包含益生菌株的发酵食品及其制备方法

本发明涉及包含益生菌株的发酵食品及其制备方法。

双歧杆菌属于结肠中占优势的厌氧菌群。人结肠中存在的主要种 类是青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、双歧双歧杆 菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌婴儿亚种 (Bifidobacterium longum ssp infantis)、短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

双歧杆菌是优选的益生菌。双歧杆菌属(Bifidobacterium)的细 菌在目前上市的众多产品中使用，并且通常加入至已包含酸乳 (yaourt)中的常规细菌(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus))的乳制品之中。

食用双歧杆菌被承认在已经历抗生素疗法的个体中重建正常双歧 杆菌群体的过程中是有益的。这种食用看起来也使得能够减少便秘、 预防突发腹泻和减少乳糖不耐性的症状。

益生菌是活细菌。这些活细菌在食品例如乳制品的制备中的使用 是棘手的，特别是关于这些细菌在产品中存活的问题。

目前上市的包含双歧杆菌的产品有80％没有满足这样的标准，即 使得能够支持它们显著改善食用它们的个体的肠运输。至少108-109 个活细胞的日摄取量已被推荐为使得能够具有疗效的最小剂量(Silva A.M.，Barbosa F.H.，Duarte R.，Vieira L.Q.，Arantes R.M.， Nicoli J.R.，Effect of Bifidobacterium longum ingestion on experimental salmonellosis in mice，J.Appl.Microbiol.97 (2004)29-37)。所需剂量可以随使用的益生菌株而定。

因此，在制备包含双歧杆菌的生物活性食品的情况下，出现了这 样的问题，即获得在产品中这些细菌的足够群体并在产品的“寿命” 期间维持其。

在发酵乳制品中的益生菌株群体的数量大小问题是已知的问题 (特别地参见D.Roy，Technological aspects related to the use of bifidobacteria in dairy products，Lait 85(2005)39-56， INRA，EDP Sciences)。

关于这个问题的几个理由已被提出，包括在贮藏期间群体的减少， 从某一pH开始的这些细菌的被扰乱的生长，或者相当简单地，这些双 歧杆菌特别是在乳中的生长能力差。

本发明的主要目的是提供在所述发酵食品的整个保存期期间包含 高双歧杆菌群体的非凝固(non ferme)发酵食品，即包含双歧杆菌的 非凝固发酵食品，所述双歧杆菌处于良好的生理学状态，并且在所述 发酵食品的保存期期间，特别是直至产品食用期限时具有较高的存活 率。

本发明的另一个目的是提供易于实施的制备方法，其使得能够获 得上述产品。

本发明的另一个目的是，相对于酸乳中存在的常规共生，促进双 歧杆菌的生长，这些共生典型地由一种或多种嗜热链球菌和保加利亚 乳杆菌菌株构成。

由于本发明人的令人惊讶的下述发现达到了本发明的目的：一定 数目的通常在非凝固发酵食品制备方法中所涉及的参数的精确调节使 得能够在群体发酵后快速获得至少108双歧杆菌/克产品，并且使双歧 杆菌的存活增加直至产品的食用期限，而不必改变其他细菌菌株的生 长。

本发明涉及包含酵素的非凝固发酵食品，所述酵素包括乳酸菌 (bactérie lactique)，所述发酵食品在至少30天、特别是至少35 天的保存期内，包含超过约5×107、特别是超过约108双歧杆菌/克发 酵食品。

“非凝固发酵食品”意指在其包装前已经在其制备过程中经历去 凝结(décaillage)和/或变光滑(lissage)的步骤的发酵食品。

凝固(ferme)发酵食品是在发酵前被包装并且发酵在包装容器中 发生的产品。因此，对于乳制品，乳被接种且被直接包装到它在其中 发酵的罐中。接种后，将经接种的乳包装到罐中。一般将这些罐置于 恒温箱中3小时。细菌繁殖并且消耗乳糖，所述乳糖从而部分转化成 修饰蛋白质结构的乳酸，形成称为乳凝胶(gel lactique)的物质。 然后，将这些产物置于通风的冷室或冷却通道中，并于约4℃贮藏。

非凝固发酵食品的例子是：搅拌型酸乳或酸乳饮品。

“酵素(ferment)”意指一组细菌，特别是用于发酵的细菌和/ 或具有益生价值的细菌。

发酵食品的保存期或贮藏期是紧接在发酵食品制备及其包装过程 结束后的时期。在这个保存期期间，发酵食品通常于约4-约10℃保 存。

上述发酵食品特别地在至少35天的保存期内，和更特别地在至少 40天的保存期内，包含超过约5×107、特别是超过约108双歧杆菌/ 克发酵食品。更具体而言，上述发酵食品包含超过约5×107、特别是 超过约108双歧杆菌/克发酵食品，直到产品的食用期限。

食用期限取决于由现行法规确定的法定保存期，这通常从生产日 期起从15到50天不等。例如，对于新鲜乳制品法定保存期一般为30 天。

考虑到与食物中的双歧杆菌供应相关的医学建议，于在4-10℃ 保存的产品的食用期限(date limite de consommation，D.L.C.) 时大于或等于108CFU/g的双歧杆菌群体可以被视为足够的双歧杆菌 群体。

更具体而言，本发明涉及如上文定义的发酵食品，其中在保存期 结束时所述发酵食品中所包含的双歧杆菌数目与至少30天、特别是至 少35天的保存期开始时所述发酵食品中所包含的双歧杆菌数目之比 是约0.2-约0.8、特别是约0.3-约0.7、特别是约0.4-约0.5。

换言之，在保存期开始(即制备过程结束)和保存期结束之间发 酵食品中包含的双歧杆菌的存活率是20-80％、特别是30-70％、和 特别是40-50％。

所述保存期是至少30天、特别是至少35天，但更特别地至少40 天或延伸直到所述发酵食品的食用期限。

本发明还涉及于约4-约10℃的温度保存至少30天、特别是至少 35天的保存期的非凝固发酵食品，其包含酵素，所述酵素包含超过约 108双歧杆菌/克发酵食品。

更具体而言，本发明涉及包含酵素的非凝固发酵食品，其于小于 12℃或小于10℃的温度保存至少30天、特别是至少35天、特别是至 少40天的保存期，并且包含超过约5×107、特别是超过约108双歧杆 菌/克发酵食品。

更具体而言，本发明涉及如上文定义的发酵食品，其在保存期开 始时包含超过约5×107、特别是超过约108双歧杆菌/克发酵食品。

根据权利要求1-4中之一的发酵食品，其中所述发酵食品中所包 含的双歧杆菌是下列类型：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，特别是动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis animalis)和/或动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis lactis)，和/或短双歧杆菌，和/或长双歧杆菌，和/或婴 儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，和/或双歧双歧杆菌。

有利地，如上文定义的发酵食品基于下述材料进行制备：植物汁， 特别是果汁或蔬菜汁例如大豆汁，或者乳制品，特别是牛奶和/或山羊 奶。

所述发酵食品还可以基于绵羊奶或骆驼奶或马奶。

植物汁意指由植物提取物，特别是大豆、tonyu、燕麦、小麦、玉 米等产生的汁液。

蔬菜汁的例子是：番茄汁、甜菜汁、胡萝卜汁等。

果汁的例子是：苹果、橙、草莓、桃、杏、李、覆盆子、黑莓、 醋栗、凤梨、柠檬、柑橘类水果、葡萄柚、香蕉、猕猴桃、梨、樱桃、 西番莲果、芒果、外来水果的果汁，多水果果汁(jus multifruit) 等。

根据一个有利的实施方案，如上文定义的发酵食品是这样的，即 所述酵素包括乳酸菌，特别是乳杆菌属(Lactobacillus spp.)的一 种或多种细菌，尤其是德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)和/或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 和/或陆氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和/或嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)和/或瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和/或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，和/ 或乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)和/或嗜热链球菌和/或乳酸 乳球菌(Lactococcus lactis)类型的细菌，和/或明串珠菌属 (Leuconostoc)的一种或多种细菌。

根据一个有利的实施方案，如上文定义的发酵食品是这样的，即 所述酵素包括在它们之间显示出共生现象的乳酸菌。

“共生现象”意指不同类型乳酸菌之间的关系，所述乳酸菌能够 在它们之间产生相互援助并增加它们的发酵活性。

根据一个有利的实施方案，在如上文定义的发酵食品中所包含的 酵素之中双歧杆菌比例是约20-约80％、特别是约30-约70％、特 别是约40-约60％、和特别是约50％。

“酵素中的双歧杆菌比例”意指相对于包括在发酵食品中的细菌 总数目，即相对于所有双歧杆菌和其他细菌特别是乳球菌、乳杆菌、 链球菌等之和的双歧杆菌比例。

在制备过程结束时在发酵食品中的双歧杆菌和其他细菌菌株之间 良好的数量平衡，以及在保存期自始至终这种平衡的基本维持，是所 述食品品质的必要保证。

50％的双歧杆菌比例构成了成本问题(双歧杆菌是昂贵的)和获 得合适的双歧杆菌群体问题之间的良好折衷。

根据一个具体实施方案，根据本发明的发酵食品呈现出搅拌型发 酵食品(produit alimentaire fermentébrassé)或用于饮用的发酵 食品或婴儿发酵食品的形式。

“搅拌型[...]产品”意指经接种、发酵、机械搅拌并随后包装的 产品，特别是乳。此类产品的发酵不在罐中而是批量地在池中进行。 凝乳在被包装到罐中之前进行搅拌随后冷却，所述罐在冷藏下贮藏。 凝乳意指蛋白质特别是乳的凝结物。

“用于饮用的[...]产品”意指基本上为液体形式的产品。用于饮 用的产品是这样的，即在机械搅拌步骤后，所述产品在包装之前在池 中进行搅打。

“婴儿[...]产品”意指具有低蛋白质和脂肪含量、适合于婴儿需 要的产品。

所述发酵食品特别可以是酸乳，或者凝固酸乳、搅拌型酸乳或酸 乳饮品，或者包含乳制材料的条块，克非尔奶酒，具有乳制馅料的饼 干，包含益生菌的水等。

此外，本发明还涉及用于从起始材料制备发酵食品的方法，其包 括下述连续步骤：

-起始材料的接种步骤，所述起始材料任选地是经巴氏灭菌的， 该步骤通过接种入包含约4×106-约1×107双歧杆菌/ml起始材料的 接种酵素来实施，以便获得经接种的材料，

-在前一步骤中获得的经接种的材料的发酵步骤，其中发酵开始 时的温度为约36-约38℃，发酵结束时的温度为约37-约39℃，并 且发酵时间为约8-约11小时，以便获得经发酵的材料，

-在前一步骤中获得的经发酵的材料的中间冷却步骤，其中中间 冷却时间为约1小时30分钟-约2小时，并且中间冷却温度为约4- 约18℃，以便获得经预冷的材料，

-在前一步骤中获得的经预冷的材料的贮藏步骤，其中贮藏时间 少于约15小时，以便获得经贮藏的材料，

-在前一步骤中获得的经贮藏的材料的最终冷却步骤，其中最终 冷却开始时的温度小于约21℃，并且最终冷却结束时的温度为约2- 约6℃，以便获得发酵食品。

用于接种起始材料的酵素一般通过于一定的条件下在培养基中生 长双歧杆菌来获得，所述培养条件是这样的，即当双歧杆菌群体达到 汇合时，该群体包含108-109双歧杆菌/ml培养基。因此，应当指出， 根据本发明在开始时使用的酵素量相应于通常所使用的双歧杆菌量的 约0.1％。

“发酵”意指包括在微生物作用下从有机底物中释放能量的生化 反应。这是原料经由微生物转化的过程，这种转化随后产生生物量和 代谢物。特别地，乳酸发酵是经由酵素中的细菌消耗乳糖的厌氧过程， 这导致乳酸形成和pH降低。

本发明根据本发明人令人惊讶的下述发现得出：时间、温度和双 歧杆菌原始群体这些参数在上述范围内的调节使得能够改善双歧杆菌 的抗性及其存活能力。与当将所述参数确定在上述范围外的值时相比， 本发明制备方法结束时发酵食品中包含的双歧杆菌处于更佳的生理学 状态，这允许更多数量的这些双歧杆菌在随后的发酵食品保存期期间 存活。

此外，所述参数在上述范围内的调节允许大量节省特别是时间和 能量。

离开依照本发明确定的范围，在保存期期间双歧杆菌的存活率被 不利地改变。

上述制备方法使得能够获得非凝固发酵食品。

有利地，所述酵素包括乳酸菌。

根据一个具体实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方法 是这样的，即双歧杆菌选自下列类型的细菌：动物双歧杆菌，特别是 动物双歧杆菌动物亚种和/或动物双歧杆菌乳酸亚种，和/或短双歧杆 菌，和/或长双歧杆菌，和/或婴儿双歧杆菌，和/或双歧双歧杆菌。

根据一个具体实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方法 是这样的，即双歧杆菌选自动物双歧杆菌类型的细菌。

有利地，在根据本发明的用于制备发酵食品的方法中的中间冷却 时间是约1小时30分。

有利地，在根据本发明的用于制备发酵食品的方法中的贮藏时间 小于或等于约12小时、特别是等于约12小时。

有利地，在根据本发明的用于制备发酵食品的方法中的最终冷却 结束时的温度是约4℃。

根据用于制备如上文定义的食品的方法的一个具体实施方案，接 种酵素包括乳酸菌，特别是乳杆菌属的一种或多种细菌，尤其是德氏 乳杆菌保加利亚亚种和/或干酪乳杆菌和/或陆氏乳杆菌和/或嗜酸乳 杆菌和/或瑞士乳杆菌和/或植物乳杆菌，和/或乳脂乳球菌和/或嗜热 链球菌和/或乳酸乳球菌类型的细菌，和/或明串珠菌属的一种或多种 细菌。

有利地，乳酸菌在它们之间显示出共生现象。

根据用于制备如上文定义的食品的方法的一个具体实施方案，接 种酵素中的双歧杆菌比例是约20-约75％、特别是约30-约50％、 特别是约35-约40％、特别是约37.5％。

“接种酵素中的双歧杆菌比例”意指在接种步骤过程中相对于全 部所有接种的细菌来说的双歧杆菌比例。

考虑到开始时双歧杆菌的浓度越高，它们相对于酵素中的其他菌 株而言在生长方面就越有竞争力，并且越快达到双歧杆菌的最适浓度， 这个比例相应于就成本和双歧杆菌终浓度而言的最佳点。

根据用于制备如上文定义的食品的方法的一个具体实施方案，起 始材料基于下述材料：植物汁，特别是果汁或蔬菜汁例如大豆汁，或 者乳制品，特别是由牛奶和/或山羊奶构成的乳制品。

起始材料还可以包括绵羊和/或骆驼和/或马奶。

在发酵食品是乳制品的情况下，起始材料可以包括乳、奶粉、糖、 乳和植物汁的混合物、乳和果汁的混合物、乳和淀粉的混合物。

根据一个具体实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方法 在发酵步骤和中间冷却步骤之间包括另外的搅拌步骤，这使得能够由 在发酵步骤中获得的经发酵的材料得到经搅拌的经发酵的材料。

“搅拌”意指使用涡轮或螺旋桨式搅拌器的机械搅拌过程。这是 决定产品特别是乳制品的油性的步骤。如果搅拌太剧烈，那么可以发 生空气掺入和乳清分离。如果搅拌不充足，那么产品具有随后变得太 稠的可能。

根据一个具体实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方法 在接种步骤之前包括巴氏灭菌步骤，这使得能够由起始材料获得经巴 氏灭菌的起始材料。

“巴氏灭菌”意指食品保存领域中的通常方法，所述方法在于快 速加热而不沸腾，随后为突然冷却，从而使得能够破坏大多数细菌而 同时部分地维持蛋白质。

依照根据本发明的用于制备发酵食品的方法的一个有利实施方 案，所述经巴氏灭菌的起始材料是由原料获得的、经巴氏灭菌的、保 持的(chambré)、任选地均匀化的和冷却的起始材料，所述方法在接 种步骤之前包括下述连续步骤：

-原料中脂肪物质的标准化步骤，以便获得标准化的材料，

-在前一步骤中获得的标准化的材料的干物质富集步骤，以便获 得经富集的材料，

-在前一步骤中获得的经富集的材料的预热步骤，以便获得起始 材料，

-在前一步骤中获得的起始材料的巴氏灭菌和保持步骤，以便获 得经巴氏灭菌和保持的材料，

-在前一步骤中获得的经巴氏灭菌和保持的物质的任选的均匀 化步骤，以便获得经巴氏灭菌的、保持的和任选地均匀化的材料，

-在前一步骤中获得的经巴氏灭菌的、保持的和任选地均匀化的 材料的最初冷却步骤，以便获得经巴氏灭菌的、保持的、任选地均匀 化的和冷却的起始材料。

“脂肪物质的标准化”意指使起始材料中存在的脂肪物质的量达 到预定水平的步骤。

干物质富集在于添加蛋白质和脂肪物质以改变凝乳的硬度。

“保持(chambrage)”在于乳的快速加热抑菌法，并使得能够破 坏植物性微生物菌群，其中包括致病形式。它的一般持续时间是4- 10分钟、特别是5-8分钟、和特别是约6分钟。

“均匀化”意指乳类型材料中的脂肪物质分散成小的脂肪球。均 匀化例如在100-280巴、特别是100-250巴、特别是100-200巴、 特别是约200巴的压力下进行。这个均匀化步骤完全是任选的。特别 地，在具有0％脂肪物质的产品生产过程中不存在该步骤。

根据一个有利的实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方 法在最终的冷却步骤后包括于约4-约10℃的温度下保存所述发酵食 品的步骤。

根据一个有利的实施方案，根据本发明的用于制备发酵食品的方 法在与接种步骤同时或者在接种步骤和发酵步骤之间包括中间制剂添 加步骤，以便由所述经接种的材料获得完全的经接种的材料，或者在 发酵步骤后包括中间制剂添加步骤，以便由所述经发酵的材料获得完 全的经发酵的材料，所述中间制剂包括水果和/或谷类和/或添加剂例 如调味料和着色剂的制剂。

中间制剂可以特别地包含增稠剂(可溶性和不溶性纤维、藻酸盐、 角叉菜聚糖、黄原胶、果胶、淀粉(特别是糊化的)、吉兰糖胶(gomme gélane)、纤维素及其衍生物、瓜尔胶和角豆胶、菊粉)或增甜剂(阿 斯巴甜、乙酰舒泛钾、糖精、三氯蔗糖(sucralose)、环己烷氨基磺 酸盐)或防腐剂。

调味料的例子是：苹果、橙、草莓、猕猴桃、可可等调味料。

着色剂的例子是：β-胡萝卜素、洋红、胭脂虫红。

此外，上述水果制剂可以包含完整或块状或果冻形式或果酱形式 的水果，这使得能够例如获得水果酸乳。

中间制剂还可以包含植物提取物(大豆、稻等)。

本发明还涉及由如上文定义的方法之一获得的发酵食品。

附图简述

图1显示了耐性图，其相应于作为开始时的双歧杆菌量的函数的 发酵温度影响。横坐标：以107CFU/ml接种的双歧杆菌量；纵坐标： 以摄氏度表示的发酵温度。黑色：少于5×107CFU/ml的双歧杆菌量； 细影线：在5×107和108CFU/ml之间的双歧杆菌量；粗影线：大于 108CFU/ml的双歧杆菌量。测量在发酵结束时进行。

图2显示了耐性图，其相应于作为冷却至20℃之前的等待时间的 函数的在10℃进行最终贮藏前的产品冷却温度影响。横坐标：变光滑 的等待时间(以小时表示)；纵坐标：最终贮藏前的冷却温度(以℃ 表示)。细影线：在5×107和108CFU/ml之间的双歧杆菌量；粗影线： 大于108CFU/ml的双歧杆菌量。测量在发酵后35天进行。

图3显示了耐性图，其相应于作为发酵温度的函数的在10℃进行 最终贮藏前的产品冷却温度影响。横坐标：发酵温度(以℃表示)； 纵坐标：在最终贮藏期间的冷却温度(以℃表示)。黑色：少于5× 107CFU/ml的双歧杆菌量；细影线：在5×107和108CFU/ml之间的双 歧杆菌量；粗影线：大于108CFU/ml的双歧杆菌量。测量在发酵后35 天进行。

实施例1

为了证明如上文定义的不同参数的范围相应于对于在保存期间双 歧杆菌存活的优化，通过独立地改变每个因素来制备标准搅拌型酸乳。 每个因素在低水平(标记为-1)、中等水平(标记为0)和高水平(标 记为+1)上进行测试。受试参数的列表显示于下表1中：

表1

根据不同实验，使这些因素相关联并对于双歧杆菌的生长和存活 建立耐性图，这相应于对于每个参数所获得的双歧杆菌量的映射 (projection)：参见图1-3。

特别地，在图2中应当指出，如果产品未足够快速地冷却(在发 酵池中的等待时间太长)，那么存在双歧杆菌的损失。在图3中应当 指出，如果产品未恰当地冷却至4℃-6℃，那么在D+35时双歧杆菌 的损失是显著的。

实施例2

工业规模的测试在3000升上进行。

第1组测试：

对照1：发酵温度39℃；贮藏时间24小时。

对照2：发酵温度40℃。

测试1：发酵温度37℃，冷却6℃。

(对照1和对照2：乳+奶粉)

第2组测试：

对照3：发酵温度39℃。

对照4：发酵温度40℃。

测试2：所有参数选自要求保护的范围，即：

双歧杆菌的接种：1×107CFU/ml；

发酵时间：9小时40分；

发酵温度：37℃；

中间冷却时间：1小时30分；

中间冷却温度：18℃；

变光滑后的缓冲贮藏时间：12小时；

最终冷却温度：6℃。

(对照3和对照4：乳+奶粉+在生产结束时添加的水果制剂) 结果呈现于下表2和3中，其中双歧杆菌群体以CFU/ml显示。

表2

表3

在这些表中，D相应于发酵结束时，D+1相应于贮藏1天时，等等。