면역보강제 {IMMUNOADJUVANT}
본 발명은 감염성 제제에 대한 특이적 면역 반응을 증폭시키기 위한 젖산 박테리아의 용도에 관한 것이다.
식량농업기구 (FAO) 및 세계보건기구 (WHO)의 정의에 따르면, 프로바이오틱은 적정량으로 투여될 때 숙주에게 건강상 이익을 제공하는 살아있는 박테리아이다 (FAO/WHO 2001). 프로바이오틱은 유당 흡수 장애, 급성 설사, 항생제 연관 설사, 알레르기 및 염증성 장 질환과 같은 여러 가지 질환들에 있어 유익한 효과를 보여왔다 (Goldin and Gorbach 2008). 프로바이오틱 박테리아는 일반적으로 락토바실러스 ( Lactobacillus ), 스트렙토코쿠스 ( Streptococcus ), 락토코쿠스 ( Lactococcus ) 및 비피도박테리움 ( Bifidobacterium ) 속 (genera)에서 발견된다. 이들 속으로부터 유래하는 다수의 균주들이 치즈, 요거트 및 기타 낙농 제품을 제조하는데 흔히 사용된다. 프로바이오틱은 병원성 미생물의 발생을 저해함으로써 및/또는 보다 직접적으로 면역 시스템에 작용함으로써 특히 장내세균총 (intestinal flora) 수준에서 개입한다고 여겨진다. 예를 들어, 프로바이오틱 박테리아 또는 이들 박테리아를 포함하는 발효 식품, 예컨대 요거트 등의 섭취는 병원성 박테리아의 감소를 이끌어내는 것으로 알려졌고; 면역 시스템의 관점에서, 다양한 효과들이 보고되었다: 특이적 또는 비특이적 면역 반응, 예컨대 림프구 및 대식 세포 등과 관련된 세포의 활성화, 면역 글로불린 및 특히 IgA 수준의 증가; 면역 시스템 활성화 사이토카인 수준의 증가 등 (리뷰용, 예컨대 문헌 [MEYDANI 및 HA (Am J Clin Nutr, 71, 861-7217, 2000]). 결국, 다양한 프로바이오틱 젖산 박테리아에 대하여 수행된 연구들은 일부 종, 또는 적어도 이들 종의 일부 균주들이 면역 자극 특성을 갖는다고 결론짓는 경향이다. 인간 및 동물에서 수행된 몇몇 연구는 L. 카세이 ( L. casei ) 종의 박테리아가 건강상 유용한 효과를 나타내고, 특히 면역 시스템에 있어 긍정적인 효과를 나타냄을 제안하고 있다. 마우스에서의 L. 카세이 연구 L. 카세이 균주 DN-114 001을 함유하는 발효유의 섭취가 살모넬라 티피무리움 ( Salmonella typhimurium ) 감염에 대한 저항성을 증가시키고 (문헌 [PAUBERT-BRAQUET et al. Int J Immunother, 4:153, (1995)]); 대식 세포의 활성화 및 순환 IgA의 증가가 동시에 관찰되었음이 마우스에서 밝혀졌다. 락토바실러스 파라카세이 ( Lactobacillus paracasei ) 아종 파라카세이 ( L. 카세이 431 ® 를 먹인 영양실조 마우스들이 폐렴성 호흡기 감염에 대한 저항성 증가를 나타내었다 (Villena et al. 2005). 아것은 대조군에 비하여 혈액으로부터 더 효과적으로 병원체들이 제거되고 폐 손상이 현저히 적음으로써 보여진 것이다. 또한, 항폐렴성 (antipneumococcal) IgA 수준 뿐 아니라 백혈구와 호중구의 수 역시 증가하였다 (Villena et al. 2005). 인간에서의 L. 카세이 연구 건강한 성인에서, 락토바실러스 람노수스 LGG ® ( Lactobacillus rhamnosus LGG ® (LGG ® )또는 L. 카세이 431 ® 을 함유하는 화학적 산성화유를 이용한 보충제는, 대상체가 소아마비 (polio)에 대하여 경구 백신 처리된 연구에서 제8일에 순환 중화 항체 역가 증가의 결과를 나타내었다. 특히, 소아마비 바이러스 특이적 면역 글로불린 A (IgA), IgG 및 IgM이 증가하였다 (de Vrese et al. 2005). 저자들은 프로바이오틱이 바이러스 중화 항체의 생산을 증가시킴으로써 바이러스 감염으로부터 세포의 시스템 방어 증강을 제공할 수 있는 면역학적 반응을 유발한다고 결론지었다 (de Vrese et al. 2005). 서로 연관되고 동일한 방향을 나타냄에도, 이 문헌에서 보고된 결과는 모든 경우에 있어서 그 차이가 유의미하지는 않음을 보여준다. L. 카세이 431 ® 과 관련하여 통계적으로 유의미한 유일한 결과는 항원형-2-특이적 IgM에 대한 효과가 통계적으로 유의미하였다는 것이었다. 분립의 IgA 증가를 보여주는 아동에서의 BB -12 ® 연구 아동에서의 몇몇 연구는 프로바이오틱 균주 비피도박테리움 아니말리스 ( Bifidobacterium animalis ) 아종 락티스, BB-12 ® (BB-12 ® )의 면역 조절 특성을 보여주었다. 12 월령의 나이까지는 경구 소아마비 백신 처리를 완료한 7 명의 아동 (15 내지 31 월령)에게 성장기용 조제식으로 BB-12 ® 를 투여하자 분립 중 총IgA 농도와 항소아마비 바이러스 IgA의 농도가 증가하였고, 이것은 위장관 감염에 대한 점막 저항성을 증진시키는데 기여할 수 있다 (Fukushima et al. 1998). 생애 첫 1년 동안 조제식을 먹은 유아에 의한 LGG ® 및 BB-12 ® 의 조합 섭취는 유아의 식이 중 우유가 유입되는 시점에 우유 특이적 IgA 분비 세포의 증가라는 결과를 나타내었다 (Rautava et al. 2006). 미숙아에게 있어서, 21 일간의 BB-12 ® 경구 투여는 대조군과 비교하여 분립 중 IgA의 증가라는 결과를 낳았다. 또한, 체중, 분립 중 아세테이트 및 락테이트의 농도가 증가하였고, 후자의 발견은 유당 소화의 향상을 나타내는 것이다. 프로바이오틱 군에서 분립의 칼프로텍틴이 감소하였고, 이것은 식이 및 박테리아 항원에 대한 점막 면역의 향상과 염증 반응의 감쇠를 증명하는 것이다 (Mohan et al. 2008). L. 카세이 431 ® 이외 기타 L. 카세이 균주에서의 인플루엔자 백신 모델 인플루엔자 백신 모델을 채용한 종전의 연구 결과는 다른 프로바이오틱 균주들에 대하여 설명하였다. 예비 연구에서, 70 세 이상의 노인 대상자 86 명 (n=86) 에게 프로바이오틱 균주 락토바실러스 카세이 ( Lactobacillus casei ) DN-114 001을 함유하는 발효 낙농 제품을 7 주간 섭취하게 하자 인플루엔자 백신 처리에 대한 면역 반응이 향상되는 결과가 나타났다. 대조군에서보다 프로바이오틱 군에서 특정 인플루엔자 균주에 대한 혈청방어율 및 항체양성률이 일관성 있게 높았다. 또한, 인플루엔자 특이적 항체 역가도 백신 처리 후 증가하였는데, 이것은 대조군에 비하여 프로바이오틱 제품 군에서 일관되게 높은 것이었다. 그러나, 군들 간 어떠한 차이점도 통계적으로 유의미하지는 않았다 (Boge et al. 2009). 그 후, 13 주간 락토바실러스 카세이 DN-114 001 또는 비발효 대조군 낙농 제품을 함유하는 발효유 음료를 섭취한 222 명의 노인 자원자들 (평균 연령 85 세)에 대하여 확인 연구가 수행되었다. 이 연구에서도, 백신 처리 후 대조군에서보다 프로바이오틱 제품 군에서 특이적 항체 역가가 일관성 있게 높았다. 제품 섭취 전 기간에 걸쳐 대조군에 대하여 프로바이오틱 군에서의 B 균주 항체 역가 및 항체양성이 현저히 높았다. 치료의도분석 (intention to treat, ITT)에 의한 군들 간 항체양성률 분석에 있어서도 백신 처리 5 개월 후에도 여전히 B 균주 및 H3N2 균주에 대하여 유의미한 차이가 관찰되었다 (Boge et al. 2009). 건강한 성인 자원자들 (n=50)에 있어서, 락토바실러스 퍼멘툼 ( Lactobacillus fermentum ) CECT5716을 함유하는 캡슐의 경구 섭취는 인플루엔자 백신 처리 후 항원 특이적 IgA 및 총IgM을 현저히 증가시켰고, 백신 처리 2 주 후 대조군에 비하여 프로바이오틱 군에서 이들 항체의 농도가 높은 결과를 나타내었다. 또한, 프로바이오틱 군에서 인플루엔자 백신 처리 2 주 후에 자연살해 세포 (NK cell)의 비율이 증가하였다. 결국, 5 개월째 (2 월)에 군들 간 유의미한 차이를 나타내면서, 대조군과 비교하여 프로바이오틱을 섭취한 군에서 백신 처리 후 5 개월의 기간 동안 인플루엔자 유사 병증 (ILI)의 발생이 더 낮았다 (Olivares et al. 2007). 이러한 연구들에도 불구하고, 프로바이오틱의 건강상 이점은 균주 의존적이고, 한 가지 프로바이오틱 균주에 대하여 입증된 기능적 효과가 다른 균주들에 대하여도 반드시 추론될 수는 없다 (UN의 FAO 및 WHO (2002)). 문헌 [ Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food . Report of a Joint FAO / WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food . London/Ontario: FAO / WHO and Rijkers GT, Bengmark S, Enck P, et al (2010) Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research J Nutr 140, 671S-676S)]. 비피도박테리움 아니말리스 ( Bifidobacterium animalis ) 아종 락티스 (BB-12 ® ) 및 락토바실러스 파라카세이 ( Lactobacillus paracasei ) 아종 파라카세이 ( L. casei 431 ® )의 면역 조절 효과에 관한 인간을 대상으로 한 실험 데이터가 드물고, 효율적인 면역 반응을 이끌어 내기 위하여 더 효과적인 추가 기술을 개발하고자 하는 요구가 여전하기 때문에, 인플루엔자 백신 처리를 이용하여 제어되고 적절히 강력한 시도로 이들 두 가지 프로바이오틱 균주의 효과를 더 조사하는 것이 중요하다고 여겨진다.
발명의 요약 본 발명의 발명자는 인플루엔자 백신과 조합한 L. 카세이 431 또는 BB-12의 투여가 백신만으로 나타나는 것보다 더욱 강력한 면역 반응을 이끌어냄을 보여준다. 그러므로, 본 발명은 인플루엔자 백신과 함께 L. 카세이 431 또는 BB-12와 같은 프로바이오틱 박테리아를 공투여 (co-administering)함으로써 백신의 효율을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 치료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 혈장 IgG
도 2. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 혈장 IgG1
도 3. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 혈장 IgG3
도 4. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 타액 IgG
도 5. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 타액 IgA
도 6. 베이스라인 및 연구군 제42일의 백신 특이적 타액 IgM
발명의 상세한 설명
면역 반응에 대한 프로바이오틱의 효과를 시험하기 위하여, 본 연구는 다음의 이유로 인플루엔자 백신 모델을 이용하였다:
병원체에 대한 자연 노출은 매우 비제어적, 비예측적이고, 백신 모델을 이용함으로써 자연 노출은 사멸되거나 감쇠된 미생물 (백신)에 대한 제어된 노출로 교체된다. 백신은 병원체에 대한 항원 특이적 반응을 이끌어내는, 면역계 능력의 표지자인 생체 내 ( in vivo ) 면역 반응을 유발한다 (Albers et al. 2005). 백신 처리에 대한 반응은 방어적 생체 내 면역 반응성에 대한 영양의 효과에 관하여 고급 정보를 제공하는 광범위하게 사용되는 면역 기능의 마커이다. 인플루엔자 백신은 매년 이용되므로 접근이 용이한 모델이다. 이 모델은 대다수의 사람들에게 사용될 수 있어 적정한 수의 연구 참여자들의 모집을 용이하게 한다.
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 또는 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 역시 선천성 면역과는 다른, 주어진 병원성 제제에 대하여 특이적 면역 반응이라는 결과를 나타내는 적응 면역에 대한 작용을 일으키는지를 연구하였다.
이러한 목적을 위하여, 본 연구는 인플루엔자 백신 모델에 있어서 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 ( L. casei 431 ® , 수탁번호 ATCC55544로 American Type Culture Collection에 이미 기탁) 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 (BB-12 ® , 수탁번호 DSM15954로 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 이미 기탁)의 면역 조절 특성을 연구하기 위하여 설계되었다. 이들 균주 양자 모두는 Chr. Hansen A/S (Horsholm, Denmark)에서 시판중이다. 본 연구의 목적은 각각 위약 음료 또는 위약 캡슐과 비교하여 백신에 대한 특이적 면역 반응 및 일반적인 면역 반응에 관한, L. 카세이 431 ® 을 함유하는 우유계 음료 또는 BB-12 ® 를 함유하는 캡슐을 포함하는 보충제 섭취의 효과를 결정하기 위한 것이다.
본 발명의 결과는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이, L. casei 431 ® 를 함유하는 미니음료 또는 프로바이오틱 균주 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스, BB-12 ® 를 함유하는 캡슐을 포함한 보충제의 섭취가 인플루엔자 백신에 대한 생체 내 면역 반응을 증가시키는 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 본 연구에서 입증된 다중적이고 보완적인 효과자 메카니즘의 유도 및 강화는, 점막으로 전염되는 병원체들, 예컨대 인플루엔자 바이러스 등에 대한 최선의 방어와 연관되는 것으로 여겨진다. 대응하는 위약군들과 비교하여 L. 카세이 431 ® 및 BB-12 ® 제품군들에서 인플루엔자 특이적 항체 및 총항체 양자 모두가 증가하였으므로, 따라서 이러한 결과는 점막 면역 및 전신 면역 양자 모두에 있어서 프로바이오틱의 유익한 효과를 암시한다.
"면역 증강"이라는 용어는 대응하는 위약군과 비교하여 처리군에서 IgG, IgG1 및 IgG3와 같은 백신 특이적 항체의 농도가 현저히 증가하는 상황을 포함한다. 이러한 면역 증강은 점막 전이 바이러스, 예컨대 인플루엔자에 의하여 야기되는 질병들, 예컨대 감기 등을 예방 또는 치료하는데 영향을 미칠 수 있다.
관련 병원체들은 특히 박테리아 또는 바이러스이고; 예를 들어 후자 가운데서는 리노바이러스, 호흡기세포융합바이러스 (RSV), 및 믹소바이러스 (오르소믹소바이러스, 예컨대 인플루엔자 바이러스 (인플루엔자 타입 A, B 또는 C), 또는 파라믹소바이러스)를 언급할 수 있다.
본 발명의 구현이라는 맥락에서, 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 ( L. casei 431 ® , ATCC55544) 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 (BB-12 ® , DSM15954) 균주들은 단독으로 또는 다른 종의 다른 젖산 박테리아와 조합하여 사용될 수 있다. 좋기로는, 요거트 발효체, 이름하여 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus ) 및 스트렙토코쿠스 써모필러스 ( Streptococcus thermophilus )와 조합하여 사용될 수 있다.
이 균주들은 살아있거나 그렇지 않은 온전한 박테리아의 형태로 사용될 수 있고, 박테리아 용해질의 형태 도는 박테리아 일부분의 형태로도 사용될 수 있다.
좋기로는, 본 발명에 따른 용도의 맥락으로 제조된 조성물은 ml당 10 5 이상, 좋기로는 10 6 이상, 일반적으로는 1x10 8 과 1.5x10 9 사이의 세포들을 함유한다.
상기 균주들이 요거트 발효체들과 조합하여 사용될 때, 조성물은 또한 좋기로는 ml당 10 7 이상, 좋기로는 2x10 8 과 1x10 9 사이의 스트렙토코쿠스 써모필러스 세포, 및 5x10 5 이상, 좋기로는 4x10 6 과 2x10 7 사이의 락토바실러스 불가리쿠스 세포를 함유한다.
본 발명의 용도로 특히 가장 적합한 균주는 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이 ( L. casei 431 ® , ATCC55544) 및 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 (BB-12 ® , DSM15954) 균주이다. 이들 균주는 프로바이오틱 균주들이다.
본 발명에 따라 제조된 조성물들은 식품 또는 식품 보충제의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 낙농 제품, 특히 필요에 따라 다른 젖산 박테리아, 예를 들어 요거트 발효체와 조합하여, 적어도 상기 균주를 포함하는 발효 낙농 제품일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 조성물들은 감염으로 유래하는, 특히 바이러스로부터 유래하는 병리학적 질환들, 특히 독감의 예방 및 치료의 맥락으로 사용될 수 있다. 좋기로는, 최적의 효과를 얻기 위하여 이들은 1주 이상, 좋기로는 10일 이상의 기간 동안 10 7 이상, 좋기로는 10 8 이상, 일반적으로 10 9 과 10 12 사이의 L. 카세이 431 ® 또는 BB-12 ® 세포의 흡수에 해당하는 양으로 투여될 것이다.
프로바이오틱 세포의 투여는 백신과 동시적일 수 있지만, 백신의 투여 전, 예컨대 백신 처리를 기준으로 최소 1주, 2주 또는 3주 전에 프로바이오틱 세포를 투여하는 것이 좋다. 좋기로는 프로바이오틱은 꾸준히, 예컨대 1일 1회 또는 2회로 투여된다. 또한, 프로바이오틱은 백신 처리 후, 예컨대 백신 처리 후 1주, 2주, 3주 또는 4주의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 프로바이오틱의 투여는 백신 처리 2 주 전에 이루어지고 백신 처리 4주 후까지 계속된다.
그러므로, 본 발명은 전술한 균주들과 같은 프로바이오틱 박테리아가 백신과 짝을 이루어 전술한 투여량 및 시간 스케쥴대로 투여되는 치료 스케쥴을 제공한다.
따라서, 본 발명은 백신 처리 하루 전 내지 20일 전 사이 또는 백신 처리 약 10일 전에 투여되는 면역 증강 조성물로 사용하기 위한, 수탁번호 ATCC55544 또는 DSM15954의 프로바이오틱 박테리아 균주를 제공한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 6주에 걸쳐 투여되는 면역 증강 조성물로 사용하기 위한, 수탁번호 ATCC55544 또는 DSM15954의 프로바이오틱 박테리아 균주를 제공한다.
또 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 조성물이 우유계 음료 또는 캡슐인, 청구항 제1항 또는 제2항에 따른 용도의 수탁번호 ATCC55544 또는 DSM15954의 프로바이오틱 박테리아 균주를 제공한다.
본 발명은 이어지는 추가 설명에 힘입어 더욱 명확히 이해될 것이고, 이는 미생물 항원에 대한 특이적 반응을 강화하기 위한 락토바실러스 카세이 또는 비피도박테리움 균주의 특성을 설명하는 비제한적 실시예에 관한 것이다.
실시예 1 전반적 연구 설계 및 계획 설명 이것은 백신 처리 모델의 면역에 대한 두 가지 프로바이오틱 균주들의 효과를 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약 제어된 병행군 연구이다. 본 연구는 2주 길이 이상의 스크리닝기, 그 사이 백신 처리가 수행 (2주의 보충기 이후)되는 6주 길이의 보충기 및 어떠한 프로바이오틱 보충제도 없는 10주 길이의 추적 (follow-up) 기간을 포함한다. 효능 파라미터 분석을 위한 혈액 및 타액 시료는 보충기 바로 전 (제0일)과 보충기 6주 후 (제42일)에 수집되었다. 상기도감염/증상 (URTI)와 인플루엔자 유사 병증 (ILI) 및 감염에 대한 정보는 보충기가 진행되는 동안과 추적 10주 후에 수집되었다. 본 연구의 조건: 대상자들의 배치 총 221명의 대상자들이 본 연구에 참가하였으며 4 개의 치료군 중 하나에 무작위 배치되었다. 56명의 대상자들이 위약 음료군에, 59명이 L. 카세이 431 ® 음료군에, 52명이 위약 캡슐군에 배정되었고 54명은 BB-12 ® 캡슐군에 배정되었다. 총, 10명의 대상자는 연구 중 이탈하였고, 그 중 단 한 명만이 인플루엔자 백신을 접종받은 대상자였다. 4 가지 치료 부문은 프로바이오틱 균주 락토바실러스 파라카세이 아종 파라카세이, L. 카세이 431 ® (L. casei 431 ® )를 함유하는 음료 또는 위약 음료, 프로바이오틱 균주 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스, BB-12 ® (BB-12 ® )를 함유하는 캡슐 또는 위약 캡슐이었다. 위약 제품들은 활성 제품들과 유사하였지만, 활성 성분을 함유하지 않았고, 대상자들, 시험관들 및 현장 직원들은 단지 음료인지 캡슐인지만 알 뿐 대상자가 섭취하는 제품이 무엇인지는 알지 못하였다. 1.1.1. 스크리닝 (제-14일 ~ 제0일) 스크리닝시 잠재적인 각 대상자에게 본 연구의 목적과, 치료 및 평가에 관한 상세를 온전히 설명하였다. 본 연구에 대한 대상자의 적합성을 식이 습관 및 병력을 포함한 인구 통계학적 정보를 수집함으로써 평가하였다. 또한, 대상자들은 스크리닝 방문시로부터 본 연구의 마지막까지 섭취가 허용되지 않는 발효 제품들에 관하여 지도받았다. 스크리닝은 전화로 이루어질 수 있었다. 대상자들이 임상 센터에서 스크리닝되고 적합하다고 판정되면, V2 과정은 동일한 날에 수행되었다. 1.1.2. 무작위 방문 (2회차 방문 ( Visit 2, V2 ), 제0일, 베이스라인) V2 시점에, 대상자들은 사전 동의 서류에 서명하였다. 또한, 다음의 과정들 및 평가가 수행되었다: - 적합성 평가 (포함/배제 기준) - 병력 - 면역학적 마커 분석을 위한 금식 혈액 시료 - 면역 글로불린 분석을 위한 타액 시료 - 신장 및 체중, 바이탈 싸인 (심장 박동, 혈압, 체온 및 호흡) 및 감염 상태를 포함한 임상적 평가 - 병용 약물 기록 - 적합한 대상자들의 무작위 배치 - 보충기 중 필요한 모든 캡슐 또는 유통기한으로 인하여 배치에 있던 음료 일부의 분배 - 연구 도중 대상자들에게 섭취가 허용되지 않는 발효 제품들에 대한 지도 대상자들은 하기 정보를 수집하기 위한 다이어리를 제공받았다: - 감기 및 독감 유사 증상이 정의된 리스트에 근거한 발생, 지속 및 정도의 주간 기록 - 증상 다이어리에 기초하여 매 4주마다 인플루엔자 유사 병증 증상의 기록 - 연구 전 기간에 걸친 부작용 (AEs)의 기록 - 연구 전 기간에 걸친 조사 제품의 투여 누락 기록 대상자들은 제0일에 조사 제품의 섭취를 시작하였다. 1.1.3. 백신 처리 방문 (3회차 방문 ( Visit 3, V3 ), 제14일) V3 시점에, 대상자들은 2008/2009 유행성 바이러스 특이적 인플루엔자 백신 (Fluad ® , Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)을 근육 주사로 맞았다. 또한, 감염 상태에 대한 임상적 평가가 수행되었고 부작용이 평가되었다. 대상자들은 이후 4주간 조사 제품의 섭취를 계속하였다. 1.1.4. 평가 방문 (4회차 방문, ( Visit 4, V4 ), 제42일) V4 시점에, 하기 과정들이 수행되었다: - 면역학적 마커 분석을 위한 금식 혈액 시료 - 면역 글로불린 분석을 위한 타액 시료 - 신장 및 체중, 바이탈 싸인 (심장 박동, 혈압, 체온 및 호흡) 및 감염 상태를 포함한 임상적 평가 - 부작용 평가 - 병용 약물 기록 1.1.5. 추적 방문 (5회차 방문 ( Visit 5, V5 ), 제112일) V5 시점에, 하기 과정들이 수행되었다: - 신장 및 체중, 바이탈 싸인 (심장 박동, 혈압, 체온 및 호흡) 및 감염 상태를 포함한 임상적 평가 - 부작용 평가 - 병용 약물 기록 연구 프로토콜에 있어서, 이 마지막 방문은 감염 상태를 점검하고 상기도 감염/증상 (URTI) 및 인플루엔자 유사 병증 (ILI) 증상들에 관한 정보를 수집하기 위하여 포함되었다. 그러나, 상기 방문은 2009년 8월에 이루어졌고 이들 증상을 발견하는 확률이 낮았기 때문에 마지막 방문은 전화로 수행하고 대상자들에게 인플루엔자 증상, 부작용 및 병용 약물의 사용에 관하여 질문하기로 결정되었다. 실시예 2 투여 조정 2개의 군에 위약 음료 또는 조사 음료 중 어느 하나를 제공하였다 (표 1 참고). 음료는 100 ml당 대략 57 kcal였다. 연구 중 음료는 5 개의 서로 다른 배치에서 생산되고 Chr. Hansen으로부터 각 지점으로 보내졌다. 음료의 제한된 유통 기한으로 인하여 (제조일로부터 4주) 음료는 작은 배치로 대상자들에게 배분되었다. 2회차 방문시 대상자들은 음료 일부를 받고 새 음료 배치를 받기 위하여 연구 중 각 지점에 2회 반환하였다. 각 음료의 레이블은 하기 정보를 담고 있었다: 'IMPRESS-프로바이오틱을 함유하거나 함유하지 않는 산성화유', '오로지 임상적 이용 목적', 대상자 번호, '흔들어서 점심 식사와 함께 섭취', '110 mL 함유', 유통 기한, 보관 조건, 스폰서명, 시험 코드, 및 조사자명. 표 1. IMPRESS-연구용 음료의 상세 다른 2개의 군에는 경구 투여를 위한 위약 캡슐 또는 BB-12 ® 함유 캡슐을 제공하였다 (표 2 참고). 각 알루미늄 튜브의 레이블은 하기 정보를 담고 있었다: 'IMPRESS-프로바이오틱을 함유하거나 함유하지 않는 캡슐', '오로지 임상적 이용 목적', 대상자 번호, '1일 1 캡슐을 점심 식사와 함께 섭취', '30 캡슐', 유통 기한 (제조일로부터 24 개월), 보관 조건, '어린이의 손이 닿지 않는 곳에 둘 것', 스폰서명, 시험 코드, 및 조사자명. 표 2. IMPRESS-연구용 캡슐의 상세 대상자들은 사코 병원의 조사원들로부터 6주간 (42일) 점심 식사와 함께 1일 1 음료 또는 1일 1 캡슐을 섭취하라는 지도를 받았다. 음료병 및 캡슐 알루미늄 튜브는 맹검을 유지하기 위하여 코드화되었다. 적합 여부는 대상자의 투여 누락 다이어리 기록에 근거하였다. 본 연구에 사용된 인플루엔자 백신은 유통 기한 2009년 6월 10일인 Novartis Vaccines and Diagnostics사 (Siena, Italy)의 2008/2009 시즌 Fluad ® 백신이었다. 이 백신에 존재하는 균주들은 아래와 같다: A/Brisbane/59/2007 (H1N1)-유사 균주 (A/Brisbane/59/2007, IVR-148), A/Brisbane/10/2007/ (H3N2)-유사 균주 (A/Uruguay/716/2007, NYMCX-175C) 및 B/Florida/4/2006-유사 균주 (B/Florida/4/2006). 백신은 4℃ 병원 약제실에 보관되었다. 3회차 방문시, 모든 대상자들에게 0.5 mL 백신을 근육 내로 주사하였다. 치료군으로의 대상자 할당 방법 블록 사이즈 6인 연령 및 성별로 계층화된 순열 블록 무작위 할당을 생성하기 위하여 SAS 컴퓨터 프로그램을 사용하였다. 연령은 20~39세 및 40~60세로 계층화하였다. 연구 고유 ID 시스템에 따라 캡슐 제품을 레이블하기 위하여 무작위 목록은 스프림의 통계 팀에 의하여 스폰서에게 전해졌다. 음료는 분배 전에 무작위 목록에 따라 맹검 연구 코디네이터들에 의하여 레이블되었다. 각 대상자에 대한 무작위 번호의 할당은 각 연령-성별 계층 내에서 대상자의 나이 순서에 기초하였다. 모든 제품은 맹검이었다. 연구시 투여량 선택 본 연구를 위하여 최소 투여량으로 BB-12 ® 또는 L. 카세이 431 ® 1 x 10 9 CFU/일이 선택되었는데, 이것이 통상 면역 시스템을 조절하는데 필요한 일일량이기 때문이다 (Minelli and Benini 2008). 각 대상자에 대한 투여 시간 및 선택 대상자들은 음료 또는 캡슐을 점심 시간에 섭취하라고 조사원들로부터 지도받았다. 섭취 용법은 연구 제품의 포장에도 쓰여 있었다. 제품 섭취 시간이 점심 시간으로 선택된 것은, 이탈리아에서는 아침 식사시 낙농 제품을 섭취하는 것보다 점심 시간에 섭취하는 것이 더 흔하기 때문이다. 맹검 각각 위약 음료와 프로바이오틱 음료 및 위약 캡슐과 프로바이오틱 캡슐 간에는 외관, 모양, 냄새와 맛이 구별되지 않았다. 구체적인 제품 (활성 대 위약)의 식별은 대상자들, 지원 스태프 및 조사자들에게 비밀 유지되었다. 지점의 약국은 각 무작위 번호의 제품 식별력을 갖는 한 세트의 밀봉된 봉투를 접수하였고, 이것은 위급 상황에서는 열 수 있는 것이었다. 본 연구중 어떠한 코드 파기도 없었다. 효능 변수 효능 측정 평가 및 플로우 차트 연구 측정 및 방법에 대한 스케쥴링의 개관을 표 3에 제공한다. 표 3. IMPRESS-연구에 대한 연구 스케쥴 1 총IgG, IgA, IgM, IgG1, 및 IgG3; 백신 특이적 IgG, IgG1, 및 IgG3; IL-2, INF-γ 및 IL-10; NK 활성, CD4+ T 세포, 식세포 작용; 파상풍 특이적 IgG 분석용 2 총 타액 IgA, IgG 및 IgM, 또는 백신 특이적 타액 IgA, IgG 및 IgM 분석용 3 V2 및 V4 시점에서, 임상적 평가는 신장 및 체중, 바이탈 싸인 (심박수, 혈압, 체온 및 호흡율) 및 감염 상태를 포함하였고; V3 시점에서, 평가는 감염 상태에 대하여만 이루어졌다. 1차 효능 변수 항원 특이적 면역 반응 - 백신 특이적 IgG, IgG1 및 IgG3의 혈장 수준 - 백신 특이적 타액 IgG, IgA 및 IgM의 수준 2차 변수 적응 면역계의 반응 - 총IgG, IgA, IgM, IgG1 및 IgG3의 혈장 수준 - 총 타액 IgG, IgA 및 IgM의 수준 - 사이토카인 IFN-γ, Il-2 및 Il-10의 혈장 농도 선천적 면역계의 반응 - NK 세포 활성 - CD4 양성 T 림프구 - 식세포 작용 및 식세포 살해 상기도감염/증상 및 인플루엔자 유사 병증에 대한 효과 보충 기간 및 추적 기간 동안 대상자들에게 대상자들이 매주 증상 다이어리를 채움으로써 URTI 증상을 평가하고 매 4주마다 증상 다이어리를 기초로 하여 ILI를 평가하는 종이 다이어리를 제공하였다. 다이어리는 그 나라 언어로 제공되었다. 감염 상태 1회차 방문 내지 4회차 방문시 임상적 평가에 의하여 감염 상태가 평가되었다. 감염률 (예/아니오)은 열, 독감 유사 증상, 예컨대 인후 감염 및 전신 권태감 및/또는 신체 통증 여부로 평가함으로써 임상적으로 수립된다. 사용된 감염 상태 평가는 하기 나열된 7 가지 증상의 WHO 기준으로부터 발전시킨 것이다. 감염 기간은 일수로 기록되었다. 코, 인후 및 기관지에 대략 7일간 영향을 미치고 하기와 같이 특징화되는 감염을 바이러스 감염으로 정의하였다: - 근육통 (예/아니오) - 심한 두통 (예/아니오) - 심한 불쾌감 (예/아니오) - 비증식적 기침 (예/아니오) - 인후염 (예/아니오) - 비염 (예/아니오) 7일 이상 지속되는 증상이 있다면, 특정 증상 및 투여된 치료 타입을 기록하였다. 상기 나열된 항목에 각 "예" 응답인 경우, 다음의 세부 사항이 기록되었다: - 진단일 - 증상의 발병일 - 증상 정지일 - 섭취 약물 - 약물이 처방된 증상 생물학적 시료의 처리 및 실험 분석 방법 각 연구 목적을 위하여 측정된 파라미터들과 이용된 실험 방법의 개관을 하기 표 4에 제공한다. 표 4. IMPRESS 연구에 대한 효능 및 안전성 변수의 실험실 분석 실시예 3 생물학적 시료의 처리 혈액 샘플링 2회차 및 4회차 방문시 조사 팀 멤버가 전완 정맥의 정맥 천자에 의하여 EDTA (Becton Dickinson & Co., Rutherford, NJ)를 함유하는 3개의 진공채혈관 (7 mL)에 금식 혈액 시료를 수집하였다. 혈액 시료를 원심 분리 전 2 시간 동안 실온에 두었다. 혈장 수집 비응고 전혈 (EDTA)을 20℃, 1400 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 혈장 시료를 얻었다. 원심 분리 후, 분석 전까지 대상자당 2 개의 동결튜브에 2 mL의 혈장을 옮겨 즉시 -80℃로 동결시켰다. 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 분리 혈장 수집 후, 림프구 분리 배지 (Organon Teknica Corp., Durham, NC)의 연막 (buffy coat)로부터 PBMC를 분리하고, 인산 완충 염용액 (PBS)(Organon Teknica)으로 2회 세척하고 1900 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 얼음에서 작업하면서, 1 mL의 동결 용액 (85% FBS 보충 RPMI + 15% DMSO)을 PBMC 펠렛에 첨가하고 세포를 재현탁하였다. 마지막으로, 세포 현탁액을 2 mL 동결바이알로 옮겨 바이알당 10~5x10 6 생 PBMC의 양으로 (트립판 블루 배제로 측정) 사용 전까지 -80℃로 동결하였다. 타액 샘플링 타액은 침을 뱉는 (spitting) 방법에 따라 2회차 방문 및 4회차 방문시 샘플링되었다. 대상자는 수직 위치에서 구강 바닥에 모인 타액을 멸균 시험관으로 뱉으라고 요구받았다. 대상자들은 5 분간 매 60 초마다 타액을 뱉었고 타액을 담은 튜브는 분석 전까지 -80℃에서 즉시 동결되었다. 타액 시료는 밤새 금식한 후 수집되었다. 실시예 4 실험실 분석 방법 모든 실험실 시료들은 하기 간단한 설명에 따라 시판 키트를 이용하여 2회 반복으로 분석되었다. 혈장 내 백신 특이적 항체 인플루엔자 A IgG ELISA 키트 (IBL-America, Inc., MN, USA)를 제공한 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 혈장 내 백신 특이적 IgG를 분석하였다. 이 분석을 제공하는 마이크로타이터 플레이트는 미리 인플루엔자 A 항원으로 코팅되었고, 시료 중의 IgG 항체와 고정화된 항원간의 결합은 인간 IgG에 특이적인, 효소가 결합된 2차 항체에 의하여 검출되었다. 기질 (테트라메틸벤지딘, TMB)의 첨가는 청색의 발현을 유도하였다. 기질 반응 후, 중지 용액을 첨가하였고, 이것은 색을 황색으로 바꾸었으며 450 nm에서 광분석기로 광학 밀도 (OD)를 60 분 내에 측정하였다. 발현된 색의 세기는 시료 중의 IgG 특이적 항체의 양과 직접적으로 비례한다. 시료 중의 IgG의 양은 표준 곡선을 이용하여 결정되었다. 본 분석의 인플루엔자 A IgG의 검출 한도는 1.09 U/mL이었다. 전술한 대로 인플루엔자 A IgG ELISA 키트 (IBL-America, Inc., MN, USA)를 제공한 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 혈장 내 백신 특이적 IgG1 및 IgG3를 분석하였으나, 하기의 변형을 가하였다: 고정화 항원에 결합되어 있는 시료 중의 특이적 항체는 1:2000으로 희석된 인간 IgG1 또는 IgG3 특이적 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 결합된 2차 항체 (Alpha Diagnostic Intl. Inc., Texas, USA)로 검출되었다. 기질 반응 후, 중지 용액을 첨가하였고, 450 nm에서 광분석기로 OD를 60 분 내에 측정하였다. 발현된 색의 세기는 검출된 IgG 특이적 항체의 양과 직접적으로 비례한다. 시료 중의 IgG1 또는 IgG3의 양은 표준 곡선을 이용하여 결정되었다. 본 분석의 인플루엔자 A IgG의 검출 한도는 1.09 U/mL이었다. 타액 내 백신 특이적 항체 인플루엔자 A IgG/IgA/IgM ELISA 키트 (IBL-America, Inc., MN, USA)를 제공한 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 혈장 내 백신 특이적 IgG, IgA 및 IgM을 분석하였다. 이 분석을 제공하는 마이크로타이터 플레이트는 미리 인플루엔자 A 항원으로 코팅되었다. 고정화된 항원에 결합된 시료 중의 특이적 항체는 인간 IgG, IgA 및 IgM에 특이적인, 효소가 결합된 2차 항체에 의하여 검출되었다. 기질 반응 후, 중지 용액 첨가 후에 60 분 내에 450 nm에서 광분석기로 OD를 측정하였다. 발현된 색의 세기는 검출된 IgG, IgA 및 IgM 특이적 항체의 양과 비례한다. 각 시료 중의 특이적 항체의 양은 표준 곡선을 이용하여 직접적으로 결정되었다. 본 분석의 인플루엔자 A IgG, IgA 및 IgM의 검출 한도는 각각 1.09 U/mL, 1.29 U/mL 및 1.17 U/mL이었다. 혈장 내 파상풍 특이적 IgG 파상풍 항체 ELISA 키트 (Wuhan Institute of Biologic Product, Wuhan, China)를 제공하는 제조사의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 혈장 내 파상풍 특이적 IgG를 분석하였다. 이 키트에 제공되는 마이크로타이터 플레이트는 파상풍 특이적 IgG에 특이적인 항체로 미리 코팅되었다. 그 후, 표준 또는 시료를 적당한 마이크로타이터 플레이트 웰에 첨가하였다. 파상풍 특이적 IgG에 특이적인 비오틴 결합된 폴리클로날 항체 제제와 HRP에 결합된 애비딘 역시 각 마이크로플레이트 웰에 첨가하고 반응시켰다. 그 후, 각 웰에 TMB 기질 용액을 첨가하고, 파상풍 특이적 IgG, 비오틴 결합 항체 및 효소 결합 애비딘을 함유하는 웰은 색 변화를 나타내었다. 황산을 첨가하여 효소-기질 반응을 종결시키고 색 변화를 450 nm에서 광분석기로 측정하였다. 표준 곡선과 시료의 OD를 비교하여 시료 중의 파상풍 특이적 IgG의 농도를 결정하였다. 본 분석에서 파상풍 특이적 IgG의 검출 범위는 0.1~40 IU/L였고, 검출의 하한은 0.1 IU/L였다. 혈장 내 총항체 휴먼 이뮤노글로불린 ELISA 키트 (Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, USA)를 제공하는 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 혈장 IgA, IgG, IgM, IgG1 및 IgG3의 총농도를 분석하였다. ELISA 방법을 이용한 이들 항체들에 대하여, 중지 용액은 청색으로부터 황색으로 색을 변화시키고, 색의 세기는 광분석기를 이용하여 450 nm에서 측정되었다. 시료 중의 항체 농도를 측정하기 위하여, 각 ELISA 키트는 검량 표준 한 세트를 포함하였다. 검량 표준은 시료와 마찬가지로 동시에 2회 반복으로 분석되었고 그 결과 OD 대 항체 농도의 표준 곡선을 얻었다. 그 후, 시료 중의 항체 농도를 표준 곡선과 시료의 OD를 비교함으로써 결정하였다. IgG1 및 IgG3의 검출 한도는 0.01 mg/mL였다. IgG, IgA 및 IgM 분석의 민감도는 각각 1.0 mg/mL, 0.01 mg/mL, 및 0.1 mg/mL였다. 타액 내 총항체 휴먼 세크레토리 이뮤노글루불린 A, SIgA ELISA 키트 (USCNLIFE TM Wuhan, CHINA)를 제공하는 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 타액 SIgA의 총농도를 분석하였다. 이 키트에 제공되는 마이크로타이터 플레이트는 SIgA에 특이적인 항체로 미리 코팅되었다. 그 후, 적절한 마이크로타이터 플레이트 웰에 표준 또는 시료들이 첨가되었다. SIgA 특이적 비오틴 결합된 폴리클로날 항체 제제 및 HRP 결합된 애비딘 역시 각 마이크로플레이트 웰에 첨가하고 반응시켰다. 그 후, 각 웰에 TMB 기질 용액을 첨가하고, SIgG, 비오틴 결합 항체 및 효소 결합 애비딘을 함유하는 웰은 색 변화를 나타내었다. 황산을 첨가하여 효소-기질 반응을 종결시키고 색 변화를 450 nm에서 광분석기로 측정하였다. 표준 곡선과 시료의 OD를 비교하여 시료 중의 SIgG의 농도를 결정하였다. 본 분석에서 SIgG의 검출 한도는 통상 3.9 ng/mL였고, 검출 하한은 0으로부터 차별화될 수 있는 최저 단백질 농도로 정의되었다. 퀀티터티브 휴먼 IgG ELISA/ 퀀티터티브 휴먼 IgM ELISA 키트 (ZeptoMetrix Corporation, NY, USA)를 제공하는 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 타액 IgG 또는 IgM의 총농도를 분석하였다. 최적의 검출 농도를 얻기 위하여 시료의 농도를 조정하였다. 이들 분석을 제공하는 마이크로타이터 플레이트는 인간 IgG 또는 IgM에 대한 폴리클로날 항체로 미리 코팅되었다. 적절한 마이크로타이터 플레이트에 2회 반복하여 표준 또는 시료를 첨가하고 반응시켰다. 각 표준 및 시료 웰에 HRP와 결합된 검출 항체를 피펫팅하였다. 반응 후, TMB 기질 용액을 각 웰에 첨가하고 인간 IgG 또는 IgM을 함유하는 웰에서는 청색이 발현되었다. 황산을 첨가하여 효소-기질 반응을 종결시켰고, 청색으로부터 황색으로의 색 변화가 일어났다. 색 변화를 450 nm에서 광분석기로 측정하였다. 표준 곡선과 시료의 OD를 비교하여 시료 중의 IgG 또는 IgM의 농도를 결정하였다. 본 분석에서 IgG alc IgM의 검출 한도는 통상 3.9 ng/mL였고, 검출 하한은 0으로부터 차별화될 수 있는 최저 단백질 농도로 정의되었다. 혈장 내 Il -2, INF -γ 및 IL -10 휴먼 Il-2/INF-γ/IL-10 이뮤노어세이 키트 (Quantikine ® R&D Systems, Inc., MN, USA)을 제공하는 제조자의 설명에 따라 ELISA 기술을 이용하여 사이토카인의 혈장 농도를 분석하였다. 이들 분석을 제공하는 마이크로타이터 플레이트는 IL-2, INF-γ 또는 IL-10 특이적인 모노클로날 항체로 미리 코팅되었다. 표준 및 시료들을 2회 반복으로 웰로 피펫팅하고 존재하는 사이토카인은 고정화된 항체에 결합하였다. 결합을 이루지 못한 물질들을 씻어낸 후, IL-2, INF-γ 또는 IL-10 특이적인, 효소와 연결된 폴리클로날 항체를 각 웰에 첨가하였다. 미결합 항체-효소 제제를 제거하기 위하여 세척한 후, 각 웰에 기질 용액을 첨가하자 최초 단계에서 결합된 사이토카인의 양과 비례하여 색이 발현되었다. 색 발현을 중지시키고 색의 세기를 450 nm의 파장에서 광분석기로 측정하였다. 시료 중의 사이토카인 농도는 표준 곡선과 시료의 OD를 비교함으로써 결정되었다. 본 분석에서 IL-2, INF-γ 및 IL-10의 검출 한도는 통상적으로 각각 7.0, 8.0 및 3.9 pg/mL 미만이었다. 식세포 작용 및 식세포 살해 Saresella와 그 동료들에 의하여 종래 설명된 방법 (1997)에 따라 식세포 작용 및 살해를 측정하였다. 식세포작용 및 살해 분석을 위하여 전혈 백혈구 (CD13+ 세포)를 옵소닌화 플루오레세인 이소티오시안산염-표지된 (FITC-labeled) C. 알비칸즈 ( C. Albicans ) 출아포자와 반응시켰다. 살아있는 FITC-표지된 C. 알비칸즈 출아포자 단독을 대조군으로 이용하였다. 식세포 작용 및 살해를 식세포 (CD13+ 세포)를 통문시켜 (gating) 식세포 연관 녹색 형광 세포의 백분율을 계산함으로써 결정하였다. 이 방법은 에티디움 브로마이드 (EtBr) 염색 후 FITC-표지된 C. 알비칸즈 출아포자가 녹색 형광을 잃고 적색 형광을 취득한다는 사실에 기초하는 것이다. 그러므로, 포식된 C. 알비칸즈 출아포자는 녹색으로 남아있는 반면, 부착되고 포식되지 않은 출아포자들은 적색 염색된다. 식세포 작용 및 PMN 살해의 백분율은 녹색- 및 녹색 및 적색 이중 표지된 수와 동일하다. 식세포 작용 및 살해의 세포 분석은 488 nm에서 작동하는 공기 냉각 15 mW 아르곤 이온 레이저를 구비한 Coulter EPICS XL 유세포 분석기를 이용하여 수행되었다. 다종 파라미터 데이터를 대략 10,000 건의 등록에 의하여 수집하였고 Coulter System II 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. FITC의 녹색 형광은 525 nm 대역 필터로 측정되었고, EtBr의 적색 형광은 620 nm 대역 필터를 통하여 측정되었다. 4 개의 상이한 군이 동정되었다: FITC-표지된 C. 알비칸즈 출아포자가 부착된 식세포 (% 부착), FITC-표지된 C. 알비칸즈 출아포자가 포식되고 부착된 식세포 (% 부착 및 포식), FITC-표지된 C. 알비칸즈 출아포자 포식되기만 한 식세포 (% 포식), 및 어떠한 상호 작용도 하지 않은 식세포 (% 비상호작용). 자연 살해 세포 활성 50 mL의 미리 데워둔 (37℃) 완전 배지로 50 mL의 시험관을 채움으로써 자연 살해 (NK) 세포 평가를 개시하였다. 37℃ 수조에서 신속 교반하여 K562 표적 세포 바이알 하나를 신속히 해동하였다. 얼음이 녹으면, 바이알을 수조로부터 빼내어 세포 현탁액을 따뜻한 완전 배지를 함유하는 튜브에 옮겨 약하게 혼합하였다. 실온, 1500 rpm에서 5 분간 세포 현택액을 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 세포 페렛을 1 mL의 완전 배지에 재현탁하였다. 트립판 블루 배제 시험을 통하여 세포 수를 측정하고 완전 배지 내에 1x10 5 /mL로 세포 농도를 조정하였다. 효과자 세포들을 해동하고 표적 세포와 같이 준비하였다. 트립판 블루 배제 시험을 통하여 세포 수를 측정하고 완전 배지 내에 1x10 5 /mL로 세포 농도를 조정하였다. "고(高)조절" 시료용으로, 30 μl IL-2 (200 U/mL)를 효과자 세포 현탁액에 첨가하였다. 효과자 세포를 최종 부피 200 μl 중에 K562 표적 세포와 25:1 E:T 비율로 혼합하였다. 표적 세포 단독을 대조군으로 사용하였다. 모든 튜브를 볼텍싱하고 1500 rpm에서 3 분간 우너심 분리하였다. 그 후, 습윤 CO 2 배양기에서 120 분간 튜브를 배양하였다. 튜브당 50 μl의 DNA 염색 용액을 첨가하고, 볼텍싱하여 5 분간 얼음에서 반응시켰다. 마지막으로, 250 μl의 PBS를 첨가하고 유세포 분석기로 시료를 분석하였다. NK 세포 활성은 25:1의 E:T 비에서 죽은 표적 세포의 %로 산술되었다. CD4 양성 T 림프구 CD4+ T 세포를, 인간 CD4 - 성숙 T 보조 세포의 하위 집단인 흉선 세포의 대다수 및 낮은 수준으로는 단핵구에 의하여 발현되는 59 kDa의 세포 표면 수용체와 반응하는 모노클로날 항체 (피코에리트린 항-인간 CD4; eBioscience™, San Diego, USA)를 이용, 유세포 분석 기술로 분석하였다. 이 항체는 일반적인 인간 PBMC의 유세포 분석으로 미리 적정되고 시험되었다. 이것은 총염색 부피 100 μl 중 백만개의 세포당 5 μl (0.125 μg)로 사용되었다. 실시예 5 SAS 패키지 버전 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 통계 분석이 수행되었다. 다중 비교 ( Multiple Comparisons , MC ) 1차 효능 변수는 홈-본페로니 (Holm-Bonferroni) 방법 (Holm 1979)에 의한 다중성 (multiplicity)을 위하여 조정되었다. 연관 쌍들만이 통계학적으로 비교되었다: 각 파라미터에 대한 두 가지 비교를 제공하면서 L. 카세이 431 ® 음료가 위약 음료와 비교되고 BB-12 ® 캡슐은 위약 캡슐과 비교되었다. 1차 효능 엔드포인트 (혈장 내 특이적 IgG, IgG1 및 IgG3 및 타액 내 특이적 IgA, IgG 및 IgM)가 있었는바, 1차 효능 평가용 비교수는 12개가 되었다. Holm-Bonferroni 방법에 있어서, 12 개의 비교는 우선 비조정으로 수행되었고 p-값은 최소부터 최대로 순서화되었다. 최소 p-값은 알파 adj =5%/12 (알파/비교 수) = 0.004와 동등한 조정된 유의미 수준과 비교되었다. 최소 p-값이 알파 adj 보다 크면 모든 비교들은 유의미하지 않다고 결론지어졌다. 최소 p-값이 알파 adj 미만이면 해당 비교는 5% 수준으로 통계학적으로 유의미하다는 결론이었다. 다음 단계에서, 전술한 것과 같은 방법을 이용하여 두번째로 낮은 p-값이 알파 adj =5%11과 비교되었다. 이 과정을 알파 adj 보다 큰 p-값이 나올 때까지 계속하였고 나머지 비교들은 유의미하지 않다고 결론지었다. 2차 목적 엔드포인트에 대한 통계적 분석은 다중 시험으로 조정되지 않았다. 효능 분석 1차 목적 분석 통계학적으로 분석된 1차 효능 변수는 베이스라인과의 차이, 즉 제42일과 제0일의 평가 간 차이였다. 분산 변량 분석 (Univariate analysis of variance)이 연구 효과를 식별하기 위하여 사용되었다. 군들 간 통계적 분석은 또한 베이스라인 내에서, 제42일 내 및 평균 배수 증가 (Mean Fold Increase, MFI)에 대하여 수행되었다. MFI는 (제42일-제0일)/제0일로 정의되었다. 게다가, 베이스라인으로부터 제42일까지 특정 항체의 2 배 이상의 증가는 실질적인 것으로 사료, 상이함 (제42일-제0일)≥2 x 제0일 로 정의되었고 (Stephanova et al. 2002, Kurstak 1985), 백신 특이적 항체에 있어서 실질적 증가가 이루어진 각 군의 대상자 수가 산술되었다. 동종 제품 내의 군들에서만, 즉 L. 카세이 431 ® 음료 대 위약 음료 및 BB-12 ® 캡슐 대 위약 캡슐에서 비교가 이루어졌다. 모든 ANOVA 모델은 처리, 성별 및 연령 조건을 포함한 베이스라인 모델에서의 분석을 제외하고는 처리, 성별, 연령 및 베이스라인의 조건을 포함하였다. 군들간 BMI가 현저히 상이하였기 때문에, ANOVA 모델에서 추가적인 공변량으로서 BMI를 이용하여 사후 분석 (post-hoc analysis)를 수행하였다. 기하 평균 평가가 산술되었고 자세하게 보고되었다. 기하 평균은 로그값의 산술 평균의 반로그를 취하여 계산하였다. 제2 목적 분석 이 분석은 제1목적에 대하여 개괄된 동일한 방법론적 전략에 따랐다. 데이터 요약 및 기술적 통계 인구 통계학적 및 베이스라인 변수와 같은 연속 변수뿐 아니라 면역 글로불린 값도 평균, 표준편차 (SD), 중앙값, 95% 신뢰 구간 (CI), 5% 및 95%-분위수, 및 최소 및 최대값을 이용한 처리군에 의하여 요약되었다. 성별 및 그 항체값에 있어서 실질적 증가를 달성한 대상자 비율과 같은 범주적 변수들에 대한 요약은 각 처리군 내에서의 계수 및 빈도에 의존적이었다. 분포 가정 인증 ( Distributional Assumptions Verifications ) 지속적인 결과 측정을 위한 핵심은 데이터의 정규성 (normality)을 결정하는데 있었다 (Gaussian distribution). 이것은 Wilk 및 Shapiro (1965) 기법뿐 아니라 QQ 플롯을 이용하여 평가되었다. 일부 파라미터에 대하여는, 정규 분포 가정은 위배되었다. 이들 경우에 있어서, 비모수적 방법, 즉 Mann-Whitney 시험도 대안 분석으로서 수행되었다. 이들 대안 분석의 결과는 파라미터 분석 결과와 일치하였다. 무작위 계획의 검증 이들 분석의 목표는 연구군들 중 연령, 성별 및 베이스라인 면역 글로불린 값과 같은 "공지의" 예측성 공변량의 관점에서 유의미한 차이 (불균형)이 존재하는지를 결정하기 위한 것이었다. 이들 분석은 관련군 (즉, L. 카세이 431 ® 음료 대 위약 음료 및 BB-12 ® 캡슐 대 위약 캡슐)내에서 평균값의 항등을 평가하기 위한 ANOVA 또는 비모수적 시험에 의존한다. 데이터 분석 설정 전체적으로, ITT 분석 세트에 211 명의 대상자들에 대한 데이터가, PP 분석 세트에 196 명의 대상자들에 대한 데이터가 포함되었다. ITT 분석의 결과만을 본 명세서에 보고하였다. 인구 통계학적 및 기타 베이스라인 특성 ITT 분석 세트의 대상자들에 대한 인구 통계학적 및 베이스라인 특성이 표에 나타나 있다. 전체적인 평균 (SD) 연령은 33.2세 (13.1세)였고 19세 내지 60세까지의 범위였다. 전체적으로, 남성보다는 여성이 많았다: 118 명 (55.9%) 여성, 및 93 명 (44.1%) 남성. 표 5. IMPRESS-연구 (ITT 분석 세트)의 대상자들의 인구 통계적 및 베이스라인 특성 효능 결과 1차 목적 혈장 내 백신 특이적 IgG , IgG1 및 IgG3 베이스라인으로부터의 변화에 대한 1차 분석에서 프로바이오틱과 위약군 간의 현저한 차이가 3 가지 모든 파라미터들에 대하여 입증되었다. 베이스라인과 제42일간의 차이를 비교하였을 때, 위약군에서보다 BB-12 ® 군의 베이스라인으로부터 제42일에 이르는 백신 특이적 항체 값이 현저히 많이 증가하였다 (모든 파라미터들에 대하여 p<0.001). 유사하게, L. 카세이 431 ® 군의 특이적 항체 값이 대응 윙약군에서보다 현저히 많이 증가하였다 (IgG에 대하여 p=0.010이고, IgG1 및 IgG3에 대하여 p<0.001). 추가 분석은 백신 특이적 IgG, IgG1 및 IgG3의 값이 모든 연구군에 걸쳐 유사하다는 것을 보여주었다. 제42일 값에 대한 횡단적 분석은 BB-12 ® 군 대 위약군 및 L. 카세이 431 ® 군 대 위약군에 대하여 3 가지 모든 파라미터의 현저히 높은 수치를 보여주었다 (3 가지 모든 파라미터에 대하여 p<0.001)(도 1, 도 2 및 도 3). IgG, IgG1 및 IgG3에 대한 인플루엔자 백신 특이적 값 역시 평균 배수 증가 (MFI)에 대하여 평가되었다. BB-12 ® 군 대 위약군의 IgG (p=0.016), BB-12 ® 군 대 위약군의 IgG1과 IgG3 및 L. 카세이 431 ® 군 대 위약군의 IgG1과 IgG3에 대한 MFI에 있어서 유의미한 군 차이가 관찰되었다 (모두 p<0.001)(표 6). 표 6. 연구군에 의한 인플루엔자 백신 특이적 혈장 IgG, IgG1 및 IgG3의 평균 배수 증가 백신 특이적 IgG, IgG1 및 IgG3에 있어서 2 배 이상의 평균 배수 증가가 실질적 증가로 정의되었고, 실질적 증가를 달성한 대상자들의 비율이 각 군에 대하여 산술되었다. 연관 위약군과 비교하여 특이적 항체 값에 있어 실질적 증가를 보인 대상자들의 수가 각 프로바이오틱군에서 현저히 컸다 (표 7). 표 7. 연구군에 의하여 IgG, IgG1 및 IgG3에 있어서 실질적 증가를 나타낸 대상자들의 수 타액 내 백신 특이적 IgG , IgA 및 IgM 베이스라인으로부터 변화에 관한 군들간 차이에 대한 1차 분석은 타액 IgG, IgA 또는 IgM에 대하여는 아무런 유의미한 차이를 보여주지 못하였다. 그러나, IgA에 대하여는 BB-12 ® 캡슐군과 대응 위약군 사이에서 유의미한 차이를 보여주는 듯한 경향이 나타났다 (p=0.084 조정). 베이스라인에서 위약군과 비교하여, BB-12 ® 군의 IgG 및 IgA의 베이스라인은 군들간 유사했던 반면 IgM 값은 다소 높았다 (p=0.007)(도 4, 도 5 및 도 6). 제42일 값에 대한 횡단적 분석은 위약군에 비하여 BB-12 ® 군에서 더 높은 IgA 값을 (p=0.014), 위약군에 비하여 L. 카세이 431 ® 군에서 더 높은 IgA 값을 (p=0.047) 보여주었다 (도 4, 도 5 및 도 6). 유사하게, 평균 배수 증가는 연관 위약군에 비하여 각 프로바이오틱군의 백신 특이적 IgA의 MFI가 더 높음을 드러내었다 (표 8). 표 8. 연구군에 의한 인플루엔자 백신 특이적 타액 IgA, IgG 및 IgM의 평균 배수 증가 |
