添加ＭＩＬＳ培地（Ｉｗａｔａ ＆ Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｌｅｔｔｅｒ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ９，１６５−１６８，１９８９）に各菌株を接種し、３７℃、嫌気培養（アネロパック（三菱ガス化学））で単一コロニーの分離を繰り返すことにより、純化された菌株の菌形態（ＭＩＬＳ培地で一夜培養後、グラム染色）及びコロニー性状を観察した。

ＡＰＩ ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｊａｐａｎ製）を用いてマニュアルの方法に従い、１晩培養後の菌液を各基質に接種した。 これを３７℃で７日間嫌気培養後、各基質の発酵性状を判定した。

本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌の利用形態は特に制限されず、凍結乾燥したものであってもよく、あるいはこれら細菌を含む培養物として利用することもできるが、いずれの形態であっても、細菌が生菌の状態であることが好ましい。

本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌は、固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で利用することもできる。 このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散在、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。 これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。 上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。 また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌は、上記のような製剤とするだけでなく、飲食品に配合して使用することもできる。 飲食品に配合する場合は、そのまま、又は種々の栄養成分と共に含有せしめればよい。 具体的に本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、すなわち、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。 なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。

本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌は、環境が異なる様々な種類の飲食品に適用することが可能であり、飲食品中での菌の生残性が高いため、ビフィドバクテリウム属細菌が有する整腸作用等の一般的な生理効果を効果的に発揮させることができる。 また、ヘリコバクター・ピロリの除菌作用等の特異的な生理効果を元来有するビフィドバクテリウム属細菌を本発明の作出方法によって改良することで、該菌株を様々な飲食品に利用することが可能となり、該菌株を含有する飲食品の嗜好性が向上すると共に、消費者の選択肢の幅が広がることとなる。 さらに、該菌株の生残性が改善することで該菌株が有する生理効果を増強させることが可能となる。

さらに飲食品としては、本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌を生菌の状態で含有する発酵乳飲食品、発酵豆乳、発酵果汁、発酵野菜汁等の発酵飲食品が好適に用いられ、特に発酵乳飲食品の利用が好ましい。 これら発酵乳飲食品の製造は常法に従えばよく、前述の方法により製造することができる。 このようにして得られる発酵乳飲食品は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。

また、本発明は、本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌を含有する飲食品、特に甘味料を含有する発酵乳飲食品に関する。 発酵乳飲食品の種類、製造法、形態としては、前記と同様のものが挙げられる。 本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌と共にラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス属細菌から選ばれる１種以上を併用して発酵乳飲食品を製造すると高い嗜好性が得られ、継続的な飲用が可能となるため好ましい。

また、ビフィドバクテリウム属細菌を利用した飲食品において、保存時の生残性を高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された容器が主に用いられてきたが、本発明の方法により得られたビフィドバクテリウム属細菌は、高い生残性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、酸素透過性の高い樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等）も容器素材として使用できる。 これらの樹脂を用いた容器は、酸素不透過性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低く、成型の自由度が高いというメリットを有する。

本発明のＤＮＡ断片及びプライマーは、配列番号１若しくは配列番号２で表される塩基配列、又は該配列に相補的な塩基配列を有する。 本発明のＤＮＡ断片プライマーは、数多くのビフィドバクテリウム属細菌及びその類縁菌由来のＤＮＡに対してＰＣＲを行い、ＲＡＰＤ法により検索することにより得られる。 すなわち、ビフィドバクテリウム属細菌由来のＤＮＡに対して、多くのランダムプライマーを用いてＰＣＲを行い、ランダムプライマー間に挟まれたＤＮＡ断片を増幅する。 得られたＲＡＰＤバンドパターンを元にクローニングし、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２に特異的なＰＣＲ増幅産物の塩基配列を決定する（配列番号３）。 当該塩基配列から、本発明のＤＮＡ断片プライマーを設計する（配列番号１及び２）。 本発明のＤＮＡ断片プライマーには、配列番号１又は２で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するものが含まれる。

本発明のプライマーは、配列番号１と配列番号２で表される２つの塩基配列の組み合わせ；又は該配列に相補的な２つの塩基配列の組み合わせを用いるのがより好ましい。 さらには、配列番号１又はこれに相補的な配列を有するプライマーをフォワードプライマーとし、配列番号２又はこれに相補的な配列を有するプライマーをリバースプライマーとして用いるのが好ましい。

本発明のプライマーは、前記ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２に特異的であり、当該ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２の検出、細菌数の定量及び生菌の定量に有用である。 本発明の検出、定量法の検体としては、前記ＹＩＴ １２２７２を含有する飲食品、医薬品、糞便等が挙げられる。

ＹＩＴ １２２７２の検出、定量法としては、例えば（１）検体中のＤＮＡを抽出する工程、（２）本発明プライマーを用いたＰＣＲ反応を行う工程、及び（３）工程（２）により増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程が挙げられる。

より詳細には、まず、糞便、飲食品等からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのサンプルとする。 糞便等の希釈液からＤＮＡを抽出する方法としては、定法であるＭａｒｍｕｒ法、その変法である酵素法、及びベンジルクロライド法が好ましい。 また、菌体の一部をバッファー又は滅菌水に懸濁し、９５℃、１５分程度加熱したものを、テンプレートとして、ＰＣＲに供することも可能である。

抽出されたＤＮＡに本発明のプライマーを組み合わせ、増幅反応を行うことにより、目的とするＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）を得ることができる。 通常、ＰＣＲ法等にプライマーを使用する際には、２種類のプライマーを１組として用いることが好ましい。 例えば、配列番号１及び２に係るプライマーセットを用いれば、多種類存在する細菌群のうち、前記のビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２のＤＮＡにおいてのみ、両者のプライマー間で増幅反応が起こり、これを同定することができる。 また、ＰＣＲを行う際に、予め鋳型のＤＮＡ量を段階希釈し、検出限界を求め同様の解析を行えば、目的とする菌の定量化も可能である。

このようにして得られたＤＮＡを電気泳動すれば、バンドの有無から前記のビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２を同定することができる。

また、検体を膜透過性色素で処理した後、これにＰＣＲ反応を行えば、前記ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２の生菌のみを検出、定量することができる。 用いられる膜透過性色素としては、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）等が挙げられるが、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）が特に好ましい。 検体の膜透過性色素処理は、例えば最終濃度で５〜２５０μＭの膜透過性色素溶液を添加し、その後光照射する。 かかる処理後の検体については、前記と同様にしてＰＣＲを行えばよい。

以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。

（実施例１）交互継代培養法によるビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１、ＹＩＴ ４１２５の育種改良 ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１株（ＦＥＲＭ ＢＰ―８２０５）及びビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ ４１２５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８１３）を親株として交互継代濃縮を行った。

（１）２０．７％全粉乳培地を１３５℃、３．５秒殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１株又はＹＩＴ ４１２５株のシードスターター１を０．５％、ビフィドバクテリウム・ビフィダムのシードスターターを１％接種し、３３℃でｐＨ５．３まで混合培養して菌液Ａ１（４００ｍＬ）を調製した。
（２）菌液Ａ１に、パラチノースの終濃度が１０％となるようにシロップ液Ａを調合して乳製品Ａ１（６３０ｍＬ）を調製した。 乳製品Ａ１（２００ｍＬ）を３００ｍＬ容コルベンに分注し、綿栓をした好気的条件下、５℃、１週間撹拌（９０ｒｐｍ）保存（以後、好気撹拌保存と略す）した後、試験管に満杯充填してブチル栓をした嫌気条件下、１０℃、１週間静置保存（以後、嫌気静置保存と略す）した。
（３）本条件で保存した乳製品Ａ１（１ｍＬ）をセファロシン添加ミルク培地（１２％脱脂粉乳、０．１％酵母エキス、０．０３％Ｌ−システイン塩酸塩、０．２％沈降性炭酸カルシウム、セファロシン５μｇ／ｍＬ、以後、セファロシン添加ミルク培地と略す）１０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター２とした。 マザースターター２（０．０３ｍＬ）をミルク培地（１２％脱脂粉乳、０．１％酵母エキス、０．０３％Ｌ−システイン塩酸塩、０．２％沈降性炭酸カルシウム、以後、ミルク培地と略す）３０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター２を調製した。 シードスターター２を用いて上記と同様の操作を繰り返した。 すなわち、シードスターター２で調製した乳製品Ａ２を好気撹拌保存後、嫌気静置保存し、ビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター３、さらにシードスターター３を調製した。
（４）次に、２３．５％脱脂粉乳培地を１２０℃、３．５秒殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター３を２％、ラクトコッカス・ラクチスのシードスターターを０．０１％接種し、３７℃でｐＨ４．４まで混合培養して菌液Ｂ１（１００ｍＬ）を調製した。
（５）また、１２０℃、３．５秒殺菌した１９．７％脱脂粉乳培地に乳ペプチドを０．０８％添加した後、ストレプトコッカス・サーモフィラスのシードスターターを０．５％接種し、３７℃でｐＨ４．３まで培養して菌液Ｃ１（７００ｍＬ）を調製した。 菌液Ｂ１に菌液Ｃ１を加え（混合比１：２）、さらに、還元麦芽糖水あめの終濃度が５％となるようにシロップ液Ｂを調合して乳製品Ｂ１（８７０ｍＬ）を調製した。
（６）乳製品Ａ１と同様に、好気撹拌保存後、嫌気静置保存した乳製品Ｂ１（１ｍＬ）をセファロシン添加ミルク培地１０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター４とした。 マザースターター４（０．０３ｍＬ）をミルク培地３０ｍＬに接種し、３７℃、２４時間嫌気培養してビフィドバクテリウム・ブレーベのシードスターター４を調製した。 シードスターター４を用いて上記と同様の操作を繰り返した。 すなわち、シードスターター４で調製した乳製品Ｂ２を好気撹拌保存後、嫌気静置保存し、ビフィドバクテリウム・ブレーベのマザースターター５、さらにシードスターター５を調製した。

このように、乳製品Ａの調製、好気撹拌保存、及び嫌気静置保存を２回繰り返した後、生残したビフィドバクテリウム・ブレーベを用いて、乳製品Ｂの調製、好気撹拌保存、及び嫌気静置保存を２回繰り返し、ビフィドバクテリウム・ブレーベの濃縮操作を行った。 本一連の工程を１サイクルとし、合計４サイクル繰り返した。 最終的に１０℃、２週間嫌気静置保存した乳製品Ａ８及び乳製品Ｂ８から、各々１ｍＬをセファロシン５μｇ／ｍＬを添加したＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業）に塗沫し、３７℃でアネロパック（三菱ガス化学）で嫌気培養して単一コロニーを分離した。 本単一コロニー分離を繰り返すことにより純化し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１株及びＹＩＴ ４１２５株由来の単一コロニーを乳製品Ａ８から計２１株、乳製品Ｂ８から計２１株、合計４２株を分離した。

（実施例２）生残性確認試験 親株と分離株を用いて、実施例１の方法で乳製品Ａ、Ｂを各々調製し、好気条件下、５℃、１週間撹拌保存後、嫌気条件下、１０℃、２週間静置保存した。 乳製品Ａ、Ｂ両方で生残性が良好であったビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株（ＹＩＴ ４１２５株由来、乳製品Ａ８より分離）を選抜した。
ＹＩＴ １２２７２株、対照菌（ＹＩＴ １０００１株、ＹＩＴ ４１２５株）の乳製品Ａ、Ｂでの生残性の結果を表３に示す。 ＹＩＴ １２２７２株は、乳製品Ａ、Ｂ何れにおいても、好気条件下、５℃、１週間撹拌保存後、嫌気条件下、１０℃、２週間静置保存しても３×１０ ^７ ＣＦＵ／ｍＬ以上の生菌が生残した。 一方、対照菌で作製した乳製品Ａ、Ｂのどちらか一方では３×１０ ^７ ＣＦＵ／ｍＬ以上の生菌が生残したが、両方の製品で良好な生残性を示さなかった。
また、乳製品Ａ、Ｂの物性を表４に示す。 菌液ＡにシロップＡを調合して乳製品Ａを調製したところ、乳製品ＡのｐＨ、酸度は各々５．６、３．４であり、浸透圧は菌液Ａでは５５０ｍＯｓｍであったが、乳製品Ａでは９５０ｍＯｓｍに増加した。 一方、菌液Ｂに菌液ＣとシロップＢを調合して乳製品Ｂを調製したところ、乳製品ＢのｐＨ、酸度は各々４．４、７．５であり、浸透圧は菌液Ｂでは９００ｍＯｓｍであったが、乳製品Ｂでは６００ｍＯｓｍに減少した。

以上より、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株は、培養温度、ｐＨ、酸度、シロップ調合による浸透圧変化、無脂乳固形分、乳脂肪分の異なる乳製品Ａ、Ｂの両方で、対照菌と比べて生残性が強化されていることが明らかになった。

（実施例３）人工胃液耐性確認試験 ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株及び対照菌（ＹＩＴ １０００１株、ＹＩＴ ４１２５株）を、各々ミルク培地で３７℃、一晩嫌気培養した。 本菌液０．５ｍＬを３７℃、３０分間温めた人工胃液１０ｍＬに加え、速やかに混合後、３７℃で保温した。 保温（人工胃液処理）０分後、１２０分後に１ｍＬを分取し、適宜希釈後、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業、３７℃、嫌気培養）で生菌数を測定した。
なお、人工胃液の調製は以下のとおり行った。 すなわち、最終濃度がプロテオースペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．）：５ｇ／Ｌ、胃ムチン（和光純薬）：１．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム：３ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム：１ｇ／Ｌとなるようにイオン交換水に溶解し、３．６規定の塩酸でｐＨ２．８に調整後、本溶液を１１５℃、１５分間オートクレーブ滅菌して４℃で保存した。 次にペプシン（和光純薬）を４００ｍｇ／Ｌとなるようにイオン交換水に溶解後、メンブランフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、アドバンテック、０．４５μｍ）でろ過滅菌してペプシン溶液とした。 ｐＨを２．８に再度調整した上記溶液１８０ｍＬに対し、ペプシン溶液２０ｍＬを使用直前に加えて人工胃液とした。
人工胃液処理０分後、１２０分後の生菌数を表５に示す。 ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株は、１２０分間人工胃液処理しても生菌数はほとんど変化しなかったが、対照菌（ＹＩＴ １０００１株、ＹＩＴ ４１２５株）は、本処理により生菌数が低下した。 ＹＩＴ １２２７２株は、対照菌と比べて人工胃液耐性も強化されたことが明らかになった。

（実施例４）人工胃液・人工胆汁腸液連続処理耐性確認試験 ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株及び対照菌（ＹＩＴ １０００１株、ＹＩＴ ４１２５株）を用い、実施例１と同様に乳製品Ｂを調製した。 各菌株で調製した乳製品Ｂ（２００ｍＬ）を各々３００ｍＬ容コルベンに分注し、綿栓をした好気条件下で５℃、１週間撹拌（９０ｒｐｍ）保存した後、試験管に満杯充填してブチル栓をした嫌気条件下で１０℃、静置保存した。 なお、ＹＩＴ ４１２５株で調製した乳製品Ｂのみ、３００ｍＬ容コルベンの気相を窒素ガスで置換した後、ブチル栓をした嫌気条件下で５℃、１週間撹拌（９０ｒｐｍ）保存し、さらに、嫌気条件下で１０℃、静置保存した。
実施例３と同様の方法で、１０℃、４日間静置保存した乳製品Ｂの０．５ｍＬをｐＨ３．３に調整した人工胃液１０ｍＬに加え、３７℃、６０分間、人工胃液処理した。 本試験溶液２ｍＬに予め３７℃で保温した人工胆汁１ｍＬを加え、すばやく撹拌した。 続いて、本混合物に、３７℃、３０分間保温した人工腸液４ｍＬと人工膵液１ｍＬの混合物５ｍＬを加え、撹拌後、３７℃で保温した。 人工胃液処理０、６０分後、人工胆汁腸液処理６０分後に各々１ｍＬ分取し、適宜希釈後、セファロシン５μｇ／ｍＬを添加したＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業、３７℃、嫌気培養）で生菌数を測定した。

なお、人工胆汁は、胆汁粉末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ）を４０ｇ／Ｌとなるようにイオン交換水に溶解し、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨを８．０に調整した後、胆汁粉末の濃度が１％（Ｗ／Ｖ）となるようにイオン交換水で希釈して１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌して用いた。 また、人工腸液は、最終濃度が塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、塩化カリウム：１ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム：３ｇ／Ｌとなるようにイオン交換水に溶解し、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨを８．０に調整した後、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌して調製した。 人工膵液は、試験直前に膵臓リパーゼ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を２０ｇ／Ｌとなるように人工腸液に溶解し、メンブランフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、アドバンテック、０．４５μｍ）でろ過滅菌した後、氷中保存して用いた。

人工胃液処理０分後、６０分後、人工胆汁腸液処理６０分後の生菌数を表６に示す。 保存後の乳製品Ｂ中のビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株は、対照菌（ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １０００１株、ＹＩＴ ４１２５株）と比較して、人工胃液処理後だけでなく人工胃液・人工胆汁腸液連続処理後においても生菌数が高かった。 ＹＩＴ １２２７２株は、対照菌よりも人工胃液耐性、人工胆汁・腸液耐性ともに強化されたことが明らかになった。

（実施例５）発酵乳飲食品の製造 全粉乳１２４ｇを水５０６ｇに溶解し、１３５℃で３秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株を０．５％、ビフィドバクテリウム・ビフィダムを１％、ラクトバチルス・アシドフィルスを０．００１％接種し、３３℃でｐＨ５．３まで培養し、１５ＭＰａで均質化して、菌液６３０ｇを得た。 一方、パラチノース９８ｇ、ニンジンジュース８ｇ、ＤＨＡ含有油２．５ｇ、乳化カルシルム７ｇ、ラクトフェリン０．１ｇ、ビタミンＤ０．０２ｇ、香料１ｇを水に溶解し、水を加えて全量を３７０ｇとした後、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を得た。 菌液、シロップ液を混合し、テトラブリック容器に充填して、ｐＨ；５．６、酸度；３．４、無脂乳固形分；８．７％、乳脂肪分；３．２％の発酵乳を得た（ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の初発菌数は９．５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ）。
この発酵乳を１０℃で１４日間保存したところ、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生残率は３０％であり、風味も良好であった。

（実施例６）発酵乳飲食品の製造 脱脂粉乳２５ｇを水９０ｇに溶解し、１２０℃で３．５秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株を２％、ラクトコッカス・ラクチスを０．０１％接種し、３７℃でｐＨ４．４まで培養し、１５ＭＰａで均質化して、菌液Ａ １１５ｇを得た。 また、脱脂粉乳６０ｇ、乳ぺプチド０．２５ｇを水に溶解して、水を加えて全量を３３０ｇとし、１２０℃で３．５秒間殺菌した後、ストレプトコッカス・サーモフィルスを０．５％接種し、３７℃でｐＨ４．３になるまで培養し、１５ＭＰａで均質化して菌液Ｂ ３３０ｇを得た。 一方、マルチトール４７ｇ、ポリデキストロース２９ｇ、ガラクトオリゴ糖液糖１４ｇ、乳化鉄３．５ｇ、ペクチン３ｇ、コラーゲンペプチド１ｇ、ビタミンＢミックス０．３ｇ、アスパルテーム０．１ｇを水に溶解し、香料１ｇ、ビタミンＥ油１ｇを加え、さらに水を加えて全量を５５５ｇとした後、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を得た。 菌液Ａ、菌液Ｂ、シロップ液を混合しテトラブリック容器に充填して、ｐＨ；４．４、酸度；７．５、無脂乳固形分；８．１％、乳脂肪分；０．１％の発酵乳を得た（ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の初発菌数は８．８×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ）。
この発酵乳を１０℃で１６日間保存した結果、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生残率は３４％であり、風味も良好であった。

（実施例７）発酵乳飲食品の製造 脱脂粉乳５８ｇを水１９８ｇに溶解し、１２０℃で３．５秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株を１％、ラクトコッカス・ラクチスを０．２％、ストレプトコッカス・サーモフィルスを０．０１％接種し、３７℃でｐＨ４．５まで培養し、１５ＭＰａで均質化して、菌液２５６ｇを得た。 一方、ガラクトオリゴ糖液糖２５ｇ、ラクチトール１６ｇ、パラチノース１６ｇ、ペクチン３ｇ、スクラロース０．０５ｇを水に溶解し、香料１ｇを加え、さらに水を加えて全量を７４４ｇとした後、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を得た。 菌液、シロップ液を混合し、テトラブリック容器に充填してｐＨ；４．４、酸度；５．３、無脂乳固形分；５．５％、乳脂肪分；０．１％の乳酸菌飲料を得た（ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の初発菌数は１．３×１０ ^９ ＣＦＵ／ｍＬ）。
この乳酸菌飲料を１０℃で２３日間保存した結果、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生残率は４１％であり、風味も良好であった。

（実施例８）発酵乳飲食品の製造全粉乳５８ｇと脱脂粉乳４２ｇ、乳ペプチド０．０２ｇを水４８７ｇに溶解し、１３５℃で３秒間殺菌した後、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株とラクトバチルス・アシドフィルスのスターターをそれぞれ０．５％と１．０％接種し、３３℃でｐＨ５．３まで培養し、１５ＭＰａで均質化して、菌液５８７ｇを得た。
一方、パラチノース９８ｇ、ニンジンジュース８ｇ、香料１ｇを水に溶解し、水を加えて全量を４１３ｇとした後、１２０℃で３秒間殺菌してシロップ液を得た。
菌液、シロップ液を混合し、テトラブリック容器に充填して、ｐＨ；５．６、酸度；２．９、無脂乳固形分；８．１％、乳脂肪分；１．４％の発酵乳を得た（ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の初発菌数は９．５×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ）。
この発酵乳を１０℃で１４日間保存したところ、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生残率は３０％であり、風味も良好であった。

（実施例９）錠剤の製造 下記の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
（処方） （ｍｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物^１） ２０
微結晶セルロース １００
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム ０．５
メチルセルロース １２
１）ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生菌体を凍結乾燥して製造した。

（実施例１０）清涼飲料の製造 下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。 得られた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。 得られた清涼飲料は外観・風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
（処方） （ｇ）
本発明の細菌菌体の乾燥物^１） ５
香料 ０．８
水 １００
還元澱粉糖化物 ２４
果糖 １８
１）ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２株の生菌体を凍結乾燥して製造した。

（実施例１１）Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法を用いた菌株特異的プライマーの作製 ビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌６２菌株を用い、以下の手順に従い、菌体からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行うことでＲＡＰＤ法を行い、ＹＩＴ １２２７２に特異的な配列を検索した。
（１）菌体からのＤＮＡの抽出 ＧＡＭ培地（日水製薬）に１％グルコースを添加した液体培地を用いて、３７℃で２４時間嫌気培養したビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌６２菌株（ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＹＩＴ ４０１４ ^Ｔ ，ＹＩＴ ４０１５，ＹＩＴ ４０２３，ＹＩＴ ４０２４，ＹＩＴ ４０４３，ＹＩＴ ４０４９，ＹＩＴ ４０６３，ＹＩＴ ４０６４，ＹＩＴ １２２７２、他５３株）を用いた。 ０．５ｍＬの菌液を遠心して、上清を取り除いたのちＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ９．０）を０．２５ｍＬ、１０％ＳＤＳを０．０５ｍＬ、ＴＥ飽和フェノールを０．５ｍＬ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を０．７ｇ加え、激しく振とうし、菌体を破砕した。 ３Ｍ 酢酸ナトリウムを０．１５ｍＬ加えた後に遠心し、上清を別のチューブに移した。 イソプロパノール沈殿、７０％エタノールでの洗浄を行い、風乾して最後に０．１ｍＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。

（２）ＲＡＰＤ法 ２７種類のランダムプライマー（表７）を用いて行った。 総量を２０μＬとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ _２ 、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、１．５μＭ ランダムプライマー、１．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）により、９４℃１２０秒、（９４℃２０秒、３６℃３０秒、７２℃９０秒）を６サイクル、（９４℃２０秒、３６℃３０秒、７２℃９０秒）を３０サイクル、７２℃１８０秒のＰＣＲ反応を行った。 増幅産物は１．５％アガロースゲルを用いて５０Ｖで電気泳動を行い、エチジウムブロミド染色後、ＵＶを照射下で確認した。

（３）クローニング ビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌６２株のＲＡＰＤバンドパターンを比較してＹＩＴ １２２７２に特異的であったＰＣＲ増幅産物をＴＡクローニングキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて付属のマニュアル通りにクローニングを行った。 すなわちｐＣＲ２．１ベクターにＰＣＲ増幅産物を挿入後、大腸菌に導入して形質転換させた。 その後、Ｘ−ｇａｌ含む５０μｇ／ｍＬのアンピシリン添加ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地に形質転換した大腸菌を塗抹して培養後、形成した白色コロニーをＬＢ液体培地で増菌後、ＤＮＡを抽出してクローンＤＮＡを得た。 定法にしたがい、ダイターミナーター法を用いてクローニングしたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を決定した（図１）。

（４）菌株特異的プライマーの作製と特異性の確認 クローニングにより得られたＹＩＴ １２２７２特異的なＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列の中から、ＹＩＴ １２２７２に最も特異的で、ＰＣＲの反応性が高い配列を選択して、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを作製した。 その配列を表８に示した。 このＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを用いてビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌６２菌株とヒト腸管からよく分離される１２属７８種８２菌株（表９）、あわせて１４４菌株から抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行い、特異性を確認した。 ＰＣＲは、総量を２０μＬとし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ _２ 、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、０．３μＭ プライマー、０．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含む反応液で、９４℃１２０秒、（９４℃２０秒、６０℃１０秒、７２℃２０秒）を３２サイクル、７２℃１８０秒のＰＣＲ反応を行った。 増幅産物は１．５％アガロースゲルを用いて１００Ｖで電気泳動を行い、エチジウムブロミド染色後、ＵＶを照射下で確認した。 その結果、作製したＹＩＴ １２２７２特異的プライマーがビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２に特異的であることが確認された。

（実施例１２）生きているＹＩＴ １２２７２のＰＣＲ法による検出（１）膜透過性色素の最適化 膜透過性色素であるエチジウムモノアジド（ＥＭＡ）とプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）をビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２に対して使用した。 ＧＡＭ＋１％グルコース添加液体培地を用いて、２４時間３７℃嫌気条件下で培養したＹＩＴ １２２７２をそのまま（生菌）もしくは８０℃１０分間加熱して得られた死菌体、１０日間３７℃で培養し続けて得られた死菌体に対して、最終濃度として２４０μＭ ＥＭＡ又は５０μＭ ＰＭＡとなるように色素をそれぞれ添加して、５分間室温で保温した後、２つの５００Ｗのハロゲンランプを用いてランプの下２０ｃｍの距離で２分間光を照射した。 その後、それらの菌体からＤＮＡを抽出してＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲを用いてＹＩＴ １２２７２の定量を行った（定量的ＰＣＲの方法は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００８）Ｖｏｌ．１２６，ｐ２１０−２１５ に記載した方法を用いた）。 その結果、ＥＭＡ及びＰＭＡともに死菌体のＰＣＲ増幅を抑制したが、ＥＭＡでは生菌からのＰＣＲ増幅も抑制した。 ＰＭＡはＹＩＴ １２２７２の生菌のＰＣＲ増幅を抑制することなく、死菌のＰＣＲ増幅を抑制したことから生きたＹＩＴ １２２７２の定量的ＰＣＲを用いた検出定量にはＰＭＡが適していることが分かった（図２）。

ＰＭＡ処理の最適化を図るため、ＰＭＡの濃度（５μＭ，５０μＭ，１５０μＭ）及び光照射時間（１，２，５分間）を変化させ、ＹＩＴ １２２７２の生菌及び加熱死菌体を処理し、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲを行った。 その結果、光照射時間はＰＭＡ処理に影響を与えず、低濃度（５μＭ）及び高濃度（１５０μＭ）のＰＭＡ処理は、５０μＭのＰＭＡ処理に比べて、加熱死菌体からのＰＣＲ増幅の抑制効果が弱いことが分かった（図３）。 したがって、ＹＩＴ １２２７２に対するＰＭＡ処理は、５０μＭ ＰＭＡ、２分間光照射が適していることが分かった。

（２）糞便中の生きているＹＩＴ １２２７２の検出・定量 ＹＩＴ １２２７２が存在しないことを選択培地及びＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲで確かめた糞便に、ＹＩＴ １２２７２の加熱死菌体を添加してＰＭＡ処理（５０μＭ ＰＭＡ、２分間光照射）を行った。 その結果、糞便中のＹＩＴ １２２７２の加熱死菌体からのＰＣＲ増幅は抑制され、ＹＩＴ １２２７２の死菌の定量値は約２０，０００分の１に減少することが分かった（図４）。 一方、２４時間培養後の生きたＹＩＴ １２２７２を糞便に添加してＰＭＡ処理を行い、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲを用いてＹＩＴ １２２７２を定量したところ、ＰＭＡ処理がＹＩＴ １２２７２のＰＣＲ増幅を阻害することなく、ＹＩＴ １２２７２が糞便１ｇあたり１０ ^５以上存在した場合、正確に定量可能であることが示された（図５）。 ここで、以下の式３により、ＹＩＴ １２２７２の生菌数を算出することが可能である。

（記号）
ＰＭＡ非処理時のＹＩＴ １２２７２のＰＣＲ定量値：Ｘ ｃｅｌｌｓ／ｇ
ＰＭＡ処理時のＹＩＴ １２２７２のＰＣＲ定量値：Ｙ ｃｅｌｌｓ／ｇ
サンプル中のＹＩＴ １２２７２の生菌数：Ｌ ｃｅｌｌｓ／ｇ
サンプル中のＹＩＴ １２２７２の死菌数：Ｄ ｃｅｌｌｓ／ｇ

糞便からのＤＮＡ抽出は以下の方法を用いた。 嫌気の希釈液（表１０）を用いて糞便の１０倍希釈液０．２ｍＬを遠心後、上清を取り除き、１．０ｍＬのＰＢＳバッファーに再懸濁する洗浄操作を３度繰り返した。 その後、糞便ペレットは核酸を抽出するまで、−８０℃で保存した。 凍結保存していた糞便ペレットを解凍後、０．６ｍＬのＡＳＬバッファー（キアゲン社）を添加し、７０℃５分間加熱後、ＴＥ飽和フェノールを０．５ｍＬ、φ０．１ｍｍガラスビーズを０．７ｇ加え、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１社）を用いて６．５ｍ／ｓで３０秒激しく振とうした。 ３Ｍ酢酸ナトリウムを０．１ｍＬ添加後、遠心して上清を得た。 上清０．７ｍＬにＡＳＬバッファー０．７ｍＬとＩｎｈｉｂｉｔＥＸ錠（キアゲン）加え、よく混ぜたのち、遠心して上清を得た。 上清０．５５ｍＬにＡＬバッファー（キアゲン）０．５５ｍＬと１００％エタノール０．５５ｍＬを加え、撹拌した後、ＱＩＡｍｐスピンカラム（キアゲン）に全量通過させ、ＤＮＡをカラムに吸着させた。 カラムを洗浄後、ＡＥバッファー（キアゲン）０．１ｍＬを加え、遠心してＤＮＡを回収した。

（３）ＹＩＴ １２２７２飲用試験における糞便中の生きたＹＩＴ １２２７２の検出、定量 健康成人に対して、生菌を含む食品を３週間摂取禁止した後、実施例６の発酵乳（ＹＩＴ １２２７２を１０ ^１０．５ ／本含む）を１日１本（１００ｍＬ）１０日間連続飲用する試験を実施した。

（３−１）選択培地とＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを組み合わせた生きたＹＩＴ １２２７２の検出 ＹＩＴ １２２７２を含む実施例６の発酵乳の飲用前後の糞便を希釈バッファー（ＰＢＳ）を用いて１０倍段階希釈を行い、その１００μＬをＹＩＴ １２２７２選択培地（Ｔ−ＣＢＰＣ、表１１）に塗抹し、３７℃嫌気で７２時間、培養してコロニーを形成させた。 得られたコロニーを１％グルコースを添加したＧＡＭ液体培地（日水製薬）で３７℃嫌気で２４時間培養して菌体を得た。 菌体からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。 また、一部の菌株に対してはＲＡＰＤ試験による菌株識別を行った。 その結果、両者によるＹＩＴ １２２７２識別の結果はすべて一致した。 これまで、選択培地上に形成したコロニーをＹＩＴ １２２７２と確定するには時間や手間のかかるＲＡＰＤ試験やＹＩＴ １２２７２特異的なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ−ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）試験が必要であったが、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを用いることで迅速・簡便に行えることが示された。

（３−２）糞便中の生きたＹＩＴ １２２７２の定量 ＹＩＴ １２２７２を含む実施例６の発酵乳の飲用前後の糞便中の生きたＹＩＴ １２２７２を検出するため、溶解した糞便ペレットを０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、２０ｍＭのＰＭＡ溶液を１．４μＬ添加して（最終濃度５０μＭ）やさしく攪拌後、５分間暗所に保管した。 その後、ハロゲンランプを用いて２分間強光を照射して遠心後、上清を取り除いた。 ＰＭＡ処理後の糞便からＤＮＡを抽出し、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲを組み合わせて糞便中の生きたＹＩＴ １２２７２を定量した。 また、ＰＭＡ処理を行わずに死菌も含めた糞便中のＹＩＴ １２２７２の全菌数も同時に定量した。 その結果をＴ−ＣＢＰＣ寒天選択培地を用いて得られたＹＩＴ １２２７２のＣＦＵと合わせて表１２に示す。 ＹＩＴ １２２７２を含む発酵乳の飲用前の糞便中には培養法及び、ＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲのどちらにおいてもＹＩＴ １２２７２は検出されなかった。 一方、飲用終了後の糞便１グラム中、ＰＭＡ処理せず、定量的ＰＣＲにより検出されたＹＩＴ １２２７２の総数（生菌及び死菌）が１０ ^８．１ ± ^０．８ ｃｅｌｌｓであり、ＰＭＡ処理し、定量的ＰＣＲにより検出された生きたＹＩＴ １２２７２が１０ ^７．５ ± ^１．０ ｃｅｌｌｓであり、菌株特的な選択培地により検出されたＹＩＴ １２２７２は１０ ^６．９ ± ^１．５ ＣＦＵ であった。 また、ＰＭＡ処理時の死菌体のＰＣＲによる定量値は十分に少ないため、式３で計算したＹＩＴ １２２７２の生菌数は、ＰＭＡ処理時の定量的ＰＣＲの菌数（表１２）と等しかった。 従って、ＰＭＡ処理と定量的ＰＣＲを用いることで糞便中のＹＩＴ １２２７２の生菌数を測定可能であることが確認できた。

これまでは、糞便中のＹＩＴ １２２７２を検出定量する方法は選択培地にコロニーを形成させることで行われていたが、コロニーがＹＩＴ １２２７２であることを確かめる確定検査に多大な手間と時間が必要であった。 また、選択培地には高濃度の抗生物質が使用されていることから、損傷菌などが分裂できずに、生きたＹＩＴ １２２７２が過少評価されている可能性が指摘されている。 本発明のＹＩＴ １２２７２特異的プライマーを使用した定量的ＰＣＲでは生菌死菌を問わず、糞便中のすべてのＹＩＴ １２２７２を定量することが可能となった。 さらに、膜透過性色素であるＰＭＡと組み合わせることで糞便中の生きたＹＩＴ １２２７２のみを迅速簡便に定量可能となった。

（実施例１３）飲用菌の回収性試験 ２０代〜５０代の健常成人１９名をランダムに２群に割付け、７日間の観察後（観察期）、実施例６に記載した方法に準じ、ＹＩＴ １２２７２株で作製した発酵乳（試験飲料）、または、ＹＩＴ １２２７２株の代わりにＹＩＴ １０００１株で作製した発酵乳（対照飲料）を１本（１００ｍＬ）／日、７日間摂取させた（摂取期１）。 １０日間の休止後（休止期）、試験飲料と対照飲料を摂取する被験者をクロスオーバーし、さらに７日間摂取させた（摂取期２）。 観察期、各摂取期、休止期の最終日の翌日に便を採取した。 なお、試験期間中、試験飲料または対照飲料以外の乳製品やプロバイオティクス製品の摂取を禁じた。 また、試験飲料と対照飲料のビフィズス菌数は、各々、６．８〜８．９×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ、２．９〜４．２×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬであった。

実施例１２に準じ、Ｔ−ＣＢＰＣ寒天選択培地を用いて糞便中の飲用菌（ＹＩＴ １２２７２株またはＹＩＴ １０００１株）のＣＦＵを求めた。 ＲＡＰＤ法または表８のＹＩＴ １２２７２株特異的プライマーを用いて菌株の定性試験を行った。

飲用前には何れの被験者からも飲用菌は糞便から検出されなかったが、飲用後、試験飲料群、対照飲料群で検出された飲用菌の菌数は、各々、７．３±０．８ Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇ、５．９±１．１ Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、対照飲料群と比べて、試験飲料群では有意に高値であった（表１３）。 なお、試験期間中、試験飲料や対照飲料の飲用に伴う有害事象は認められなかった。

本発酵乳の飲用により、発酵乳中のＹＩＴ １２２７２株、ＹＩＴ １０００１株は何れも生きた状態で糞便から回収されるが、その菌数はＹＩＴ １２２７２株の方が有意に多いことが明らかになった。 この結果は、ＹＩＴ １２２７２株が製品中での生残性が良好であるとともに、人工胃液耐性や人工胆汁・腸液耐性が強化されていることを反映しているものと考えられた。

（実施例１４）整腸作用試験１
年齢が６３歳以上の便秘または便秘傾向者５７名（排便回数が３〜５回／週、便の水分含量が７０％未満、男性２７名、女性３０名、平均年齢６８．７±５．４歳）を対象に、２週間の観察後、実施例８に記載した発酵乳を１本（１００ｍＬ）／日、４週間飲用させるオープン試験を実施し、観察期と飲用期の最終週に排便状況、便性状（ブリストール便性スケール）を調べた。 なお、試験期間中、本発酵乳以外の乳製品やプロバイオティクス製品の摂取を禁じた。 本発酵乳のビフィズス菌数は、１×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ以上であった。

飲用前と比べて、飲用後では排便回数、排便日数、排便量が有意に増加し、また、便性状スコアが有意に改善し、硬めの便が正常化した（表１４）。 なお、試験期間中、本発酵乳の飲用に伴う有害事象は認められなかった。 本結果より、本発酵乳は整腸作用を有することが確認された。

（実施例１５）整腸作用試験２
便秘傾向の女子学生７５名（１８〜２３歳、排便回数が５回以下／週）を対象に、４週間の観察後、実施例６の発酵乳（試験群）またはプラセボ飲料（菌、ガラクトオリゴ糖およびポリデキストロースを含まない未発酵乳、プラセボ群）を１本（１００ｍＬ）／日、４週間飲用させるプラセボ対照二重盲験並行群間試験を実施し、観察期と飲用期の最終週に排便状況、便性状（ブリストール便性スケール）を調べた。 なお、試験期間中、本発酵乳またはプラセボ飲料以外の乳製品やプロバイオティクス製品の摂取を禁じた。 本発酵乳のビフィズス菌数は、１×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ以上であった。

便の水分含量が７０％未満の被験者４４名について解析した（表１５）ところ、排便回数は飲用期において、プラセボ群と比べて試験群では多い傾向（ｐ＝０．０８１）を示した。 排便日数は、観察期と比べて飲用期では、プラセボ群では変化しなかったが、試験群で有意に増加し、飲用期においてプラセボ群と比べて試験群では有意に多かった。 便性状スコアは、観察期と比べて飲用期では、プラセボ群では変化しなかったが、試験群で有意に高くなり、便性状が改善した。 また、飲用期においてプラセボ群と比べて試験群では高値傾向（ｐ＝０．０７０）を示した。 なお、試験期間中、本発酵乳やプラセボ飲料の飲用に伴う有害事象は認められなかった。 本結果より、本発酵乳は整腸作用を有することが確認された。

（実施例１６）腐敗産物産生抑制作用試験 ２０代から７０代の健常女性３９名を年齢、身長、体重、ＢＭＩが均等になるように２群に割付て、４週間の前観察後、実施例６の発酵乳（試験群）またはプラセボ飲料（菌、ガラクトオリゴ糖およびポリデキストロースを含まない未発酵乳、プラセボ群）を１本（１００ｍＬ）／日、４週間飲用させるプラセボ対照二重盲験並行群間試験を実施し、観察期と飲用期の最終週に腕から採血した。 なお、試験期間中、本発酵乳またはプラセボ飲料以外の乳製品やプロバイオティクス製品の摂取を禁じた。 また、本発酵乳のビフィズス菌数は、１×１０ ^８ ＣＦＵ／ｍＬ以上であった。

採取した血液から定法に従って血清を調製し、−８０℃で凍結保存した。 血清２５μＬ、ミリＱ水４７５μＬ、塩酸２００μＬ、内部標準液（４−クロロフェノール（東京化成）を酢酸エチル（シグマ社）で３００倍希釈）１０μＬを撹拌・混合した後、密栓した試験管中で１００℃、６０分間加熱した。 冷却後、ジエチルエーテルを２ｍＬ添加し、撹拌後、ジエチルエーテル層を１ｍＬ採取し、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム含有メタノール１ｍＬと混合した。 本混液を遠心エバポレーターで乾固後、酢酸エチル２００μＬに溶解し、０．４５μｍのフィルター（ウルトラフリーＭＣ、ミリポア社）でろ過してＨＰＬＣ試料とした。 また、パラクレゾール（ナカライテスク社）を酢酸エチルで０〜０．０１％に希釈した溶液２５μＬ、酢酸エチル６７５μＬ、上記内部標準液１０μＬを混合し、標準溶液とした。 以下の条件でパラクレゾールのＨＰＬＣ分析を行った。

ＨＰＬＣシステム：Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５（ウォーターズ社）
検出器：蛍光検出器 Ｅｘ２６０ｎｍ，Ｅｖ３０５ｎｍ（ＵＶ検出器２７０ｎｍ併用）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ４．６×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ（ＣＥＲＩ社）
カラム温度：４０℃
溶離液：％Ａ；０．１％リン酸、％Ｂ；アセトニトリル、％Ａ／％Ｂ＝８０／２０（アイソクラティック）
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
試料室温度：１０℃
測定時間：３０分間

飲用後の血中パラクレゾール濃度は、飲用前と比べてプラセボ群では変化しなかったが、試験群では有意に低下し、プラセボ群と比べて試験群では有意に低値であった（表１６）。 なお、試験期間中、本発酵乳やプラセボ飲料の飲用に伴う有害事象は認められなかった。

以上の結果より、本発酵乳の飲用により、腸内細菌により産生され、生体に対して毒性を示す腸内腐敗産物（パラクレゾール）の血中濃度を低下させることが明らかとなり、これは腸内環境改善作用による腸内でのパラクレゾール産生抑制の結果と考えられた。 すなわち、本発酵乳は腸内環境改善作用を有するものと考えられた。

本発明のビフィドバクテリウム属細菌の作出方法により、環境要因が異なる条件でも生残性に優れるビフィドバクテリウム属細菌を得ることができる。 該菌株は様々な飲食品に適用でき、かつ、飲食品中での菌の生残性が高いため、ビフィドバクテリウム属細菌が有する生理効果を効果的に発揮させることができる。 また、抗ヘリコバクター・ピロリ作用等の特異的な生理効果を有するビフィドバクテリウム属細菌を、本発明の作出方法によって改良することで、様々な飲食品に利用可能な菌株を作出することができるため、本発明の産業上の利用性は極めて高い。