在支气管、消化管、泌尿生殖器官等的粘膜面上存在着针对以 细菌、病毒等微生物或食物蛋白为代表的很多外来抗原、以防御机 体的分泌型IgA为主体的强力粘膜免疫机制。分泌型IgA与血清中的 IgA不同，是以与含有J链的二聚体IgA(二聚体IgA:2IgA·J)与分泌成 分(SC：分泌成分或分泌片)结合的形式(2IgA·J·SC)存在，在唾液、泪 液、鼻液、乳汁、以及支气管或肠道等的分泌液中较多含有。所述 粘膜面上的淋巴组织被称为粘膜相关淋巴组织，在IgA生成诱导中扮 演着中心性的作用。粘膜免疫中，通过肠道的代表性的粘膜相关淋 巴组织一淋巴集结等，接受了抗原刺激的活化B细胞经由全身的血液 循环，不仅是肠道，而是再次分布于外分泌腺或支气管、泌尿生殖 器官的粘膜面上，分化成IgA生成细胞-转化细胞，生成二聚体IgA。 并且这样生成的二聚体IgA与在粘膜上皮细胞中生成的分泌成分结 合，形成分泌型IgA，由粘膜内向管腔或机体外分泌。已知分泌成分 是将二聚体IgA分泌到管腔或机体外的必须成分。
在支气管、消化管、泌尿生殖器官等的粘膜中诱导二聚体IgA的 生成和分泌成分的生成的食品成分或组合物有望使分泌型IgA的生成 量或分泌型IgA由粘膜向管腔或机体外分泌的分泌量增加，增强机体 防御能力。粘膜免疫带来的上述机体防御能力的增强特别在防止病 原体侵入体内或预防食物变态反应发病等中有用。
作为使分泌型IgA的生成亢进的物质，例如本发明人等发现了果 糖低聚糖及其组合物(专利文献1)。该果糖低聚糖是报道的对分泌成 分的生成有影响的少数食品成分之一。另一方面，以往已知双歧杆 菌长双歧杆菌和短双歧杆菌在淋巴集结细胞中诱导IgA的生成(专利文 献2)。本发明人等过去就已发现：由成人的粪便分离的长双歧杆菌OLB 6001菌株(Bifidobacterium longum OLB 6001)具有IgA生成诱导能力(非 专利文献1)。该双歧杆菌长双歧杆菌OLB 6001菌株与本发明人等的 研究小组报道的长双歧杆菌NO.7(保藏号FERM P-13610)是相同的(专 利文献3)。但是，人们仍然希望具有比上述双歧杆菌更高的免疫活化 效果的免疫活化用组合物出现。

发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供免疫活化用组合物以及可用于免疫活化 的饮料食品和药物组合物。
解决课题的方法
本发明人等为解决上述课题进行了深入的研究，结果，成功地 从属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌菌株中获得了多种可以促进分泌成 分的生成和肠道粘膜系统中二聚体IgA生成、在免疫活化中有用的菌 株，从而完成了本发明。即，本发明包含以下内容。
[1]免疫活化用组合物，其特征在于：该免疫活化用组合物含有 具有使肠道上皮细胞的分泌成分生成量至少增加为1.2倍的分泌成分 生成诱导能力的属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌和/或该双歧杆菌的处 理物。
[2]上述[1]的免疫活化用组合物，其特征在于：上述双歧杆菌进 一步具有在抗CD3抗体存在下，使每5×105个淋巴集结细胞的IgA生 成量至少增加至10μg/ml的IgA生成诱导能力。
[3]上述[1]或[2]的免疫活化用组合物，其中上述双歧杆菌是两 歧双歧杆菌OLB 6377菌株(保藏号NITE BP-30)或两歧双歧杆菌OLB 6378菌株(保藏号NITE BP-31)。
[4]上述[1]～[3]的免疫活化用组合物，其中上述双歧杆菌的处理 物是选自双歧杆菌的悬浮物、培养物、培养上清、发酵物、加热处 理物、破碎物、浓缩物、糊化物、干燥物和稀释物的至少一种。
[5]饮料食品，该饮料食品含有上述[1]～[4]的免疫活化用组合 物。
[6]上述[5]的饮料食品，该饮料食品选自婴儿食品、幼儿食品、 哺乳期妇女用食品、老年食品、病人用食品、保健功能食品、辅助 食品、发酵乳和乳酸菌饮料。
[7]药物组合物，该药物组合物含有上述[1]～[4]的免疫活化用组 合物。
[8]两歧双歧杆菌OLB6377菌株(保藏号NITE BP-30)或两歧双歧 杆菌OLB6378菌株(保藏号NITE BP-31)在免疫活化用饮料食品或药 物组合物的制备中的应用。
[9]下述(a)或(b)的双歧杆菌：
(a)两歧双歧杆菌OLB6377菌株(保藏号NITE BP-30)
(b)两歧双歧杆菌OLB6378菌株(保藏号NITE BP-31)。
发明效果
本发明的免疫活化用组合物可以促进上皮细胞的分泌成分的生 成，与以往报道的具有免疫活化作用的双歧杆菌(长双歧杆菌或短双 歧杆菌等)相比，可非常强烈地诱导淋巴集结细胞中IgA的生成。因此， 本发明的免疫活化用组合物特别是在粘膜免疫的活化中非常有用。 并且，本发明的饮料食品和药物组合物含有来自人类作为食品常年 摄取的双歧杆菌的免疫活化用组合物作为有效成分，因此产生副作 用的可能性小。使用本发明的两歧双歧杆菌OLB 6377菌株(保藏号 NITE BP-30)和两歧双歧杆菌OLB 6378菌株(保藏号NITE BP-31)，可 以促进分泌成分的生成，并且与以往的双歧杆菌相比，可以制备可 数倍强烈地诱导IgA生成的免疫活化用组合物。
本说明书也包含本申请的优先权主张的基础-日本特愿2005- 026631号和日本特愿2005-256835号所记载的内容。
附图简述
图1表示在抗CD3抗体存在下，将来自小鼠淋巴集结的淋巴细胞 群与各种双歧杆菌共同培养时的IgA生成诱导能力。n＝3，其值以平 均值±标准偏差表示。
图2表示两歧双歧杆菌OLB 6377菌株的破碎物有助于由HT-29生 成分泌成分的效果。试样是添加在培养基中，使浓度为50～500μg/ml， 培养48小时。*p＜0.05对对照组，Student t-检测。n＝3。值是以对照为 1时的相对值，以平均值±标准偏差表示。
图3是表示两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的破碎物有助于由HT-29 细胞生成分泌成分的效果。试样是添加到培养基中，浓度为500 μg/ml，培养48小时。*p＜0.05对对照组、Student t-检测。n＝3。值是 以对照为1时的相对值，以平均值±标准偏差表示。
图4是表示两歧双歧杆菌MEP170212和两歧双歧杆菌MEP170222 的破碎物有助于由HT-29细胞生成分泌成分的效果。试样是添加到培 养基中，浓度为250μg/ml或500μg/ml，培养48小时。通过Student t- 检测。在各组之间都没有5％基准的显著偏差。n＝3。值是以对照为1 时的相对值，以平均值±标准偏差表示。
图5是两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物对小肠和大肠中 分泌成分基因的表达量的效果。棒状表示以平均值±SD(标准偏差) 表示的相对值。
图6是用分泌成分浓度(ng/ml)表示两歧双歧杆菌OLB 6378菌株有 助于由HT-29细胞生成分泌成分的效果。
实施发明的最佳方式
以下详细说明本发明。
1.所使用的双歧杆菌及其筛选
本发明中，使用具备分泌成分生成诱导能力和高IgA生成诱导能 力、属于两歧双歧杆菌属的双歧杆菌制备免疫活化用组合物。
本发明中使用的双歧杆菌所属的“两歧双歧杆菌”是双歧杆菌属的 一个菌种。本发明中，被分类为两歧双歧杆菌的双歧杆菌通常可按 照分类学的基准进行鉴定，也可以通过近年来经常使用的分子生物 学方法、例如使用两歧双歧杆菌特异性DNA探针的方法(肠内菌群研 讨会8“肠内菌群的分子生态学检测鉴定(Molecular Ecological Detection and Identification of Intestinal Flora))”或与标准菌株的DNA 同源性来鉴定。
本发明中，“分泌成分生成诱导能力”是指促进粘膜上皮细胞(例 如肠道上皮细胞，但并不限于此)进行分泌成分的分泌的能力。例如 将与双歧杆菌或双歧杆菌处理物接触了的粘膜上皮细胞分泌的分泌 成分量与不使用双歧杆菌等的对照实验组进行比较时，该分泌成分 生成诱导能力可通过分泌成分的增加率或分泌成分量的相对值来表 示。更具体地说，本发明的双歧杆菌所具有的“分泌成分生成诱导能 力”相当于使肠道上皮细胞的分泌成分生成量增加至1.2倍、优选1.4倍 以上，一般增加至1.2～10倍、通常为1.2～3倍的能力。
本发明中使用的双歧杆菌优选在属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌 中，选择使肠道上皮细胞的分泌成分生成量至少增加至1.2倍的菌类。 分泌成分生成量例如如后述实施例所述，可通过体外法进行测定。
对上述双歧杆菌的选择没有限定，例如可按照本说明书的实施 例记载的测定法进行。简单地说，首先将属于两歧双歧杆菌的双歧 杆菌在将葡萄糖改为乳糖制备的厌氧EG培养基中培养，洗涤所得培 养物中的菌体，接着进行加热处理和超声波破碎，获得菌体破碎物。 将该菌体破碎物添加到接种了来自人肠道上皮细胞的细胞系(例如 HT-29细胞)的培养基中，优选在37℃培养48小时，然后测定培养上 清中的分泌成分浓度。或者向上述培养基中直接添加培养菌体的PBS(-) 悬浮液，以此代替菌体破碎物。并且，使用PBS(-)[即，除去Ca和Mg 离子的Dulbecco磷酸盐缓冲盐]代替菌体破碎物，除此之外进行同样 的实验操作，作为对照实验，测定培养上清中的分泌成分浓度。分 泌成分浓度可通过ELISA法测定。接着，以对照实验组中的分泌成分 浓度的测定值为1，将实验组中得到的分泌成分浓度的测定值换算成 相对值。将所得的相对值视为使肠道上皮细胞的分泌成分生成量增 加的水平。即，可以选择该相对值显示1.2以上的双歧杆菌。例如， 使用某种双歧杆菌菌株进行上述测定，所得相对值为1.5时，可视为 该双歧杆菌具有使肠道上皮细胞的分泌成分生成量增加至1.5倍的能 力，可作为本发明的双歧杆菌选择。该测定法的培养系统中不含有 转化细胞(IgA生成细胞)，因此，在该测定系统中，分泌成分不与IgA 结合，单独分泌到培养上清中。
本发明中使用的双歧杆菌的分泌成分生成诱导能力还通过使肠 内分泌成分基因的表达量增加的效果来体现。本发明中使用的双歧 杆菌优选可使分泌成分基因的表达量至少增加为2.0倍。本发明的双 歧杆菌使分泌成分的基因的表达量增加，具体来说可以以小肠或大 肠中分泌成分基因-pIgR基因(多聚免疫球蛋白受体基因；GeneID： 18703；Shimada S等.，J Immunol.1999；163(10)：5367～73)表达的mRNA (例如检索号BC013556[国际核酸序列数据库])的百分数(相对于总 mRNA量)增加来证实。来自pIgR基因的mRNA量例如可如下确定： 以由小肠(例如回肠、空肠等)或大肠(例如右位大肠等)的组织中提取 的总RNA为模板，通过使用低聚dT引物的反转录PCR制备cDNA，以 所得cDNA为模板，使用pIgR基因特异性的引物对，进行实时PCR， 由所检测的扩增产物的量确定。为了使测定条件均一化，用于pIgR 基因表达量测定的肠组织可以是器官培养的组织。优选利用GAPDH 基因、β肌动蛋白基因等作为实时PCR的内标。这些基因可以以市售 的杂交探针(Applied Biosystems公司、Stratagene公司等)的形式获得， 它们也适合作为内标使用。
通过判定上述粘膜上皮细胞的分泌成分生成量的增强水平来筛 选含有高免疫活化效果、具有有利的功能性的双歧杆菌等的双歧杆 菌筛选方法也包含在本发明中。
本发明中使用的双歧杆菌优选可以使上述分泌成分基因的表达 量增加，同时使肠内干扰素调节因子1基因(IRF-1基因)的表达量也增 加。本发明中使用的双歧杆菌优选可以使肠组织内的IRF-1基因的表 达量至少增加至1.5倍。本发明的双歧杆菌导致的IRF-1基因表达量的 增加具体可以以小肠或大肠中IRF-1基因(干扰素调控因子1；GeneID： 16362)所表达的mRNA(例如检索号NM008390[国际核酸序列数据库]) 的百分数(相对于总mRNA量)增加的形式来确认。来自IRF-1基因的 mRNA量例如可以以由小肠(例如回肠、空肠等)或大肠(例如右位大肠 等)的组织中提取的总RNA为模板，通过使用低聚dT引物的反转录PCR 制备cDNA，以所得cDNA为模板，使用IRF-1基因特异性引物对进行 实时PCR，由所检测的扩增产物的量来确定。还可以通过使用以总 RNA为模板制备的cRNA的DNA微阵列对来自IRF-1基因的mRNA量 的变化进行分析。为了使测定条件均一化，用于IRF-1基因表达量测 定的肠组织可以采用器官培养所得的组织。在给予了本发明的双歧 杆菌或其处理物的肠组织中，可以认为上述IRF-1基因表达量的增加 是经由细胞内信号传导途径使分泌成分的生成量增加。但是，本发 明并不受限于上述理论。
另一方面，本发明中，“IgA生成诱导能力”是指促进由存在于粘 膜相关淋巴组织(例如肠道粘膜，但并不限于此)的转化细胞进行的IgA 的分泌的能力。该IgA生成诱导能力例如将与双歧杆菌或与双歧杆菌 处理物接触的粘膜相关淋巴组织分泌的IgA量与未使用双歧杆菌等的 对照实验组比较时，通过IgA浓度的增加率来表示。或者该IgA生成 诱导能力可以在某种特定的测定体系中，以来自粘膜相关淋巴组织 的IgA生成细胞所生成的IgA浓度表示。本发明的双歧杆菌的IgA生成 诱导能力比以往报道的双歧杆菌具有高的IgA生成诱导能力。更具体 地说，本发明的双歧杆菌所具有的“高IgA生成诱导能力”相当于在体 外实验体系中，在抗CD3抗体存在下，每5×105个淋巴集结细胞的IgA 生成量至少增加至10μg/ml、一般为10μg/ml～100μg/ml、通常为10 μg/ml～30μg/ml水平的能力。
本发明中使用的双歧杆菌优选在属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌 中选择如下的的双歧杆菌：例如在下述测定系统中、抗CD3抗体存在 下，每5×105个淋巴集结细胞的IgA生成量至少为10μg/ml。
对为了选择双歧杆菌而基于IgA生成量进行的测定并没有限定， 例如根据本说明书的实施例的记载，可如下进行。简单地说，首先 将属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌在将葡萄糖变更为乳糖制备的厌氧 EG培养基上培养，将所得培养物中的菌体进行清洗，然后例如通过 4％-甲醛-PBS等固定菌体。根据需要将该固定菌体除去甲醛等，然后 调节菌液浓度，使其在660nm下的浊度为1.6。另一方面，将由小鼠 采集的淋巴集结在培养基(例如含2％胎牛血清的RPMI-1640培养基)中 搅散，过150目的灭菌不锈钢筛，清洗后再悬浮于培养基中，制备含 有T细胞和B细胞的淋巴细胞群。本测定中，该淋巴细胞群作为淋巴 集结细胞使用。接着将该淋巴细胞群以每孔5×105个接种于预先用 CD3抗体铺板的培养板上，向其中添加5μl上述菌液(浊度＝1.6)，在二 氧化碳培养箱内、在37℃下培养5天。从培养物中除去淋巴细胞，收 集培养上清，测定培养上清中的IgA量。可以将该培养上清中的IgA 量视为在抗CD3抗体存在下每5×105个淋巴集结细胞的IgA的生成 量。即，可以选择该培养上清中的IgA量显示为10μg/ml以上的双歧 杆菌。另外，除不添加双歧杆菌液之外，与上述同样地进行对照实 验，测定培养上清中的IgA量，以该对照实验组的IgA量为1，可以将 实验组的培养上清中的IgA量换算成相对值。可认为本测定方法中测 定的IgA大部分是在淋巴集结细胞中，由在抗CD3抗体存在下分化的 转化细胞(IgA生成细胞)分泌到细胞外的二聚体IgA。
本发明中使用的双歧杆菌的IgA生成诱导能力还可以以以往所报 道的具有高IgA生成诱导能力的双歧杆菌菌株-长双歧杆菌OLB 6001 菌株(保藏号FERM P-13610)或短双歧杆菌菌株(保藏号FERM BP-2824) 的IgA生成诱导能力为基准进行规定。它们是保藏在独立行政法人产 业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1 番地1中央第6)的菌株。例如，在基于上述IgA生成量的测定方法中， 使用长双歧杆菌OLB 6001菌株或短双歧杆菌菌株(保藏号FERM BP- 2824)代替实验组的双歧杆菌，除此之外通过同样的操作进行对照实 验，以该对照实验中培养上清中的IgA的量为1，将实验组的培养上 清中的IgA的量换算成相对值，可以显示以该相对值表示的本发明的 双歧杆菌IgA生成诱导能力，以此作为该双歧杆菌在抗CD3抗体存在 下促进淋巴集结细胞中的IgA的生成的能力。例如，上述测定的结果 中，如果以长双歧杆菌OLB 6001菌株在培养上清中的IgA的量为1， 属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌菌株的IgA量相对值为3，则该双歧杆 菌菌株与长双歧杆菌OLB 6001菌株相比，具有可以使淋巴集结细胞 在抗CD3抗体存在下的IgA生成量增加至3倍的IgA生成诱导能力。本 发明中使用的双歧杆菌IgA生成诱导能力与例如长双歧杆菌OLB 6001 菌株比较，具有使淋巴集结细胞在抗CD3抗体存在下的IgA生成量增 加至2～10倍、优选2.4～5倍的IgA生成诱导能力。
本发明中，对于所使用的双歧杆菌的分泌成分生成诱导能力和 IgA生成诱导能力，可使用上述测定方法确认。
本发明中特别优选使用的双歧杆菌菌株是由本发明人等从婴儿 的粪便中独自分离的双歧杆菌两歧双歧杆菌OLB 6377菌株和两歧双 歧杆菌OLB 6378菌株。使用菌种特异性的DNA探针对这些菌株进行 研究，鉴定均为属于两歧双歧杆菌的菌株。这些菌株于2004年10月26 日(原保藏日)保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构特许微生 物寄托中心(日本国千叶县木更津市かずさ鎌足2-5-8)，两歧双歧杆菌 OLB 6377菌株的保藏号是NITE P-30，两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的 保藏号是NITE P-31。这些菌株于2006年1月18日根据布达佩斯条约由 原保藏处转移保藏，两歧双歧杆菌OLB 6377菌株的保藏号变更为 NITE BP-30，两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的保藏号变更为NITE BP- 31。如实施例中所详细记载的，这些菌株通过上述测定，确认了其 具有分泌成分生成诱导能力，并且与以往的双歧杆菌相比具有高2～5 倍IgA生成诱导能力。由这些菌株得到的突变株等只要是其具有分泌 成分生成诱导能力和高的IgA生成诱导能力，均适合在本发明中使 用。
为了培养本发明的双歧杆菌，可以使用双歧杆菌培养中通常使 用的培养基。即，只要是除主要的碳源之外还适当含有氮源、无机 物等其它营养素的培养基即可，均可使用，如果添加半胱氨酸或胱 氨酸或者甲硫氨酸等含硫氨基酸，则可得到良好的生长。碳源可以 使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、废糖蜜等，可根据所 使用菌的可利用性来使用。氮源可以使用酪蛋白的水解产物、乳清 蛋白水解产物、大豆蛋白水解产物等有机含氮物。除此之外，还可 以使用肉膏、鱼肉膏、酵母提取物等作为增殖促进剂。
本发明的双歧杆菌的培养可在厌氧条件下进行。厌氧培养可以 采用在预先通入二氧化碳的培养基中进行培养的方法；或者 AnaeroPack或GasPack等封入脱氧剂的厌氧罐等公知的方法。培养温 度通常优选35～40℃，只要是菌种可生长的温度即可，也可以是其它 温度条件。培养开始时的培养基的pH优选保持为5.0～8.0。为了获得 免疫活化用组合物的制备中使用的培养物，培养时间通常为10～20小 时较为恰当。
2.免疫活化用组合物
本发明中，可以使用上述本发明的含双歧杆菌的组合物作为免 疫活化用组合物。还可以除本发明的双歧杆菌之外或者代替该双歧 杆菌，使用含有本发明的双歧杆菌的处理物的组合物作为免疫活化 用组合物使用。本发明的免疫活化用组合物诱导(促进)肠道上皮细胞 等粘膜上皮细胞生成分泌成分，且高水平诱导(促进)以淋巴集结细胞 为代表的粘膜相关淋巴组织的IgA的生成。
通过适量添加，本发明的免疫活化用组合物可以使饮料食品或 药物组合物具有例如抑制病原体感染等的免疫活化作用。对该免疫 活化用组合物没有限定，例如可以是液体状、凝胶状、粉末状、颗 粒状、固体状、胶囊状或片状等任意的形态。
本发明的免疫活化用组合物中使用的本发明的双歧杆菌可以是 活菌体也可以是灭活菌体，可以是湿润菌也可以是干燥菌。本说明 书中，术语“双歧杆菌”指双歧杆菌的菌株和菌体均可。
本发明中，对双歧杆菌的“处理物”没有限定，例如可以是双歧杆 菌的悬浮物(悬浮液)、培养物(含有菌体、培养上清和培养基成分)、 培养上清(从培养物中除去固体成分所得)、发酵物(使鲜乳、脱脂粉 乳或豆乳等经双歧杆菌发酵所得；酸乳酪等)、加热处理物、灭菌处 理物(例如放射线灭菌)、破碎物(例如超声波破碎物)、浓缩物、糊化 物、干燥物(例如喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、转鼓干燥 物等)、液体状物和稀释物。
本发明中，双歧杆菌的“处理物”还可以是将培养物或发酵物浓缩 制成浓缩物，还可以将该浓缩物进一步干燥，使菌体浓度为每1g干 燥物含有1010个以上。该浓缩物的干燥可按照通常的方法例如真空干 燥、喷雾干燥或冷冻干燥等进行。
对本发明的双歧杆菌处理物中所含的最高菌体数没有特别限 定，通常浓缩物中为约4×1010个/g，干燥物中约为5×1011个/g左右。
本发明的双歧杆菌即使是灭活菌体也可以显著诱导淋巴集结细 胞中IgA的生成(参照实施例)，因此可以认为两歧双歧杆菌的双歧杆 菌的细胞壁中含有使IgA的生成诱导活化的成分。但本发明并不限于 上述理论。
分泌到消化道内的分泌成分单独与感染性大肠杆菌或毒素原性 梭状芽孢杆菌菌体结合，并抑制这些病原菌的感染(J.Med.Biol.1995， 42：3～9；J.Med.Microbiol.1998，47：879～888)。因此，本发明的免疫 活化用组合物通过促进分泌成分的生成，具有降低感染性大肠杆菌 或毒素原性梭状芽孢杆菌等的感染性病原体感染的风险的效果。
另一方面，已知肠道粘膜上皮细胞向机体外(肠道腔内)生成分泌 型IgA，这是肠道粘膜的转化细胞生成IgA以及肠道上皮细胞生成分 泌成分两方面发挥了重要作用。在实际中，在分泌成分基因缺损的 实验动物中，原本应该分泌到肠道腔内的IgA蓄积在血清中(J ExpMed 1999；190：915～22)。有报道指出：来自环境的刺激显示了与分泌成分 的表达的相关性，营养失调导致分泌成分表达降低(Lab Invet 1998；78： 1255～66)。本发明的免疫活化用组合物显示分泌成分生成诱导能力， 且具有高的IgA生成诱导能力，因此，例如通过简便的口服给药即可 以促进分泌型IgA的生成。
本发明还涉及通过对受试体给予本申请发明的免疫活化用组合 物(优选口服给药)，以提高受试体的免疫力的方法。该方法中，接受 给药的受试体中，优选分泌成分的生成和IgA的生成两方均得到促 进，结果使分泌型IgA的生成得到促进。该方法中，给予免疫活化用 组合物的受试体与后述的药物组合物的给药对象相同。优选的受试 体的例子有：孕产妇、哺乳期妇女、婴幼儿、老年人、免疫功能低 下的患者等。本申请的免疫活化用组合物的给药量可按照后述药物 组合物的给药量进行。
3.含有免疫活化用组合物的饮料食品
本发明还涉及饮料食品，该饮料食品中添加了含有属于两歧双 歧杆菌的双歧杆菌和/或该双歧杆菌的处理物的免疫活化用组合物， 其中，上述双歧杆菌和/或该双歧杆菌的处理物具有分泌成分生成诱 导能力和高的IgA生成诱导能力。本说明书中，对“饮料食品”没有特 别限定，包含饮料、食品和功能性食品。
对含有本发明的免疫活化用组合物的饮料食品没有特别限定。 例如作为含有本发明的免疫活化用组合物的饮料可以列举发酵乳(酸 乳酪等)、乳酸菌饮料、乳饮料(牛奶咖啡、水果牛奶等)、茶系饮料(绿 茶、红茶和乌龙茶等)、水果/蔬菜类饮料(含有橙、苹果、葡萄等果汁 或西红柿、胡萝卜等蔬菜汁的饮料)、酒精性饮料(啤酒、发泡酒、葡 萄酒等)、碳酸饮料和清凉饮料等饮料。关于各种饮料的制造方法可 以参考现有的参考书，例如“Latest edition：Soft Drinks”(2003)(株式 会社光琳)等。
对含有本发明的免疫活化用组合物的食品没有特别限定，可以 是生鲜食品，也可以是加工食品，例如有布丁、果冻、雪糕类、蛋 糕、糖果、意大利面食、日本面条、鱼糕、火腿、酱油、调味汁、 蛋黄酱、豆腐、汤、面包、鱼肉片、加工肉类、蔬菜、蘑菇等各种 食品。本发明中特别优选的食品是可以将活体的本发明的双歧杆菌 直接送入肠内的发酵乳或乳酸菌饮料。
含有本发明的免疫活化用组合物的饮料食品特别是优选功能性 食品。本发明的“功能性食品”是指对机体具有一定的功能性的食品， 例如特定保健用食品(包含带条件的特保[特定保健用食品])以及包含 营养功能食品的保健功能食品、特别用途食品、营养辅助食品、健 康辅助食品、辅助食品(例如片剂、包衣片、糖衣片、胶囊和溶液剂 等各种剂型)以及美容食品(例如减肥食品)等所谓的健康食品全体。 本发明的功能性食品还包含可以采用基于Codex(FAO/WHO合同食品 规格委员会)食品规格的健康强调标识(健康声明)的健康食品。
作为本发明的功能性食品，更优选的具体例子是病人用食品、 孕产妇/哺乳期妇女用奶粉、婴儿配方奶粉、老年人食品等特别用途 食品。本发明的免疫活化用组合物几乎没有副作用，可以增强肠道 免疫，该肠道免疫可全身性引发对广泛的病原体等的比较非特异性 的免疫应答，因此特别优选在免疫功能尚未发育完全的婴幼儿的配 方奶粉或液体配方乳中使用(例如可添加到通常的婴幼儿用配方乳的 原料中)、或者哺乳期妇女用的奶粉等孕妇或哺乳期妇女用食品、以 及用于免疫功能低下的老年人或患病的老年人食品和病人食品中使 用。
本发明所适合的功能性食品还有：用于免疫功能尚未发育成熟 的婴幼儿的婴幼儿辅助食品、以及以增强或恢复免疫功能为目的的 孕产妇/哺乳期妇女的辅助食品、老年人辅助食品和病人辅助食品。
含有本发明的免疫活化用组合物的功能性食品的优选例子有按 照日本国法令规定的保健功能食品。保健功能食品制度基于国内外 的动向，将以往的特定保健用食品制度整合，不仅是通常的食品， 也以制成片剂、胶囊等形状的食品作为对象。在该制度下，保健功 能食品包含特定保健用食品(个别许可型)和营养功能食品(规格基准 型)两种类。并且也包含带条件的特保[特定保健用食品]等新的类型。
本发明的功能性食品优选对免疫活化有效。本发明的功能性食 品通过表示免疫机能提高、优选肠道免疫(粘膜免疫)功能提高的指标 (例如IgA生成量的增加、分泌成分生成量的增加、分泌型IgA量的增 加、淋巴细胞数的增加等)，显示对免疫活化有效。本发明的功能性 食品可以以免疫活化以外的用途作为第一目标。本发明的功能性食 品(优选特定保健用食品或带条件的特保[特定保健用食品])可以记载 或标记具有免疫活化效果或者会获得与免疫活化有很大相关的指标 (分泌成分的生成量增加等)。记载或标记具有免疫活化效果，这可以 根据保健功能食品制度中的规定得到标记认可。例如，可认为在本 发明的功能性食品中可以记载“改善低下的粘膜免疫功能”、“提高防 御感染的能力”、“防止感冒”、“提高身体抵抗力”等。
本发明的功能性食品可以是片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊 剂等固体制剂，溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等液体制剂，或者凝胶剂 等制剂的形状，也可以是通常的饮料食品的形状(例如饮料、粉末状 茶叶、糕点等)。
对本发明的免疫活化用组合物在饮料食品中的配合量没有特别 限定，可根据情况有各种不同方案。具体的配合量可考虑饮料食品 的种类、所需求的味道或口感，由本领域的技术人员适当确定。不 过通常添加的免疫活化用组合物中，双歧杆菌和/或该双歧杆菌的处 理物的总量为0.001～100％质量、特别是0.1～100％质量的免疫活化用 组合物的配合量较为适当。
本发明的免疫活化用组合物可通过本领域可利用的任意适当方 法含在饮料食品中。例如可以将本发明的免疫活化用组合物制成液 体状、凝胶状、固体状、粉末状或颗粒状，然后将其配合在饮料食 品中。或者将本发明的免疫活化用组合物直接混合或溶解于饮料食 品的原料中。本发明的免疫活化用组合物可以涂布、覆盖、渗透或 喷在饮料食品中。本发明的免疫活化用组合物可以均匀分散在饮料 食品中，也可以局部存在。也可以制成含有本发明的免疫活化用组 合物的胶囊等制剂。还可以将本发明的免疫活化用组合物用可食用 薄膜或食用包衣剂等进行包裹。还可以是在本发明的免疫活化用组 合物中添加适当的赋形剂等，然后成型为片剂等形状。含有本发明 的免疫活化用组合物的饮料食品可以进一步加工，上述加工品也包 含在本发明的范围内。
本发明的饮料食品的制备中，可以使用饮料食品中经常使用的 各种添加物。对添加物没有特别限定，可以是显色剂(亚硝酸钠等)、 着色剂(栀子染料、红102等)、香料(橙味香料等)、甜味剂(甜菊、天 冬甜素等)、防腐剂(乙酸钠、山梨酸等)、乳化剂(软骨素硫酸钠、丙 二醇脂肪酸酯等)、抗氧化剂(EDTA二钠、维生素C等)、pH调节剂(柠 檬酸等)、化学调味剂(肌苷酸钠等)、增稠剂(呫吨胶等)、膨胀剂(碳 酸钙等)、消泡剂(磷酸钙)等、粘结剂(多磷酸纳等)、营养强化剂(钙 强化剂、维生素A等)、赋形剂(水溶性糊精等)等。还可以进一步添加 人参(panax ginseng)提取物、刺五加(Acanthopanax senticosus Harms) 提取物、桉树提取物、杜仲茶提取物等功能性材料。
4.含有免疫活化用组合物的药物组合物
本发明涉及含有免疫活化用组合物作为有效成分的药物组合 物，其中所述免疫活化用组合物含有具有分泌成分生成诱导能力和 高IgA生成诱导能力的、属于两歧双歧杆菌的双歧杆菌和/或该双歧杆 菌的处理物。
本发明的药物组合物中可以配合药物制剂中可接受的载体或添 加物。上述载体和添加物的例子有：水、医药上可接受的有机溶剂、 胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸钠、 水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、果胶、呫吨胶、阿拉 伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、 石蜡、硬脂基醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、 作为药物添加物可接受的表面活性剂等，以及脂质体等人工细胞结 构物等。所使用的添加物可根据制剂的剂型适当或组合选择。本发 明的药物组合物还可以进一步含有其它药理成分。
本发明的药物组合物可以口服或非口服给药，特别优选口服给 药。口服给药的本发明的药物组合物可以是片剂、颗粒剂、散剂、 丸剂、胶囊剂等固体制剂，凝胶剂，或溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等 液体制剂等剂型。以液体制剂的形式使用时，使用本发明的药物组 合物时可以以干燥物的形式供给，然后再使其再溶解。
上述剂型中，口服用固体制剂可以含有药学上通常使用的粘结 剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、湿润剂等添加剂。口服用液体制剂 可以含有药学上通常使用的稳定剂、缓冲剂、矫味剂、防腐剂、芳 香剂、着色剂等添加剂。
本发明的药物组合物优选发挥免疫活化作用。本发明的药物组 合物可以在含有其它药理物质的用于其它治疗用途的药物组合物中 追加免疫活化作用。或者本发明的药物组合物优选为免疫活化剂。
本发明的药物组合物可以特别增加粘膜免疫系统的IgA生成量， 且增加分泌成分的生成量，可以强化免疫系统、特别是粘膜免疫系 统。本发明的药物组合物例如可以以提高对病原体感染的防御能力 为目的使用。
本发明的药物组合物的给药量根据给药对象的年龄和体重、给 药途径、给药次数不同，可根据本领域技术人员的经验，在广范围 内变更。例如，口服给药时，药物组合物中免疫活化用组合物所含 的双歧杆菌和/或该双歧杆菌的处理物的给药量适合为1～1000mg/kg/ 天。本发明的药物组合物可以单次给药，也可以间隔6～8小时重复给 药。
给予本发明的药物组合物的对象是包括人、家畜、宠物、实验 动物等的哺乳动物。免疫功能尚未成熟的婴幼儿期的哺乳动物、老 年或生病等导致免疫功能低下的哺乳动物、体质性或环境性免疫功 能容易低下的哺乳动物特别优选为给予本发明的药物组合物的对 象。本发明的药物组合物没有副作用的问题，因此可持续利用，并 非常有效。
本说明书中引用的所有的刊物、专利或专利申请均以其全体作 为参照，援引到本说明书中。
实施例
以下给出实施例以说明本发明，但本发明的技术范围并不限于 此。
[实施例1]双歧杆菌对IgA生成诱导能力的测定
1.双歧杆菌的制备
将长双歧杆菌OLB 6001菌株(保藏号FERM P-13610)、两歧双歧 杆菌OLB 6377菌株(保藏号NITE BP-30)、两歧双歧杆菌OLB 6378菌 株(保藏号NITE BP-31)、短双歧杆菌菌株(保藏号FERM BP-2824)以及 两歧双歧杆菌MEP170212(以前的名称为两歧双歧杆菌#1(明冶)菌 株；该菌株由明治乳业株式会社(日本)保有)分别在将葡萄糖变更为 乳糖制备的厌氧EG培养基上、在37℃下培养过夜。厌氧EG培养基按 照以下组成制备。
厌氧EG培养基的组成     
40.0g(每升)
肉膏              2.6g
蛋白胨          10.0g
酵母膏            5.0g
磷酸氢钠          4.0g
乳糖              1.5g
可溶性淀粉        0.5g
L-胱氨酸          0.2g
L-半胱氨酸盐酸盐  0.5g
消泡剂(硅)        0.2g
聚山梨醇酯        800.5g
琼脂              15.0g
                      
                  pH7.7
将所得培养物中的菌体用冷PBS(-)洗涤两次，然后悬浮于少量的 PBS(-)中，悬浮于等量的8％-福尔马林-PBS中，固定菌体。在进行IgA 生成诱导能力的测定实验的当天，通过用冷PBS(-)洗涤，由该固定的 菌体中除去福尔马林，然后将菌液悬浮于PBS中，调节菌液浓度，使 其在660nm下的浊度为1.6。将这样得到的菌液称为经福尔马林处理 的双歧杆菌液。
2.双歧杆菌对淋巴集结细胞的IgA生成诱导能力的测定
在二氧化碳气流下，将8周龄的BALB/C小鼠(雌性)放入其中50 秒，杀死，从无菌切取的小肠中采集淋巴集结。将该淋巴集结加入 到含有少量2％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco)中，将Suzuki等 人的方法(载玻片法：双歧杆菌微生物区(Bifidobacteria Microflora，9： 87～98，1990)，部分变化，制备淋巴集结细胞。即，将采集的淋巴集 结加入到培养皿中，该培养皿中装有少量含2％胎牛血清的RPMI-1640 培养基(Gibco公司)，用解剖用的手术刀刃切碎，用塑料注射器的柄 (Terumo公司)缓慢压散。将这样得到的细胞悬浮液过150目的灭菌不 锈钢筛，再用含2％胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤两次。将细胞 再次悬浮于含有适量2％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，获得含有T 细胞和B细胞的淋巴细胞群(淋巴集结细胞)。
所得淋巴细胞群用RPMI-1640培养基更换两次、洗涤，然后使用 台盼蓝确认98％以上均为活细胞，以每孔5×105个接种于96孔微量板 (Falcon 3072)。该96孔板使用预先用抗CD3抗体铺板的微量板，如下 操作：在各孔中预先分别加入100μl抗CD3抗体(CEDARLANE，No. CL7202AP、使用浓度：2.5μg/ml)，在37℃下保温2小时，然后用200μl PBS洗涤一次，再用200μl FCS(-)RPMI培养基洗涤一次。
再在接种了淋巴细胞群的96孔微量板中，分别向三个孔中添加5 μl按照上述“1.双歧杆菌的制备”制备的、来自五个菌株的经福尔马 林处理的双歧杆菌液(浊度＝1.0)，在二氧化碳培养箱内、在37℃下培 养5天。培养后的菌液通过1400rpm离心10分钟，以除去了淋巴细胞 群的培养上清作为IgA量测定用试样，在测定前保存在-80℃下。接着， 使用小鼠IgA ELISA定量试剂盒(Bethyl laboratories公司)，按照说明书 记载的方法，对该培养上清试样中的IgA量进行测定。
另一方面，作为对照实验，不添加经福尔马林处理的双歧杆菌 液，除此之外与上述同样，在抗CD3抗体共存下将淋巴细胞群培养5 天，同样地测定该培养上清中的IgA的量。
以上测定的培养上清中的IgA浓度如表1所示。
[表1]
  样品   菌株  抗CD3抗体   IgA量(μg/ml)   抗CD3(-)   无  -   0.42   抗CD3(+)   无  +   3.84   1   长双歧杆菌OLB6001  +   4.21   2   短双歧杆菌菌株   (保藏号FERM BP-2824)  +   3.67   3   两歧双歧杆菌OLB6377  +   10.5   4   两歧双歧杆菌OLB6378  +   16.8   5   两歧双歧杆菌MEP170212  +   5.73
按照表1，在图1中以图表表示结果。
如图1的图表左侧所示，在抗CD3抗体共存下将上述淋巴细胞群 (淋巴集结细胞)培养5天，IgA分泌到培养上清中。这可以确认：在抗 CD3抗体的共存下培养的淋巴集结细胞中，分化出IgA生成细胞(转化 细胞)。
由表1和图1的图表右侧所示，通过使用本测定系统，两歧双歧 杆菌OLB 6377菌株和两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的IgA生成诱导能 力比以往报道的具有IgA生成诱导能力的长双歧杆菌OLB 6001菌株 (保藏号FERM P-13610)和短双歧杆菌菌株(保藏号FERM BP-2824)显 示大2～5倍。
[实施例2]双歧杆菌对分泌成分生成诱导能力的测定I
1.双歧杆菌破碎物的制备
分别与实施例1同样地，将两歧双歧杆菌OLB 6377菌株、两歧双 歧杆菌OLB 6378菌株、两歧双歧杆菌MEP170212(以前的名称：两歧 双歧杆菌#1(明治)菌株；该菌株为明治乳业株式会社(日本)保有)和两 歧双歧杆菌MEP170222(以前的名称：两歧双歧杆菌#2(明治)菌株； 该菌株为明治乳业株式会社(日本)保有)分别在将葡萄糖变更为乳糖 制备的厌氧EG培养基中培养过夜。接着，将所得培养物中的菌体用 冷PBS(-)洗涤两次，然后以10mg/ml悬浮于PBS(-)中。将该悬浮物在75 ℃加热处理60分钟，然后用超声波破碎机(BRANSON SONIFIER250、 暂载率：60％、输出控制：双微量滴头(2 micro tip limit))得到菌体破 碎物。
2.双歧杆菌破碎物对HT-29细胞的分泌成分生成诱导能力的测定
将来自人肠道上皮细胞的HP-29细胞接种在12孔板上，使其浓度 为3～6×105个/孔左右，加入1.0ml含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培 养基(invitrogen公司制备)。第二天，将按照上述“1.双歧杆菌破碎物 的制备”制备的4个菌株的双歧杆菌(两歧双歧杆菌OLB 6377菌株、两 歧双歧杆菌OLB 6378菌株、两歧双歧杆菌MEP170212菌株和两歧双 歧杆菌MEP170222菌株)的菌体破碎物分别添加到上述制备的12孔板 的各3个孔的培养基中，使菌体破碎物浓度为50～500μg/ml，在37℃ 培养48小时。对照实验使用PBS(-)[除去了Ca和Mg离子的Dulbecco磷 酸盐缓冲盐水]代替菌体破碎物。由所得培养物中采集培养上清，通 过ELISA法测定培养上清中的分泌成分浓度。为此，首先将ELISA板 的孔用人分泌成分的多克隆抗体(DAKO公司、用PBS(-)稀释1000倍 使用)在4℃下铺板过夜，然后用0.01％吐温20加PBS(-)洗涤，接着加 入1％牛血清白蛋白(BSA)-PBS(-)，在室温下温育1小时，进行封闭。 接着向该板的各孔中加入50μl上述得到的各培养上清作为样品，在 室温下温育1小时。将各孔用0.01％吐温20加PBS(-)洗涤，然后添加辣 根过氧化物酶标记的抗人分泌成分抗体(DAKO公司、用1％BSA-PBS(-) 稀释1000倍)，在室温下温育30分钟。接着将各孔用0.01％吐温20加 PBS(-)洗涤，然后向各孔中加入100μl邻苯二胺/过氧化氢水溶液，反 应30分钟。反应后添加20μl 2NH2SO4，中止反应，然后测定波长490nm 下的吸光度。以对照的分泌成分生成量为1时，测定结果以相对值表 示。各组间的显著差异检测是通过Student t-检测，判定在显著性水平 5％以下是否有显著差异。
上述测定中，将两歧双歧杆菌OLB 6377菌株的菌体破碎物变为50 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的量，添加到培养基中，其 分泌成分的测定结果如表2和图2所示。
[表2]
  两歧双歧杆菌OLB6377   破碎物的添加量(μg/ml)   分泌成分量的相对值   0   1.00   50   1.44   100   1.55   200   1.63   500   1.57
该结果中，即使添加50μg/ml菌体破碎物，与对照相比已经可见 约1.4倍的分泌成分生成量的增加。另外，即使增加菌体破碎物的用 量，其分泌成分生成量的增加也是相同程度(图2)。
该结果显示：本发明的双歧杆菌即使是在75℃下进行60分钟加 热处理失活后的菌体破碎物，也具有促进分泌成分生成的效果。
上述测定中，将两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物以500 μg/ml添加到培养基中，分泌成分的测定结果如表3和图3所示。
[表3]
  样品   分泌成分量的相对值   对照   1.00   两歧双歧杆菌OLB6378破碎物   500μg/ml   2.54
如上所述，以500μg/ml添加两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体 破碎物时，与对照相比，可见约2.5倍的分泌成分生成量的增加。
上述测定中，以250μg/ml和500μg/ml将两歧双歧杆菌MEP170212 和两歧双歧杆菌MEP170222的菌体破碎物添加到培养基中，分泌成 分的测定结果如表4和图4所示。
[表4]
  样品   分泌成分量的相对值   对照   1.00   两歧双歧杆菌MEP170212破碎物250μg/ml   0.84   两歧双歧杆菌MEP170212破碎物500μg/ml   0.89   两歧双歧杆菌MEP170222破碎物250μg/ml   1.09   两歧双歧杆菌MEP170222破碎物500μg/ml   0.90
由图4所示，两歧双歧杆菌MEP170212和两歧双歧杆菌 MEP170222中，即使是250μg/ml这样较高的浓度，也未见分泌成分 生成量的增加。这显示，属于两歧双歧杆菌属的双歧杆菌未必均具 有增强分泌成分生成的能力。
[实施例3]用双歧杆菌破碎物处理的小肠和大肠器官培养组织中的分 泌成分基因表达量的测定
从刚出生后24小时以内的BALB/c小鼠中摘除回肠和右位大肠， 用于器官培养的研究。即，将回肠和右位大肠切成环状，制备宽度 约2～4mm的组织切片。将组织切片在玻璃滤纸上沿着纵向切开成片 状，使肌板的一侧的面贴合在玻璃滤纸上。将制作的组织片放入48 孔板，加入100U/ml青霉素(万有制药)、0.1mg/ml链霉素(明治制果)、 0.05mg/ml庆大霉素(LIFE TECHNOLOGIES)和0.5ml含有10％胎牛血 清的RPMI培养基(日水制药)。
接着，将按照上述实施例2的“1.双歧杆菌破碎物的制备”制备的 来自两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物分别添加到上述制备 的48孔板的各3个孔的培养基中，菌体破碎物浓度为500μg/ml，在37 ℃下培养18小时(n＝3)。对照实验是使用PBS(-)代替菌体破碎物(n＝3)。
培养结束后，使用RNA纯化试剂盒(QIAGEN、RNeasy mini kit)， 从培养组织中提取总RNA，以其为模板，通过低聚dT引物 (INVITROGEN)制备cDNA。再以该cDNA为模板，用Light Cycler (Roche公司)进行使用pIgR基因(分泌成分基因)特异性的PCR引物(5’- AGGCAATGACAACATGGGG-3’(SEQ ID No.1)和5’- ATGTCAGCTTCCTCCTTGG-3’(SEQ ID No.2))的实时PCR，测定 cDNA中pIgR基因表达量。对于各试样所测定的pIgR基因表达量是使 用管家基因之一的GAPDH基因(PCR引物、使用5’- TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’(SEQ ID No.3)和5’- TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQ ID No.4)，按照同样方法检测) 的表达量，按照以下计算式进行补正。
pIgR基因的相对表达量＝pIgR基因表达量/GAPDH基因表达量
根据以上计算的pIgR基因相对表达量，由多个实验样品计算的 pIgR基因的相对表达量平均值的结果如表5和图5所示。
[表5]
  对照   两歧双歧杆菌OLB 6378破碎物   (500μg/ml)   回肠   0.0011   0.0031   右位大肠   0.0042   0.0102
图5中，白色棒表示对照实验中的pIgR基因的相对表达量，黑色 棒表示添加了两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物时pIgR基因 的相对表达量。各棒也表示了标准偏差。
如表5和图5所示，以菌体破碎物浓度500μg/ml添加按照实施例2 制备的两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物时，与对照相比， 在回肠(小肠下部)中可见2.9倍、在右位大肠(大肠的开始部分)可见2.4 倍的pIgR基因(分泌成分基因)的基因表达量的增加。在大肠中的增加 可通过Mann-Whitney的U检测确认其有显著差异(P＜0.05)。由此显示， 两歧双歧杆菌的菌体破碎物可以增强小肠和大肠中分泌成分基因的 表达。
[实施例4]用两歧双歧杆菌破碎物处理的小肠和大肠器官培养组织中 的分泌成分基因表达量、以及IRF-1基因表达量的DNA微阵列测定
从出生第18天的BALB/c小鼠中摘除回肠和右位大肠，进行器官 培养，用于研究。与上述实施例3同样，将回肠和近位大肠切成环状， 制备宽约2～4mm的组织切片。将组织切片在玻璃滤纸上沿纵向切开 成片状，使肌板一例的面与玻璃滤纸贴合。将制作的组织片放入48 孔板中，加入100U/ml青霉素(万有制药)、0.1mg/ml链霉素(明治制 果)、0.05mg/ml庆大霉素(LIFE TECHNOLOGIES)和0.5ml含有10％ 胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)。
接着，将按照上述实施例2的“1.双歧杆菌破碎物的制备”制备的 来自两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物分别添加到上述制备 的48孔板的各3个孔的培养基中，菌体破碎物浓度为500μg/ml，在37 ℃下培养18小时。对照实验是使用PBS(-)代替菌体破碎物(n＝3)。
培养结束后，使用RNA纯化试剂盒(QIAGEN、RNeasy mini kit)， 从培养组织中提取总RNA，将3个孔的总RNA汇成一个，用于以下的 测定。以总RNA为模板，使用基因芯片单循环靶标记和调控试剂试 剂盒(GeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagents kit) (Affymetrix公司)合成片段cRNA。即，使用上述试剂盒中含有的基因 芯片表达3’-扩增试剂单循环cDNA合成试剂盒(GeneChip Expression 3’-Amplification Reagent One-Cycle cDNA Synthesis Kit)(Affymetrix公 司)和基因芯片真核生物Poly-A RNA调控试剂盒(GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit)(Affymetrix公司)合成cDNA。接着使用 GeneChip Cleanup Module(Affymetrix公司)纯化cDNA，使用基因芯 片表达3’-扩增试剂IVT标记试剂盒(GeneChip Expression 3’- Amplification Reagent IVT labeling kit)(Affymetrix公司)进行体外转录 反应。使用GeneChip Cleanup Module(Affymetrix公司)纯化cRNA，然 后将cRNA用片段化缓冲液(Fragmentation buffer；Affymetrix公司)处 理成片段，得到片段cRNA。使用片段cRNA，通过DNA阵列系统 (Affymetrix公司)进行分析。这里所使用的DNA阵列的探针是含有约 36000种小鼠基因的小鼠基因组MG U74Av2Set(Affymetrix公司)。实 验间的变动使用基因表达对内部调控之比进行补正。两歧双歧杆菌 OLB 6378菌株的处理对各基因表达量的效果可以以相对于对照实验 (PBS(-)处理)中各基因表达量的比表示。
结果，可见小肠和大肠器官培养组织中分泌成分基因(pIgR基因) 表达量增加、以及细胞内信号传导因子-IRF-1基因的表达量增加(表 6)
[表6]
  对照   两歧双歧杆菌OLB 6378破碎物   (500μg/ml)  (pIgR基因表达量)  回肠   1.0   2.0  右位大肠   1.0   6.1  (IRF-1基因表达量)  回肠   1.0   1.5  右位大肠   1.0   4.0
如表6所示，以菌体破碎物浓度500μg/ml添加按照实施例2制备 的两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物时，与对照相比，在回 肠(小肠下部)中可见2.0倍、在右位大肠(大肠的开始部分)可见6.1倍的 分泌成分基因(pIgR基因)表达量的增加。与实施例3的结果大致一致。 并且两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的菌体破碎物与对照相比，在回肠 可见1.5倍、在右位大肠(大肠的开始部分)可见4.0倍的IRF-1基因表达 量的增加。
IRF-1显示为分泌成分基因的转录调节因子之一(Blanch等.J Immunol 1999，162：1232～1235)。因此，通过使用两歧双歧杆菌OLB 6378菌株的处理，分泌成分基因表达的诱导显示经由细胞内信号传 导途径增强。
[实施例5]双歧杆菌对分泌成分生成诱导能力的测定II
基本上按照实施例2的方法，测定双歧杆菌两歧双歧杆菌OLB 6378菌株和两歧双歧杆菌JCM1255T菌株对分泌成分生成的诱导能 力，进行比较。两歧双歧杆菌JCM1255T菌株作为比较用菌株，由独 立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室(JCM) (日本国崎玉县和光市广泽2-1)获得。
两歧双歧杆菌OLB 6378菌株和两歧双歧杆菌JCM 1255T菌株按照 实施例2的顺序培养过夜，然后用冷PBS(-)洗涤两次，悬浮于PBS(-) 中，将其以菌体浓度500μg/ml的量添加到接种有按照实施例2的顺序 制备的HT-29细胞的培养基(含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基 (invitrogen公司制备))中，在37℃下培养72小时(n＝2)。在培养第48小 时和第72小时时，由所得培养物中采集培养上清，按照实施例2的顺 序，通过ELISA法测定各培养上清中的分泌成分浓度。
对照实验中，将PBS(-)代替菌体的PBS(-)悬浮物添加到上述培养 基中(下述表7中以PBS(-)表示)。还有的对照实验是上述培养基中不添 加菌体的PBS(-)悬浮物，也不添加任何替代物质进行培养(下述表7中 以仅含培养基表示)。
[表7]
  分泌成分浓度(ng/ml)   第48小时   第72小时   仅含培养基   0.31   0.55
  PBS(-)   0.31   0.47   两歧双歧杆菌JCM1255T   0.35   0.57   两歧双歧杆菌OLB6378菌株   0.61   1.07
由表7和图6所示，HT-29细胞即使在无刺激下也生成分泌成分。 并且，两歧双歧杆菌OLB 6378菌株与两歧双歧杆菌JCM 1255T菌株相 比，可以显著地诱导生成较多量的分泌成分。
产业实用性
本发明的免疫活化用组合物促进分泌成分的生成且高度促进IgA 的生成，由此可以特别提高粘膜免疫系统的功能。因此，本发明的 免疫活化用组合物在使饮料食品或药物组合物具有上述免疫功能增 强作用方面有效。另外，含有本发明的免疫活化用组合物的饮料食 品和药物组合物适合在免疫功能低下患者例如婴幼儿或老年人、病 人等中使用。本发明的免疫活化用组合物可使用本发明的双歧杆菌 的灭活菌体制备，因此也可以添加到育儿用配方奶粉等具有生物学 规定的产品中使用，可以制成各种产品形态应用于各种制品中。
专利文献1：日本特开2003-201239号公报
专利文献2：日本特公平7-106142号公报
专利文献3：日本特开平7-69907号公报
非专利文献1：Takahashi T.，Nakagawa E.，Nara T.，Yajima T.和Kuwata T.Biosci Biotechnol Biochem 62(1)，(1998)10～15页
序列表自由文本
SEQ ID No.1～4的序列是引物。
序列表
<110>明治乳业株式会社
<120>免疫活化用组合物
<130>PH-2696-PCT
<140>PCT/JP2006/301661
<141>2006-02-01
<150>JP2005-026631
<151>2005-02-02
<150>JP 2005-256835
<151>2005-09-05
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Inventor：Moro，Itaru；Iwase，Takashi；Ochiai，Kuniyasu
Inventor：Yajima，Masako；Terahara，Masaki；Nakamura，Yoshitaka
Inventor：Totsuka Mamoru；Yamada，Kiyoshi
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>1
aggcaatgac aacatgggg        19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>2
atgtcagctt cctccttgg                 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>3
tgaacgggaa gctcactgg                 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>4
tccaccaccc tgttgctgta                20