ＲＳ３ 유형의 저항 전분에 대해 분해능이 있는비피도박테리움 아도레스센티스를 유효성분으로 함유하는것을 특징으로 하는 식품 조성물

ＲＳ３ 유형의 저항 전분에 대해 분해능이 있는 비피도박테리움 아도레스센티스를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물{Food composition with Bifidobacterium adolescentis to utilize RS-3 type resistant starch}

도 1은 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주의 광학현미경 사진이고,

도 2는 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주의 탄수화물 발효 성상(API 50 CHL Test Kit) 결과이고,

도 3은 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주의 생균수와 pH 측정 결과이고,

도 4는 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주 및 대조 균주들의 배양시 pH 변화 측정 결과이고,

도 5는 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주 및 대조 균주들의 16S rRNA PCR 결과 사진이고,

도 6은 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주 및 대조 균주들의 내산성 측정 결과이고,

도 7은 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 균주 및 대조 균주들의 내담즙성 측정 결과이다.

본 발명은 RS3 유형의 저항 전분 분해능이 있는 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물에 관한 것이다.

활생균(프로바이오틱스, probiotics)은 사람에게 투여하였을 때 장내 미생물 균형을 향상시킴으로써 건강증진 효과 및 숙주에게 유익한 효과를 나타내는 활성미생물 및 발효산물 등의 식이 보충제를 지칭한다(Fuller, R. Probiotics in man and animals. J. Appl . Bacteriol . 66:365-378. 1989).

활생균은 장내 균총을 안정화시키고, 유해 세균의 정착억제에 따른 부패 생성물 감소, 콜레스테롤 저하, 항암, 변비 예방 및 억제에 그 기능성이 있다(Fuller, R. Probiotics in human medicine. Gut 32:439-442. 1991). 대표적인 활생균으로는 비피도박테리움( Bifidobacterium ), 락토바실러스( Lactobacillus ) (WHO & FAO. 2001)를 들 수 있다.

반면, 프레바이오틱스(prebiotics)는 대장 내에 이미 상주하고 있는 특정 균중 활생균의 활성과 생육을 선택적으로 촉진하여 인체에 유익한 영향을 줄 수 있는 식품 성분을 가리킨다(Manning, T. Prebiotics. Best Pract Res Clin Gastroenterol . 18:287-298, 2004). 대표적인 예로 올리고당과 식이섬유를 들 수 있다.

한편, 저항 전분(Resistant starch)은 올리고당 및 식이섬유와 비슷한 생리활성을 가지고 있는 전분으로서, 건강한 사람의 소장에서는 소화·흡수되지 않으며, 혈중 콜레스테롤이나 지방질의 축적을 저하시켜 성인병을 예방하는 효과를 발휘하고, 소장에서 흡수되지 않고 대장으로 넘어간 저항 전분은 미생물에 의해 탄소원으로 이용되어 단쇄 지방산(Short Chain Fatty Acid, SCFA)을 생산하는 데 일조를 하게 된다. 특히 단쇄 지방산 중 대장암의 위험도를 낮추는 부티르산의 생성이 현저히 증가한다고 알려져 있는데(Faisant, N. Structural features of resistant starch at the end of the human small intestine. Eur . J. Clin . Nutr . 47:285-296. 1992), 암세포 성장을 억제하는 부티르산 생성이 식이섬유 섭취시보다 대장암의 억제 능력에 있어 더 큰 것으로 보고되었다(Edwards, CA In vitro method for quantification of the fermentation of starch by human fecal bacteria. J. Sci . Food Agric . 71:209-217. 1996).

이상과 같은 효능을 발휘하는 저항 전분은 크게 4개 유형으로 나뉘지는데, 물리적으로 효소의 접근이 어려운 RS1, 생전분으로 B형의 결정형을 갖는 입자형의 RS2, 노화된 아밀로오스의 결정을 포함하는 노화 전분인 RS3와 화학적 변성 전분으로 소화되지 않는 전분인 RS4형으로 나뉜다(신말식, 식품산업과 영양 9(2). 1-9. 2004).

이에 상기와 같은 특성을 지닌 저항 전분을 분해할 수 있는 유산균을 새롭게 개발한다면, 유산균이 상대적으로 적게 존재하는 소장에서는 저항 전분이 많이 분해되지 않아 식이섬유로서의 역할을 기대할 수 있고, 유산균이 많은 대장으로 넘어와서는 저항 전분이 유산균의 생육을 위한 먹이로 활용이 되어 유산균으로부터 여러 단쇄 지방산의 배출을 유도함으로써 대장암을 예방할 수 있는 역할을 기대할 수 있다.

그런데, 유산균의 경우는 경구 섭취시 pH가 낮은 위장에서 생육이 저해되고, 또 위장을 통과한 후에는 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해서 그 생육이 억제되는 문제점이 있어 경구용 식품 조성물로 개발하기에는 근본적인 한계가 있어 왔다.

이에 본 발명은 상기의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 저항 전분의 분해능이 우수하고, 경구 섭취하였을 때 위와 소장을 거치면서 생존을 유지할 수 있는 새로운 유산균을 분리하여 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RS3 유형의 저항 전분 분해능이 있는 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )를 유효성분으로 함유 하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )에 RS3 유형의 저항 전분 분해능이 있는 것을 최초로 규명하여 이를 유효성분으로 함유하는 식품 조성물 형태로 제공하는 것이다.

유산균을 함유하는 식품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 바람직하게는 유산균 발효유, 두유, 분유, 음료, 이유식, 생식 또는 건강보조식품 중 어느 하나인 것이 좋다.

한편, 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )는 공시 균주를 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 본 발명자들이 분리한 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)을 사용하는 것이 좋다. 본 발명자들이 분리한 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)가 공시 균주인 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) ATCC 15703 보다 저항 전분 이용능(저항 전분을 빠르게 이용하는 특징이 있음)이 우수하기 때문이다.

비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)는 본 발명자들의 실험 대상자의 분변으로부터 분리한 균으로서, 노화된 아밀로오스의 결정을 포함하는 노화전분인 RS3 유형의 저항 전분을 탄소원으로 함유하는 배지를 통해 분리하였다.

분리한 JCS2 균주는 V-, Y- 곤봉형의 그람 양성 간균이고, 편성 혐기성균임이 확인되었다. 이후, F6PPK 테스트(Scardovi, V. Starch gel electrophoresis of fructose-6-phosphate phosphoketolase in the genus Bifidobacterium . J. Bacteriol . 106:1036-1039. 1971)를 통해, 본 발명에서 분리한 JCS2 균이 비피도박테리움인 것이 확인되었고, 발효실험 결과, JCS2는 전형적인 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )의 탄수화물 발효성상을 나타냈다.

또한, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였는데, BLAST 검색 결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) JCS2의 16S rRNA의 염기서열은 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) ATCC 15703와 99% 동일하였으며, 위의 균주를 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁일자 2006년 3월 17일, 기탁번호 KCTC 10924BP).

한편, 다른 비피더스( Bifidus ) 균주( Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Bifidobacterium bifidum ATCC 29521)들이 RS-3 유형의 저항 전분을 이용하지 못하는 반면, 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) 계통은 RS3-유형의 저항 전분을 생육을 위한 탄소원로 이용할 수 있었다.

그런데, 그 중 본 발명자들이 분리한 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2가 공시 균주인 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) ATCC 15703보다 저항 전분 이용능이 더 우수 하였고, 성장 속도도 저항 전분을 배지로 사용하였을 경우 글루코오스에서 배양했을 때와 비슷한 정도로 빠른 결과를 나타냈다.

한편, 본 발명에서 분리한 균주 JCS2의 내산성을 알아보기 위하여 pH 6.8에서 생육된 균수에 대한 pH 5.0에서 생육한 균수의 백분율을 생존율로 하여 산에 대한 내성을 측정하였는데, 그 결과 JCS2의 생존율은 94%로 높아 내산성이 우수함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서 분리한 균주 JCS2의 내담즙성을 확인하기 위하여, 배지에 균액을 2% 수준으로 접종하고 생존 균수를 측정하였는데, 그 결과 JCS2가 61%의 생존율을 나타냈으며, 다른 공시 유산균에 비해 내담즙성이 우수함을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시 예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 비피도박테리움의 분리 및 동정

실험 대상자의 분변을 받아 멸균된 혐기성 완충용액에 십 배수로 희석한 후, 유산균 선택배지인 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)배지를 변형한 mMRS 배지(표 1)를 사용하여, 저항 전분을 탄소원으로 이용하는 균주를 분리하였다.

-pH는 6.8로 조정

상기 표에서 저항 전분은 Novelose  330 ^® (National Starch & Chemical, NJ, USA) 전분에 판크레아틴(pancreatin)과 아밀로글루코시데이스(amyloglucosidase) 효소를 혼합하여 37°C에서 16시간 동안 반응시킨 후 잔존한 전분(잔존 전분은 RS3 유형의 저항 전분임)을 분리하여 사용하였다(Englyst, HN Classification and measurement of nutritionally important starch fractions. Eur . J. Clin . Nutr . 46:S33-S55. 1992).

균주 선발을 위한 혐기성 배양은 Gas-pak을 이용하여 37℃에서 48시간 동안 수행하였다. mMRS 배지에서 생성된 콜로니를 분리하고 다시 산성에서 노란색을 나타내는 BCP 배지를 이용하여 노란색 환을 나타내는 콜로니 JCS2를 분리하였다. 분리한 콜로니 JCS2는 V-, Y- 곤봉형의 그람 양성 간균이고 편성 혐기성균임을 확인하였다(도 1).

한편, 비피도박테리움은 특징적으로 프럭토오스-6-포스페이트 포스포케톨레이스(fructose-6-phosphate phosphoketolase; F6PPK)의 대사계를 가지고 있으므로, F6PPK 시험(Scardovi, V. J. Bacteriol . 106:1036-1039. 1971)를 통해 상기에서 분리한 JCS2 균이 F6PPK 시험에서 양성 반응을 보이는 균주임을 확인하였다.

이 균주를 API 50 CHL 당 발효 키트 (bioMerieux Vitex, Inc, France)을 이용하여 균주의 탄수화물 발효 형태를 결정하였고, 발효실험 결과(도 2) JCS2는 전형적인 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis )의 탄수화물 발효성상을 나타냈다.

종(specie) 수준에서는 Bergey's Manual(Bergey, DH Bergey's manual of systematic bacteriology. 1418-1434. 1986)의 지침에 따라 실험하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였는데, BLAST 검색 결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) JCS2의 16S rRNA의 염기서열은 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) ATCC 15703와 99% 동일하였으며, 위의 균주를 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2로 명명한 후, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 국제 기탁하였다(기탁일자 2006년 3월 17일, 기탁번호 KCTC 10924BP).

본 발명에 따른 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)의 특성은 아래와 같다.

[ 실험예 1] 본 발명의 균주 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924BP)의 mMRS 배지에서 성장 곡선 및 pH 변화

mMRS broth(하기 표 1) 배지를 사용하여 JCS2 균주를 배지의 2% 수준으로 접종하여 pH와 균수(도 3에서 보라색으로 표시된 것은 mMRS 배지에서 측정한 균수임)를 측정하였다. 측정 결과, 탄소원으로 글루코오스가 있는 MRS 배지와 저항 전분만 들어 있는 mMRS 배지에서 둘 다 비슷한 속도의 성장속도가 나타났다(도 3).

또한, 다른 비피더스( Bifidus ) 균주( Bifidobacterium infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum ATCC 15707, Bifidobacterium bifidum ATCC 29521)는 저항 전분을 이용하지 못하는 반면, 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) 계통은 저항 전분을 생육을 위한 탄소원로 이용할 수 있었다(도 4), 한편, 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2는 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) ATCC 15703(도 4에서 노란색 표시) 보다 저항 전분 이용능이 더 우수하였으며(저항 전분을 보다 빨리 이용함), JCS2의 경우 성장 속도도 저항 전분에서 배양했을 경우, 글루코오스에서 배양했을 때와 비슷한 정도로 빨랐다.

[ 실험예 2] PCR 에 의한 본 발명의 균주 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924 BP )의 16S rRNA 의 증폭

프라이머(표 2)로는 BiADO-1 BiADO-2 (Matsuki, T. Rapid identification of human intestinal bifidobacteria by 16S rRNA-targeted species and group-specific primers. FEMS Microbiol . Lett . 167:113-121. 1998)를 이용하였다. PCR은 94°C에서 20초간 변성(denaturation)시키고, 55°C에서 20초간 어니일링(annealing)하여 72°C에서 30초간 신장(extension)시키는 과정을 30회 반복하여 실시하였다.

그 결과, 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)이 유전자 수준에서 비피도박테리움 아도레스센티스( Bidobacterium adolescentis ) ATCC 15703와 일치함을 확인할 수 있었다(도 5).

[ 실험예 3] 본 발명의 균주 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924 BP )의 산성에 대한 저항성 ( Acid resistance )

본 발명에서 분리한 균주 JCS2의 내산성을 측정하기 위하여 시스테인이 첨가된 MRS broth 배지를 HCl을 사용하여 pH를 6.8, 5.0으로 조절하여 실험하였다. 배지에 균액을 2% 수준으로 접종하고 균수를 측정하였다. pH 6.8에서 생육된 균수에 대한 pH 5.0에서 생육한 균수의 백분율을 생존율로 하여 산에 대한 내성을 측정하였다. 측정 결과(도 6), JCS2의 생존율은 94%로 높아 내산성이 우수함을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 4] 본 발명의 균주 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924BP)의 담즙산에 대한 저항성 ( Bile resistance )

본 발명에서 분리한 균주 JCS2의 내담즙성을 측정하기 위하여 시스테인이 첨가된 MRS broth 배지에 OX-BILE을 0.25% 농도로 첨가하여 사용하였다. 배지에 활성화된 균액을 2% 수준으로 접종하고 균수를 측정하였다. 측정 결과(도 7), JCS2가 61%의 생존율을 나타냈으며, 다른 공시 균주에 비해 내담즙성이 우수함을 확인할 수 있었다.

[ 제제예 1] 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924 BP )를 함유하는 정제의 제조

당업계에서 공지된 기술을 사용하여, 본 발명의 유산균 JCS2를 포함하는 식품조성물을 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제 또는 드링크제로 제형화할 수 있다.

예를 들어, 정제를 제조하기 위하여 탈지유(skim milk)를 10%(w/v) 함유하는 액체 배지에 1~2%(중량)의 올리고당, 2-4%(중량)의 락토바실러스 아시도필러스 (L. acidophilus ) 균주 및 상기 실시예에서 확인된 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP) 균주의 혼합물을 첨가한 후 35~40℃ 온도에서 10~20시간 동안 발효를 수행하였다.

그 후, 상기 혼합물을 유동층 분리기 및 정립기를 사용하여 직경이 5mm이하가 되도록 입자를 형성시키고, 건조시킨 후 타정기에 넣고 일시적인 압력을 가하여 입자의 중량이 개당 300mg 정도 되도록 정제를 제조하였다.

또한, 상기 혼합물을 진공상태에서 동결 건조시켜서 고형화된 결정체를 얻은 후, 결정화된 고형분을 적당히 분쇄하여 과립제, 분말제를 형성하거나, 그 분말제를 물에 녹여 드링크제로 제조하였다.

[ 제제예 2] 비피도박테리움 아도레스센티스 ( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 ( KCTC 10924 BP )를 이용한 요구르트의 제조

지방질 3.2%의 원유(탈지고형분 함량 : 8.6%)에 탈지 분유를 첨가하여, 탈지고형분 함량이 12%가 되도록 조정한 후, 가온하여 균질 및 살균하여 배지를 제조하였다.

그 후, 동결 건조된 발효 균주 비피도박테리움 아도레스센티스( Bifidobacterium adolescentis ) JCS2 (KCTC 10924BP)와 락토바실러스 아시도필러스 (L. acidophilus ) 균주를 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양은 pH 4.5가 될 때까지 수행하였다.

그 후, 감미제로 과실 쨈을 첨가하여 요구르트를 최종 제조하였다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비피도박테리움 아도레스센티 스( Bifidobacterium adolescentis ) 균주는 저항 전분 분해능이 우수하고, 내산성 및 내답즙성이 뛰어나므로 다양한 식품 조성물로 개발될 수 있는 바, 식품산업에서 매우 유용한 발명인 것이다.