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一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25
申请号	CN201510018130.2	申请日	2015-01-14	公开(公告)号	CN104560829A	公开(公告)日	2015-04-29
申请人	贵州大学;			发明人	何腊平; 张玲;
摘要	一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25，该菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)，该菌株纯培养物于2014年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该中心地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；保藏编号为CGMCC NO.10225，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。该菌株不仅降胆固醇能力高、耐酸受性、耐胆盐受性、耐氧性能良好和具有益生特性，能作为益生菌添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，丰富了双歧杆菌菌种资源，对双岐杆菌保健产品的开发有积极意义。
权利要求	1.一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25，其特征在于该菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.Lactis)，该菌株的纯培养物已于2014年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该中心地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏编号为CGMCC NO.10225，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。 2.如权利要求1所述的香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25，其特征在于所述杆菌BZ25的形态特征及生理生化特征菌均接近于双歧杆菌属，其16S rRNA基因序列与动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. Lactis）的16S rRNA 序列同源性在99%以上，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌属的分类规定，动物双歧杆菌乳亚种BZ25属于放线菌门( Actinobacteria)、放线菌纲（Actinobacteria）、放线菌亚纲(Actinobacteridae)、双歧杆菌目（Bifidoacteriales）、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属（Bifidobacterium），动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. Lactis）。
说明书全文	一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌BZ25 技术领域 [0001] 本发明涉及微生物，特别涉及降胆固醇、耐氧双歧杆菌。背景技术 [0002] 胆固醇广泛存在于动物组织细胞中，是构成细胞的重要成分之一，在人体中发挥着重要的生理作用。它在体内转化形成类固醇激素，是合成维生素D以及胆汁酸的前体物质。体内胆固醇主要有两个来源，一是食物，二是内源合成。有些人由于不合理膳食习惯，血液胆固醇含量超过正常指标；而体内胆固醇含量过高会造成动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病，严重威胁到人类健康。据报道，全球心脑血管疾病引起人类死亡的人数占总死亡人数的29％。根据世界卫生组织预测，到2030年，心脑血管疾病仍将是导致人类死亡的主要原因，而血清中的胆固醇过高是引发冠心病、动脉硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要因素。有研究发现与拥有正常血脂的人相比，高胆固醇血症的人患心脏病的风险是其正常人的3倍。因此，通过降低血清胆固醇水平来对心脑血管疾病进行防治是一种实效可行的研究方向，具有潜在的应用价值和广阔是市场空间。 [0003] 欲降低体内胆固醇，除了通过合理饮食以外，运用生物转化法，特别是运用益生菌对胆固醇进行直接降解已成为研究的趋势。双歧杆菌作为人体肠道内的一类益生菌，其益生作用有维持肠道内菌群平衡、降低血清胆固醇、抗肿瘤等益生作用。而贵州香猪是贵州省特色资源，属于小型猪，其遗传稳定，器官结构和功能与人体相似。因此，从香猪中筛选出来的双歧杆菌易于为人体所接受和利用。 [0004] 目前中国专利数据库中，涉及双歧杆菌的专利申请件很多，但涉及耐氧双歧杆菌的专利申请件仅有浙江大学申请的ZL2009100965117号《一种耐氧性双歧杆菌》和天津科技大学申请的ZL2011100894937号《一种耐氧耐酸性长双歧杆菌》2件。这两个双歧杆菌能否降胆固醇不得而知。迄今为止，尚无涉及降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌的申请件。发明内容 [0005] 本发明旨在提供一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，使之有可能作为益生菌进一步深度开发利用，添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，以降低人体胆固醇含量，促进人类健康。 [0006] 发明人提供的香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，该菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)，该菌株的纯培养物已于2014年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该中心地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏编号为CGMCC NO.10225，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。该菌株是从贵州特色资源小香猪的肠道内溶物中筛选与分离纯化得到。 [0007] 上述动物双歧杆菌乳亚种BZ25的形态特征及生理生化特征菌均接近于双歧杆菌属，其16S rRNA基因序列与动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)的16S rRNA序列同源性在99％以上，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌属的分类规定，动物双歧杆菌乳亚种BZ25属于放线菌门(Actinobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌亚纲(Act inobacteridae)、双歧杆菌目(Bifidoacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)，动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.Lactis)。 [0008] 发明人提供的菌株是从贵州特色资源小香猪肠道内溶物中分离并初步筛选出具有降胆固醇能力的双歧杆菌，并对所得的菌株以降胆固醇率、耐酸耐胆盐受性为指标进行进一步的复筛，复筛出一株胆固醇去除率高且耐酸受性、耐胆盐受性均良好的双歧杆菌菌株，然后对该菌株进行耐氧性能实验，最终通过对该菌株进行形态学、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列鉴定，最终鉴定出此菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)。 [0009] 为了验证本发明的菌株，发明人进行了如下实验： [0010] (1)样品的采集与分离纯化 [0011] 从贵州省特色资源小香猪的多个部位采样，包括小肠、大肠以及新鲜的小香猪粪便中，编号并记录，并迅速带回实验室处理。取10g的新鲜样品放入装有90mL的无菌生理盐水中，人工摇匀后，在洁净工作台内用移液枪吸取100ul混合液涂布于含有Li-Mupirocin的MRS平板上，置于厌氧培养箱(厌氧环境为N2∶CO2∶H2＝90∶5∶5)中，37℃培养48h，然后挑取单菌落接种于含有X-gal的PTYG平板上，放入37℃、20％CO2浓度的二氧化碳培养箱中培养两天，观察菌落颜色、形态并进行革兰氏染色、镜检，记录菌株形态特征。将疑似双歧杆菌菌株在PTYG平板上纯化传代4次后，甘油保藏于-80℃的超低温冰柜中。 [0012] 上述MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，吐温801mL，K2HPO42g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，琼脂20g；制法是将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调pH值至6.5，121℃灭菌15min，备用。 [0013] 上述含有Li-Mupirocin的MRS(MUP-MRS)中，100mLMRS琼脂培养基含有5mg的莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)。 [0014] 上述PTYG液体培养基成分为：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉 10g，葡萄糖10g，吐温801mL，盐溶液40mL；制法是将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调pH值至 6.5，121℃灭菌15min，备用。 [0015] 上述培养基中的盐溶液成分为：无水CaCl20.2g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O 0.48g，Na2CO310g,NaCl 2g；制法是将CaCl2和MgSO4·7H2O混合在300mL蒸馏水中直至溶解，加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解；再加入200mL蒸馏水，混合后贮存于4℃，备用。 [0016] 上述PTYG琼脂培养基制法为：在每1000mL的液体培养基中加入20g琼脂粉，加热煮沸，121℃灭菌15min后倾注平板，备用。 [0017] 上述含有X-gal的PTYG(PTYG-X)培养基制法为：在每1000mL的改良PTYG培养基中加入X-gal 40mg，由于X-gal不耐高温，直接用无菌水稀释浓度为20mg/mL，每个PTYG平板涂布40μL，备用。 [0018] (2)胆固醇去除率的测定 [0019] 将初筛所得的菌株采用邻苯二甲醛法(OPA)测其胆固醇去除率。 [0020] (3)待测菌悬液的制备 [0021] 将保藏在-80℃的超低温冰柜中的菌株活化，划线纯化3次后，接种于PTYG液体培8 养基中进行富集培养，然后将菌悬液离心，收集菌泥，将菌液浓度调至10CFU/mL，菌悬浮液带用于体外耐受实验。 [0022] (4)酸耐受性实验 [0023] 将待测菌悬液按5％(体积比)接种量分别接种于pH3.0和pH7.0的灭菌PTYG液体培养基中，混匀后37℃下静置2h，进行平板计数。 [0024] (5)胆盐耐受性实验 [0025] 将待测菌悬液按5％(体积比)接种量分别接种于添加0.3％(质量/体积)牛胆盐的灭菌PTYG液体培养基和不含牛胆盐的灭菌PTYG液体培养中，37℃恒温二氧化碳培养箱中培养，分别于0h和24h进行活菌计数。 [0026] (6)耐氧性能实验 [0027] 将经过耐酸性和胆盐耐受性的菌株接种到PTYG培养基中分别在普通培养箱和20％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h后，进行平板计数。对两者生长去进行对比以判断其耐氧性。 [0028] 通过上述采样、分离纯化的初筛实验以及以菌株的降胆固醇率，耐受性为指标进行复筛，最终得到一株菌株BZ25，其降胆固醇率高，达到36.32％，且耐酸受性和耐胆盐受性好，并对氧有较好耐受性。 [0029] (7)菌株的鉴定 [0030] 对所得菌株进行生理生化鉴定以及种属的鉴定，了解其生理生化特征，对有效地应用文献、指导进一步研究和应用有重要作用。因此，对本发明中的菌株BZ25进行了生理生化实验鉴定以及16S rRNA序列的鉴定。 [0031] 形态特征：将菌株接种于PTYG平板上，37℃培养48h，其菌落形态为菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明且质地柔软，在PTYG-X平板上则呈现出深蓝色的菌落。挑取其菌落进行革兰氏染色，其革兰氏染色呈阳性，且在光学显微镜下观察其细胞形态呈多形态杆状，符合双歧杆菌细胞形态特征。其生理生化实验结果见表1。 [0032] 表1细胞形态及理化试验结果 [0033] [0034] 注：+：阳性，-：阴性 [0035] 根据以上的细胞形态以理化试验结果，菌株BZ25特征符合双歧杆菌属的特征，初步鉴定属双歧杆菌属。 [0036] 本发明的菌株是由中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Col lection Center，CGMCC)进行16S rRNA序列鉴定，将所测得的16S rRNA基因序列登陆http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站，通过在线BLAST(Bas ic Local Al ignment Search Tool)，共搜索到100个与该序列同源性比较高的基因片段，且该菌株的16S rRNA基因序列与动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)的16S rRNA序列同源性在99％以上，选取同源性较高的20株菌，应用MEGA5.0分析软件构建系统进化树。作图显示，菌株BZ25与Genbank中Bifidobacterium animalis subsp.lactis AD011strain AD011以及 Bifidobacterium animalis subsp.lactis strain YIT 4121两株动物双歧杆菌乳亚种同属于一个最小分支中，表明它们之间的亲缘关系最近。 [0037] 因此，根据其形态特征、理化试验结果以及根据16S rRNA基因序列所构建的系统发育树分析，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌属的分类规定，动物双歧杆菌乳亚种BZ25菌株属于放线菌门(Act inobacteria)、放线菌纲(Act inobacteria)、放线菌亚纲(Act inobacteridae)、双歧杆菌目(Bifidoacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)，动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)。 [0038] 本发明的一株香猪源性动物双歧杆菌乳亚种BZ25(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)，不仅降胆固醇能力高、耐酸受性、耐胆盐受性、耐氧性能良好和具有益生特性，而且能作为益生菌添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，从而丰富了双歧杆菌菌种资源，对双岐杆菌保健产品的开发具有积极意义。 [0039] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。附图说明 [0040] 图1是本发明的菌株BZ25与相关菌种的16S rRNA序列系统发育进化树，图2是菌株BZ25的菌落形态图，图3是菌株BZ25的革兰氏染色示意图，图4是胆固醇含量测定的标准曲线图。具体实施方式 [0041] 实施例1：从贵州省特色资源小香猪的肠道内溶物中筛选与分离筛选得到动物双歧杆菌乳亚种BZ25： [0042] (1)样品的采集： [0043] 从贵州省贵阳市生态园中猪龄小于2个月的贵州特色小香猪的多个部位采样，包括小肠、大肠以及从新鲜的小香猪粪便中。用已灭菌的镊子将新鲜小香猪样品放置于无菌密封袋中，编号后放入装有冰袋的自制冷相中，在1h内带回实验室处理。 [0044] (2)双歧杆菌的分离及纯化 [0045] 将10g的新鲜样品放入装有90mL的灭菌蒸馏水中(内含玻璃珠)，人工摇匀后进行梯度稀释。在超净工作台内，取其样品稀释液0.1mL加入到含有Li-Mupirocin的MRS(MUP-MRS)平板培养基中进行涂布，放入厌氧培养箱中(厌氧环境为N2∶CO2∶H2＝90∶5∶5)，37℃培养两天，然后挑取单菌落接种在含有X-gal的PTYG(PTYG-X)平板上，放入37℃、20％CO2浓度的二氧化碳培养箱中培养2d。从样品稀释到涂布，平板暴露在空气中的时间不超过15min。 [0046] (3)菌落形态及细胞形态特征观察 [0047] 在样品处理及培养后，观察并记录菌落形态、颜色，并进行革兰氏染色，镜检观察并记录。挑选在MUP-MRS平板上菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明、质地柔软的单一菌落，并且在PTYG-X平板上呈现出深蓝色的菌落，纯化传代四次后，得到纯化菌株，编号并记录菌落的形态。 [0048] (4)菌株的保藏 [0049] 将得到的菌株接种在PTYG液体培养基中，37℃下于二氧化碳培养箱中培养48h后，取2mL菌液与3mL50％甘油混合于10mL已灭菌的洁净离心管中，最终使其甘油浓度达到30％，放置于-80℃的超低温冰柜中进行冻结和保存。 [0050] 经过第一轮初筛，以菌落形态及菌株形态为指标，初步筛选出70余株疑似双歧杆菌菌株，甘油保藏于-80℃的超低温冰柜中。 [0051] (5)降胆固醇率的测定：采用邻苯二甲醛(OPA)法测其降胆固醇率，其具体方法如下： [0052] a、邻苯二甲醛法(OPA)标准曲线绘制 [0053] 准确吸取胆固醇标准溶液各0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20mL于洁净试管中，再加入无水乙醇使其体积为1mL，然后在各试管中加入OPA 试剂4mL，室温放置10min。再向其中缓慢加入4mL浓硫酸，立即用振荡器振20s，充分混合后于室温黑暗条件下放置 10min。空白对照以1mL无水乙醇代替胆固醇储备液，最后测其在550nm处的吸光值，以胆固醇浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标做标准曲线如图1，计算出其线性回归方程为y＝ 2 4.9264x-0.0130，相关系数R为0.9992。 [0054] b、双歧杆菌胆固醇的测定 [0055] 将-80℃下保藏的菌株快速取出活化，并在PTYG平板上划线纯化3次后，接种到液体PTYG培养基中相同条件下进行富集培养48h后，以 5000r/min，4℃条件下离心10min，8 收集菌体。然后用PBS缓冲溶液稀释菌体，将待测菌液调至3×10CFU/mL后按10％(体积比)接种量接种于胆固醇含量为0.1mg/mL的胆固醇PTYG培养基中，厌氧环境，37℃培养 48h。菌液以10000r/min，4℃条件下离心20min，保留上层清液作为待测液，同时用PBS缓冲溶液洗涕菌泥两次，洗液并入上清待测液，用于测定胆固醇含量，以未接种的胆固醇PTYG培养基作为空白对照组。然后采用邻苯二甲醛(OPA)法测其双歧杆菌降胆固醇率。 [0056] 降胆固醇率S按以下公式计算： [0057] S＝(1-A/B)×100％ [0058] 注：S—降胆固醇率，％ [0059] A—待测发酵上清液中胆固醇浓度，mg/mL [0060] B—未接种的胆固醇PTYG培养基中胆固醇浓度，mg/mL [0061] 经第一次复筛，以降胆固醇率为指标筛选出7株降胆固醇率高于30％的菌株，进行下一步的复筛。 [0062] (6)待测悬浮液的制备 [0063] 将-80℃下保藏的菌株快速取出活化，并在PTYG平板上划线纯化3次，接种到液体PTYG培养基中相同条件下进行富集培养48h后，将菌液在5000r/min，4℃条件下离心10min，收集菌泥，再用无菌磷酸盐缓冲盐PBS洗涕一次病重新制成悬浮液，将菌液浓度调 8 至10CFU/mL，悬浮液带用于体外耐受实验。 [0064] (7)酸耐受性实验 [0065] 将待测菌悬液按5％(体积比)接种量分别接种于pH 3.0和pH 7.0的灭菌PTYG液体培养基中，混匀后于37℃恒温静置2h，取1mL加入到含9mL质量分数为0.84％无菌生理盐水的试管中，用快速混匀器混匀，继续 10倍递减稀释至合适梯度。各取0.1mL涂布于PTYG平板上37℃，二氧化碳培养箱中培养48h，进行活菌计数，每个平板做3个平行重复。根据以下公式计算出存活率N。 [0066] N＝N0/N1×100％ [0067] 式中，N—菌株耐酸性存活率 [0068] N0—pH3.0PTYG培养2h的存活菌数 [0069] N1—pH3.0PTYG培养2h的存活菌数 [0070] (8)胆盐耐受性实验 [0071] 将待测菌悬液按5％(体积比)的接种量分别接种于添加0.3％(质量与体积之比)牛胆盐的灭菌PTYG液体培养基和不含牛胆盐的灭菌PTYG液体培养中，37℃二氧化碳培养箱中培养，分别于0h和24h进行活菌计数。每个平板做3次平行重复。 [0072] (9)耐氧性能实验 [0073] 将经过耐酸性和胆盐耐受性的菌株接种到PTYG培养基中分别在普通培养箱和20％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h后，进行平板计数。根据以下公式评价其耐氧性能Y。 [0074] Y＝N3/N2×100％ [0075] 式中，Y—菌株耐性性存活率 [0076] N3—普通培养箱中培养24h后的活菌数 [0077] N2—20％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h后的活菌数 [0078] 结果表明，普通培养箱中培养24h后的活菌数为CO2培养箱中的94.1％，表现出较好的耐氧性，而且菌株的生长性能良好。 [0079] 经第二次复筛，以耐酸耐胆盐受性为指标进行复筛，筛选出一株菌株BZ25降胆固醇能力高且耐酸受性、耐胆盐受性良好的菌株，其降胆固醇率达到36.32％，在pH值3.0条件下的存活率达到97.27％，在含有0.3％胆盐的PTYG培养基中其存活率达到90％以上，而且其耐氧性能好。 [0080] (10)通过以上的初筛与复筛实验，最终筛选出菌株BZ25降胆固醇能力高且耐酸受性、耐胆盐受性、耐氧性能良好的菌株，并进行生理生化实验鉴定以及16S rRNA基因序列鉴定。

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