[0001] 本发明涉及食品发酵工程技术领域，具体涉及一种富含大豆异黄酮苷元的酱油及其生产工艺。

[0002] 酱油起源于我国的周朝，迄今已有2000多年的历史，已成为亚洲国家最受人们喜爱的调味品，尤其是在中国、日本、韩国以及东南亚等一些国家。最近几年，酱油在西方国家也越来越收欢迎，需求量与日俱增，由于酱油具有明显的鲜味，丰富的氨基酸和人体所需的生物活性物质（蛋白质和异黄酮），故造成全球对酱油的需求量在不断增大，而我国每年的年产量也在不断提高。目前，我国是全球酱油第一生产大国，年产量已达到840多万吨。传统的酱油酿造过程，是多种微生物共同作用的过程，米曲霉在酱油酿造过程起主导地位。而现在大多数酱油企业均是只采用米曲霉单一菌种制曲，所制备的酱油中生物活性物质的含量远不及传统酿造，故造成其中异黄酮的含量略低，不及其它发酵豆制品。

[0003] 异黄酮是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质，也是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素。目前发现的大豆中天然存在的异黄酮共有12种，分为游离型的甙元和结合型的糖甙两类：游离型的甙元约占总量的2%～3%，包括染料木素(Genistein)，大豆黄素(Daizein)和黄豆黄素(Glycitein)；结合型的糖甙约占总量的97%～98%，包括丙二酰型葡萄糖苷，乙酰型葡萄糖苷和β-葡萄糖苷。而已发现的异黄酮是一种优良的天然抗氧化剂，具有多种生物活性，如对肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和更年期综合症预防与治疗作用以及降低胆固醇和改善经期不适。

[0004] 近些年，异黄酮的研究已成为行业研究热点。由于它独特且多样的生物活性，而异黄酮苷元的生物活性在所有异黄酮活性中是最高的。为提高异黄酮苷元的含量，大多学者都采用发芽的方式，而发酵不仅可提高异黄酮苷元的含量，还可提高必需氨基酸的含量、酚类物质的含量和风味物质成分。现代酱油生产工艺多为单菌种制曲，在酱醪发酵阶段添加耐盐乳酸菌和耐盐酵母菌，该工艺存在制曲菌种单一，制曲过程中β-葡萄糖苷酶活力不足，成品酱油中异黄酮苷元的含量较低。

[0005] 专利申请号201010528550.2的中国发明专利“一种可提高豆酱中异黄酮苷元含量的方法”，介绍了采用一定比例的大豆及大豆胚芽为原料接种米曲霉制曲，确保成曲中β-葡萄糖苷酶活力大于400 U/g，粉碎成曲加入一定比例的食盐及水，拌匀后发酵10～20天，所制得的豆酱中大豆异黄酮苷元的总量达到200 μg/g。其缺点在于只采用单一菌种接种制曲，成曲中β-葡萄糖苷酶活力较低，酱醪发酵时间较短，导致其成品中异黄酮苷元的总量不高。专利申请号为201110208717.1的中国发明专利“不同乳酸菌二阶酿造酱油的工艺”，介绍了一种低盐固态发酵酱油工艺，在采用米曲霉制得酱醅后，接种嗜热乳酸链球菌进行第一阶段发酵，发酵时间为3～5天；第一阶段结束后，接种短乳杆菌进行第二阶段发酵，发酵时间为1～3天，经淋油，加入调味料，灭菌，均质、过滤，制得成品酱油。其由于制曲阶段采用单菌种制曲，造成β-葡萄糖苷酶活力不足，且发酵阶段添加嗜热乳酸链球菌和短乳杆菌，这两种乳酸菌产β-葡萄糖苷酶的能力较弱，造成成品酱油中异黄酮苷元的含量较低。专利申请号为201410143505.3的中国发明专利“一种多菌种制曲的酱油及其生产工艺”，介绍了在制曲过程中使用酵母、乳酸菌和米曲霉协同制曲，提高酱油产品的风味。而所用乳酸菌为耐盐度达到15%，分泌氨基酸脱羧酶活性低以及发酵过程中不产生酪胺、组胺、精胺等生物胺，但该乳酸菌在制曲过程中所产生的β-葡萄糖苷酶活力不足，且酵母的存在同样会影响β-葡萄糖苷酶的分泌，故造成成品酱油中异黄酮苷元的含量较低，较大程度上降低了其生物活性。专利申请号为201510317934.2的中国发明专利“一种直投式乳酸菌发酵酱油的辅料及其制品的制备方法”介绍了采用米曲霉制曲进行低盐发酵，并在氨基态氮含量最高的前0～4h添加一定量的植物乳杆菌和产酯酵母的活化液，提高酱油的风味、口感和色泽。而该方法同样只是采用单一米曲霉制曲，亦会造成制曲完成后β-葡萄糖苷酶活力不足，由于在酱醪发酵过程中添加了一定量的植物乳杆菌和产酯酵母的活化液，会略微增加其酱醪中β-葡萄糖苷酶活力，但成品酱油中异黄酮苷元的含量不发生明显变化。造成上述现象的主要原因：（1）只使用米曲霉制曲，而米曲霉分泌的β-葡萄糖苷酶含量很少，只能使大豆中部分异黄酮糖甙分解成异黄酮苷元。（2）高盐高渗环境不利于植物乳杆菌分泌β-葡萄糖苷酶，影响酱油中异黄酮苷元的含量，从而降低酱油的生物活性。

[0006] 通过检索国内外现有技术发现，米曲霉和乳酸菌在酱油制作过程中均有使用，但大多都是采用单一米曲霉制曲，在酱醪发酵阶段添加乳酸菌的常规工艺，造成成品酱油中异黄酮苷元的含量极低。而本发明采用一定溶度的食醋浸泡大豆，使吸涨后的大豆呈一定的酸性，为制曲阶段乳酸菌的生长繁殖提供条件；并在制曲阶段采用米曲霉和乳酸菌协同制曲，同时控制多菌种的添加比例、时机及方式，确保多菌种协调生长，制曲完成后以β-葡萄糖苷酶酶活和中性蛋白酶酶活为主要指标，促进酱油中异黄酮苷元含量提升的目的，同时又能确保酱油的品级。该方法避免了微生物后期的加入对高盐稀态酱醪新环境的不适应，克服了制曲及酱醪发酵过程中β-葡萄糖苷酶活力不足的困难，提高了酱油中异黄酮苷元的含量，增加酱油的生物活性。

[0007] 鉴于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种利用人工接种米曲霉和两种乳酸菌一起制曲的方法，该方法利用三种微生物发酵菌对营养物质的竞争、协同、拮抗作用，最终达到和谐的制曲生态环境，为发酵阶段提供充足的β-葡萄糖苷酶及丰富的酶系。

[0008] 为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种富含大豆异黄酮苷元的酱油，其特征在于：所述的酱油在制备过程中使用米曲霉、双歧杆菌和嗜盐乳酸菌，按如下步骤制备而成：
（1）原料处理：选大豆、面粉和炒小麦为原料，重量比例为6:3:1～8:1:1，大豆在浸泡液中45℃浸泡6h，沥水，混合面粉和炒小麦后121℃蒸煮15min。

[0009] （2）成曲制备：待原料冷却至30～35℃时，按曲料重量接入1‰～5‰米曲霉孢子3 5
粉和的双歧杆菌10～10 个/g原料，曲室湿度保持在90%以上，制曲温度32～35℃，制
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曲12～14h第一次松曲，同时接入嗜盐乳酸菌10～10 个/g原料；控制曲室温度30～
33℃，制曲20～22h进行第二次松曲，然后调节温度至28～30℃，制曲44～48h结束。成
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曲中双歧杆菌数10～10 cfu/g，嗜盐乳酸菌10～10 cfu/g，且双歧杆菌与嗜盐乳酸菌比例为15:1～1:1。

[0010] （3）稀醪发酵：打散曲料，均匀拌入40℃的18°Bé盐水（NaCl），盐水质量为成曲质量的2倍，35℃恒温发酵90d。

[0011] 进一步优选地，如上所述的一种富含大豆异黄酮苷元的酱油生产工艺，其特征在于大豆浸泡液为10%～30%（V/V）浓度的食醋，所用的食醋为山西老陈醋或镇江香醋中的一种，且酸度不低于4%。

[0012] 进一步优选地，如上所述的一种富含大豆异黄酮苷元的酱油生产工艺，其特征在于所添加的双歧杆菌为青春双歧杆菌CICC 6175，具有高出β-葡萄糖苷酶的特性。所添加的嗜盐乳酸菌为耐盐植物乳杆菌CICC 20039，耐盐度达到15%且能在高盐高渗环境下产β-葡萄糖苷酶。

[0013] 进一步优选地，如上所述的一种富含大豆异黄酮苷元的酱油生产工艺，其特征在于所添加的双歧杆菌和嗜盐乳酸菌均采用微囊化对其进行包裹，使其不影响米曲霉的生长繁殖。

[0014] 进一步优选地，如上所述的一种富含大豆异黄酮苷元的酱油生产工艺，所述的微囊化对双歧杆菌和嗜盐乳酸菌进行包裹，其特征在于使用海藻酸钠、阿拉伯胶作为壁材，采用喷雾干燥法制备双歧杆菌和嗜盐乳酸菌微胶囊；制备工艺为将2%(W/V)海藻酸钠溶液与0.5%(W/V)阿拉伯胶溶液以4:1（V:V）比例混匀，经微孔滤膜(孔径0.22µm)过滤除菌作为
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壁材溶液，与乳酸菌菌悬液（10～10 细胞数/mL）混匀(壁材溶液:菌悬液=5:1（V:V）)搅拌10min，过胶体磨2遍，喷雾干燥，即得微胶囊菌体。喷雾干燥的条件为进风温度150～
160℃，出风温度60～70℃，均质压力30～40MPa。

[0015] 与现有技术相比，本发明的技术核心是在富含大豆异黄酮苷元的多菌种制曲工艺控制，即如何让三种微生物在制曲阶段协调生长，使成曲中富含大量的大豆异黄酮苷元；米曲霉生长旺盛，分泌丰富的酶系，发酵阶段分解大豆蛋白，提供更多人体所需的必需氨基酸；另外采用一定浓度的食醋浸泡大豆为制曲过程中双歧杆菌和嗜盐乳酸菌的适量生长繁殖提供条件，获得足够的数量及达到合理的比例，促使成曲中具有较高的β-葡萄糖苷酶酶活，并由于嗜盐乳酸菌的存在，β-葡萄糖苷酶会一直存在于酱醪发酵阶段。本发明成功解决了如下问题：1、制曲阶段三种微生物的添加量、顺序及添加方式：本发明通过对富含大豆异黄酮苷元的酱油生产工艺的研究，确定了富含大豆异黄酮苷元的多菌种制曲的添加量、顺序及添加方式，即待曲料冷却后按曲料重量接入1‰～5‰米曲霉孢子粉和采用微囊化包裹的双
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歧杆菌10～10 个/g原料，第一次松曲时（12～14h）接入同样采用微胶囊包裹的嗜盐乳
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酸菌10～10 个/g原料。由于双歧杆菌被微胶囊所包裹，不会同时使大量的双歧杆菌进入曲料，避免了双歧杆菌与米曲霉对营养物质的竞争，不影响米曲霉的大量繁殖和生长，在米曲霉大量生长的后期，微胶囊包裹的双歧杆菌全部进入曲料，此时米曲霉的大量生长可为其提供丰富的小分子营养物质，而且此时米曲霉菌丝旺盛，曲料结块，为双歧杆菌的生长提供厌氧条件，同理于嗜盐乳酸菌。

[0016] 2、双歧杆菌和嗜盐乳酸菌的添加比例：双歧杆菌具有产β-葡萄糖苷酶的特性，可使成曲中大豆异黄酮苷元的含量远高于单一米曲霉制曲的成曲，但酱醪发酵阶段是一个高盐高渗的环境，双歧杆菌不能在此环境存活，且β-葡萄糖苷酶的活力也会部分受到抑制；由于嗜盐乳酸菌的存在，它可在此环境下生存，并产一定量的β-葡萄糖苷酶，使整个酱醪发酵阶段β-葡萄糖苷酶得到补充，促进生产更多的大豆异黄酮苷元。本技术方案中5 7
成曲中双歧杆菌和嗜盐乳酸菌分别需要达到10～10 cfu/g，才能充分发挥它们的发酵作用，而且双歧杆菌和嗜盐乳酸菌比例须为15:1～1:1，优选比例为15:1～5:1。过高的比例造成酱醪发酵的后期β-葡萄糖苷酶含量不足，过低的比例造成成曲中β-葡萄糖苷酶含量不足，都会导致成品酱油中异黄酮含量较低。

[0017] 3、双歧杆菌和嗜盐乳酸菌的性能要求：双歧杆菌为青春双歧杆菌 CICC 6175，具有高产β-葡萄糖苷酶的能力；嗜盐乳酸菌为植物乳杆菌 CICC 20039，耐盐需达到15%，且能在高盐高渗环境下分泌β-葡萄糖苷酶。

[0018] 以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

[0019] 双歧杆菌和嗜盐乳酸菌培养制备青春双歧杆菌接种于灭菌的强化梭菌培养基(RCM)，混匀，37℃培养箱培养48h；耐盐植物乳杆菌接种于灭菌的添加了15%（W/V）NaCl的乳酸细菌培养基（MRS）中，于37℃培养箱培养48h。使用海藻酸钠、阿拉伯胶作为壁材，采用喷雾干燥法制备双歧杆菌和嗜盐乳酸菌微胶囊。制备工艺为将2%(W/V)海藻酸钠溶液与0.5%(W/V)阿拉伯胶溶液以4:1（V:V）
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比例混匀，经微孔滤膜(孔径0.22µm)过滤除菌作为壁材溶液，与菌悬液（1×10细胞数/mL）混匀(壁材溶液:菌悬液=5:1（V:V）)搅拌10min，过胶体磨2遍，喷雾干燥，即得微胶囊菌体。喷雾干燥的条件为进风温度150～160℃，出风温度60～70℃，均质压力30～
40MPa。

[0020] 实施例1（1）原料处理：选大豆、面粉和炒小麦为原料，比例为6:3:1，用10%（V/V）山西老陈醋溶液45℃浸泡大豆6 h沥干，混合面粉和炒小麦后121℃蒸煮15min。

[0021] （2）成曲制备：待原料冷却至35℃时，按曲料重量接入2‰米曲霉孢子粉和采用微4
胶囊包裹的青春双歧杆菌6×10个/g原料，曲室湿度保持在90%以上，制曲温度32℃，12h
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第一次松曲，同时接入同样采用微胶囊包裹的耐盐植物乳杆菌4×10个/g原料；控制曲室温度30℃，制曲20h进行第二次松曲，然后调节温度至28℃，制曲48h结束，在此条件下，成曲曲料疏松，表面成墨绿色，具有特有的曲香，无异味。

[0022] （3）稀醪发酵：打散曲料，均匀拌入40℃的18°Bé盐水（NaCl），盐水质量为成曲质量的2倍，35℃恒温发酵90d。为防止酱醪表面形成白膜，采取用聚乙烯薄膜封盖酱醪表面。

[0023] （4）品质分析：采用本实施方式制备的成曲具有曲香浓郁，中性蛋白酶活可达到1590U/g干曲，与常规工艺相当，且β-葡萄糖苷酶活可达到680U/g干曲；青春双歧杆6 5
菌6×10cfu/g，耐盐植物乳杆菌4×10cfu/g，青春双歧杆菌与耐盐植物乳杆菌比例约为
15:1；成品酱油大豆异黄酮苷元的总量为991μg/g，具体结果见表1。

[0024] 实施例2（1）原料处理：选大豆、面粉和炒小麦为原料，比例为8:1:1，用20%（V/V）镇江香醋45℃浸泡大豆6h，沥水，混合面粉和炒小麦后121℃蒸煮15min。

[0025] （2）成曲制备：待原料冷却至30℃时，按曲料重量接入5‰米曲霉孢子粉和采用微3
胶囊包裹的青春双歧杆菌2×10个/g原料，曲室湿度保持在90%以上，制曲温度33℃，13h
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第一次松曲，同时接入同样采用微胶囊包裹的耐盐植物乳杆菌8×10个/g原料；控制曲室温度32℃，制曲21h进行第二次松曲，然后调节温度至30℃，制曲44h结束。在此条件下，成曲曲料疏松，表面成墨绿色，具有特有的曲香，无异味。

[0026] （3）稀醪发酵：打散曲料，均匀拌入40℃的18°Bé盐水（NaCl），盐水质量为成曲质量的2倍，35℃恒温发酵90d。为防止酱醪表面形成白膜，采取用聚乙烯薄膜封盖酱醪表面。

[0027] （4）品质分析：采用本实施方式制备的成曲具有曲香浓郁，中性蛋白酶活可达到1670U/g干曲，与常规工艺相当，且β-葡萄糖苷酶活可达到590U/g干曲；青春双歧杆6 5
菌3×10cfu/g，耐盐植物乳杆菌6×10cfu/g，青春双歧杆菌与耐盐植物乳杆菌比例约为
5:1；成品酱油大豆异黄酮苷元的总量为954μg/g，具体结果见表1。

[0028] 实施例3（1）原料处理：选大豆、面粉和炒小麦为原料，比例为7:2:1，用 30%（V/V）山西老陈醋溶液45℃浸泡大豆6h沥干，混合面粉和炒小麦后121℃蒸煮15min。

[0029] （2）成曲制备：待原料冷却至35℃时，按曲料重量接入3‰米曲霉孢子粉和采用微4
胶囊包裹的青春双歧杆菌5×10个/g原料，曲室湿度保持在90%以上，制曲温度34℃，14h
4
第一次松曲，同时接入同样采用微胶囊包裹的耐盐植物乳杆菌5×10个/g原料；控制曲室温度32℃，制曲24h进行第二次松曲，然后调节温度至30℃，制曲48h结束。在此条件下，成曲曲料疏松，表面成墨绿色，具有特有的曲香，无异味。

[0030] （3）稀醪发酵：打散曲料，均匀拌入40℃的18°Bé盐水（NaCl），盐水质量为成曲质量的2倍，35℃恒温发酵90d。为防止酱醪表面形成白膜，采取用聚乙烯薄膜封盖酱醪表面。

[0031] （4）品质分析：采用本实施方式制备的成曲具有曲香浓郁，中性蛋白酶活可达到1620U/g干曲，与常规工艺相当，且β-葡萄糖苷酶活可达到800U/g干曲；青春双歧杆6 5
菌5×10cfu/g，耐盐植物乳杆菌5×10cfu/g，青春双歧杆菌与耐盐植物乳杆菌比例约为
10:1；成品酱油大豆异黄酮苷元的总量为1046μg/g，具体结果见表1。

[0032] 对比实施例1（1）原料处理：实施同实施例1。

[0033] （2）成曲制备：除只接种米曲霉外，其它均同实施例1。

[0034] （3）稀醪发酵：实施同实施例1。

[0035] （4）品质分析：分析方法同实施例1，具体结果见表1。

[0036] 对比实施例2（1）原料处理：实施同实施例1。

[0037] （2）成曲制备：除只接种米曲霉和青春双歧杆菌外，其它均同实施例1。

[0038] （3）稀醪发酵：实施同实施例1。