에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 포함하는 발효 제품 및 그의 제조 방법

에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 포함하는 발효 제품 및 그의 제조 방법{FERMENTATION PRODUCT CONTAINING EQUOL-PRODUCING MICROORGANISM HAVING MAINTAINED EQUOL-PRODUCING ABILITY, AND METHOD FOR PRODUCING SAME}

본 발명은 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태에서 포함하는 발효 제품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물을 포함하고, 보존 후에도 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

대두 속에 포함되는 이소플라본(대두이소플라본; 다이드제인, 제니스테인, 글리시테인)은 에스트라디올과 구조가 유사하며, 에스트로겐 수용체(이하, ER이라 표기함)에의 결합에 따른 항에스트로겐 작용 및 에스트로겐-유사 작용을 갖고 있다. 지금까지의 대두이소플라본의 역학 연구나 개입 연구에서는, 항에스트로겐 작용에 의한 유방암, 전립선암 등의 호르몬 의존성의 암의 예방 효과나, 에스트로겐-유사 작용에 의한 갱년기 장해, 폐경 후의 골다공증, 고지혈증의 개선 효과가 시사되고 있다.

최근 이들 대두이소플라본의 생리 작용의 활성 본체가 다이드제인의 대사물인 에쿠올일 가능성이 지적되고 있다. 즉, 에쿠올은 대두이소플라본과 비교하여 ER과의 결합능(특히, ERβ와의 결합)이 강하고, 유방이나 전립선 조직 등의 표적 장기로의 이행성이 현저히 높은 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1 내지 4 참조). 또한, 환자-대조 연구에서는, 유방암, 전립선암 환자에게서 에쿠올 생산자가 유의하게 적은 것이 보고되었으며, 폐경 후의 골밀도, 지질대사에 대한 대두이소플라본의 개선 효과를 에쿠올 생산자와 비생산자로 나눠 해석하면 에쿠올 생산자에서 유의하게 개선된 것도 보고되고 있다.

에쿠올은 다이드제인으로부터 장내 세균의 대사를 거쳐 생산되지만, 에쿠올 생산능에는 개인차가 있어, 일본인의 에쿠올 생산자의 비율은 약 50 ％로 보고되고 있다. 즉, 일본인의 약 50 ％가 에쿠올을 생산할 수 없는 사람(에쿠올 비생산자)이고, 이러한 사람은 대두나 대두 가공 식품을 섭취하여도, 에쿠올의 작용에 기초하는 유용 생리 효과를 얻을 수 없다. 따라서, 에쿠올 비생산자에게 에쿠올의 작용에 기초하는 유용 생리 효과를 발현시키기 위해서는, 에쿠올 생산 미생물을 생균 그대로 섭취시키는 것이 유효하다고 생각된다.

한편, 에쿠올 생산 미생물에 대해서는 이미 공지이고, 예를 들면 본 발명자 등에 의해서 박테로이데스 E-23-15(FERM BP-6435호), 스트렙토코커스 E-23-17(FERM BP-6436호), 스트렙토코커스 A6G225(FERM BP-6437호) 및 락토코커스 20-92(FERM BP-10036호)가 인간의 장내에서 단리되어 있다(특허문헌 1 및 2 참조).

따라서, 에쿠올 생산 미생물을 생균 그대로 포함하는 발효 제품을 제공할 수 있으면, 에쿠올 생산 미생물의 섭취가 가능해지고, 에쿠올 생산 미생물에 기초하는 유용 효과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 그러나, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 통상의 방법에 따라 발효 제품을 제조하면, 상기 미생물의 에쿠올 생산능이 상실되어, 에쿠올 생산 미생물을 생균 그대로 포함하는 발효 제품이 얻어지지 않는다는 문제점이 있다. 또한, 에쿠올 생산 미생물은 저pH 조건이나 호기적 보존 등에 의해 에쿠올 생산능이 상실되기 쉬운 경향이 강하기 때문에, 가령 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 유지시킨 상태에서 발효 제품을 제조할 수는 있어도, 보존에 견딜 수 없으며, 유통 단계에서 에쿠올 생산능이 손상된다는 문제점도 있다.

이러한 종래 기술을 배경으로, 에쿠올 생산을 유지한 미생물을 생균 그대로 포함하는 발효 제품의 개발이 갈망되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 발효 제품을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은, 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태에서 포함하고, 게다가 보존 후에도 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지할 수 있는 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 바, 놀랍게도 에쿠올 생산 미생물을 이용한 발효에 있어서, 마더 스타터(mother starter)의 제조로부터 본발효에 걸친 각 공정에서, 사용하는 원료에 따라 발효 분위기 및 pH 등에 특단의 창의 고안을 행함으로써, 공업적 규모로의 적용 가능한 방법으로, 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 발효물이 얻어지는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 조성물에 아스코르브산 및/또는 그의 유도체를 첨가함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지할 수 있고, 보존 안정성이 우수한 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물이 얻어지는 것을 발견하였다. 구체적으로는, 본 발명자들은 이하의 지견을 발견하였다.

(i) 제1법의 발효물의 제조 방법

에쿠올 생산 미생물을 이용하고, 대두 분말 또는 두유를 원료로서 발효물을 제조할 때에, (1) 에쿠올 생산 미생물을 이용하여, 다이드제인류의 존재하에 pH 5.0 이상, 혐기 조건하에서 발효함으로써 마더 스타터를 제조하고, (2) 상기 마더 스타터를 이용하여, 다이드제인류의 존재하에 pH 5.0 이상으로 발효함으로써 벌크 스타터(bulk starter)를 제조하고, (3) 상기 벌크 스타터를 이용하여, 대두 분말 또는 두유를 포함하는 배지에서 발효하여 발효물을 제조함으로써, 에쿠올 생산능이 유지된 미생물을 생균 그대로 포함하는 발효물의 제조가 가능해진다.

(ii) 제2법의 발효물의 제조 방법

에쿠올 생산 미생물을 이용하고, 유즙(milk)을 원료로서 발효물을 제조할 때에, 마더 스타터를 다이드제인류의 존재하에서 혐기 조건하에서 발효시킴으로써 제조하고, 추가로 마더 스타터를 이용하여 유원료를 발효시킬 때에, 다이드제인류의 존재하에 pH 4.6 이상이 되는 조건하에서 행함으로써, 에쿠올 생산능이 유지된 미생물을 생균 그대로 포함하는 발효물의 제조가 가능해진다. 또한, 해당 발효물은 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능이 장기간에 걸쳐 유지되어, 보존 안정성도 우수하다. 또한, 마더 스타터의 제조로부터 유원료의 발효에 걸쳐 행해지는 모든 발효를 효모 엑기스의 존재하에서 실시함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능의 유지 및 보존 안정성을 한층 향상시킬 수 있다.

(iii) 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물

에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 발효 제품에 아스코르브산 및/또는 그의 유도체를 첨가함으로써, 보존 후에도 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능이 상실되지 않는 조성물의 제공이 가능해진다.

본 발명은 이들 지견에 기초하여 개선을 더욱 거듭함으로써 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 하기 양태의 발명을 제공한다.

항1. 이하의 공정을 포함하는 발효물의 제조 방법:

(1) 다이드제인 배당체, 다이드제인 및 디히드로다이드제인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 다이드제인류를 함유하는 배지에서, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 pH 5.0 이상을 유지한 상태에서 혐기 발효를 행함으로써 마더 스타터를 제조하는 공정,

(2) 상기 공정 (1)에서 얻어진 마더 스타터를 이용하여, 상기 다이드제인류를 함유하는 배지에서, pH 5.0 이상을 유지한 상태에서 발효를 행함으로써 벌크 스타터를 제조하는 공정, 및

(3) 상기 공정 (2)에서 얻어진 벌크 스타터를 이용하여, 대두 분말 및/또는 두유를 포함하는 배지에서 발효를 행함으로써 발효물을 얻는 공정.

항2. 상기 항1에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 유산균인 제조 방법.

항3. 상기 항1에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 락토코커스 가르비에( Lactococcus garvieae )인 제조 방법.

항4. 이하의 공정을 포함하는 발효물의 제조 방법:

(I) 다이드제인 배당체, 다이드제인 및 디히드로다이드제인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 다이드제인류를 함유하는 배지에서, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 혐기 발효함으로써 마더 스타터를 제조하는 공정, 및

(II) 상기 공정 (I)에서 얻어진 마더 스타터를 이용하여, 상기 다이드제인류 및 유즙을 포함하는 배지에서, pH 4.6 이상을 유지한 상태에서 발효를 행함으로써 발효물을 얻는 공정.

항5. 상기 항4에 있어서, 다이드제인류로서 대두 배축 추출물이 사용되는 제조 방법.

항6. 상기 항4에 있어서, 상기 공정 (I) 및 (II)에서 사용되는 배지가 효모 엑기스를 더 포함하는 제조 방법.

항7. 상기 항4에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 유산균인 제조 방법.

항8. 상기 항4에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 락토코커스 가르비에인 제조 방법.

항9. 상기 항1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 발효물을 함유하는 발효 제품.

항10. 상기 항4 내지 8 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 발효물을 함유하는 발효 제품.

항11. 상기 항10에 있어서, pH가 4.6 이상인 발효 제품.

항12. (A) 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물, 및 (B) 아스코르브산, 그의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물.

항13. 상기 항12에 있어서, 상기 (B) 성분이 0.05 내지 5 중량％의 배합 비율로 포함되는 조성물.

항14. 상기 항12에 있어서, pH가 5.0 이하인 조성물.

항15. 상기 항12에 있어서, 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물로서, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 발효한 발효물을 포함하는 조성물.

항16. 상기 항12에 있어서, 발효 대두 음료 또는 발효 두유인 조성물.

항17. 상기 항12에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 유산균인 조성물.

항18. 상기 항12에 있어서, 에쿠올 생산 미생물이 락토코커스 가르비에인 조성물.

항19. 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물을 포함하는 조성물에 아스코르브산, 그의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능의 유지 방법.

본 발명의 제조 방법에 따르면, 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 발효 제품을 제조할 수 있기 때문에, 세계 최초로 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 음식품을 제공하는 것이 실현된다. 또한, 본 발명의 제조 방법은, 대량 생산을 요하는 공업적 규모로 실시하여도, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 유지하여 발효를 진행시킬 수 있기 때문에, 상업상의 실용성이 높아 매우 유용성이 있다.

에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 음식품을 제공할 수 있으면, 에쿠올을 생산할 수 없는 인간(에쿠올 비생산자)에 대하여, 에쿠올 생산능을 획득시킬 수 있기 때문에, 본 발명에 의해 에쿠올 비생산자에 대하여 에쿠올에 기초하는 유효 생리 활성을 얻는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에 따르면, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 장기간 안정적으로 유지할 수 있고, 유통·판매에 충분히 견딜 수 있는 보존 안정성을 구비하고 있다. 특히, 본 발명의 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물이 발효 대두 음료 또는 발효 두유의 형태인 경우에는, 다이드제인류를 비롯한 대두 유래의 유용 성분과 함께, 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물이 포함되어 있기 때문에, 장내에서 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올을 생성하기 쉬워진다는 이점도 있다.

[도 1] 실시예 4에서, 각 음료에 포함되는 락토코커스 가르비에의 생균수를 측정한 결과이다.
[도 2] 실시예 4에서, 각 음료에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능을 측정한 결과이다.

본 발명에서 에쿠올 생산 미생물이란, 다이드제인 배당체, 다이드제인 및 디히드로다이드제인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 다이드제인류를 자화하여 에쿠올을 생산하는 능력(대사 활성)을 갖는 미생물이다. 여기서 다이드제인 배당체로는, 구체적으로는 다이드진, 말로닐다이드진, 아세틸다이드진 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 에쿠올 생산 미생물로는 식품으로서 섭식이 허용되며, 에쿠올 생산능을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 락토코커스 가르비에( Lactococcus garvieae ) 등의 락토코커스속에 속하는 미생물; 스트렙토코커스 인터메디우스( Streptococcus intermedius ), 스트렙토코커스 콘스텔라투스( Streptococcus constellatus ) 등의 스트렙토코커스속에 속하는 미생물; 락토바실러스 뮤코사에( Lacobacillus mucosae ) 등의 락토바실러스속에 속하는 미생물; 박테로이데스 오바투스( Bacteroides ovatus ) 등의 박테로이데스 속에 속하는 미생물; 엔테로코커스 패시움( Enterococcus faecium ) 등의 엔테로코커스속에 속하는 미생물; 피네골디아 마그나( Finegoldia magna ) 등의 피네골디아속에 속하는 미생물; 베일로넬라( Veillonella )속에 속하는 미생물; 애들러크루지아 에쿠올리파시엔스( Adlercreutzia equolifaciens ) 등의 애들러크루지아속에 속하는 미생물; 유박테리움 리모섬( Eubacterium limosum ) 등의 유박테리움속에 속하는 미생물; 에게르텔라 홍콘게니스( Eggerthella hongkongenis ) 등의 에게르텔라( Eggerthella )속에 속하는 미생물; 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis ), 비피도박테리움 브레베( Bifidobacterium breve ) 등의 비피도박테리움속에 속하는 미생물; 슬락키아( Slackia )속에 속하는 미생물; 아시네토박터( Acinetobacter )속에 속하는 미생물 등의 속에 상기 능력을 갖는 미생물이 존재하고 있는 것을 알 수 있다. 에쿠올 생산 미생물 중에서, 바람직하게는 락토코커스속, 스트렙토코커스속, 락토바실러스속 및 비피도박테리움속 등의 유산균이고, 더욱 바람직하게는 락토코커스속에 속하는 유산균이며, 특히 바람직하게는 락토코커스 가르비에를 들 수 있다. 에쿠올 생산 미생물은, 예를 들면 인간 장내 중에서 에쿠올의 생산능의 유무를 지표로서 단리할 수 있다. 상기 에쿠올 생산 미생물에 대해서는, 본 발명자 등에 의해 인간 장내에서 단리 동정된 균, 즉 락토코커스 20-92(FERM BP-10036호), 스트렙토코커스 E-23-17(FERM BP-6436호), 스트렙토코커스 A6G225(FERM BP-6437호) 및 박테로이데스 E-23-15(FERM BP-6435호)가 기탁되어 있고, 본 발명에서는 이들 기탁균을 사용할 수 있다. 또한, 에쿠올 생산 미생물로는 유박테리움 림노섬(ATCC 8486), 에게르텔라 에스피(KCC10490), 애들러크루지아 에쿠올리파시엔스(JCM14793), 에게르텔라 홍콘게니스 HKU10(JCM14552), 비피도박테리움 아돌레센티스 TM-1(FERM P-20325호), 비피도박테리움 브레베(JCM1273), 슬락키아 TM30(FERM AP-20729호), 그램 양성 세균 do03(AHU-1763)(FERM AP-20905호) 등에 대해서도 사용할 수 있다. 이들 기탁균 중에서도, 본 발명에서 락토코커스 20-92가 바람직하게 사용된다.

이하, 본 발명의 발효물의 제조 방법(제1법과 제2법), 발효 제품 및 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에 대해서 상술한다. 제1법은 대두 분말 및/또는 두유를 원료로서 발효물을 제조하는 방법이고, 제2법은 유즙을 원료로서 발효물을 제조하는 방법이다.

본 명세서에서, 마더 스타터란 스톡컬쳐로부터 제조되는 스타터(종균)이고, 벌크 스타터란 마더 스타터를 이용하여 제조된 스타터(종균)이며, 본발효에 의해서 발효물을 대량 생산할 때에 스타터로서 사용되는 것이다.

1. 발효물의 제조 방법 ( 제1법 )

본 제1법의 발효물의 제조 방법은 마더 스타터(이하, "마더 스타터-1"이라고도 함)를 제조하는 공정 (1), 마더 스타터-1을 이용하여 벌크 스타터(이하, "벌크 스타터-1"이라고도 함)를 제조하는 공정 (2) 및 벌크 스타터-1을 이용하여 대두 분말 또는 두유를 원료로서 발효물을 제조하는 공정 (3)을 포함한다. 이하, 본 제1법의 발효물의 제조 방법에 대해서 공정마다 상술한다.

공정 (1)

본 발명에서는, 우선 에쿠올 생산 미생물을 다이드제인류를 포함하는 배지(이하, "마더 스타터 배지-1"이라고도 함)로, pH 5.0 이상을 유지한 상태에서 혐기 발효함으로써, 마더 스타터(이하, "마더 스타터-1"이라고도 함)를 제조한다(공정 (1)).

마더 스타터 배지-1은 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하고, 또한 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로서 특별히 제한되지 않으며, 최종적으로 제조되는 발효물의 종류에 따라, 그의 조성을 적절하게 설정할 수 있다.

마더 스타터 배지-1에 사용되는 다이드제인류란, 다이드제인 배당체, 다이드제인 및 디히드로다이드제인 중 1종 또는 2종 이상의 다이드제인류를 포함하는 것이다. 다이드제인 배당체로는, 구체적으로는 다이드제인, 말로닐다이드제인, 아세틸다이드제인 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 상기 다이드제인류로서 다이드제인류의 순품, 다이드제인류의 조 정제품 및 다이드제인류를 포함하는 물질 중 어느 하나를 사용할 수도 있다. 다이드제인류를 포함하는 물질로는 대두, 두유, 대두 배축, 칡, 칡뿌리, 레드글로브, 알팔파 및 이들 추출물(물, 함수 알코올 등의 극성 용매 추출물) 등을 들 수 있다. 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시킨다는 관점에서, 본 발명에 사용되는 다이드제인류로서 대두, 두유, 대두 배축 또는 그의 추출물이 바람직하고, 특히 대두가 바람직하다.

여기서 다이드제인류로서 대두를 사용하는 경우에는, 바람직하게는 분말화한 대두, 더욱 바람직하게는 증자(蒸煮) 또는 자비(煮沸)하고, 분말화한 대두, 특히 바람직하게는 65 내지 105 ℃에서 30 초 내지 30 분간 증자 또는 자비하고 분말화한 대두를 들 수 있다. 또한, 분말화한 대두의 평균 입경에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 제조되는 발효물에 양호한 식감을 구비하게 한다는 관점에서, 메디안 직경이 약 50 ㎛ 정도 이하로 하는 것이 바람직하다. 또한, 입경 150 ㎛ 이상의 입자가 10 ％ 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 입경은 레이저 회절/산란식 입도 분포 측정 장치를 이용하여 측정된다.

마더 스타터 배지-1 중 다이드제인류 함유물의 배합 비율로는, 예를 들면 다이드제인류의 총량이 0.002 내지 0.04 중량％, 바람직하게는 0.004 내지 0.02 중량％, 더욱 바람직하게는 0.008 내지 0.012 중량％가 되는 비율을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 다이드제인류로서 대두 분말을 사용하는 경우이면, 마더 스타터 배지-1 중에 대두 분말이 건조 중량 환산으로 3 내지 28 중량％, 바람직하게는 5 내지 28 중량％, 더욱 바람직하게는 7 내지 17 중량％가 되는 비율을 들 수 있다. 또한, 다이드제인류로서 대두 배축 추출물을 사용하는 경우이면, 마더 스타터 배지-1 중에 대두 배축 추출물이 건조 중량 환산으로 0.005 내지 0.1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.05 중량％, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.03 중량％가 되는 비율을 들 수 있다. 이러한 배합 비율로 다이드제인류를 포함함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시켜 마더 스타터-1을 얻는 것이 가능해진다.

또한, 마더 스타터 배지-1에는, 에쿠올 생산 미생물이 육성을 촉진시키기 위해, 아르기닌 등의 아미노산; 아스코르브산 등의 비타민류; 피롤린산철 등의 미량 금속이 포함될 수도 있다. 마더 스타터 배지-1에서, 아르기닌의 첨가는 에쿠올 생산 미생물의 육성을 양호하게 하기 위해서 바람직하고, 마더 스타터 배지-1에서의 아르기닌의 배합 비율로는, 예를 들면 0.01 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 0.3 중량％가 예시된다.

또한, 마더 스타터 배지-1에는, 필요에 따라 상기 성분 이외에 질소원, 탄소원 등의 영양소가 첨가될 수도 있다.

마더 스타터 배지-1은, 발효물의 풍미에 영향을 미치는 경우가 있기 때문에, 바람직하게는 발효물의 풍미에 악영향을 미치지 않는 배지가 예시된다.

마더 스타터 배지-1은 소정량의 첨가 성분을 혼합하고, 필요에 따라 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

본 공정 (1)에서, 에쿠올 생산 미생물의 혐기 발효는 가스팩이나 혐기 배양기를 사용하는 종래 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

또한, 본 공정 (1)에서, 혐기 발효는 pH가 5.0 이상, 바람직하게는 5.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0이 되도록 유지하여 행해진다. 이와 같이 pH를 유지함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시킨 마더 스타터-1을 제조할 수 있고, 본 제1법의 제조 방법에 의해서 최종적으로 얻어지는 발효물에 있어서, 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해진다. 이러한 혐기 발효 중 pH의 제어는 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 사용하는 배지에서, 에쿠올 생산 미생물에 의해 자화되는 당질(예를 들면, 포도당 등)의 배합 비율을 0.5 중량％ 이하, 바람직하게는 0.4 중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 0.3 중량％ 이하로 설정하면, 발효가 진행되어도 pH가 저하되지 않기 때문에, 혐기 발효 중 pH를 상기 범위로 유지시키는 것이 가능해진다. 또한, 혐기 발효 중 pH의 제어는 pH 조정제를 적절하게 첨가함으로써 행할 수도 있다.

본 공정 (1)에서의 혐기 발효는, 에쿠올 생산 미생물의 종균을 마더 스타터 배지-1에 접종하여, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 20 내지 96 시간, 바람직하게는 72 내지 96 시간 동안 혐기 발효시킴으로써 실시된다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 예를 들면 35 내지 39 ℃에서 72 내지 96 시간 동안 혐기 발효하면 된다.

이와 같이 하여 얻어지는 마더 스타터-1은, 에쿠올 생산 미생물이 증식하고 또한 에쿠올 생산능이 유지된 상태에서 포함되어 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 마더 스타터는, 그대로 다음 공정 (2)에 제공함과 동시에, 필요에 따라 해당 마더 스타터를 종균으로서 사용하여, 상기와 동일한 조건으로 추가로 마더 스타터를 제조하고, 다음 생산에 이용할 수도 있다. 제조된 마더 스타터를 사용하여, 상기와 동일한 조건으로 재차 마더 스타터를 제조하는 공정은, 1회 또는 복수회, 예를 들면 1 내지 10회 정도 반복하여 행할 수도 있다. 이와 같이 발효를 반복하여 실시하여도, 상기 조건을 충족하는 한, 마더 스타터-1에서 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올 생산능을 유지한 상태에서 포함시킬 수 있다.

공정 (2)

이어서, 상기 공정 (1)에서 얻어진 마더 스타터-1을 이용하여, 상기 다이드제인류를 함유하는 배지에서(이하, "벌크 스타터 배지-1"이라고도 함), pH 5.0 이상을 유지한 상태에서 발효를 행함으로써 벌크 스타터-1(이하, "벌크 스타터-1"이라고도 함)을 제조한다(공정 (2)).

벌크 스타터 배지-1은 상기 다이드제인류를 포함하는 것이며, 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하고, 또한 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로서 특별히 제한되지 않으며, 발효물의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

벌크 스타터 배지-1은 다이드제인류를 함유함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 유지한 상태에서 증식시키는 것이 가능해지고 있다. 벌크 스타터 배지-1에 배합되는 상기 다이드제인류의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 후술하는 본발효용 배지-1과 동일하다.

또한, 벌크 스타터 배지-1에서, 상기 다이드제인류 이외에 배합 가능한 첨가 성분의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 상기 마더 스타터 배지-1과 동일하다. 또한, 벌크 스타터 배지-1은 발효물의 풍미에 영향을 미치는 경우가 있기 때문에, 바람직하게는 발효물의 풍미에 악영향을 미치지 않는 배지, 더욱 바람직하게는 상기 마더 스타터 배지-1과 동일한 조성인 것이 예시된다.

벌크 스타터 배지-1은 소정량의 배합 성분을 혼합하고, 필요에 따라 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

본 공정 (2)에서, 혐기 발효는 pH가 5.0 이상, 바람직하게는 5.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0이 되도록 유지하여 행해진다. 이와 같이 pH를 유지함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시켜 벌크 스타터-1을 제조할 수 있고, 본 제1법의 제조 방법에 의해서 최종적으로 얻어지는 발효물에서, 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해진다. 이러한 발효 중 pH의 제어는 상기 공정 (1)과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.

또한, 본 공정 (2)에서, 발효는 호기 또는 혐기 중 어느 분위기에서도 행할 수 있지만, 제조 비용의 감소, 조작 간편성 등 측면에서, 호기 분위기에서 행하는 것이 바람직하다. 에쿠올 생산 미생물은 호기 분위기에서는 에쿠올 생산능을 상실하기 쉬워지지만, 배양 중 pH 조건을 특정 범위로 제어함으로써, 호기 분위기에서도 에쿠올 생산능을 유지시키는 것이 가능해진다.

본 공정 (2)에서의 발효는, 벌크 스타터 배지-1에 상기 공정 (1)에서 얻어진 마더 스타터-1을 예를 들면 0.5 내지 10 용량％ 정도, 바람직하게는 1 내지 5 용량％ 정도 첨가하고, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 10 내지 28 시간, 바람직하게는 14 내지 24 시간 동안 발효시킴으로써 실시된다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 예를 들면 35 내지 39 ℃에서 14 내지 24 시간 동안 발효할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 벌크 스타터-1은, 에쿠올 생산 미생물이 증식하고 또한 에쿠올 생산능이 유지된 상태에서 포함되어 있다.

벌크 스타터-1은, 그대로 다음 공정 (3)에 제공할 수도 있지만, 필요에 따라 벌크 스타터-1을 스타터(1차 벌크 스타터)로서 사용하고, 재차 본 공정 (2)를 실시하여 2차 벌크 스타터를 제조하고, 이 2차 벌크 스타터를 다음 공정 (3)에 제공할 수도 있다.

공정 (3)

이어서, 상기 공정 (2)에서 얻어진 벌크 스타터-1을 이용하여, 대두 분말 및/또는 두유를 포함하는 배지(이하, "본발효용 배지-1"이라고도 함)로 발효를 행함으로써, 발효물을 제조한다(공정 (3)).

본발효용 배지-1은 대두 분말 및 두유 중 적어도 하나를 포함하는 것이며, 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하고, 또한 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로서 특별히 제한되지 않는다.

본발효용 배지-1로서 사용되는 대두 분말을 포함하는 배지는, 구체적으로는 대두 분말을 포함하는 수용액을 들 수 있다. 본발효용 배지-1에서 사용되는 대두 분말은 풍미나 식감을 양호하게 할 뿐 아니라, 대두 냄새를 억제한다는 관점에서, 증자 또는 자비에 의한 가열 처리를 실시한 대두 분말을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 가열 처리가 실시된 대두 분말로는, 구체적으로는 65 내지 105 ℃에서 30 초 내지 30 분간 증자 또는 자비한 대두를 분말화한 것이 예시된다. 대두 분말의 평균 입경에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 제조되는 발효물에 양호한 식감을 구비하게 한다는 관점에서, 메디안 직경을 약 50 ㎛ 정도 이하로 하는 것이 바람직하다. 또한, 입경 150 ㎛ 이상의 입자가 10 ％ 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 입경은 레이저 회절/산란식 입도 분포 측정 장치를 이용하여 측정된다. 본발효용 배지-1로서 대두 분말을 포함하는 수용액을 사용하는 경우, 물에 대두 분말을 첨가하고, 균질기 등을 이용하여 균질화 처리에 제공하는 것이 바람직하다. 이와 같이 균질화 처리를 행함으로써, 제조되는 발효물이 우수한 식감, 특히 부드러움을 부여하는 것이 가능해진다. 또한, 본발효 배지-1로서, 대두 분말을 포함하는 수용액을 사용하는 경우, 이 수용액에서의 대두 분말의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 대두 분말의 건조 중량 환산으로 3 내지 28 중량％, 바람직하게는 5 내지 28 중량％, 더욱 바람직하게는 7 내지 17 중량％가 예시된다.

본발효용 배지-1로서 두유를 포함하는 배지를 사용하는 경우, 두유를 그대로 본발효용 배지-1로서 사용할 수 있다. 두유의 제조 방법은, 해당 기술분야에서 공지이다. 구체적으로는, 두유는 탈피한 원료 대두를 마쇄하고, 이를 물에 가하여 습식 분쇄함으로써 현탁액(생콩; 콩즙)을 만들어, 이 현탁액을 필요에 따라 가열 처리한 후에, 고액 분리 처리에 의해 고형분(비지)을 제거함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본발효용 배지-1은 상술하는 조성에 추가로 다른 첨가 성분을 포함할 수도 있다. 본발효용 배지-1의 조성은, 제조되는 발효물의 풍미나 식감에 영향을 미치기 때문에, 배합되는 다른 첨가 성분은, 제조 목적의 발효물의 종류에 따라 적절하게 결정된다. 본발효용 배지-1에 배합되는 첨가 성분으로는, 예를 들면 자당, 수크랄로스, 스테비아 등의 감미료; 커피 엑기스, 홍차 엑기스 등의 풍미제; 향료; 과즙, 과실편, 야채즙, 야채편 등의 식물 유래 성분; 글루콘산 등의 산미료; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연, 철 등의 금속; 아스코르브산 등의 비타민류 등을 들 수 있다. 본 공정 (3)에서의 발효에서는 pH의 저하를 억제할 필요가 없기 때문에, 에쿠올 생산 미생물에 의해 자화되는 당류(자당, 글루코오스 등) 등이 포함되는 감미료나 식물 유래 성분이 본발효용 배지-1에 포함될 수도 있다.

본발효용 배지-1은 소정량의 성분을 혼합하고, 필요에 따라 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

본 공정 (3)에서의 발효는, 본발효용 배지-1에 상기 공정 (2)에서 얻어진 벌크 스타터-1을 예를 들면 0.5 내지 10 용량％ 정도, 바람직하게는 1 내지 5 용량％ 정도 첨가하고, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 10 내지 28 시간, 바람직하게는 14 내지 24 시간 동안 교반 또는 정치할 수 있다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 35 내지 39 ℃에서 14 내지 24 시간 동안 발효할 수 있다.

본 공정 (3)에서의 본발효는, 호기 또는 혐기 중 어느 분위기에서 행할 수도 있지만, 제조 비용의 감소, 조작 간편성 등의 측면에서, 호기 분위기에서 행하는 것이 바람직하다.

또한, 본 공정 (3)에서의 발효에서, 발효 중 pH는 특단 제어할 필요는 없다. 통상, 본 공정 (3)에서의 발효가 진행됨에 따라, 발효물 중 pH는 5.0 정도 이하로 저하되는 경향이 인정된다.

에쿠올 생산 미생물은, 통상 호기 분위기 및 pH 5.0 정도 이하에서는, 에쿠올 생산능을 상실하는 경향이 강해지지만, 본 제1법의 제조 방법에 따르면, 상기 공정 (1) 및 (2)를 거쳐 제조된 벌크 스타터-1을 사용하여 최종 단계의 발효를 행함으로써, 에쿠올 생산능이 유지된 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 발효물을 제조하는 것이 가능해진다.

본발효용 배지-1로서 대두 분말을 포함하는 배지를 사용하는 경우, 최종적으로 발효물로서, 음식품으로서 사용되는 발효 대두가 얻어진다. 또한, 본발효용 배지-1로서 두유를 포함하는 배지를 사용하는 경우, 최종적으로 발효물로서, 음식품으로서 사용되는 발효 두유가 얻어진다. 본 제1법의 제조 방법은, 발효 대두 음식품의 제조, 즉 대두 분말을 포함하는 배지를 발효시킨 발효물의 제조에 바람직하다.

이와 같이 하여 얻어지는 발효물은, 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올 생산능을 유지시킨 상태에서 생균으로서 포함되어 있다.

2. 발효물의 제조 방법 ( 제2법 )

본 제2법의 발효물의 제조 방법은, 마더 스타터(이하, "마더 스타터-2"라고도 함)를 제조하는 공정 (I)과, 마더 스타터-2를 이용하여 유즙을 원료로서 발효를 행하는 공정 (II)를 포함한다. 이하, 본 발명의 제조 방법에 대해서 공정마다 상술한다.

공정 (I)

본 발명에서는, 우선 에쿠올 생산 미생물을, 다이드제인류를 포함하는 배지(이하, "마더 스타터 배지-2"라 표기함)로 혐기 발효함으로써, 마더 스타터를 제조한다(공정 (I)).

마더 스타터 배지-2는 다이드제인류를 포함하고, 또한 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하며, 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로 하여, 그의 조성에 대해서는 특별히 제한되지 않으며, 발효물의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

마더 스타터 배지-2에 사용되는 다이드제인류에 대해서는, 상기 제1법의 마더 스타터 배지-1에 사용되는 것과 마찬가지이지만, 본 제2법의 제조 방법에서는 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시킨다는 관점에서, 대두 배축 또는 그의 추출물이 바람직하고, 특히 대두 배축의 추출물이 바람직하다.

마더 스타터 배지-2에 배합되는 상기 다이드제인류의 배합 비율에 대해서는, 상기 제1법에서 사용되는 마더 스타터 배지-1과 동일하다.

또한, 마더 스타터 배지-2는 상술하는 성분 이외에, 추가로 다른 첨가 성분을 포함할 수도 있다. 마더 스타터 배지-2에서 배합 가능한 다른 첨가 성분의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 상기 제1법에서 사용되는 마더 스타터 배지-1과 동일하다.

특히, 마더 스타터 배지-2에는 효모 엑기스, 효모 가수분해물 등의 효모 유래 성분, 유청 가수분해물, 카제인 가수분해물 등의 발효 촉진제를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 본 제2법의 제조 방법에서는 효모 유래 성분, 특히 효모 엑기스는 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 작용을 유효하게 발휘할 수 있다. 마더 스타터 배지-2에 효모 엑기스를 첨가하는 경우, 그의 배합 비율로는 통상 0.0125 중량％ 이상, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.2 중량％를 들 수 있다. 효모 엑기스의 농도가 상기 범위를 충족하는 경우에는, 최종적으로 제조되는 발효물에서, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 장기간 안정적으로 유지시키는 것도 가능해진다.

마더 스타터 배지-2는, 최종적으로 제조되는 발효물의 풍미에 영향을 미치는 경우가 있기 때문에, 바람직하게는 발효물의 풍미에 악영향을 미치지 않는 배지를 들 수 있고, 예를 들면 상기 성분 이외에, 유즙 및 필요에 따라서 유지방 함유 성분을 포함하고 있는 배지가 예시된다. 마더 스타터 배지-2에 배합되는 유즙 및 유지방 함유 성분의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 후술하는 발효용 배지-2와 마찬가지이다. 마더 스타터 배지-2의 바람직한 일례로서, 공정 (II)에서 사용되는 본발효용 배지-2와 동일한 조성의 것이 예시된다.

마더 스타터 배지-2는 소정량의 첨가 성분을 혼합하고, 필요에 따라 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

본 공정 (I)에서, 에쿠올 생산 미생물의 혐기 발효는 가스팩이나 혐기 배양기를 사용하는 종래 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

또한, 본 공정 (I)에서, 혐기 발효 중 pH는 4.6 이상, 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 6.5가 되도록 유지하는 것이 바람직하다. 이와 같이 pH를 유지함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시키고, 또한 제조 후에도 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시킨다는 본 발명의 효과를 증강할 수 있다. 이러한 혐기 발효 중 pH의 제어는, 상기 제1법의 공정 (1)과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.

본 공정 (I)에서의 혐기 발효는, 에쿠올 생산 미생물의 종균을 마더 스타터 배지-2에 접종하여, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 20 내지 28 시간, 바람직하게는 22 내지 26 시간 동안 혐기 발효시킴으로써 실시된다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 예를 들면 35 내지 39 ℃에서 22 내지 26 시간 동안 혐기 발효할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 마더 스타터-2는, 에쿠올 생산 미생물이 증식하고 또한 에쿠올 생산능이 유지된 상태에서 포함되어 있다.

공정 (II)

이어서, 상기 공정 (I)에서 얻어진 마더 스타터-2를 이용하여, 상기 다이드제인류를 포함하는 배지(이하, "본발효용 배지-2"라 표기함)를, pH 4.6 이상을 유지한 상태에서 발효(이하, "본발효"라고도 함)시킨다(공정 (II)).

본 공정 (II)에서는, 상기 공정 (I)에서 얻어진 마더 스타터-2를 본발효용 배지-2에 첨가하여 본발효를 행할 수도 있지만, 발효 유제품을 대량 생산하는 경우에는, 상기 마더 스타터-2를 이용하여 추가로 벌크 스타터(이하, "벌크 스타터-2"라고도 함)를 제조하고, 벌크 스타터-2를 본발효용 배지에 첨가하여 본발효를 행할 수도 있다.

벌크 스타터-2의 제조에 사용되는 배지(이하, "벌크 스타터 배지-2"라 표기함)는, 상기 다이드제인류를 포함하는 것이 사용된다. 이와 같이 다이드제인류를 배합함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 유지한 상태에서 증식시킬 수 있다. 벌크 스타터 배지-2에 배합되는 상기 다이드제인류의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 상기 마더 스타터 배지-2와 동일하다.

또한, 벌크 스타터 배지-2는 상기 다이드제인류를 포함하는 것이며, 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하고, 또한 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로서 특별히 제한되지 않으며, 발효물의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 벌크 스타터 배지-2에서, 상기 다이드제인류 이외에 배합 가능한 첨가 성분의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 상기 마더 스타터 배지-2와 마찬가지이다. 또한, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키기 위해서, 벌크 스타터 배지-2에도 효모 유래 성분, 특히 효모 엑기스가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 벌크 스타터 배지-2는 발효물의 풍미에 영향을 미치는 경우가 있기 때문에, 유즙 및 필요에 따라서 유지방 함유 성분이 포함되어 있는 것이 바람직하다.

벌크 스타터 배지-2로서, 바람직하게는 발효물의 풍미에 악영향을 미치지 않는 배지, 더욱 바람직하게는 본발효용 배지-2와 동일한 조성의 것이 예시된다.

벌크 스타터 배지-2는 소정량의 배합 성분을 혼합하고, 필요에 따라서 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

벌크 스타터-2를 제조하기 위해서는, 벌크 스타터 배지-2에 상기 공정 (I)에서 얻어진 마더 스타터-2를 예를 들면 1 내지 10 용량％ 정도, 바람직하게는 1 내지 5 용량％ 정도 첨가하고, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 20 내지 28 시간, 바람직하게는 22 내지 26 시간 동안 발효시킬 수 있다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 예를 들면 35 내지 39 ℃에서 22 내지 26 시간 동안 발효할 수 있다.

벌크 스타터-2의 제조에서, 발효는 호기 또는 혐기 중 어느 분위기에서도 행할 수 있지만, 제조 비용의 감소, 조작 간편성 등의 측면에서, 호기 분위기에서 행하는 것이 바람직하다.

또한, 벌크 스타터-2의 제조에서, 발효 중 pH에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 pH 4.6 이상, 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 6.5가 되도록 유지하는 것이 바람직하다. 이와 같이 pH를 유지함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시키는 것이 가능해진다. 이러한 발효 중 pH의 제어는, 상기 공정 (I)과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.

벌크 스타터-2는, 그대로 다음 본발효에 제공할 수도 있지만, 필요에 따라 벌크 스타터-2를 스타터(1차 벌크 스타터)로서 사용하고, 재차 벌크 스타터-2의 제조와 동일한 조건으로 발효를 실시하여 2차 벌크 스타터를 제조하고, 이 2차 벌크 스타터를 다음 본발효에 제공할 수도 있다.

본 공정 (II)에서 사용되는 본발효용 배지-2는, 상기 다이드제인류 및 유즙을 포함하는 것이며, 에쿠올 생산 미생물이 육성 가능하고, 또한 식품 성분으로서 허용되는 것을 한도로 하여 특별히 제한되지 않는다.

본발효용 배지-2에 사용되는 다이드제인류에 대해서는, 상기 제1법의 마더 스타터용 배지-1에 사용되는 것과 마찬가지이지만, 본 제2법의 제조 방법에서는 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시킨다는 관점에서, 대두 배축 또는 그의 추출물이 바람직하고, 특히 대두 배축의 추출물이 바람직하다.

본발효용 배지-2에 배합되는 상기 다이드제인류의 배합 비율에 대해서는, 상기 마더 스타터 배지-2와 동일하다.

또한, 본발효용 배지-2에 사용되는 유즙으로는, 식품으로서 허용되는 유즙이면 되고, 예를 들면 우유, 산양유, 양유 등의 짐승유; 탈지유; 탈지분유나 전분유를 용해시킨 환원유 등을 들 수 있다.

또한, 본발효용 배지-2에는, 제조되는 발효물의 풍미를 향상시키기 위해서, 본발효용 배지-2에는 생크림, 버터 등의 유지방 함유 성분이 포함될 수도 있다. 이들 유지방 함유 성분의 배합 비율로는 유지방의 양으로 환산하여, 통상 0.1 내지 4.5 중량％, 바람직하게는 0.5 내지 4.2 중량％, 더욱 바람직하게는 1.0 내지 3.5 중량％를 들 수 있다.

또한, 본발효용 배지-2에서, 상기 성분 이외에 배합 가능한 첨가 성분의 종류 및 배합 비율에 대해서는, 상기 마더 스타터 배지-2와 동일하다. 또한, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키기 위해서, 본발효용 배지-2에도 효모 유래 성분, 특히 효모 엑기스가 포함되어 있는 것이 바람직하다.

본발효용 배지-2는 유즙, 상기 다이드제인류 및 필요에 따라 다른 첨가 성분을 각 소정량 혼합하고, 필요에 따라 유화시킨 후, 살균 처리함으로써 제조된다.

본 공정 (II)에서의 본발효는, 본발효용 배지-2에 상기 공정 (I)에서 얻어진 마더 스타터-2 또는 상기 벌크 스타터-2를 예를 들면 1 내지 10 용량％ 정도, 바람직하게는 1 내지 5 용량％ 정도 첨가하고, 상기 미생물의 생육 가능한 온도 영역, 바람직하게는 상기 미생물의 최적 온도 영역에서 20 내지 28 시간, 바람직하게는 22 내지 26 시간 동안 교반 또는 정치할 수 있다. 보다 구체적으로는, 에쿠올 생산 미생물로서 유산균을 사용하는 경우에는, 35 내지 39 ℃에서 22 내지 26 시간 동안 발효할 수 있다.

본 공정 (II)에서의 본발효는 호기 또는 혐기 중 어느 분위기에서 행할 수도 있지만, 제조 비용의 감소, 조작 간편성 등의 측면에서, 호기 분위기에서 행하는 것이 바람직하다.

또한, 본 공정 (II)에서의 본발효에서, 발효 중 pH는 4.6 이상, 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 6.5가 되도록 유지한다. 이와 같이 pH를 유지함으로써, 에쿠올 생산능을 손상시키지 않고 에쿠올 생산 미생물을 증식시키고, 또한 제조 후에도 상기 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해진다. 이러한 발효 중 pH의 제어는, 상기 공정 (I)과 마찬가지의 방법으로 행할 수 있다.

본 제2법의 제조 방법에서는, 발효물로서 발효유가 제조된다. 해당 발효물에는, 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올 생산능을 상실하지 않고 생균 상태로 포함되어 있다.

3. 발효 제품

또한, 본 발명은 상기 제1법 및 제2법에서 얻어진 발효물을 포함하는 발효 제품을 제공한다. 즉, 상기 제1법 및 제2법에서 얻어진 발효물은, 그대로 또는 필요에 따라 자당, 수크랄로스, 스테비아 등의 감미료; 커피 엑기스, 홍차 엑기스 등의 풍미제; 향료; 대두 분말, 대두편, 과즙, 과실편, 야채즙, 야채편 등의 식물 유래 성분; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연, 철 등의 금속; 아스코르브산 등의 비타민; 겔화제; 글루콘산 등의 안정화제; 물 등의 희석제 등의 첨가 성분을 배합하여 발효 제품으로서 제공된다. 특히, 상기 제1법에서 얻어진 발효물은, 대두 분말을 포함하는 수용액과 혼합된 발효 제품으로서 바람직하게 제공된다.

본발효 제품에서, 상기 제1법 및 제2법에서 얻어진 발효물의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면 5 내지 100 중량％, 바람직하게는 10 내지 100 중량％가 예시된다.

본발효 제품의 pH에 대해서는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 발효 제품 중 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 장기간 안정적으로 유지시키는 것을 중시하는 경우에는, pH는 4.6 이상, 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.5 내지 6.5가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 한편, 중성 영역에서는, 잡균의 번식이 염려되기 때문에, 잡균의 번식을 억제하는 것을 중시하는 경우에는, pH는 5.0 이하, 바람직하게는 4.0 내지 4.8, 더욱 바람직하게는 4.2 내지 4.6이 되도록 조정하는 것이 바람직하다.

본발효 제품의 형태는, 제조시에 사용한 본발효 배지의 종류, 상기 제1법 또는 제2법에서 얻어진 발효물의 종류, 발효물에 배합되는 첨가 성분의 종류 등에 따라서 정해지며, 액상, 반고형상, 고형상, 겔상 중 어느 것일 수도 있다. 본발효 제품의 형태 중 바람직한 예로서, 발효 대두 음식품, 발효 두유 음식품, 발효유 등이 예시된다. 여기서, 발효유에는 요구르트(하드 타입, 소프트 타입, 드링크 타입), 유산균 음료 등이 포함된다.

본발효 제품에는 에쿠올 생산 미생물이 생균 상태로 포함되어 있기 때문에, 저온하에서 유통, 판매하는 것이 바람직하다.

본발효 제품은, 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올 생산능을 유지한 상태에서 생균 그대로 포함되어 있기 때문에, 상기 미생물에 기초하는 다양한 생리 활성이나 약리 활성을 발현할 수 있다. 따라서, 본발효 제품은 일반적인 음식품 이외에, 특정 보건용 음식품, 영양 보조 음식품, 기능성 음식품, 환자용 음식품 등으로 사용할 수 있다.

예를 들면, 본발효 제품은 섭취되어 장내에서 에쿠올 생산 미생물의 작용에 의해 에쿠올을 생성할 수 있고, 에쿠올에 기초하는 생리 활성을 유효하게 얻을 수 있기 때문에, 예를 들면 갱년기 장해, 골다공증, 전립선 비대, 대사 증후군 등의 질환이나 증상의 예방 내지 개선, 혈중 콜레스테롤값의 감소, 미백, 여드름의 개선, 정장, 비만 개선, 이뇨 등의 용도에 유용하다. 그 중에서도, 본발효 제품은 특히 중노년 여성에서의 부정수소 내지 폐경에 수반되는 증상(예를 들면, 골다공증, 갱년기 장해 등)의 예방 내지 개선에 유용하다.

본발효 유제품의 1일당 섭취량에 대해서는, 본발효 유제품 중 에쿠올 생산 미생물의 균수, 섭취자의 연령이나 체중, 섭취 횟수 등에 따라 다르지만, 예를 들면 성인 1일당 섭취량으로서 본발효 제품이 10 내지 500 g에 상당하는 양을 들 수 있다.

4. 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물

에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 조성물에서, 아스코르브산, 그의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 첨가함으로써, 저pH 조건이나 호기 보존 조건하에서도 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해지고, 장기간 보존하여도 상기 조성물에서 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능이 상실되는 것을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물(이하, 단순히 "(A) 성분"이라고도 함) 및 아스코르브산, 그의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종(이하, 단순히 "(B) 성분"이라고도 함)을 포함하는, 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물(이하, 단순히 "본 조성물"이라고도 함)을 제공한다.

본 조성물에서는, 에쿠올 생산 미생물로서 단리 또는 조 정제한 에쿠올 생산 미생물의 생균을 사용할 수도 있으며, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 발효시킨 발효물을 사용할 수도 있다.

본 조성물에 포함되는 에쿠올 생산 미생물의 농도에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 일례로서 1×10 ⁵ 내지 10 ¹⁰ CFU/g, 바람직하게는 1×10 ⁶ 내지 10 ¹⁰ CFU/g, 더욱 바람직하게는 1×10 ⁷ 내지 10 ¹⁰ CFU/g이 예시된다.

본 조성물에는 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키기 위해서 (B) 성분이 배합된다. (B) 성분 중, 아스코르브산의 유도체에 대해서는, 아스코르브산에 대하여 에스테르 결합 또는 에테르 결합에 의해서 치환기를 결합시킨 것이며, 식품 성분으로서 허용되는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 구체예로는 아스코르브산 2,6-디팔미테이트, 아스코르브산 6-스테아레이트, 아스코르브산 2-인산, 아스코르브산 2-황산, 아스코르브산 2-글루코시드, 아스코르브산글루코사민, 아스코르브산 6-팔미테이트, 테트라이소팔미트산 L-아스코르빈, 테트라 2-헥실데칸산아스코르빌 등을 예시할 수 있다. 또한, 아스코르브산 및 그의 유도체의 염으로는, 식품 성분으로서 허용되는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 나트륨 등의 알칼리 금속염이 예시된다. (B) 성분 중에서도, 바람직한 것으로서 아스코르브산 및 그의 염이 예시된다. 본 조성물에서, (B) 성분은 1종 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.

본 조성물에서의 상기 (B) 성분의 배합 비율로는, 통상 0.05 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 2 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.0 중량％가 예시된다. 이러한 배합 비율을 충족함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해진다.

본 조성물의 pH에 대해서도 특별히 제한되는 것은 아니며, 본 조성물의 종류 등에 따라 적절히 설정된다. 본 조성물에서 잡균의 번식을 억제한다는 관점에서, pH는 5.0 이하, 바람직하게는 4.0 내지 4.8, 더욱 바람직하게는 4.2 내지 4.6이 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 에쿠올 생산 미생물은 pH 5.0 이하의 환경하에서는, 에쿠올 생산능을 상실하는 경향이 강해지고, 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지할 수 없게 되지만, 본 조성물에 따르면 아스코르브산 및/또는 그의 유도체의 작용에 의해서, pH는 5.0 이하의 조건하에서도, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지하는 것이 가능해지고 있다.

본 조성물에는, 필요에 따라서 자당, 수크랄로스, 스테비아 등의 감미료; 커피 엑기스, 홍차 엑기스 등의 풍미제; 향료; 과즙, 과실편, 야채즙, 야채편 등의 식물 유래 성분; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 아연, 철 등의 금속; 베타카로텐 등의 비타민; 겔화제; 글루콘산 등의 안정화제; 물 등의 희석제 등의 첨가 성분을 포함할 수도 있다. 여기서, 본 조성물에 배합되는 첨가 성분은, 보존 안정성을 손상시키지 않기 위해, 에쿠올 생산 미생물에 의해 자화되지 않는 것이 바람직하다.

본 조성물의 형태에 대해서도 특별히 제한되지 않고, 액상, 반고형상, 고형상, 겔상 등 중 어느 하나일 수도 있다.

본 조성물의 바람직한 형태로서, 에쿠올 생산 미생물을 이용하여 발효시킨 발효물에 아스코르브산 및/또는 그의 유도체 및 필요에 따라서 다른 첨가 성분을 배합한 발효 제품을 들 수 있다. 여기서 에쿠올 생산 미생물을 이용한 발효시킨 발효물로는, 바람직하게는 상기 제1법 및 제2법에 의해서 제조된 발효물을 들 수 있다. 또한, 해당 발효 제품으로는, 구체적으로는 발효 대두 음식품, 발효 두유 음식품, 발효유 등이 예시된다. 여기서, 발효유에는 요구르트(하드 타입, 소프트 타입, 드링크 타입), 유산균 음료 등이 포함된다. 이들 발효 제품 중에서도, 바람직하게는 발효 대두 음식품 및 발효 두유 음식품, 더욱 바람직하게는 발효 대두 음식품이 예시된다.

또한, 본 조성물의 다른 바람직한 형태로서, 단리 또는 조 정제한 에쿠올 생산 미생물의 생균, 아스코르브산 및/또는 그의 유도체, 가식성의 담체 및 필요에 따라 다른 첨가 성분을 포함하는 조성물을 들 수 있다. 여기서 가식성의 담체로는, 예를 들면 대두 분말을 포함하는 수용액, 두유, 물, 가식성 겔, 유즙, 각종 염 용액 등이 예시된다.

본 조성물에는 에쿠올 생산 미생물이 생균 상태로 포함되어 있기 때문에, 저온하에서 유통, 판매하는 것이 바람직하다.

본 조성물은 에쿠올 생산 미생물이 에쿠올 생산능을 유지한 상태에서 생균 그대로 포함되어 있기 때문에, 상기 미생물에 기초하는 다양한 생리 활성이나 약리 활성을 발현할 수 있다. 따라서, 본 조성물은 의약 또는 음식품의 분야에서 사용할 수 있다.

본 조성물을 음식품의 분야에서 사용하는 경우, 본 조성물은 일반적인 음식품 이외에, 특정 보건용 음식품, 영양 보조 음식품, 기능성 음식품, 환자용 음식품 등으로 제공된다.

예를 들면, 본 조성물은 섭취되어 장내에서 에쿠올 생산 미생물의 작용에 의해 에쿠올을 생성할 수 있고, 에쿠올에 기초하는 생리 활성이나 약리 활성을 유효하게 얻을 수 있기 때문에, 의약 또는 음식품 분야에서 에쿠올 작용의 수득이 요구되는 사람에 대하여 바람직하게 사용된다. 구체적으로는, 본 조성물은 예를 들면 갱년기 장해, 골다공증, 전립선 비대, 대사 증후군 등의 질환이나 증상의 예방 내지 개선, 혈중 콜레스테롤값의 감소, 미백, 여드름의 개선, 정장, 비만 개선, 이뇨 등의 용도에 유용하다. 그 중에서도, 본 조성물은 특히 중노년 여성에서의 부정수소 내지 폐경에 수반되는 증상(예를 들면, 골다공증, 갱년기 장해 등)의 예방 내지 개선에 유용하다.

본 조성물의 1일당 섭취량에 대해서는, 본 조성물 중 에쿠올 생산 미생물의 균수, 섭취자의 연령이나 체중, 섭취 횟수 등에 따라 다르지만, 예를 들면 성인 1일당 섭취량으로서 본 조성물이 10 내지 500 g에 상당하는 양을 들 수 있다.

또한, 상술한 바와 같이, 에쿠올 생산 미생물을 생균 상태로 포함하는 조성물에서, 상기 (B)를 첨가함으로써, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능을 안정적으로 유지시키는 것이 가능해지고, 장기간 보존하여도 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능이 상실되는 것을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 생균 상태의 에쿠올 생산 미생물을 포함하는 조성물에 아스코르브산, 그의 유도체 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능의 유지 방법도 제공한다. 에쿠올 생산능에 대해서는, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라서 측정된다. 해당 보존 안정화 방법의 구체적 실시 양태에 대해서는, 상기한 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에 관한 기재 내용이 원용된다.

<실시예>

이하에 실시예 등에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예 및 비교예에서 사용한 대두 분말은, 이하의 방법으로 제조한 것을 사용하였다.

대두 분말 용액의 제조

껍질을 벗기고 절반으로 분할하여 탈피 대두를 증자 처리에 제공하였다. 증자 처리는, 탈피 대두에 대하여 100 ℃의 온도에 도달할 때까지 증기를 계속해서 보내고, 100 ℃에 도달한 시점부터 140 초간 100 ℃로 유지하였다. 이어서, 증자 처리 후의 대두를 롤러밀의 롤러 사이에 통과시켜 플레이크상으로 하였다. 그 후, 플레이크상의 대두를 80 ℃에서 열풍 건조를 행하고, 수분 함량을 3 내지 6 ％ 정도가 될 때까지 건조시키고, 이를 에어그라인더로 분쇄함으로써, 대두 분말을 얻었다. 에어그라인더에서의 분쇄는, 분쇄 입자의 직경 150 ㎛ 이상이 10 ％ 이하가 되도록 행하였다.

이어서, 적량의 탄산수소나트륨 및 시트르산삼나트륨을 용해시킨 물에, 상기에서 얻어진 대두 분말을 소정량 첨가하여 분산 용해시키고, 15 분 이상 팽윤시켰다. 이어서, 얻어진 용액을 95 ℃에서 10 분간 가열하여 대두 분말 중 수용성 성분을 추출시키고, 추가로 대두 분말 중에 포함되는 LOX, 트립신인히비터 등의 효소를 실활시켰다. 가열 후, 80 ℃ 이상의 온도를 유지한 상태에서, 적량의 시트르산을 첨가하여 pH를 중성으로 복귀시켰다. 그 후, 균질기(가울린(GAULIN)사 제조 LAB40)를 이용하여, 200 내지 1000 kgf/c㎡ 범위의 조건하에서 균질화 처리를 행함으로써, 대두 분말 용액(대두 분말을 건조 중량 환산으로 14 중량％ 포함함)을 제조하였다.

실시예 1: 제1법에 의한 발효 대두 식품의 제조 및 발효 대두 식품의 평가

1. 발효 대두 식품의 제조

에쿠올 생산능을 갖는 락토코커스 가르비에(락토코커스 20-92주, FERM BP-10036호)를 이용하여, 이하의 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조, 본발효 및 용기에의 충전을 행하였다.

<마더 스타터의 제조>

대두 분말 용액(건조 중량으로 14 ％의 대두 분말을 포함함) 80 중량％, 글루코오스 0.1 중량％, L-아르기닌 0.1 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액(pH 7.48) 100 ㎖를 오토클레이브 살균(121 ℃, 15 분간)하고, 마더 스타터 배지를 제조하였다. 이 스타터 배지에, 락토코커스 20-92주의 종균을 접종하고 가스팩에서 37 ℃에서 96 시간 동안 혐기 배양을 행함으로써 마더 스타터(pH 6.64)를 얻었다.

<벌크 스타터의 제조>

대두 분말 용액(건조 중량으로 14 ％의 대두 분말을 포함함) 80 중량％, 글루코오스 0.1 중량％, L-아르기닌 0.1 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액(pH 7.48) 5 ℓ를 오토클레이브 살균(121 ℃, 15 분간)하고, 벌크 스타터 배지를 제조하였다. 이 스타터 배지에, 상기에서 얻어진 마더 스타터를 1 용량％가 되도록 접종하여 37 ℃에서 15 시간 동안 호기 조건하에서 정치 배양을 행함으로써 벌크 스타터(pH 6.72)를 얻었다.

<본발효>

대두 분말 용액(건조 중량으로 14 ％의 대두 분말을 포함함) 50 중량％, 당근즙(미야자키 농협 과즙) 6 중량％, 호박 페이스트(나가노 산요 푸드) 6 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액(pH 6.78) 200 ℓ를 이중 관식 살균기에서 95 ℃, 30 초간 살균하고, 본발효용 배지를 제조하였다. 살균 후 회수한 본발효용 배지에 상기에서 얻어진 벌크 스타터 4 ℓ를 접종하여 37 ℃에서 15 시간 동안 호기 조건하에서 정치 배양을 행함으로써, 발효 대두액(pH 4.56)을 얻었다.

<부원료 혼합, 용기에의 충전>

대두 분말 용액(건조 중량으로 14 ％의 대두 분말을 포함함) 65 중량％, 당 7.4 중량％, 겔화제 제제 FG2524(니쓰타 젤라틴 제조) 1.0 중량％, 글루콘산 0.8 중량％, 향료 0.4 중량％, L-아스코르브산 0.1 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액 800 ℓ를 이중 관식 살균기에서 95 ℃, 30 초간 살균하고, 부원료 용액을 얻었다. 이 부원료 용액 80 중량부와 상기에서 얻어진 발효 대두액 20 중량부를 37 내지 40 ℃에서 혼합하였다. 혼합액의 온도를 유지한 상태에서 위생적으로 폴리에틸렌컵(만주 용량 130 ㎖, 구경 71 mm)에 100 g 충전하고, 알루미늄 덮개로 밀봉하였다. 충전물은 5 ℃의 냉장고에 넣고, 냉각 고화시켜 락토코커스 가르비에 생균을 포함하는 발효 대두 식품을 얻었다.

2. 각종 평가

상기에서 얻어진 밀봉된 발효 대두 식품에 대해서 10 ℃에서 3주간 보존하였다. 제조 직후, 1주 후, 2주 후 및 3주 후에 발효 대두 식품의 pH를 측정하고, 추가로 발효 대두 식품에 포함되는 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효 대두 식품에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능의 유무를 이하의 방법으로 평가하였다. 또한, 상기에서 제조한 마더 스타터, 벌크 스타터 및 본발효 후의 발효물에 대해서도, 락토코커스 가르비에의 균수 및 각각에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능에 대해서 마찬가지로 측정하였다.

<락토코커스 가르비에의 균수의 측정>

락토코커스 가르비에의 생균수의 측정은, BCP 첨가 플레이트 카운트 한천 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤 제조)를 이용하여 37 ℃, 72 시간 동안 혼석 배양을 행하고, 생육한 콜로니수를 계측함으로써 구하였다.

<락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능 유무의 측정>

다이드제인을 10 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 변법 GAM 부용(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤 제조) 5 ㎖에, 발효 대두 식품을 200 ㎕ 첨가하여 37 ℃에서 96 시간 동안 가스팩으로 혐기 배양을 행하였다. 이어서, 얻어진 배양액을 HPLC에 제공하고, 배양액 내의 에쿠올량을 정량하였다. HPLC에 의한 분석은 다음과 같이 하여 실시하였다. 우선, 배양액 0.5 ㎖를 아세트산에틸 5.0 ㎖에 가하여 침투 추출을 행하고, 얻어진 추출액을 3000 rpm으로 10 분간 원심하고, 상청을 원심 증발기에 의해 용매를 감압 건고하였다. 이어서 얻어진 고형물을 1.0 ㎖ 용매(이동상 A/이동상 B=50/50)로 재용해하여 HPLC의 검체에 제공하였다. HPLC의 분석은 D7000 시리즈(히따찌 세이사꾸쇼 제조)를 사용하고, 칼럼은 캅셀 팩(Capcell Pack) UGL 205 ㎛ 4.6Φ×250 mm(시세이도 제조)를 사용하였다. 이동상은, 이동상 A로서 0.05 ％ 인산 완충액(EDTA 함유)과 아세트산에틸-메탄올(1:10)을 8:2로 혼합한 용액을 사용하고, 이동상 B로서 2 ％ 아세트산에틸 함유 메탄올하였다. 경사법으로 유속을 1.0 ㎖/분으로 하였다. 검출은 SPD-10AVP UV-VIS 검출기를 이용하고, 검출 파장은 254 nm와 280 nm로 하였다.

<락토코커스 가르비에의 균수 및 에쿠올 생산능의 측정 결과>

결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이 결과로부터, 마더 스타터, 벌크 스타터의 pH가 5 이상이면, 본발효 후의 발효물, 발효 대두 식품의 pH가 4.6 이하여도 에쿠올 생산능을 유지한 락토코커스 가르비에를 포함하는 발효 대두 식품을 제조할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한, 발효 대두 식품에서의 락토코커스 가르비에의 균수 자체는, pH나 에쿠올 생산능의 유무에는 그다지 영향을 미치지 않으며, 장기간 일정하게 유지되는 것도 확인되었다.

<맛의 평가>

제조 직후의 발효 대두 식품 및 3주간 보존 후의 발효 대두 식품도 대두의 풍미가 양호하고 이상한 맛, 이상한 냄새도 없어 식품으로서 바람직하였다.

비교예 1: 발효 대두 식품의 제조 및 발효 대두 식품의 평가

마더 스타터의 제조에서, 글루코오스 첨가량을 0.1 중량％에서 1.0 중량％로 변경하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조 및 본발효를 행하고, 발효 대두 식품(비교예 1-1)을 제조하였다.

또한, 벌크 스타터의 제조에서, 글루코오스 첨가량을 0.1 중량％에서 1.0 중량％로 변경하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조 및 본발효를 행하여, 발효 대두 식품(비교예 1-2)을 제조하였다.

비교예 1-1 및 1-2의 발효 대두 식품의 pH, 락토코커스 가르비에의 균수 및 에쿠올 생산능의 유무를 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 또한, 마더 스타터, 벌크 스타터 및 본발효액에 대해서도 락토코커스 가르비에의 균수, 에쿠올 생산능의 유무에 대해서도 마찬가지로 측정하였다.

결과를 하기 표 2에 나타내었다. 마더 스타터 제조에서 pH가 저하되는 배지를 이용한 비교예 1-1에서는, 락토코커스 가르비에의 균수에는 차가 인정되지 않았지만, 에쿠올 생산능은 상실되어 있었다. 계속해서 벌크 스타터, 본발효액 제조, 발효 대두 식품 제조에서도 균수, pH 및 관능면에서 실시예 1과 큰 차는 인정되지 않았지만, 에쿠올 생산능은 회복되지 않았다. 또한, 벌크 스타터 제조에서 pH가 저하되는 배지를 이용한 비교예 1-1에서도, 락토코커스 가르비에의 균수에는 차가 인정되지 않았지만, 에쿠올 생산능은 상실되어 있었다. 계속해서 본발효, 발효 대두 식품 제조에서도 균수, pH 및 관능면에서 큰 차는 인정되지 않았지만, 에쿠올 생산능은 회복되지 않았다.

실시예 2: 제2법에 의한 발효유의 제조 및 발효유의 평가

1. 발효유의 제조

에쿠올 생산능을 갖는 락토코커스 가르비에(락토코커스 20-92주, FERM BP-10036호)를 이용하여, 이하의 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조, 본발효 및 용기에의 충전을 행하였다.

<마더 스타터의 제조>

탈지분유 10 중량％, 생크림 6.67 중량％, 효모 엑기스("SK 효모 엑기스 Hi-K", 닛본 세이시 케미컬 가부시끼가이샤) 0.1 중량％, 대두 배축 추출물("소야플라본 HG", 후지 세이유 가부시끼가이샤; 대두 배축 추출물 중 다이드제인류의 함유 비율은 약 37 중량％) 0.025 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액(pH 6.14) 500 ㎖를 오토클레이브 살균(115 ℃, 15 분간)하고, 마더 스타터 배지를 제조하였다. 이 스타터 배지에 락토코커스 20-92주의 종균을 접종하여, 가스팩에서 37 ℃에서 24 시간 동안 혐기 배양을 행함으로써 마더 스타터를 얻었다.

<벌크 스타터의 제조>

탈지분유 10 중량％, 생크림 6.67 중량％, 효모 엑기스("SK 효모 엑기스 Hi-K", 닛본 세이시 케미컬 가부시끼가이샤) 0.1 중량％, 대두 배축 추출물("소야플라본 HG", 후지 세이유 가부시끼가이샤) 0.025 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액 10 ℓ를 UHT(초고온) 살균(140 ℃, 4 초간)하고, 벌크 스타터 배지를 제조하였다. UHT 살균 후에 회수한 벌크 스타터 배지에 상기에서 얻어진 마더 스타터를 1 v/v％가 되도록 접종하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 호기 배양을 행함으로써 벌크 스타터를 얻었다.

<본발효>

탈지분유 10 중량％, 생크림 6.67 중량％, 효모 엑기스("SK 효모 엑기스 Hi-K", 닛본 세이시 케미컬 가부시끼가이샤) 0.1 중량％, 대두 배축 추출물("소야플라본 HG", 후지 세이유 가부시끼가이샤) 0.025 중량％, 정제수 잔부를 포함하는 용액 10 ℓ를 UHT(초고온) 살균(140 ℃, 4 초간)하고, 본발효용 배지를 제조하였다. UHT 살균 후에 회수한 본발효용 배지에 상기에서 얻어진 벌크 스타터를 1 v/v％가 되도록 접종하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 호기 배양을 행함으로써, 발효유를 얻었다.

<용기로의 충전>

상기 본발효에 의해 얻어진 발효유를 멸균된 600 ㎖ 용량의 용기에 무균적으로 넣고, 추가로 소정량의 락트산을 용기 내에 무균적으로 첨가하여 혼합한 후에, 용기를 밀폐하였다.

2. 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능의 평가

상기에서 얻어진 밀봉된 발효유의 각각에 대하여 10 ℃에서 74주간 보존하였다. 제조 직후, 2주간 후, 6주간 후 및 74주간 후에 발효유의 pH를 측정하고, 추가로 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능의 유무를, 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 또한, 상기에서 제조한 마더 스타터 및 벌크 스타터에 대해서도, 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능에 대해서도 마찬가지로 측정하였다.

결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이 결과로부터, 발효유의 pH가 4.6 이상이면, 에쿠올 생산능을 유지한 락토코커스 가르비에를 포함하는 발효유를 제조할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한, 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능은, 발효유의 pH가 5.28 이상이면 2주간, 발효유의 pH가 5.79 이상이면 6주간, 발효유의 pH가 5.92 이상이면 74주간 안정적으로 유지되는 것도 확인되었다. 한편, 발효유의 pH가 4.09 및 3.53인 경우에는, 제조 직후에도 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능이 상실되는 것을 알 수 있었다. 또한, 발효유에서의 락토코커스 가르비에의 균수 자체는, 발효유의 pH나 에쿠올 생산능의 유무에는 그다지 영향을 미치지 않으며, 장기간 일정하게 유지되는 것도 확인되었다.

<맛의 평가>

제조 직후의 발효유(락트산 첨가 없음) 및 74주간 보존 후의 발효유(락트산 첨가 없음)는 모두 산미가 적고 마시기 쉬워 식품으로서 바람직하였다.

실시예 3: 제2법에 의한 발효유의 제조 및 발효유의 평가

마더 스타터 배지, 벌크 스타터 배지 및 본발효용 배지로서, 하기 조성을 베이스로 하는 배지에, 하기 표 4에 나타내는 소정량의 발효 촉진제를 첨가하여 제조한 것을 이용하는 것 이외에는, 상기 실시예 2와 동일한 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조 및 본발효를 행하였다.

<배지 조성>

탈지분유 10 중량％

생크림 6.67 중량％

대두 배축 추출물 0.025 중량％

("소야플라본 HG", 후지 세이유 가부시끼가이샤)

표 2에 나타내는 발효 촉진제 표 2에 나타내는 농도

정제수 잔부

합계 100 중량％

이와 같이 하여 얻어진 발효유 500 g을 멸균된 600 ㎖ 용량의 용기에 무균적으로 넣어 밀봉하고, 10 ℃에서 10주간 보존하였다.

제조 직후, 2주간 후, 4주간 후 및 10주간 후에 발효유의 pH를 측정하고, 추가로 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능의 유무를 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 또한, 마더 스타터 및 벌크 스타터에 대해서도, 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능에 대해서 마찬가지로 측정하였다.

얻어진 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 이 결과로부터, 효모 엑기스, 유청 가수분해물 또는 카제인·효모 가수분해물을 배지에 첨가함으로써, 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능을 유지할 수 있는 것이 확인되었다. 특히, 효모 엑기스 0.1 중량％ 이상, 또는 카제인·효모 가수분해물 0.1 중량％ 이상을 포함하는 경우이면, 발효유 중 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능을 10주간 이상의 장기간에 걸쳐 안정적으로 유지할 수 있는 것이 명백해졌다.

비교예 2: 발효유의 제조 및 발효유의 평가

마더 스타터의 제조에서, 호기 배양하는 것 이외에는 실시예 2와 동일한 조건으로 마더 스타터의 제조, 벌크 스타터의 제조 및 본발효를 행하였다.

이와 같이 하여 얻어진 발효유의 pH를 측정하고, 추가로 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능의 유무를, 실시예 2와 동일한 방법으로 평가하였다. 또한, 마더 스타터 및 벌크 스타터에 대해서도, 락토코커스 가르비에의 균수 및 발효유에 포함되는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능에 대해서 마찬가지로 측정하였다.

그 결과, 마더 스타터를 호기적 조건으로 호기 발효시켜 제조하면, 마더 스타터 중 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능은 유지되어 있더라도, 최종적으로 얻어지는 발효 유제품에서는 락토코커스 가르비에의 에쿠올 생산능은 상실되어 있었다. 또한, 마더 스타터를 호기 발효로 제조하여도, 발효유 중 pH와 락토코커스 가르비에의 균수에 대해서는, 마더 스타터를 혐기 발효로 제조한 경우와 동일한 정도였다.

실시예 4: 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능의 유지 효과의 평가

1. 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물의 제조

변법 GAM 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤) 5 ㎖에 락토코커스 가르비에(락토코커스 20-92주, FERM BP-10036호)의 종균을 접종하여 가스팩에서 37 ℃에서 24 시간 동안 혐기 배양을 행하였다. 이어서, 얻어진 배양물 2 ㎖를 변법 GAM 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤) 50 ㎖에 접종하여 가스팩에서 37 ℃에서 24 시간 동안 혐기 배양을 행하였다. 또한 얻어진 배양물 8 ㎖를 변법 GAM 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤) 200 ㎖에 접종하여 가스팩에서 37 ℃에서 24 시간 동안 혐기 배양을 행하였다.

얻어진 배양물을 원심 분리(4500 rpm×15 분)하여 균체를 회수하고, 얻어진 균을 대개 1×10 ⁸ cfu/㎖의 균 농도가 되도록 하기 표 6에 나타내는 조성의 각 음료에 첨가하여 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물을 제조하고, 이를 15 ㎖ 용량의 폴리프로필렌 튜브(이와키(IWAKI) 제조)에 10 ㎖씩 나눠 주입하였다.

1. 보존 후의 에쿠올 생산능의 평가

상기에서 얻어진 각 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물을 10 ℃에서 21일간 보존을 행하였다. 보존 기간 중에 각 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에 대해서, pH, 균수 및 에쿠올 생산능의 평가를 행하였다. 균수의 측정 방법은 상기 실시예 1과 동일하다. 또한, 에쿠올 생산능은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의한 분석을 하고, 하기 수학식에 따라서 에쿠올 변환율을 산출하였다.

pH의 측정 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 또한, 균수의 측정 결과를 도 1에 나타내고, 에쿠올 생산능의 측정 결과를 도 2에 나타내었다. 표 7로부터 명백한 바와 같이, 어느 음료에서도, 보존하여도 제조 직후의 pH가 유지되어 있고, 음료 중에서 잡균이 번식할 수 없는 환경이 유지되어 있었다. 또한, 도 1로부터 명백한 바와 같이, 각 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에서는, 보존 기간 중 생균수에 대해서는 거의 차가 인정되지 않았다. 한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산을 첨가하지 않은 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에서는, 보존 14일 후에는 에쿠올 생산능이 상실되었지만, 아스코르브산을 첨가한 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에서는, 보존 21일 후에도 에쿠올 생산능이 유지되어 있었다. 특히, 아스코르브산을 1 중량％ 또는 2 중량％로 첨가한 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물에서는, 에쿠올 생산능이 매우 안정적으로 유지되어 있는 것이 확인되었다.

실시예 5: 에쿠올 생산 미생물의 에쿠올 생산능의 유지 효과의 평가

1. 에쿠올 생산 미생물 함유 조성물의 제조

실시예 1에서 사용한 마더 스타터 배지와 동일한 조성의 배지 5 ㎖에 락토코커스 20-92주의 종균을 접종하여 가스팩에서 37 ℃에서 96 시간 동안 혐기 배양을 행함으로써 마더 스타터를 얻었다.

이어서, 실시예 1에서 사용한 벌크 스타터 배지와 동일한 조성의 배지 10 ㎖에, 상기에서 얻어진 마더 스타터 0.2 ㎖를 접종하여 15 시간 동안 가스팩을 이용하여 37 ℃에서 혐기 배양을 행하고, 1차 벌크 스타터를 얻었다. 또한, 실시예 1에서 사용한 벌크 스타터 배지와 동일한 조성의 배지 300 ㎖에, 상기에서 얻어진 마더 스타터 6 ㎖를 접종하고 15 시간 동안 가스팩을 이용하여 37 ℃에서 혐기 배양을 행하고 2차 벌크 스타터를 얻었다.

이어서, 실시예 1에서 사용한 본발효용 배지와 동일한 조성의 배지 2000 ㎖에, 상기에서 얻어진 2차 벌크 스타터 40 ㎖를 접종하고, 37 ℃에서 15 시간 동안 호기 조건하에서 정치 배양을 행함으로써 발효 대두액을 얻었다.

얻어진 발효 대두액에 6종의 항산화제를 하기 표 8에 나타낸 바와 같이 첨가하여 발효 제품을 제조한 후, 종이컵에 130 g씩 충전하고, 알루미늄 덮개로 시일밀봉하였다. 이를 10 ℃에서 보존하고, 0 및 7일 후에 개봉하여, 에쿠올 산성 미생물의 균수와 그의 에쿠올 생산능을 실시예 4와 동일한 방법으로 측정하였다.

2. 평가 결과

에쿠올 생산 미생물의 균수를 측정한 결과를 하기 표 9에 나타내고, 에쿠올 생산능을 측정한 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 보존 개시시에는, 어느 산화 방지제를 배합한 경우에도 에쿠올 생산능이 인정되었다. 그러나, 보존 7일 후에는 아스코르브산을 첨가한 발효 제품 이외에는 전부 에쿠올 생산능이 소실되었다.