酸乳是在牛乳等中加入乳酸菌或酵母使之发酵制造的食品，近年来作为 健康食品，其消费一直呈增加趋势。
酸乳根据制造方法的不同，一般大致分为静置型酸乳和搅拌型酸乳。静 置型酸乳是凝固状的酸乳，是在原料乳中加入乳酸菌，填充到容器中后使之 发酵得到的酸乳。静置型酸乳包括只有原料乳未加入添加剂的淡酸乳，以及 加入砂糖和香料等用明胶或琼脂凝固成布丁状的硬型酸乳等。另一方面，搅 拌型酸乳是流动状或液体状的酸乳，是在罐内对凝固的酸乳进行搅拌，呈流 动状后填充到容器中得到的酸乳。搅拌型酸乳包括加入了果肉的软型酸乳， 以及捣碎成液状得到的饮料酸乳等。
已知在制造这些酸乳时，组合使用适当的乳酸菌与仅使用单一的乳酸菌 相比，乳的凝固时间很短即可。这是利用乳酸菌的共生现象。因此，以前组 合多种乳酸菌制造酸乳时，使用的乳酸菌的组合是选择相互存在共生关系， 即互相利用关系的菌。例如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgicus)和嗜热 链球菌(Streptococcus thermophilus)是最常使用的乳酸菌组合，其理由是这 两种菌相互存在共生关系。下面，以使用这些菌制造酸乳的场合为例，具体 说明乳酸菌的共生关系。
如果将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌添加到牛乳中，在发酵的初期阶段 可见嗜热链球菌显著增殖。但是，随着生成乳酸引起酸度上升，pH降低至5.5～ 5.0，嗜热链球菌的繁殖变得缓慢。另一方面，在低氧条件下，由于存在嗜热 链球菌由甲酸或牛乳中含有的尿素生成的二氧化碳，保加利亚乳杆菌的繁殖 得到促进。而且，保加利亚乳杆菌在发酵过程中分解蛋白质生成大量肽和游 离氨基酸。这些游离氨基酸中，缬氨酸、组氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和亮氨酸 等作为促进活性已减弱的嗜热链球菌繁殖的物质发挥作用，从而使嗜热链球 菌的发酵能力恢复。如上所述，创造出乳酸菌互助的主要因素，互相促进发 酵的关系是共生关系。
另外，双歧杆菌属(bifidobacterium)的菌群和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)由于均为肠内细菌，繁殖环境一致，因此大多混合使用。但是， 以前即使对于这些细菌，必须条件也是选择存在互助关系或互不妨碍繁殖关 系的细菌。
如上所述，以前制造酸乳时，关于使用的乳酸菌，选择相互存在共生关 系的菌是一种常识，而且没有见到使用非共生关系的乳酸菌制造酸乳的实例。
本发明的目的在于提供一种抛开以前的常识利用新型乳酸菌组合得到的 酸乳及其制造方法。
另外，本发明的目的在于提供一种风味优良且兼具整肠作用的酸乳及其 制造方法。
本发明的其它目的和优点可以通过下述记载得知。

本发明涉及一种酸乳，其特征在于，含有乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris) 以及双歧杆菌属(bifidobacterium)。
双歧杆菌属(bifidobacterium)可以为动物双歧杆菌(B.animalis)。
另外，本发明还涉及一种酸乳的制造方法，其特征在于，在使用乳酸菌 制造酸乳的方法中，该乳酸菌是包括乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)以及 双歧杆菌属(bifidobacterium)的混合菌。
双歧杆菌属可以是选自双歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B. longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌(B.Breve)和动物双歧杆 菌(B.animalis)的至少1种。
附图说明
图1表示本发明酸乳的制造工序的一个实例。
图2表示在牛乳中仅加入A菌得到的酸乳相对于时间的pH变化的一个 实例。
图3表示在牛乳中仅加入B菌群得到的酸乳相对于时间的pH变化的一 个实例。
图4表示本发明酸乳相对于时间的pH变化的一个实例。
图5表示利用PARD对分离株进行菌株识别的结果。
图6表示采用PCR法鉴定菌种的结果。
图中，1、6表示Y50178的分离株，2、7表示Y50179的分离株，3、8 表示Y50180的分离株，4、11表示Y50181的分离株，5表示乳酸乳球菌乳 亚种，9表示乳酸乳球菌乳脂亚种，10表示动物双歧杆菌。

以下参照附图详细说明本发明的实施方式。
本发明酸乳的特征在于，含有乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种 以及双歧杆菌属。
另外，本发明酸乳的制造方法的特征在于，通过添加乳酸菌使蛋白质发 酵的酸乳制造方法中，该乳酸菌是包括乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂 亚种以及双歧杆菌属的混合菌。
图1表示本发明酸乳的制造工序的一个实例。图中，乳酸发酵之前混合、 匀化、杀菌和冷却的各步骤可以按照常规方法进行。
首先，准备作为酸乳原料的蛋白质。作为蛋白质，除来源于牛乳、山羊 乳、羊乳、加工乳、脱脂乳、脱脂乳粉、全脂乳粉、酪蛋白类和乳清蛋白等 的乳蛋白等以外，也可以使用植物性蛋白质等。使用脱脂乳粉作为蛋白质时， 作为水分，可以加入水。另外，作为副原料，也可以在原料中添加砂糖等甜 味剂、鲜奶油、果实、果汁、琼脂、明胶、油脂、香料、色素或稳定剂等。
称量给定量的所用原料和副原料等后，将其混合。这时，也可以对混合 物进行加热。例如可以在80℃～85℃加热15分钟～20分钟。接着，进行匀 化处理后，进行杀菌处理。杀菌处理例如可以通过在70℃～90℃加热保持5 分钟～30分钟进行。然后，冷却至下述发酵温度。将经由这些混合、匀化、 杀菌和冷却步骤得到的物质称为混合物。
在本发明中，作为乳酸菌发酵剂，其特征在于，使用包括乳酸乳球菌乳 亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种以及双歧杆菌属的混合菌。
乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种均为乳酸菌，由于产酸能力 低，以前一直认为不适于酸度必须快速上升的酸乳制造。
另外，已知乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种，以及在酸乳的制 造中一般使用的双歧杆菌属相互不存在共生关系。也就是，将这些菌混合用 于发酵时，以前一直认为双歧杆菌属几乎不发酵。认为其理由如下。
双歧杆菌属虽然能够在强酸性条件下繁殖，但是呈专性厌氧性，因而在 牛乳那样氧含量多的环境下，其繁殖受到抑制。因此，一般情况下可以说为 了使用双歧杆菌属进行发酵，添加低聚糖等促进繁殖的物质是不可缺少的。 另一方面，乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种具有能够在有氧条件下 繁殖，但在强酸性中较弱的性质。
如上所述，对于双歧杆菌属，以及乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂 亚种，各自适合的繁殖环境不同。因此，一直认为将这些菌混合时，在没有 促进繁殖的物质，繁殖环境不同的乳酸菌中，不会存在双歧杆菌属发酵的任 何蛛丝马迹，其繁殖能力逐渐减弱。
如上所述，乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种与双歧杆菌属相互 不存在共生关系，是在以前的酸乳制造方法中没有使用过的组合。但是，本 发明人进行悉心研究，结果发现通过将这些菌混合使用，能够得到本发明的 酸乳。
而且，本发明人还发现通过将发酵温度设定成对双歧杆菌属最为合适的 温度范围，能够得到本发明的酸乳。对双歧杆菌属最为合适的温度范围(30 ℃～40℃)与对于乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的最适温度范围 (20℃～30℃)相比，在高温范围。
因而，本发明的酸乳是在下述状态下进行制造的，即无论对双歧杆菌属， 还是对乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种均不是一般认为优选的繁殖 条件。但是，本发明人利用被认为是由于微生物本来具有的环境适应能力附 属产生的效果，发明了该酸乳。
作为本发明中使用的双歧杆菌属的具体实例，例如双歧双歧杆菌(B. bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆 菌(B.Breve)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、 假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、齿双歧杆菌(B.dentium)、角双歧 杆菌(B.angulatum)、高卢双歧杆菌(B.gallicum)、异形双歧杆菌(B. Inopinatum)、居齿双歧杆菌(B.Denticolens)、假长双歧杆菌(B. pseudolongum)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、豚双歧杆菌(B.choerinum)、动 物双歧杆菌(B.animalis)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、牛双歧杆菌(B. boum)、大双歧杆菌(B.magunum)、小鸡双歧杆菌(B.pullorum)、猪双歧 杆菌(B.suis)、鸡胚双歧杆菌(B.gallinarum)、反刍双歧杆菌(B.ruminantium)、 瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、波伦亚双歧杆菌(B.saeculare)、最小双歧杆 菌(B.minimum)、纤细双歧杆菌(B.subtile)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、 星状双歧杆菌(B.asteroides)和蜜蜂双歧杆菌(B.indicum)等。其中，优选 双歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B. infantis)、短双歧杆菌(B.Breve)或动物双歧杆菌(B.animalis)。双歧杆菌 属可以选择1种使用，也可以组合使用2种以上。
以下，为了简便，将双歧杆菌称为A菌，将乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳 球菌乳脂亚种称为B菌群。
向上述经由混合、匀化、杀菌和冷却各步骤的原料中，添加A菌和B菌 群。A菌和B菌群的比优选为A菌∶B菌群＝1∶1～1∶2。具体而言，相对于混 合物，优选添加A菌1％～2％，添加B菌群2％。另外，A菌和B菌群的混 合菌的添加量优选相对于混合物，总体为3％～4％。
发酵温度为适于A菌繁殖的30℃～40℃，比作为中温菌的B菌群的最 适温度(20℃～30℃)高。特别优选为36℃～38℃。另外，发酵在pH达到 4.0～5.5，优选4.6～4.8后结束。发酵时间优选为5小时～10小时，特别优 选7小时～9小时。
图2表示在牛乳中仅加入A菌在38℃下使之发酵得到的混合物相对于 时间的pH变化的一个实例。如图所示，pH随时间经过平稳降低。从发酵开 始经过11小时后的pH为6.20，混合物呈稍稍凝固的状态。
另一方面，图3表示在牛乳中仅加入B菌群在38℃下使之发酵得到的 混合物相对于时间的pH变化的一个实例。如图所示，pH随时间经过剧烈变 化。从发酵开始经过6小时后的pH为5.14，混合物达到凝固的状态。但是， 仅使用B菌群得到的酸乳风味差，而且不能获得整肠作用等有益的功效。
图4表示在牛乳中加入A菌和B菌群在38℃下使之发酵得到的混合物 相对于时间的pH变化的一个实例，相当于本发明的酸乳。pH变化与图3大 致相同，从发酵开始经过6小时后得到pH5.25呈凝固状态的酸乳。另外，该 酸乳具有优良的风味，以及以整肠作用为代表的有益功效。
也就是说，按照本发明的方法，与仅添加A菌的场合相比，可以加快发 酵时间。另外，能够得到仅添加B菌群的场合不能得到的风味和功效。因而， 即使将由于没有共生关系以前不使用的乳酸菌组合，按照本发明的方法也能 够制造具有优良特征的酸乳。
发酵结束后，冷却至5℃～8℃，得到凝乳。制造搅拌型酸乳时，进一步 将凝乳粉碎形成液状。
本发明的酸乳的制造方法对于静置型酸乳和搅拌型酸乳均可适用。
根据本发明，发现通过组合使用乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚 种以及双歧杆菌属作为乳酸菌发酵剂，即使是没有共生关系的乳酸菌组合也 能够制造酸乳。
另外，根据本发明，发现通过组合使用乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌 乳脂亚种以及双歧杆菌属作为乳酸菌发酵剂，能够制造与以前的酸乳相比具 有清爽的芳香和风味，同时具有即刻改善便秘等整肠作用的酸乳。
实施例1
在85℃下将鲜乳加热保持15分钟，进行杀菌处理。接着，冷却至38℃ 后，相对于鲜乳添加乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的混合物 (Rhodia公司制，商品名为EZAL MR014)2％、双歧杆菌属(Rhodia公司 制，商品名为EZAL BL)1％。然后，将加入了乳酸菌的混合物注入到容器 中，移至发酵库，在38℃的温度下发酵8小时。发酵结束后，冷却至5℃～8 ℃，得到静置型酸乳。
实施例2
在85℃下将鲜乳加热保持15分钟，进行杀菌处理。接着，冷却至38℃ 后，相对于鲜乳添加乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的混合物 (Rhodia公司制，商品名为EZAL MR014)2％、双歧杆菌属(Rhodia公司 制，商品名为EZAL BL)1％。然后，将加入了乳酸菌的混合物注入到容器 中，移至发酵库，在38℃的温度下发酵8小时。发酵结束后，冷却至5℃～8 ℃。接着，将凝固成布丁状的酸乳(凝乳)粉碎后，用匀浆机液化，作为搅 拌型酸乳，得到无糖型的饮料酸乳。
实施例3
在鲜乳中加入砂糖5％混合，搅拌，匀化。接着，在85℃下将该混合物 加热保持15分钟，进行杀菌处理。接着，将混合物冷却至38℃后，相对于 鲜乳添加乳酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的混合物(Rhodia公司制， 商品名为EZALMR014)2％、双歧杆菌属(Rhodia公司制，商品名为EZAL BL)1％。然后，将加入了乳酸菌的混合物注入到容器中，移至发酵库，在38 ℃的温度下发酵8小时。发酵结束后，冷却至5℃～8℃。接着，将凝固成布 丁状的酸乳(凝乳)粉碎后，用匀浆机液化，作为搅拌型酸乳，得到加糖型 的饮料酸乳。
对实施例2和实施例3得到的酸乳中含有的菌的种类和活菌数进行分 析。
对于活菌数测定用的平板培养基上出现的菌落，根据类型取菌，反复进 行单一菌落分离(single colony isolation)得到纯化的菌株，按照BCGB法对 纯化的菌株进行DNA提取。以其1μl作为模板，按照使用引物A(5’- CCGCAGCCAA-3’)以及引物B(5’-AACGCGCAAC-3’)的RAPD法， 比较增殖产物的电泳图案，进行菌株的划归。
另外，以按照BCGB法由酸乳1.0ml直接提取的DNA为模板，按照使 用菌种特异性引物的PCR法进行菌种鉴定。作为菌种特异性的引物，使用动 物双歧杆菌(B.animalis，BLAC)、双歧双歧杆菌(B.bifidum，BiBIF)、短 双歧杆菌(B.breve，BiBRE)、长双歧杆菌(B.longum，BiLON)、嗜酸乳杆 菌(L.acidophilus，LbA)、干酪乳杆菌(L.casei，LbC)、德氏乳杆菌(L. delbrueckii，LbD)、加氏乳杆菌(L.gasseri，LbG)、瑞士乳杆菌(L.helveticus， LbH)、约氏乳杆菌(L.johnsonii，LbJ)、植物乳杆菌(L.plantarum，LbP)、 鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus，LbR)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris，LcC)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis，LcL) 和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，ST)共计15种。
根据DNA的分析，确认实施例2和实施例3得到的酸乳均对BLAC、LcC 和LcL这3种引物发生菌种特异性的扩增，能够确认存在动物双歧杆菌、乳 酸乳球菌乳亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种3个菌种。
另外，按照培养法，由实施例2和实施例3得到的酸乳均分离出电泳图 案不同的4种菌株。图5表示利用PARD对分离株进行菌株识别的结果。图 中，条带号M表示DNA大小标记、1表示Y50178的分离株，2表示Y50179 的分离株，3表示Y50180的分离株，且4表示Y50181的分离株。
图6表示采用PCR法进行菌种鉴定的结果。图中，确认了对乳酸乳球菌 乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris，LcC)、乳酸乳球菌乳亚种 (Lactococcus lactis subsp.lactis，LcL)和动物双歧杆菌(B.animalis，BLAC) 的菌种特异性谱带。
图6中，条带号M表示DNA大小标记、5表示乳酸乳球菌乳亚种，6 表示Y50178的分离株，7表示Y50179的分离株，8表示Y50180的分离株， 9表示乳酸乳球菌乳脂亚种，10表示动物双歧杆菌，且11表示Y50181的分 离株。根据该结果，鉴定分离株Y50178为乳酸乳球菌乳脂亚种，Y50179的 分离株和Y50180为乳酸乳球菌乳亚种，Y50181为动物双歧杆菌。
取酸乳1ml，将10倍梯度稀释液各0.1ml涂抹在TOS琼脂培养基、Acidic -MRS琼脂培养基(pH5.4)和加BCP平板计数琼脂培养基上。TOS琼脂培 养基和Acidic-MRS琼脂培养基(pH5.4)在37℃下厌氧培养3天。另外， 加BCP平板计数琼脂培养基在37℃下好氧培养3天，并在26℃下好氧培养 7天。测定培养后每1ml试样中的活菌数。
表1表示实施例2和实施例3得到的每1ml酸乳中含有的活菌数。表1 表示的活菌数是分别使用下述培养基进行计算的，即，对动物双歧杆菌，使 用TOS琼脂培养基，对乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳亚种，使用加BCP 平板计数琼脂培养基(26℃下培养得到的物质)。
【表1】 乳酸菌     实施例2     (个/ml)     实施例3     (个/ml) 动物双歧杆菌(B.animalis)     6.3×107     1.4×108 乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcus lactis subsp.cremoris)     1.9×108     4.8×108 乳酸乳球菌乳亚种 (Lactococcus lactis subsp.lactis)     1.2×109     1.3×109
由表1可以得知，按照本发明制造的酸乳，与以前的酸乳不同，存在大 量双歧杆菌属的动物双歧杆菌。另外，也可以得知存在量特别大的乳酸乳球 菌乳亚种。
发明效果
根据本发明，发现通过组合使用乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌乳脂亚 种和双歧杆菌属作为乳酸菌发酵剂，即使是没有共生关系的乳酸菌组合也能 够制造酸乳。
另外，根据本发明，发现通过组合使用乳酸乳球菌乳亚种、乳酸乳球菌 乳脂亚种以及双歧杆菌属作为乳酸菌发酵剂，能够制造与以前的酸乳相比具 有清爽的芳香和风味，同时具有即刻改善便秘等整肠作用的酸乳。