갈근 또는 갈화 추출물의 발효물을 함유하는 비만 또는고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물

갈근 또는 갈화 추출물의 발효물을 함유하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Prevention or Treatment of Obesity or Hyperlipidemia Comprising Fermentation Product of Puerariae Radix or Puerariae Flos Extract}

도 1은 서로 다른 유산균에 의해 발효된 갈근(A) 및 갈화(B) 수추출물의 발효물을 6 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 후 MCF-7 세포의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 2는 서로 다른 유산균에 의해 발효된 갈근(A) 및 갈화(B) 수추출물의 발효물을 25 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 후 MCF-7 세포의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 3은 난소를 적출한 시험동물의 체중변화를 시간의 경과에 따라 보여주는 그래프이다.

도 4는 시험동물에 시료 투여 후 자궁의 위축이 일어났는지 여부를 보여주는 사진이다.

도 5는 시험동물에 시료를 투여한 후의 체지방 변화를 보여주는 사진이다.

본 발명은 비만 또는 고지혈증에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 갈근 또는 갈화 추출물의 미생물 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

비만은 에너지의 섭취와 소비가 균형을 이루지 못하여 과잉된 에너지가 지방으로 축적되어 체지방이 비정상적으로 많아지고, 대사 이상이 유발되는 상태를 일컫는다. 비만은 육식을 주식으로 하는 서구에서 뿐만 아니라 우리나라에서도 심각한 건강문제로 대두되고 있으며, 현대인의 약 30∼40%가 비만증을 가지고 있다고 알려져 있다. 비만의 원인으로는 환경 및 사회의 변화에 따른 고지방, 고열량의 식생활 패턴 및 편리함을 추구하는 문명의 발달로 인한 운동부족과 그외 내분비 이상이나 병리생리학적인 이상 등을 들 수 있다. 또한, 유전적 요인이 비만의 중요한 원인으로 작용한다는 것은 비만이 가계와 연관되어 집중 발생한다는 사실에서 알 수 있는데, 환경적 요인 외에 유전적 요인이 비만의 발생에 적어도 30∼50% 정도의 영향을 미친다고 알려져 있다.

비만은 모든 연령층에 걸쳐 영향을 주고 있으며, 특히 장년층의 발생빈도가 높다. 동양에서는 채식위주의 생활습관으로 인해 비만이 그리 많지 않았으나, 현대에 들어서 서양문물의 영향으로 식생활 습관이 바뀌고 주거환경이 바뀌면서 동양인에게서도 점차 비만이 많아지고 있는 추세이다. 또한, 현대인은 과로, 과음, 스 트레스 등으로 인하여 체력이 저하되며, 약 30~40%가 비만을 가지고 있고, 그 중 약 10% 정도는 심각하거나 병적인 비만을 나타낸다고 보고된 바 있다.

비만은 단순성 비만과 2차성 비만(증후성 비만)으로 분류된다. 단순성 비만의 원인으로는 과식, 운동부족, 및 기초대사의 저하 등을 들 수 있다. 임상적으로 비만으로 판정되는 경우의 대부분은 단순성 비만이며, 단순성 비만이 발현하여 그 상태가 지속되면 각종 건강 장해를 일으키는 원인이 된다. 2차성 비만은 임의의 기초질환이 원인이 되어 발생하는 비만으로, 내분비성 비만, 시상하부성 비만, 유전성 비만 또는 약제에 기인한 비만 등을 들 수 있다. 비만은 여러 가지 질환이 원인이 되어 합병증으로 나타나는 경우도 있지만, 비만 자체가 당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환, 가성 뇌종양(pseudotumor cerebri), 고지혈증, 수면 무호흡증, 암, 폐 고혈압, 담낭염 및 골관절염 등을 유발하는 것으로 알려져 있어, 각종 질환의 원인이 되거나 또는 활동성의 저하 등의 문제를 야기한다.

대개 비만 환자들은 식이요법과 운동요법을 통해 체중을 줄이고 있으며, 그 외 행동요법, 정신요법, 약물요법 또는 외과요법(위축소술과 같은 수술요법) 등도 병행하고 있다. 식이요법은 총 에너지 섭취량을 제어하는 치료방법이나, 안정시의 대사율이 저하되기 때문에 기대한 정도의 체중감소는 얻을 수 없고, 감량이 성공한 경우라도 제(除)지방체중의 감소가 중심이 되거나, 또는 영양 불량장해, 공복감 또는 스트레스 등의 육체적 및 정신적 고통을 환자에게 초래하는 문제가 있다. 운동요법의 경우 소비 에너지의 증가 뿐만 아니라, 안정시 대사율의 개선, 인슐린 저항성의 시정 및 체지방의 감소 등의 효과가 있으나, 1회에 20분간의 호기(好氣)적 운 동을 주 3회 이상 행하는 것이 필요하므로 계속적으로 시행하는 것이 쉽지가 않다. 행동요법 또는 정신요법은 식이요법 또는 운동요법을 유지하기 위한 방법이나, 충분한 효과를 얻는 것은 일반적으로 곤란하다.

상기의 치료방법이 유효하지 않은 경우, 또는 극도의 비만에 대한 긴급치료가 필요한 경우에는, 약물요법 또는 외과요법 등이 행해지고 있으나, 외과요법은 환자에게 주는 부담이 매우 크다. 약물요법을 위해 사용되는 비만증 치료약으로서는 식욕억제제, 소화흡수 저해제, 비만축적 방해제 또는 대사촉진제 등이 있으나, 이들 비만 치료제는 약물 의존성 등의 부작용을 일으킬 위험성이 있다. 또한, 투여한 환자에게 단기간에 내성이 생겨버리는 경우도 있기 때문에, 장기간 연속하여 사용할 수 없다는 문제점도 있다. 아울러, 운동요법을 행하는 경우, 비만한 사람에게 격렬한 운동을 강제시키면 하지(下肢)관절이 상할 위험성이 높아지기 때문에, 일반적으로 가벼운 수영 등을 행하는 것이 바람직하다. 이 경우, 에너지 대사를 활성화시키고 부작용이 적은 약제와 가벼운 수영 등 가벼운 운동을 병행하여 근육을 증가시키고, 기초대사의 증대에 의해 에너지 소비를 촉진하는 것은 비만개선을 위한 하나의 바람직한 방법으로서 여겨지고 있다.

따라서, 인체에 부담을 주지 않으면서 장기간 연속하여 사용할 수 있는, 부작용이 적고 효과적으로 체중감소를 촉진하는 새로운 방법이나 의약품의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 갈근(葛根)은 콩과 식물의 다년생 초본인 칡(Pueraria lobata Ohwi)의 주피를 제거하여 뿌리를 건조시킨 것으로 한국, 중국, 일본 각 지역의 산에 자생하 는 생약이다. 한의학에서는 칡의 여러 부위를 각각 분류하여 칡뿌리를 건조한 것을 갈근, 꽃은 갈화, 열매는 갈곡 또는 갈실, 잎은 갈엽, 덩굴은 갈만이라 부르며 질병의 증상 및 치료방법에 따라 각각 다르게 사용하여 왔다.

한방에서 갈근은 기육을 풀어 주는 작용을 하므로 감기 몸살이나 발진성 질환, 항강통 등에 해표시킬 목적으로 사용되며, 비장과 위장의 기를 상승하게 도와주어 진액을 만들어 갈증을 해소하게 하고 지사시키는 작용을 한다(본초학, 148, 1995). 또한, 사상의학에서는 태음인의 약물로 분류하여 갈근해기탕, 열다한소탕, 갈근승기탕, 조각대황탕, 갈근부평탕 등의 기본처방에 사용한다(사상의학원론, 343-50, 1985).

갈근은 이소플라보노이드(isoflavonoide)를 다량 함유하고 있으며(중약현대연구여임상응용, 626, 1994), 주로 이소플라보노이드와 관련한 성분의 연구가 많이 보고되어 있다. 갈근과 관련한 약리 작용으로는 항알콜중독(antidipsotropic) 작용(Proceeding of National Academy of Sciences of USA, 95(5):2198-203, 1998; Alcoholism: Clinical & Experimental Research 40(4):659-63, 1996), 간보호 작용(Planta Medica, 64(5):413-6, 1998), 숙취 억제 작용(Proceeding of National Academy of Sciences of USA, 94(5):1675-9, 1997), 항산화 작용(Chem. Pharm. Bull. 40(3):721-4, 1992) 등이 알려져 있다. 또한, 평활근의 이완 작용, 심혈관계에서 관상동맥 확장 및 혈압 강하, 심박동 조절 작용, 혈소판 응집 억제 작용, 강혈당 작용, 해열 작용 등이 알려져 있으며(중약현대연구여임상응용, 626-632, 1994), 노년 질환의 두통, 항강, 사지 감각 장애, 이롱, 당뇨 등에도 응용된다(항 노쇠중약학, 186-187, 1989). 그러나, 현재까지 갈근 또는 갈화를 비만이나 고지혈증 등의 증상 완화에 직접적으로 이용한 보고는 없다.

본 발명은 갈근 또는 갈화 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 골지혈증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈근 또는 갈화 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈근 또는 갈화 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 골지혈증의 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 갈근 또는 갈화를 물로 추출하여 제조되는 수추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기에서, 갈근 또는 갈화 수추출물의 유산균 발효물(이하, 각각 "갈근 발효물" 및 "갈화 발효물"이라 약칭함)을 제조하기 위해서는, 먼저 갈근 또는 갈화, 바람직하게는 건조 갈근 또는 갈화에 2∼10배량의 물을 가한 후 70 내지 100℃에서 열수 추출한 수추출물을 제조한다. 상기 추출물을 냉각한 뒤 유산균을 시료 중량의 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 2 중량%로 접종하고, 30 내지 40℃, 바람직하게는 37℃에서 24 내지 52시간, 바람직하게는 48시간 발효시킴으로써 갈근 또는 갈화 발효물이 제조된다.

상기에서, 유산균으로는 분리균주 또는 시판중인 다양한 유산균을 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 비피도박테리움, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코카스 및 락토코커스 속(屬)의 미생물, 바람직하게는 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱굼(B. longum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 락토바실러스 불가리쿠스(Latobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 스트렙토코커스 썰모필러스(Streptocuccus thermophilus), 스트렙토코커스 패시움(S. faecium), 스트렙토코커스 패칼리스(S. faecalis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코커스 세레비지애(Pediococcus cerevisiae) 및 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) 중에서 선택될 수 있으며, 이중에서 비피도박테리움 속의 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 갈근 또는 갈화 발효물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 갈근 또는 갈화 발효물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위 한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 갈근 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 함유할 수 있다. 개별 투약량은 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

상기 갈근 또는 갈화 발효물의 인체 투여량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별, 상태, 질병의 정도 등에 따라 적절히 선택되며, 성인에게 10∼300 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 20∼100 ㎎/㎏이며, 하루 1 내지 6회 나누어 투여될 수 있다.

상기 갈근 또는 갈화 발효물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독 성 실험을 수행한 결과, 이들 모두 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD ₅₀ )은 적어도 5 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 갈근 또는 갈화 발효물을 제조하는데 가장 효과적인 유산균 균주를 선별하기 위하여, 예비적으로 30여종의 유산균 중에서 β-글루코시다제의 활성이 우수한 균주를 선별한 후 갈근 및 갈화를 발효시켜 에스트로겐상 활성을 측정하였다. 그 결과, 갈근 및 갈화의 발효물을 투여한 경우 시험관내에서 에스트로겐상 활성이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었으며, 갈근보다는 갈화 발효물에서 에스트로겐상 활성이 더 높은 것으로 나타났다(도 1 참조). 또한, 여러 유산균을 실험한 결과, 그중 비피도박테리움 K111에서 에스트로겐상 활성이 가장 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 2 참조).

다음으로, 난소를 제거한 시험동물을 이용하여 상기 갈근 또는 갈화 발효물이 비만 또는 고지혈증에 미치는 영향을 조사하였다. 시험물질을 연속경구 투여한 결과 특별한 임상증상 및 사망동물은 관찰되지 않았으나, 난소를 제거한 시험동물의 체중이 대조군에 비해 1주부터 유의성 있게 증가되었다. 이는 난소 적출에 의한 호르몬의 급격한 변화로 체지방의 축적이 유도되어 시험동물의 체중이 증가된 것으로 생각된다. 그러나, 갈근 발효물을 투여한 경우에는 증가됐던 체중이 유의성 있게 감소되었다(도 3 참조). 이는 상기 갈근 발효물이 에스트로겐과 유사한 작용을 하여 체중 증가를 억제시켰기 때문인 것으로 생각된다.

부검소견으로는 난소 적출에 의한 자궁 위축 현상이 음성대조군에서 뚜렷이 관찰되었으나 갈근 발효물 투여군에서는 음성대조군보다 위축된 정도가 통계적으로 유의성 있게 억제되었다(도 4 참조). 또한, 비장 장기는 정상대조군에 비해 난소 적출군에서 증대되었으나, 갈근 발효물을 연속 경구투여시에는 비대된 장기가 유의성 있게 감소하였다(표 3 참조). 이는 상기 갈근 발효물이 에스트로겐 결핍에 의한 자궁 및 비장 장기의 변화에 대하여 에스트로겐 대체 효능이 있음을 의미한다.

복부지방은 난소를 적출한 음성대조군에서 정상대조군보다 통계적으로 유의성 있게 증가되었으나, 갈근 발효물을 투여한 경우에는 유의성 있게 감소되었다. 음성대조군의 경우 복부지방의 양이 정상대조군에 비해 250% 이상 증가하였으나, 갈근 발효물을 투여한 경우에는 정상대조군에 비해 복부지방이 오히려 20%정도 감소하였다(도 5 및 표 4 참조). 또한, 난소 적출시 에스트로겐 함량은 정상대조군에 비해 20% 이상 감소되었으나, 갈근 발효물 투여군에서는 정상대조군에 비해 다소 증가되었다(표 5 참조).

스트레스, 노화, 임신 및 호르몬의 불균형 등은 콜레스테롤 수치에 많은 영향을 미친다. 갈근 또는 갈화 발효물을 투여한 경우 콜레스테롤 농도가 음성대조군에 비해 대폭 감소되었는데, 이로부터 상기 갈근 발효물이 스테로이드 호르몬, 성 호르몬 등의 선구물질인 콜레스테롤이 에스트로겐으로 대사되는 것을 촉진시키는 것으로 추측되었다. 또한, 동맥경화증의 중요 발병요인인 LDL-콜레스테롤과 중성지방의 양이 음성대조군에 비해 30% 이상 감소되었다(표 6 참조). 즉, 갈근 발효물을 투여한 경우에는 모든 종류의 콜레스테롤이 통계적으로 유의성 있게 감소되었다.

본 발명에 따르면, 식물성 에스트로겐인 피토에스트로겐의 함량이 더 많은 갈화 발효물보다 갈근 발효물을 투여한 경우에 비만 및 고지혈증 예방 및 치료효과가 우수한 것으로 나타났는데, 이로부터 갈근의 수추출물을 발효시킴으로써 단순히 피토에스트로겐의 함량이 늘어나 것 이외에 비만 및 고지혈증의 예방 및 치료에 있어서 상승효과를 부여하는 특정한 효능 성분이 증가하였음을 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 호르몬 균형을 일정부분 유지시키는 물질로 작용하는 것으로 생각되며, 비만 및 고지혈증 뿐만 아니라 각종 내분비 질환 예방, 치료에 도움이 될 것으로 예상된다.

또한, 본 발명은 갈근 또는 갈화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.

상기 갈근 또는 갈화 발효물은 비만 또는 고지혈증 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 갈근 또는 갈화 발효물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이들을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 원료에 대하여 갈근 또는 갈화 발효물이 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물에는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 갈근 또는 갈화 발효물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01∼0.04 g, 바람직하게는 약 0.02∼0.03 g 이다.

이 외에도 상기 갈근 또는 갈화 발효물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 상기 갈근 발효물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 갈근 또는 갈화 발효물 100 중량부 당 0.01∼0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 갈근 발효물의 제조

<1-1> 갈근 열수추출물의 제조

국내산 건조 갈근을 구입하여 시료로 사용하였다. 정선한 갈근 1 ㎏에 물 5 ℓ를 가한 후 100℃에서 열수 추출하여 추출물을 얻었다.

<1-2> 균주의 배양

예비적으로 30여종의 유산균 중에서 β-글루코시다제 활성이 우수한 균주로 비피도박테리움 브레브 K-111(경희대약대 김동현교수실), 비피도박테리움 브레브 K-110 (KCCM 10097) 및 스트렙토코커스 패시움(KCTC 3077) 균주를 먼저 선발하였다. 선발된 분리균주 및 시판중인 락토바실러스, 비피도박테리움 및 스트렙토코쿠스 속의 미생물들을 표준배지(호기성균; MRS 배지, 혐기성균; GAM 배지)에서 계대 배양한뒤 초기균수를 10 ⁸ 으로 조절하여 실험에 사용하였다.

<1-3> 수추출물 발효물의 제조 (1)

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 갈근의 수추출물을 냉각시킨 후 실시예 <1-2>의 표준배지에서 배양한 유산균 50 g(습중량)을 첨가하여 37℃에서 6 내지 96시간 반응시키고 동결건조하여 본 발명의 갈근 발효물 분말을 얻었다.

<1-4> 수추출물 발효물의 제조 (2)

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 갈근의 수추출물을 냉각시킨 후 실시예 <1-2>의 표준배지에서 배양한 유산균을 갈근 수추출물 시료 중량의 1%로 접종하고, 37℃에서 36시간 동안 발효시킨 후 동결건조시켜 본 발명의 갈근 발효물 분말을 제조하였다.

실시예 2: 갈화 수추출물의 발효물 제조

갈근 대신에 갈화를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 동결건조한 갈화 수추출물의 발효물 분말을 제조하였다.

비교예 1: 대두 수추출물의 발효물 제조

갈근 대신에 대두를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여 동결건조한 대두 수추출물의 발효물(이하, "대두 발효물"이라 약칭함) 분말을 제조하였다.

비교예 2: 갈근, 갈화 및 대두 수추출물의 제조

실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 갈근, 갈화 및 대두의 수추출물을 제조한 후 동결건조시켜 이들의 수추출물 분말을 제조하였다.

실험예 1: 갈근 수추출물과 이의 발효물의 이소플라보노이드 성분 분석

실시예 <1-1>에서 제조한 갈근 수추출물과 실시예 <1-3>에서 제조한 갈근 수추출물의 발효물(이하, 별도의 언급이 없는 한 실시예 <1-3>의 발효물임)에 포함되어 피토에스트로겐으로 작용하는 이소플라본의 함량을 HPLC (일본 미쯔비시사)를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 4.6×250 ㎜ 크기의 칼럼을 사용하였으며, 이동상으로는 0.1% 아세트산을 함유한 아세토니트릴과 0.1% 아세트산을 함유한 2차 증류수를 30:70 비로 혼합한 용매를 사용하였다. 시료의 주입량은 10 ㎕ 였으며, 유속은 1.0 ㎖/분으로 조정하였다. 시료내에 포함된 이소플라보노이드의 함량은 254 nm의 파장에서 UV 검출기로 검출하였으며, 이소플라본 표준물질은 미국 시그마사의 제품을 사용하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 발효물은 유산균 발효에 의해 이소플라보노이드 성분에 많은 변화가 생기며, 특히 활성성분인 다이드제인과 제니스테인의 함량이 매우 증가하게 된다는 것을 확인하였다.

실험예 2: 수추출물 및 발효물의 에스트로겐상 작용 측정

본 발명의 발효물이 유방암 세포주인 MCF-7 세포주를 이용한 에스트로겐상 효과를 측정하였다.

이를 위하여, 먼저 10% FBS가 함유된 DMEM 배지(Dullbecco's modified Eagle's medium, 미국 Sigma 사)를 사용하여 MCF-7 세포를 5% CO ₂ , 37℃ 조건하에서 배양하였다. 호르몬 유도하기 전에 PBS 완충액으로 세포를 세척하였으며, 시료처리 전에 모든 에스트로겐 원(source)을 제거하기 위해 10% CD-FBS (charcoal-dextran stripped FBS)가 함유된 페놀레드가 없는 DMEM에서 2일 동안 세포를 배양하였다. 배양된 세포는 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA를 처리하여 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였고, 세포수를 측정하여 5×10 ³ 세포/웰이 되도록 96웰 배양판에 0.1 ㎖씩 분주하였다. 24시간 후 시료를 각각 6 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖ 씩 처리하고 6일(144시간) 동안 배양한 후 MTT 분석 시험으로 세포의 증식 정도를 측정하였다. 이때, 시료는 상기 실시예 및 비교예에서 제조한 갈근 및 갈화 수추출물의 발효물과 갈근 및 갈화의 수추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 최종농도가 0.1% 이하가 되도록 DMSO에 녹여 사용하였다.

MTT 분석을 위하여, 6일간 배양된 상기 세포에 2 ㎎/㎖의 MTT 시약을 웰 당 50 ㎕씩 가하여 30분 동안 인큐베이터에서 반응시켰다. 배지를 제거한 후 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 가하여 540 nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 시료를 6 ㎍/㎖ 농도로 사용한 경우 갈근 및 갈화 모두에서 단순 수추출물(G, K)에서보다 추출물을 발효시킨 경우에 에스트로겐상 효과가 크게 증가하였으며, 전체적인 에스트로겐상 효과는 갈근보다 갈화가 우수함을 확인하였다(도 1). 또한, 유산균으로는 비피도박테리움 K111 (G111, K111)이 에스트로겐상 효능을 가장 많이 증가시키는 것을 알 수 있었다.

한편, 고농도의 시료를 사용한 경우에도 역시 전체적인 에스트로겐상 효과는 갈근 보다는 갈화가 우수하였으며, 갈화의 경우는 유산균으로 비피도박테리움 K110을 사용한 경우에, 그리고 갈근의 경우는 비피도박테리움 K111을 사용한 경우에 에스트로겐상 효과가 크게 상승하였다(도 2).

실험예 3: 실험동물을 이용한 비만 및 고지혈증에 대한 효능 실험

<3-1> 골다공증의 유발 모델의 확립 및 육안 관찰

<3-1-1> 골다공증 유발 모델의 확립

본 발명자들은 난소가 제거되어 골다공증이 유발된 동물모델을 대상으로 상기 실시예에서 제조된 갈근 또는 갈화 발효물이 비만 및 고지혈증에 미치는 영향을 조사하였다. 골다공증을 유발하는 동물모델은 폐경기 이후의 타입 Ⅰ으로, 실험동물은 8주령의 SD (Sprague-Daweley)계 래트 암컷을 (주)오리엔트로부터 구입하여 사용하였다. 9주령에 난소를 적출하여 골다공증을 유발하였으며, 1주간 순화시킨 후 10주령에 실험을 실시하였다. 이때, 난소를 적출하지 않은 군을 정상대조군으로 사용하였고 난소를 적출하고 아무런 약물치료를 하지 않은 군을 음성대조군으로 사용하였다.

구체적으로, 마취약(염산 케타민(ketamine) 50 ㎎/㎖, 유한양행 + 자일라진(xylazine) 20 ㎎/㎖, 바이엘코리아 주식회사)을 시험동물 등배부에 피하주사하여 전신마취시킨 다음, 하복부의 털을 제거하고 동물의 체위를 반듯이 눕힌 상태에서 요오드(삼일제약)로 수술부위를 소독한 후 난소를 적출하였다. 시험동물의 정중선을 중심으로 하복부에서 1 ㎝ 정도로 피부, 복근 및 복막을 차례로 절개하고 소독된 핀셋으로 난소를 노출시켜 난관을 견사로 결찰한 후, 좌측 및 우측의 난소를 제거하였다. 감염방지를 위해 항생제(쎌파포르테-4, 유니화학 주식회사) 0.4 ㎖를 복강내 주입하였고 견사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다.

<3-1-2> 시료의 투여

상기 실시예 및 비교예에서 제조한 건조함량(추출전 시료량) 5 g/㎏의 시료를 생리식염수 10 ㎖/㎏에 녹여 투여용량으로 동물실험에 사용하였다. 시험군당 실험동물의 수, 시험물질의 투여량은 하기 표 2와 같다. 정상대조군 및 음성대조군에 대해서는 주사용 멸균 생리식염수(10 ㎖/㎏)를 투여하였다. 배부피부 고정법으로 실험동물을 고정하고 경구투여용 금속제 존데와 주사관을 이용하여 위내에 강제 경구투여하였다. 투여기간은 1일 1회 7주 및 14주간 투여하였으며, 투여량은 매주 1회 측정된 체중을 기준으로 하여 각각의 군별 투여량에 맞게 투여액량을 계산하였다.

C ; 정상대조군, NC ; 음성대조군, T1 ; 대두추출물 투여군, T2 ; 대두 발효물 투여군, T3 ; 갈근 발효물 투여군, T4 ; 갈화 발효물 투여군.

<3-1-3> 체중변화 측정

시험에 사용된 모든 동물에 대하여 주 1회 오전 10시에 체중을 측정하여 시료의 투여가 시험동물의 체중 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 모든 실험군에 대하여 동물 측정용 저울(Mettler, AT261)로 무게를 측정하고 평균과 표준 편차를 구하였으며, 하기 모든 실험에서 대조군과 시험군 간의 통계학적 유의성은 스튜던트 t-테스트에 의해 검정하였다. 이때, p<0.05를 실험군간의 유의성 있는 차이로 판정하였다.

그 결과, 난소를 적출한 음성대조군의 체중이 정상대조군에 비해 1주부터 유의성 있게(p<0.01) 증가되었으나, 갈근 발효물을 2주간 연속투여시 증가됐던 체중이 유의성 있게(p<0.01) 감소되었음을 확인하였다(도 3).

<3-1-4> 부검소견

시료 투여 후 7주 및 14주째에 에테르 마취하에서 하복부를 개복한 후, 복대동맥에서 채혈하였고, 내부 장기를 육안으로 관찰하였다. 채혈한 후 잔혈은 방혈하였으며, 자궁, 뇌, 뇌하수체, 비장, 부신, 신장, 간, 폐 및 심장의 무게를 저울을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 난소 적출에 의한 자궁 위축 현상이 관찰된 것을 제외하고는 모든 실험군에서 시험물질 투여와 관련된 이상 소견은 나타나지 않았다. 음성대조군에서는 정상대조군의 자궁과 대비될 정도로 자궁이 현저히 위축되었으나, 본 발명의 갈근 발효물을 투여한 경우에는 다른 시료 투여군에 비해 자궁 위축이 유의적으로 억제되었다(도 4). 장기 무게로부터도 정상치는 아니지만 다른 실험군에 비하여 자궁의 위축이 현저히 억제됨을 확인하였다(표 3).

a ; 수치는 평균치로 나타냄, b ; ±SD, 음성대조군과 통계학적으로 유의적인 차이를 보임(*p<0.05, **p<0.01).

<3-1-5> 복부지방 측정

부검시 시험동물의 복벽지방 및 복부지방을 분리한 후 동물장기 측정용 저울을 사용하여 무게를 측정하였다.

그 결과, 난소를 적출한 음성대조군에서는 정상대조군에 비해 복부지방이264% 증가되었으나(p<0.01), 갈근 발효물을 투여한 경우에는 정상대조군의 81% 수준으로 오히려 복부지방이 감소된 것을 확인하였다(도 5 및 표 4).

a ; 수치는 평균치로 나타냄, b ; ±SD, 음성대조군과 통계학적으로 유의적인 차이를 보임(*p<0.05, **p<0.01).

<3-2> 비만 및 고지혈증과 관련된 혈액학적 검사

<3-2-1> 호르몬 농도 측정

부검시 채취한 혈액으로부터 혈중 에스트로겐 함량을 측정하였다. 그 결과, 난소적출시 에스트로겐 함량은 정상대조군에 비해 21.37% 감소하였다. 대두추출물 투여군(T1) 및 대두 발효물 투여군(T2)의 경우에는 에스트로겐 농도가 정상대조군에 비해 각각 4.49 및 7.62% 감소되어 음성대조군보다 증가하는 경향을 보였으며, 갈근 발효물 투여군(T3) 및 갈화 발효물 투여군(T4)의 경우에는 각각 100.46% 및 117.65%로 나타나 음성대조군보다 현저하게 증가되었다. 특히, T4군은 통계적으로 유의성(p<0.01) 있게 증가되었다(표 5).

a ; 수치는 평균값으로 나타냄, b ; ±SD, 음성대조군에 비하여 통계적 유의성(**p<0.01).

<3-2-2> 혈중 총 콜레스테롤 정량분석

혈장내 콜레스테롤 수치는 관상동맥질환, 갑상선 기능, 간 기능, 담즙 분비의 기능, 장의 흡수 및 부신 질환의 가능성을 나타내는 지표라 할 수 있다. 스트레스, 노화, 임신 및 호르몬 균형 등은 콜레스테롤 수치에 영향을 미친다. 혈장의 콜레스테롤 에스테르가 콜레스테롤 에스트라제(estrase)에 의해 콜레스테롤과 유리 지방산으로 가수분해되고, 콜레스테롤은 콜레스테롤 옥시다제(oxidase)에 의해 콜레스트-4-엔-3-온과 과산화수소로 산화된다. 이렇게 생성된 과산화수소는 시약중의 하이드록시벤조산과 4-아미노안티피린(aminoantipyrine)과 결합하여 발색하게 되는데, 이를 510 nm/620 nm에서 정량함으로써 총 콜레스테롤의 양을 정량할 수 있다.

본 발명에서는 Allain의 방법(Allain CC, et al., Clin. Chem., 20: 470-475, 1974)을 변형시킨 Roeschlau의 방법(Roeschlau P, et al., Clin. Chem., 12: 226, 1974)으로 총 콜레스테롤의 양을 정량하였다. 구체적으로, 마우스 한 군을 5마리로 하여 3일간 검체를 경구투여하고, 대조군에는 검체 대신 생리식염수를 경구 투여하였다. 16시간 동안 절식 시킨 후, 트리톤 WR-1339 200 ㎎/㎏를 멸균한 생리식염수에 녹여 꼬리 정맥에 주사하고, 정상군에는 트리톤 WR-1339 대신 생리식염수를 주사하여, 18시간이 경과한 후 심장으로부터 채혈하였다. 검체는 3일간 매일 1회씩 투여하되, 검체의 마지막 투여는 트리톤 WR-1339을 주사하기 1시간 전이 되도록 하였다. 이때, 비교군으로는 제니칼(로슈 주식회사)을 사용하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

<3-2-3> 혈중 HDL-콜레스테롤 정량분석

유산소 운동 및 채소, 과일, 불포화 지방산이 많은 음식물 섭취는 혈액내 HDL-콜레스테롤의 양을 증가시킨다. HDL-콜레스테롤은 다중음이온(polyanion) 침전법에 의해 정량되는데, 상기 방법에서는 양전하로 하전된 아포단백질(apoprotein) B를 포함하는 지단백질(lipoprotein)이 다중음이온과과 결합하는 것을 이용한다(Burstein M, et al., J Lipid Res., 11: 583, 1970). 평균 분자량이 6,000 달톤(dalton)인 PEG가 특정 농도에서 분자나 입자의 크기에 근거하여 지단백질같은 거대분자를 침전시키는 성질을 이용하여 HDL-콜레스테롤을 분리해 낼 수 있으며, 따라서 PEG 처리 후 원심분리하여 얻은 상층액으로 HDL-콜레스테롤의 양을 정량하였다. 이때, 비교군으로는 제니칼을 사용하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

<3-2-4> LDL-콜레스테롤 정량분석

LDL-콜레스테롤은 혈관벽에 쌓여 동맥경화증 등을 유발하는 인자로서 동물의 내장, 간, 알, 붉은 살코기 및 포화지방산 등의 섭취에 의해 혈장내 LDL-콜레스테롤의 양은 증가된다. 본 발명자들은 혈액에서 혈청을 분리한 후, 13,000 rpm에서 30분간 고속원심분리하여 카일로마이크론(chylomicron)을 분리하였으며, 분리한 카일로마이크론을 밀도(1.063 g/㎖)를 이용하여 2℃에서 35,000 rpm으로 24시간 동안 고속원심분리하여 LDL-콜레스테롤을 얻었다. 그 후 코바스 미라 오토애널라이저(Cobas Mira autoanalyzer, Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica, Mannheim, Germany, Kit No. 310328)와 Wako Chemical GmbH 키트(Neuss, Germany, Kit No. 909-54009)를 이용하여 LDL-콜레스테롤을 정량하였다. 이때, 비교군으로는 제니칼을 사용하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

<3-2-5> 혈중 중성지방 정량분석

중성지방(triglyceride, TG)은 체내에서 여분의 칼로리가 전환되어 생성된 혈중 지질의 한 형태로, 비만, 고혈당, 심장질환 및 지방간 등의 발생과 관련이 있다. 본 발명자들은 효소 비색법(enzymatic colorimetric method)(Boehringer Diagnostica, Mannheim, GmbH, FRG, kit No. 236691, 310328, 701912)을 이용하여 Specific Chemistry Analyzer (Kone, Finland) 기기로 중성지방의 양을 측정하였다. 이때, 비교군으로는 제니칼을 사용하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

그 결과, 갈근 또는 갈화 발효물 투여군의 경우, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 중성지방의 함량은 모두 음성대조군에 비해 크게 감소되고, HDL-콜레스테롤 함량은 음성대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다(표 6).

제조예 1: 갈근 또는 갈화 발효물을 포함하는 약학적 조성물의 제조

<1-1> 시럽제의 제조

갈근 또는 갈화 발효물을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 먼저, 실시예 1에서 제조한 갈근 또는 갈화 발효물 분말, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성 성분은 다음과 같다.

갈근 또는 갈화 발효물 --------------------------------- 2 g

사카린 ---------------------------------------------- 0.8 g

당 ------------------------------------------------- 25.4 g

글리세린 -------------------------------------------- 8.0 g

향미료 --------------------------------------------- 0.04 g

에탄올 ---------------------------------------------- 4.0 g

소르브산 -------------------------------------------- 0.4 g

증류수 ----------------------------------------------- 정량

<1-2> 정제의 제조

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

갈근 또는 갈화 발효물 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 상기 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성 성분은 다음과 같다.

갈근 또는 갈화 발효물 ------------------------- 250 g

락토오스 ------------------------------------ 175.9 g

감자전분 -------------------------------------- 180 g

콜로이드성 규산 -------------------------------- 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 -------------------------------------- 160 g

활석 ------------------------------------------- 50 g

스테아르산 마그네슘 ----------------------------- 5 g

<1-3> 주사액제의 제조

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제를 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

갈근 또는 갈화 발효물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성 성분은 다음과 같다.

갈근 또는 갈화 발효물 --------------------------- 1 g

염화나트륨 ------------------------------------ 0.6 g

아스코르브산 ---------------------------------- 0.1 g

증류수 ----------------------------------------- 정량

제조예 2: 갈근 또는 갈화 발효물을 함유하는 건강식품의 제조

<2-1> 식품의 제조

갈근 또는 갈화 발효물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 20∼95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토 케찹 및 소스의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 0.2∼1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 0.5∼5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 0.1∼5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품(dairy products)의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 5∼10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다. 실시예에서 제조한 갈근 또는 갈화 발효물을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 갈근 또는 갈화 발효물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%),

종실류(들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%),

갈근 또는 갈화 발효물의 건조분말(3 중량%),

영지(0.5 중량%),

지황(0.5 중량%)

<2-2> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5∼10%, 구연산 0.05∼0.3%, 카라멜 0.005∼0.02%, 비타민 C 0.1∼1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79∼94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85∼98℃에서 20∼180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5∼0.82%를 주입하여 갈근 또는 갈화 발효물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 갈근 또는 갈화 발효물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 페트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채주스의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 5 g을 토마토 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

4. 과일주스의 제조

갈근 또는 갈화 발효물 1 g을 사과 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 갈근 또는 갈화 발효물은 갈근 또는 갈화 추출물만으로는 얻을 수 없는 뛰어난 비만 또는 고지혈증 예방 또는 치료 효과를 보이며, 알콜, 특히 독성이 있는 메탄올 수용액으로 추출한 종래 추출물에 비해 물에서 추출한 후 발효시켰으므로 인체에 적용하기 위한 고도의 정제과정을 추가로 필요로 하지 않는다는 장점이 있다.