[0001] 本发明涉及益生菌用于预防或治疗高饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性的用途。特别地，本发明涉及包含动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)的细菌菌株的组合物，目的在于降低受试者体重增加和改善胰岛素抗性。

[0002] 全球范围流行的超重、肥胖和胰岛素抗性对于糖尿病和心血管疾病是至关重要的危险因素(Alberti等人，2005)，其被认为是由过量摄取高脂肪/热量饮食和/或缺少体育锻炼引起(Vijay-Kumar等人，2010)。

[0003] 身体质量指数(BMI，kg/m2)大于或等于25被认为是超重，BMI大于或等于30被定义为肥胖。

[0004] 肥胖通常与胰岛素抗性(即一种病况，其中细胞不再能够充分应答胰岛素)相关，这导致包括代谢综合征如高血压、II型糖尿病、心血管疾病以及肝病在内的很多疾病。

[0005] 超重、肥胖、糖尿病和相关的代谢疾病的特征在于循环系统和组织中的低级的慢性炎症。

[0006] 胰岛素信号转导是一个复杂的系统，并且是解释急性(至少部分由促炎性细胞因子的作用介导)和慢性(由因衰老和肥胖导致的遗传变异所介导)胰岛素抗性难以鉴别的普遍机制(Aguirre等人，2002)。

[0007] 最近的研究表明，肠道菌群在高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖(Ley等人，2006；Turnbaugh等人，2006)和胰岛素抗性(Cani等人，2008；Larsen等人，2010)中起到触发作用。肠道菌群在难消化的食物组分的消化中发挥作用，调节宿主脂肪储存基因，然后调节宿主能量平衡( 等人，2004和2007)。HFD引起的受到破坏的肠道菌群提高了肠道通透性。因此，来自肠道细菌的水平增加的内毒素进入循环系统并引发炎症，其可以诱发肥胖和胰岛素抗性(Cani等人，2008)。因此，肠道菌群可能是预防和治疗肥胖和胰岛素抗性的潜在靶标(Jia等人，2008；Zhao等人，2010)。

[0008] 根据FAO/WHO目前所采用的定义，益生菌是在适量施用时给予宿主健康益处的活的微生物。特别地，根据在美国的国家酸奶协会(NYA)或国际生命科学研究所(ILSI)所认可的定义，益生菌是在以足量摄取时产生超出基本营养的健康益处的活的微生物。益生菌在通常用于乳品产业的属于乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、链球菌(Streptococcus)和乳球菌(Lactococcus)属的菌种中均有描述。经口施用益生菌可改变肠道菌群的结构。例如，在受试者摄取一些益生菌后，受试者肠道中的乳杆菌和双歧杆菌的数量较高(Xu等人，2012)。施用含有益生菌的发酵乳产品可能不会引起肠道中的细菌菌种构成的重大变化，但显著改变了微生物组编码的参与碳水化合物代谢的酶的表达(McNulty等人，2011)。一些益生菌降低了HFD诱导的肥胖(Lee等人，2006；Yin等人，2010)，改善了胰岛素抗性(Andreasen等人，2010)或显示出抗炎特性(Menard等人，2004；
Andreasen等人，2010；Veiga等人，2010；Fernandez等人，2011)。

[0009] 然而，与代谢疾病紧密相关的益生菌诱导的细菌变化仍不清楚。此外，不同的益生菌菌株显示出不同的功能和机制。

[0010] 动物双歧杆菌(B.animalis)是一种革兰氏阳性厌氧杆状细菌，其可以在包括人类在内的大多数哺乳动物的大肠中找到。动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)和乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)之前被认为是两个不同的菌种。现在，这两个细菌分别被认为是动物双歧杆菌的动物亚种和乳酸亚种。动物双歧杆菌和乳酸双歧杆菌这两个旧名称仍在产品标签上使用，原因是该菌种常常被用作益生菌。名称乳酸双歧杆菌和动物双歧杆菌乳酸亚种可以互换使用。

[0011] 先前已表明，动物双歧杆菌乳酸亚种的一些菌株具有肠细胞表面的糖基化调节作用(国际申请WO 02/02800)，减少肠音(boborygmi)(国际申请WO 2009/150036)，减小腹围(国际申请WO 2009/080800)，降低盲肠pH和改变短链脂肪酸谱，然后抑制患有结肠炎的小鼠中病原菌的生长(Veiga等人，2010)，降低胃肠炎症(国际申请WO 2011/051760)，以及抑制共生细菌的肠粘膜粘附和易位以治疗2型糖尿病(Amar等人，2011)。国际申请WO2010/146568公开了动物双歧杆菌乳酸亚种菌株420(B420)用于治疗肥胖、控制体重增加、诱导减重、治疗糖尿病、使胰岛素敏感性正常化并治疗代谢综合征的用途。

[0012] 这些不同的益生菌的作用是菌株特异性的，而且似乎由不同机制介导。因此，仍然需要其它的可用于控制超重和肥胖的发展以及与之相关的代谢性疾病的益生菌菌株。

[0013] 本发明人已经在小鼠中研究了益生菌对HFD诱导的肥胖和胰岛素抗性的预防作用。已知高脂肪饮食在小鼠或人中诱导体重增加和胰岛素抗性。本发明人已经证明，将动8
物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494按10细胞/天口服施用给高脂肪饮食(HFD)喂养的小鼠12周时，显著降低了体重增加并改善了胰岛素抗性。与也显示出抗炎倾向的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株420(B420)相比，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494最有效地降低了高脂肪饮食喂养的小鼠中的全身抗原负载以及肝脏、附睾脂肪组织和空肠中的局部炎症。对排泄物细菌16S rRNA基因的454焦磷酸测序数据的主成分分析(PCA)表明，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494改变了肠道菌群的结构。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)揭示，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494还改变了不同的操作分类单元(OTU)的相对丰度，但大多数升高的OUT来自产乳酸和乙酸的细菌。一个来自紫单胞菌(Porphyromonadaceae)的与炎症参数显著相关的OUT特异性被动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494特异性的改变，但其不被动物双歧杆菌乳酸亚种菌株420改变。这些结果表明，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494对肥胖和胰岛素抗性的预防与产乳酸和乙酸细菌的改变相关，并且炎症的缓解与紫单胞菌相关。

[0014] 根据布达佩斯条约，动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I-2494于2000年6月20日保藏于CNCM。该菌株是已知的，编号DN 173010，其首次公开于国际申请WO 02/02800，用作胃-肠细胞表面的糖基化调节物。

[0015] 因此，本发明的一个方面是动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494或包含所述菌株CNCM I-2494的组合物，其用于在受试者中降低饮食诱导的体重增加和改善饮食诱导的胰岛素抗性。

[0016] 所述动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494或所述包含菌株CNCM I-2494的组合物进一步用于缓解炎症。

[0017] 这种对炎症的缓解与所述受试者肠中紫单胞菌的增强有关。

[0018] 炎症优选位于所述受试者的肝、附睾脂肪组织和/或空肠中。

[0019] 在本文中，“饮食诱导的体重增加”和“饮食诱导的胰岛素抗性”定义为因过量饮食摄取所引起的体重增加和胰岛素抗性，所述过量饮食摄取包括过度饮食摄取脂肪(尤其是不饱和脂肪)，和任选的过量饮食摄取单糖(包括蔗糖和果糖)。对于给定的受试者，过量饮食摄取(尤其是脂肪和任选的单糖)是指消耗的饮食量(尤其是脂肪和任选的单糖)比满足所述受试者的生理需要并保持能量平衡所需要的量多。治疗对于降低或预防受试者中饮食诱导的体重增加和胰岛素抗性的作用可以通过比较接受所述治疗的受试者中所观察到的体重增加和胰岛素抗性与同样饮食且同样水平的体育锻炼但未治疗的同一受试者中所观察到的体重增加和胰岛素抗性来进行评估。

[0020] 如本文所用，“降低体重增加”是指限制、降低或减少受试者中如上所定义的通过给定饮食所诱导的体重的增加，其是与所述受试者未施用动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494时通过所述给定饮食所诱导的体重的增加相比较。

[0021] 如本文所用，“改善胰岛素抗性”是指改善或降低受试者中如上所定义的给定饮食所诱导的胰岛素抗性水平，其是与所述受试者未食用动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494时通过所述给定饮食所诱导的胰岛素抗性水平相比较。

[0022] 用于评估受试者的胰岛素抗性的测试是本领域已知的(参见Ferrannini等人，1998)。可以用任何本领域已知的胰岛素抗性测试，如胰岛素抗性的动态模型评估(HOM-IR))，来测量受试者的胰岛素抗性水平。

[0023] 在本发明的一个优选实施方式中，所述受试者的体重增加和胰岛素抗性是由高脂饮食(HFD)诱导的(即与高脂肪饮食相关)。

[0024] 可以通过测量TNF-α、CD11c、MCP-1、脂联素(adiponectin)和瘦素(leptin)的mRNA表达来测定炎症的缓解，尤其是在受试者的肝、附睾脂肪组织和/或空肠中的炎症缓解。下述实施例中对方法进行了描述。

[0025] 本发明还包括动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494或包含所述菌株的组合物，用于治疗、预防或缓解受试者中如上所定义的由饮食诱导的体重增加和饮食诱导的胰岛素抗性所引起的病况。

[0026] 由饮食诱导的体重增加和饮食诱导的胰岛素抗性所引起的病况的实例是超重、肥胖和相关疾病，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、高血压。

[0027] 本发明的一个方面还在于，动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494在营养组合物中作为化合物用于如上所定义在受试者中降低饮食诱导的体重增加和改善饮食诱导的胰岛素抗性以及任选的缓解炎症的用途。

[0028] 本发明的组合物可以是任何适于给药尤其是口服给药的形式。这包括，例如固体、半固体、液体和粉剂。通常优选液体组合物以方便给药，例如作为饮品。

[0029] 在本发明的组合物中，所述细菌菌株可以以活的或死的完整细菌的形式使用。或者，所述菌株可以以细菌裂解物的形式使用。优选地，细菌菌株作为活的有活力的细胞而存在。

[0030] 当所述菌株CNCM I-2494是活细菌形式时，组合物通常在每g组合物的干重中可5 13 6 7
以包含10至10 个菌落形成单位(cfu)，优选至少是10 cfu，更优选至少10cfu，还更优选
8 9 4 12
至少10cfu和最优选至少10cfu。在液体组合物的情况下，这通常对应于10至10 个菌
5 6 7
落形成单位(cfu)，优选至少是10cfu，更优选至少10cfu，还更优选至少10cfu，最优选至
9
少10cfu/ml。

[0031] 所述CNCM I-2494可以单独使用，或与动物双歧杆菌乳酸亚种或其它种的其它乳酸细菌组合使用。有利的是，它可以与酸奶发酵物即保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)组合使用。

[0032] 当所述菌株CNCM I-2494与酸奶发酵物组合使用时，所述组合物每ml中还有利7 8 9 5 6
地包含至少10，优选2×10至1×10 之间的嗜热链球菌，和至少5×10 ，优选4×10至
7
2×10之间的保加利亚乳杆菌。

[0033] 本发明的组合物包括食品产品、食品补充剂和功能性食品。

[0034] “食品补充剂”是指由通常在食品中使用的化合物所制备的产品，但其是通常与滋养品无关的片剂、粉剂、胶囊剂、饮剂或任何的其它形式，并且对人的健康具有有益作用。

[0035] “功能性食品”是也对人的健康具有有益作用的滋养品。特别地，食品补充剂和功能性食品可以对疾病例如对慢性疾病具有生理作用(防护或治疗性生理作用)。

[0036] 本发明的组合物还包括婴儿食品、婴儿配方奶粉或婴儿后续配方奶粉(infant follow-on formula)。本发明的组合物也可以是营养品、营养补充剂或医疗食品。

[0037] 本发明的组合物可以是乳制品，优选是发酵乳制品。发酵产物可以以液体形式存在或以通过干燥发酵液而获得的干燥粉末形式存在。乳制品的实例包括静置、搅拌或可饮用形式的发酵乳和/或发酵乳清、奶酪和酸奶。

[0038] 发酵产物也可以是发酵的植物，如静置、搅拌或可饮用形式的发酵的大豆、谷物和/或水果。

[0039] 在一个优选的实施方式中，发酵产品是新鲜的产品。未经历严格的热处理步骤的新鲜产品所具有的优点是细菌菌株以活的形式存在。

[0040] 组合物可以是，例如乳产品且尤其是发酵乳产品，其包含至少所述菌株CNCM I-2494以及如上所述任选组合的其它乳酸细菌，例如酸奶发酵物。

[0041] 所述菌株CNCM I-2494每日所施用的量将优选是至少2×103，有利地是至少8 10
2×10，更有利地是至少2×10 CFU。这一用量可以在高脂肪饮食期间以每日一次或多次摄取而施用。为了获得最佳效果，所述菌株CNCM I-2494将优选在高脂肪饮食期间每日施用
2次。

[0042] 本发明的另一个方面是动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494，用作药物组合物，优选是如上所定义的药物营养组合物，用于如上所定义在受试者中降低饮食诱导的体重增加和改善饮食诱导的胰岛素抗性，以及任选地用于缓解炎症。

[0043] 本发明的另一方面是在有需要的受试者中如上所定义用于降低饮食诱导的体重增加和改善饮食诱导的胰岛素抗性，以及任选地用于缓解炎症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494或包含所述菌株的组合物。

[0044] 治疗有效量的确定是本领域技术人员所熟知的，尤其是基于本文所提供的详细的公开内容。

[0045] 术语“施用(给药)”是指“经口施用(经口给药)”，即受试者将经口摄入本发明的细菌菌株或包含本发明的细菌菌株的组合物，或者旨在表示“直接施用”，即本发明的细菌菌株或包含本发明的细菌菌株的组合物将直接原位施用，尤其是通过结肠镜检查或由栓剂直肠给药。

[0046] 优选口服施用包含本发明的细菌菌株的组合物。所述组合物可以是明胶胶囊、胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或口服溶液或悬液形式。

[0047] 本发明将通过以下包括实施例和附图在内的进一步的描述来获得更清楚的理解，所述实施例例示了动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494在小鼠中降低高脂肪饮食所诱导的体重增加和改善胰岛素抗性的作用。

[0048] 图1：以下4组的体重增加(A)、空腹血糖(B)、空腹胰岛素(C)、HOMA-IR(D)、OGTT(E)和OGTT的曲线下面积(AUC)(F)：NC(正常饮食)、HFD(高脂肪饮食)、HFD+CNCM I-2494、HFD+乳酸双歧杆菌B420。数据显示为平均值±S.E.M。在SPSS中通过单向方差分析以及随后的图基事后检验(Tukey post hoc test)，**P<0.01、*P<0.05表示HFD组比较，##P<0.01、#P<0.05表示与NC组比较。根据下式计算HOMA-IR：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/L)/22.5。

[0049] 图2：NC、HFD、HFD+CNCM I-2494和HFD+乳酸双歧杆菌B420组每周的食物摄取。数据显示为2笼小鼠的平均值。未进行统计学分析。

[0050] 图3：NC、HFD、HFD+CNCM I-2494和HFD+乳酸双歧杆菌B420组动物试验在每月累积的食物摄取。数据显示为2笼小鼠的平均值。未进行统计学分析。

[0051] 图4：NC、HFD、HFD+CNCM I-2494和HFD+乳酸双歧杆菌B420组在12周期间累积的食物摄取。数据显示为2笼小鼠的平均值。未进行统计学分析。

[0052] 实施例：动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494在小鼠中降低高脂肪饮食诱导的体重增加和改善高脂肪饮食诱导的胰岛素抗性

[0053] 材料和方法

[0054] 动物处理

[0055] 将C57BL/6J小鼠(雄性，12周龄)分成3组(每组8只小鼠)进行如下的不同处理：

[0056] 组A：高 脂 肪 饮 食，含 有 34.9 ％ 的 脂 肪，5.24kcal/g，来 自 Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ(HFD)；

[0057] 组B：高脂肪饮食，加上益生菌菌株动物双歧杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-2494，8
10CFU/小鼠/天(HFD+CNCM I-2494)；

[0058] 组C：高脂肪饮食，加上益生菌菌株动物双歧杆菌乳酸亚种B420(Danisco)，8
10CFU/小鼠/天(HFD+乳酸双歧杆菌B420)，其先前所报道用以减少对代谢产生的与高脂肪饮食相关的副作用(Amar等人，2011，出处如上)，作为比较菌株；

[0059] 组D：正常饮食，包含4.3％的脂肪，3.85kcal/g，来自Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ(NC)。

[0060] 在动物试验前制备乳酸双歧杆菌CNCMⅠ-2494或乳酸双歧杆菌B420悬液，储存于-80℃并在将其通过经口饲喂而施用于每只小鼠之前1小时解冻。

[0061] 动物治疗持续12周，在此期间，每周测定2次各个小鼠的体重和每笼小鼠的食物摄取。使用代谢笼每月收集1次新鲜的粪便和尿样，并立即储存于-80℃用于后续分析。

[0062] 通过反转录(RT)-qPCR量化在施用益生菌期间第2、第6和第11周小鼠粪便中的益生菌菌株的量，并且结果证实它们可以在肠道中存活。

[0063] 在试验结束时，剥夺食物5h后，从眼窝丛中收集血液，并通过在3000rpm于4℃离心15min分离血清。通过颈脱位法处死所有动物。在处死后将附睾脂肪垫、肝和空肠切除、称重并立即保存于RNALater(Ambion)中。

[0064] 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

[0065] 在处死动物前进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。剥夺食物5小时后，向小鼠口服施用2.0g/kg体重的葡萄糖。从尾部采取血样，使用ACCU-Check血糖仪(Roche Diagnostics，加拿大)测量在施用葡萄糖之前和施用葡萄糖后15、30、60和120分钟的血糖水平。

[0066] 在施用葡萄糖之前的血糖水平被认为是空腹血糖(FBG)水平。

[0067] 空腹胰岛素、LBP和脂联素水平

[0068] 通过ELISA分析(分别是Mercodia，Sweden；Cell Sciences，USA和R&D，USA)来测定空腹胰岛素(FINS)、脂多糖结合蛋白(LBP)和脂联素水平。

[0069] 根据下列公式计算HOMA-IR：空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mU/L)/22.5。

[0070] 作为血液中内毒素负载的标记物，血清脂多糖结合蛋白(LBP)被认为是在TLR4介导的炎症应答中的重要介质。脂联素是抗炎症和抗糖尿病的激素。

[0071] 组织炎症水平

[0072] 促炎性细胞因子TNF-α在炎症中发挥了核心作用，并通过诱导胰岛素受体底物(IRS)-1中Ser307的磷酸化来参与肥胖和2型糖尿病。在其它组织(肌肉和肝脏)的炎症和空腹胰岛素水平增加之前，脂肪炎症应答提高。脂肪组织中的巨噬细胞在病态肥胖和胰岛素抗性中起到了积极的作用。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1是由巨噬细胞分泌，其招募额外的巨噬细胞以分泌大量的TNF-α并在脂肪组织中表达CD11c，然后导致肥胖和胰岛素抗性。CD11c+细胞的消除导致胰岛素的敏感性迅速正常化。据报道，脂联素可抑制小鼠中趋化因子的产生和随后的包括巨噬细胞浸润和促炎性细胞因子释放在内的炎症应答。

[0073] 根据制造商说明，使用RNeasy脂质组织小试剂盒(QIAGEN)提取总RNA。使用Nanodrop分光光度计测量RNA浓度并通过琼脂糖凝胶电泳检查完整性。根据制造商说明，使用DNaseⅠ(Invitrigen)消化以去除污染DNA，并通过使用靶向持家基因GAPDH的引物的PCR来测试DNA污染。使用SuperScript III First-Strand合成系统(Invitrogen)从500ng高质量的总RNA中随机形成互补DNA(cDNA)。

[0074] 实时PCR的引物序列如下：

[0075] GAPDH:F:GTGTTCCTACCCCCAATGTGT(SEQ ID NO:1)

[0076] R:ATTGTCATACCAGGAAATGAGCTT(SEQ ID NO:2)

[0077] TNF-a:F:ACGGCATGGATCTCAAAGAC(SEQ ID NO:3)

[0078] R:AGATAGCAAATCGGCTGACG(SEQ ID NO:4)

[0079] CD11c:F:CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG(SEQ ID NO:5)

[0080] R:GCACACTGTGTCCGAACTC(SEQ ID NO:6)

[0081] MCP-1:F:TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA(SEQ ID NO:7)

[0082] R:GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT(SEQ ID NO:8)

[0083] 脂联素:F:AGGTTGGATGGCAGGC(SEQ ID NO:9)

[0084] R:GTCTCACCCTTAGGACCAAGAA(SEQ ID NO:10)

[0085] 瘦素:F:CCTGTGGCTTTGGTCCTATCTG(SEQ ID NO:11)

[0086] R:AGGCAAGCTGGTGAGGATCTG(SEQ ID NO:12)

[0087] 连续扩增方案由以下组成：95℃4min的1个循环，然后95℃20s、55℃30s、72℃30s的40个循环，和最后94℃15s的1个循环。在每个循环的最后步骤检测荧光产物。扩增后进行熔解曲线分析以从非目标PCR产物中区分目标物。通过以0.5℃/s的速率从55℃缓慢加热至95℃的温度以及连续的荧光收集来获得溶解曲线。随后使用iQ SYBR Green Surpermix(BIO-RAD)在DNA Engine OPTICON2连续荧光检测仪(MJ research)上进行实时PCR。收集数据并使用随PCR仪附的MJ Opticon Monitor分析软件进行分析。所有mRNA定量数据按GAPDH归一化。

[0088] 肠道菌群组成

[0089] 通过珠打(bead-beating)提取和InviMag Stool DNA试剂盒从粪便样品中提取基因组DNA。通过荧光和放射性同位素科学成像系统FLA-5100(Fujifilm,Tokyo，日本)测定DNA的量。通过0.8％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整性。

[0090] 使用如下的具有样品独特的8碱基条形码的细菌通用引物扩增各个DNA样品的16S核糖体RNA(rRNA)基因的V3区域：

[0091] F：5'-NNNNNNNNCCTACGGGAGGCAGCAG-3'(SEQ ID NO：13)和

[0092] R：5'-NNNNNNNNATTACCGCGGCTGCT-3'(SEQ ID NO：14)。

[0093] PCR扩增、PCR扩增子的454焦磷酸测序和数据质量控制如前所述(Zhang等人，2010)。

[0094] 根据条形码将所有的读数分成不同的样品。去除条形码后，通过NAST多重比对按模板长度≥90个碱基和同一性百分比≥75％(Greengenes)对序列进行比对，然后使用程序CD-HIT以99.9％的相似性生成簇。选择各个簇中最丰富的序列作为代表，再导入到ARB中以构建邻接树。操作分类单元(OTU)按基于距离的OTU和在98％相似性水平的丰富度(DOTUR)进行分类，使用Rarefaction分析(aRarefact-Win软件)和Shannon多样性指数(H')(R软件包2.12.0)进行丰富度和多样性的评估。将每个OTU(98％的相似性)的最丰富的序列插入到ARB中预建立的全长16S rRNA基因序列的系统发生树中，以用于基于加权的(考虑丰度)和不加权的(不考虑丰度)指标的在线Fast UniFrac分析(无监督，考虑演化距离)。OTU的相对丰度用于主成分分析(无监督)、变量的多元方差分析(Matlab R2010a)和冗余度分析(监督)(用于Windows 4.5的Canoco)。各个OUT的代表序列针对RDP数据库(RDP Classifier)以50％的置信水平进行BLAST搜索，以确定OUT的系统发生，通过软件SPSS 16.0使用学生t检验(均一化分布的数据)或Mann-Whitney检验(非均一化分布的数据)计算并在益生菌组和HFD组之间比较各个样品中的不同门和属的相对丰度。

[0095] 结果

[0096] 小鼠中由HFD喂养诱导的肥胖和胰岛素抗性：与NC-喂养的小鼠相比，HFD组显示了更高的体重增加(图1A)，升高水平的空腹血糖(FBG)(图1B)、空腹胰岛素(FINS)(图1C)和稳态评估的胰岛素抗性指数(HOMA-IR)(图1D)，下降的葡萄糖耐量(图1E和1F)。
向HFD喂养的小鼠补充益生菌菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494或乳酸双歧杆菌B420显著地降低了体重增加(图1A)。

[0097] 虽然HFD+益生菌组和HFD组之间在空腹血糖(FBG)和空腹胰岛素(FINS)水平方面无显著差异，但益生菌菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494和乳酸双歧杆菌B420降低了HOMA-IR指数(图1D)。益生菌菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494和乳酸双歧杆菌B420两者均显著降低了葡萄糖不耐受(图1E和1F)，这表明这两个益生菌菌株均可改善胰岛素抗性。

[0098] 针对12周试验的每一周计算每只小鼠每天的平均能量摄取(图2)。在所有试验的过程中，NC组的能量摄取是最低的，并且HFD+益生菌组的能量摄取几乎与HFD组相同(第7周除外)。计算3个月期间4组动物的累积能量摄取(图3)和12周期间4组动物的累积能量摄取(图4)。这表明，益生菌治疗组所观察到的体重减轻不能归因于能量摄取的减少。

[0099] HFD喂养的小鼠经体重校正与NC组相比具有显著提高的血清LBP水平和降低的血清脂联素浓度。两个益生菌组的血清LBP水平并未显著低于HFD组，但与HFD+乳酸双歧杆菌420相比，HFD+CNCM I-2494组具有最低的LBP水平。此外，在两个益生菌组和NC组之间没有显著差异，这表明这两种益生菌菌株趋于减轻全身抗原负载。这表明益生菌菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494和乳酸双歧杆菌B420可以通过降低血清LBP水平来改善胰岛素抗性。与HFD组相比，两个益生菌组经体重校正的血清脂联素都上升了，然而此差异并不具有统计学显著性。

[0100] 测量益生菌在附睾脂肪垫(eAT)、肝脏和空肠中对组织炎症水平的影响。分析TNF-α、CD11c、MCP-1、脂联素和瘦素(另一个重要的促炎性脂肪因子)在eAT中的mRNA表达水平，以及TNF-α在肝脏和空肠中的mRNA表达水平。高脂肪饮食促进了eAT中TNF-α和CD11c的mRNA水平的上升，以及肝脏和空肠中TNF-α的mRNA表达的上升，这表明了高脂肪饮食在eAT、肝脏和空肠中诱导炎症。与HFD组相比，益生菌菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494和乳酸双歧杆菌B420显著降低了eAT中TNF-α的mRNA水平。这两种益生菌菌株趋于降低eAT中CD11c的mRNA水平，这是因为在两个益生菌组和HFD组或NC组之间没有显著差异。所有4组中，eAT中的MCP-1的mRNA水平没有统计学的显著差异，而HFD+CNCM I-2494组的水平与NC组最接近。类似于MCP-1的mRNA水平，在4组之间没有显著差异，但HFD+CNCM I-2494组在eAT中显示出增加的脂联素mRNA水平，该水平几乎等于NC组的水平。与HFD组相比，这两个益生菌组没有降低eAT中的瘦素的mRNA水平，这表明两种益生菌都没有降低促炎性脂肪因子基因的表达。乳酸双歧杆菌菌株B420的肝脏中的TNF-α的mRNA水平与HFD组和NC组没有显著差异，这表明它们都趋于降低肝脏中的TNF-α的mRNA，而乳酸双歧杆菌CNCM I-2494显著降低了肝脏中的TNF-α的mRNA水平。在两个益生菌组和HFD组或NC组之间，空肠中的TNF-α的mRNA水平没有显著差异，这表明两种益生菌菌株趋于降低空肠中的炎症。总之，这些结果显示了与菌株乳酸双歧杆菌B420相比，乳酸双歧杆菌CNCM I-2494最有效地降低了肝脏、附睾脂肪组织和空肠中的局部炎症。

[0101] 进行粪便细菌16S rRNA基因454焦磷酸测序。进行多变量统计分析以比较在试验开始和结束时所有样品的肠道菌群的整体结构。比较了在益生菌介入3个月时HFD+益生菌组、HFD组和NC组的肠道菌群的结构。进行方差分析(ANOVA)以比较单独的HFD+益生菌组、HFD组和NC组之间OTU的丰度，分别鉴定了发生显著变化的111、101、95和99个OTU。然后基于这些OTU的相对丰度的主成分分析(PCA)主要揭示了用HFD喂养的动物(包括HFD组和单独的HFD+益生菌组)和用NC喂养的动物的分离，以及HFD组与单独的HFD+益生菌组的分离。PCA的多变量方差分析(MANOVA)检验显示，在NC组、HFD组和两个HFD+益生菌组中的每一个之间存在显著差异。这些结果表明，益生菌改变肠道菌群的结构。

[0102] 使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(其是一种监督多变量统计方法)用以鉴定经益生菌治疗改变丰度的肠道菌群中关键种系型。构建PLS-DA模型以比较HFD喂养的(包括HFD组和HFD+益生菌组)和NC-喂养的动物之间，以及在单独的HFD+益生菌组和HFD组之间的细菌组成，并且弃一法交叉验证针对所有模型产生了高预测率。发现总共50个OTU在正常食物喂养的小鼠和高脂肪饮食喂养的小鼠之间在丰度上存在差异。大多数高脂肪饮食所改变的OTU属于以下家族：紫单胞菌(Porphyromonadaceae)(15个OTU)、毛螺旋菌(Lachnospiraceae)(9个OTU)、瘤胃菌(Ruminococcaceae)(7个OTU)和丹毒丝菌(Erysipelotrichaceae)(8个OTU)。益生菌菌株乳酸双歧杆菌B420和乳酸双歧杆菌CNCM I-2494分别改变了13和16个OTU。菌株乳酸双歧杆菌B420主要提高了属于双歧杆菌(1个OTU)和Barnesiella(1个OTU)的OTU的丰度，并降低了一些属于毛螺旋菌(2个OUT)的OUT。菌株乳酸双歧杆菌CNCM I-2494主要提高了属于紫单胞菌(2个OTU)、Allobaculum(1个OTU)、欧陆森氏菌(Olsenella)(1个OTU)、乳酸菌(1个OTU)、粪球菌(Coprococcus)(1个OTU)和一些属于毛螺旋菌(1个OTU)的OTU的丰度，并降低了属于Alistipes(1个OTU)的OTU。这些结果表明，这两种益生菌菌株的抗肥胖和抗胰岛素抗性效应可能部分地是通过增强水平的产乳酸和乙酸菌所介导，这是因为由益生菌所增强的大部分肠道细菌都产生乙酸和乳酸。实际上，属于Allobaculum的菌株的葡萄糖代谢的终产物主要是乳酸和丁酸，粪球菌则是丁酸、乙酸和乳酸，双歧杆菌菌株产生乙酸和乳酸，欧陆森氏菌能产生乳酸和乙酸。益生菌所减少的细菌主要是有害的/非有益的细菌。

[0103] 为了评估由益生菌诱导的肠道菌群的结构变化与宿主表型变体之间的联系，用斯皮尔曼相关分析分析由益生菌改变的OUT的丰度与宿主表型参数之间的相关性。双歧杆菌(1个OTU)、欧陆森氏菌(1个OTU)、紫单胞菌(3个OTU)、Allobaculum(1个OTU)、毛螺旋菌(3个OTU)和粪球菌(1个OTU)与肥胖、胰岛素抗性和炎症具有负相关性，而Alistipes(1个OTU)、紫单胞菌(3个OTU)、颤杆菌(Oscillibacter)(1个OTU)和毛螺旋菌(7个OTU)与它们显示出正相关性。因此，大多数由益生菌改变的OTU是与宿主健康密切相关的关键的细菌，这进一步确认了，通过益生菌预防肥胖和胰岛素抗性部分地是由这些关键细菌的调节所介导的，尤其是通过增强产乳酸和乙酸细菌。有一些OUT强烈地与宿主表型相关(R>0.5或R<-0.5)。一个来自紫单胞菌的OUT(其在各个样品中占细菌总数的0.48±0.09％)显示出与体重增加(r＝-0.54，P<0.001)和葡萄糖不耐受(r＝-0.52，P<0.001)负相关。在一个来自Allobaculum的OUT与体重增加(r＝-0.51，P＝0.030)和肝脏中的炎症(r＝-0.51，P<0.001)之间存在负相关，且这个OUT是主导OUT，其在各个样品中占细菌总数的
2.28±0.52％。一个来自颤杆菌的OTU与体重增加正相关(r＝0.51，p＝0.002)，其在各个样品中占细菌总数的2.05±0.19％。一个来自毛螺旋菌的OTU与葡萄糖不耐受呈正相关(r＝0.64，P<0.001)，且其在各个样品中能达到细菌总数的3.30±0.45％。另一个来自紫单胞菌的OTU显著地与炎症状态负相关，其是特异性地由乳酸双歧杆菌CNCM I-2494所增强。因此，经乳酸双歧杆菌CNCM I-2494的炎症缓解与紫单胞菌相关。

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