人或动物胃肠道细菌群构成为一个庞大复杂的生态系统，该系统包括许多 类型的微生物。在个体的微生物群(＝细菌微生物区系)中，有超过400种不同 细菌，其总量约为1014个。从胃到结肠，细菌数沿着胃肠道增加。发现在结肠 中细菌数量最高，每ml肠容量达到1011个菌落形成单位(cfu)。
微生物可以与宿主是寄生、共栖、或共生关系，这取决于构成微生物群的 特定细菌的种类。共生细菌的许多有益效果是可以利用的，例如预防便秘和/或 腹泻，增强矿物质吸收，避免感染，预防癌症，免疫调节等等。对宿主有益的 微生物，包括细菌，通常称为益生微生物或益生菌。
为将益生菌的有益功能提供给消费者，在制备口服形式并含足量益生菌的 产品方面付出了巨大努力。然而，这些努力反复遇到与益生菌制品生产和稳定 性相关的几个技术问题。
例如，许多益生菌是无氧代谢，这给初始培养和提供适于以足够高浓度向 人或动物递送所述细菌的可食用产品方面的所有工艺和生产标准提出了特定的 技术要求。
实际上，最起码的事实——活细菌即使在低温下仍有代谢活性——带来了 这样的问题：益生菌的可摄取载体往往由于细菌的活性而不断降解，这将导致 载体完全不适口。
另一个有关问题是，要保证有足够量的益生菌能以活的状态到达小肠和大 肠。就事实而言，在途径胃肠道的过程中，胃部的酸性环境以及暴露于胆汁酸 将极大减少细菌的存活。
现有技术已经报道了提供益生菌的多种可行性。获得稳定益生菌制剂的通 用方法包括以下步骤：进行发酵以获得细菌的高cfu，加入载体或保护性物质， 例如碳水化合物或奶粉，并干燥混合物，例如冷冻干燥。通过上述方法，可获 得低Aw和货架期延长的细菌制品。然而，这一原理所使用的热干燥或冷冻干 燥工艺的缺点是必须要经受活细菌的显著损失。而且，这种工艺仅获得干态产 品。如果有更方便的食用形式，那将是有利的。
递送益生菌的另一个方式是制备益生菌发酵产品。这种情况例如用微生物 发酵牛奶获得的酸乳。这些产品的优点在于，由于发酵产品的低pH值所以在冷 藏时它们相对稳定。然而，益生菌发酵活性产生的酸味并不一定符合每个消费 者的口味。此外，这些产品仍需冷藏。
类似地，市售的“甜味酸奶”也需冷藏，以防止产品变质和发酵(参见EP 0 154 614B1，第2栏27-33行)。该冷藏也保证了风味纯正，即使产品本身并没 有发酵。
EP 0 154 614公开了一种在牛奶中培养生长能力缓慢的生物的方法。简言 之，在牛奶中加入微生物，在最适生长条件下生长，直到pH达到4.5-5，从而 得到一批初始微生物。接着，将该批初始微生物加入至一批加工牛奶中，再在 最适生长条件下培养，直到细菌含量达到108cfu/ml。由于该产品是酸化产品， 因此同样有上述缺点。
综合现有技术，本发明的目的是提供用于益生菌微生物的其他方式或另一 递送系统。
本发明的另一目的是寻找使益生菌在干燥步骤中没有损失的方法。
此外，本发明的目的是在提供存活的益生菌的同时，避免与益生菌制品冷 却或冷藏相关的花费和能量消耗。
除此之外，本发明的目的是提供如下产品形式的益生菌，其中该产品具有 延长货架期并且方便使用。
值得注意的是，已发现益生菌微生物在基于水或乳的液体中，室温下具有 延长的保持稳定的时间，例如几个月。该令人惊奇的发现还存在于下述情况， 例如将益生菌置于不含可被微生物消化的碳水化合物的液体中。
因此，本发明一方面提供了基于水或乳的且含有活的微生物的液体产品， 其特征在于，该液体产品在10℃下有至少1个月的货架期，在该期间，产品的 pH降低少于2个点和/或活菌量减少少于2个log单位。
又一方面，本发明提供了制备基于水或乳的液体微生物递送系统的方法， 该递送系统在10℃下至少1个月是货架稳定的，该方法包括以下步骤：发酵培 养基获得活微生物的生物质，将微生物菌体加入至不含可被微生物代谢的碳水 化合物的水基液体中。
另一方面，本发明提供了为消费者提供基于水或乳的液态活微生物的方法， 该方法包括向消费者给予本发明产品的步骤。
另一方面，本发明提供了基于水或乳的液态微生物货架稳定产品的用途。
另一方面，本发明提供了一种液体产品，其能够提供有益活益生菌，该产 品能在10℃以上贮存至少一个月。
另一方面，本发明提供了为个体提供有益活益生菌的方法，该方法包括为 个体提供本发明产品的步骤。
再一方面，本发明提供了以可食用形式配送活微生物的方法，该方法包括 配送本发明产品的步骤。
附图简述
图1显示了微生物接种量为2-5×107cfu/ml的本发明产品两个月期间的pH 和Dornic酸度。
图2显示本发明液体产品在25℃下经过98天贮存，其中的细菌的cfu损失。
在本说明书中，词语“包含”意指“除其它东西之外还包括”。它不应被 曲解为“仅由......组成”。
在本发明内容中，包含活微生物的本发明产品还可以指的是所述微生物的 递送系统。
术语“基于水或乳的液体”指任何非疏水性的液体。例如，该术语排除了 基于脂或油的液体。然而，该术语包括，例如，在亲水基质中含有脂质液滴的 乳剂型液体。
优选地，本发明液体产品的Brookfield粘度在200Pas-1以下。更优选地， 本发明液体产品的Brookfield粘度在100Pas-1以下，最优选地，本发明液体产 品的Brookfield粘度在20Pas-1以下。Brookfield粘度是在5RPM剪切率、8 ℃温度下测量得到的。这些数值可用Brookfield DV-II+粘度仪建立。
术语“货架稳定”通常是指该产品不需要在8℃或以下冷藏，可以在超市的 非冷藏架上储存。超市温度通常在16-25℃之间。
就本发明而言，产品的“货架期”从产品制备完成那一刻开始计算，即在 产品装填和密封之后即开始计算。为了简单且给一个清楚的印象，产品到超市 上架所用的那段时间不能被认为是本发明的“货架期”起始点。这是因为制备 和超市陈列之间的时间高度变化，该时间实际上取决于多种非常规因素。
在一个实施方案中，本发明产品的特征在于其包含乳蛋白，乳糖和/或其他 乳或来自乳的固体。
具体而言，乳固体包括例如乳产品，或含有来自乳的成分的产品，例如乳 蛋白，如乳清蛋白、酪蛋白，乳碳水化合物，如乳糖，或乳脂，如乳酪。优选 地，本发明的产品包含乳蛋白。
因此，产品可以是全脂奶、脱脂奶或半脱脂奶，酪乳，或例如基于奶粉的 复制奶。
优选地，液体产品是灭菌奶，例如通过超高温处理(UHT)灭菌。优选地， 产品是货架稳定的液体奶产品。
可选地，本发明产品可以是例如糖浆，软饮料，碳酸软饮料，茶，如冰茶， 果汁，如苹果汁、桔子汁或一般果汁。
产品也可以是豆制品。例如，可以是豆奶或豆饮料。例如，液体产品可以 是替代奶的豆制品。豆制品可以不含乳糖。
本发明产品优选水活度0.4或以上，更优选0.6或以上，甚至更优选0.7或 以上。例如，本发明产品水活度在0.8或以上。
优选地，本发明产品是非发酵产品。
然而，可以设想本发明产品是发酵产品，例如通过发酵培养基，热处理或 巴斯德法将培养基灭菌以减少细菌量且同时杀灭发酵菌而获得。接着，在经过 发酵、并优选经过巴斯德灭菌的产品中添加本发明的微生物，其中该微生物不 能进一步在发酵培养基中生长。例如，产品可以是经过热处理的酸乳，将在该 发酵热处理产品上不能生长的微生物加入至该酸乳中，获得满足本发明特征的 产品。因此，本发明产品可以是搅拌过的或静置的酸乳，该酸乳有天然口味或 有另外的风味或成分，例如果粒。本发明产品也可以是货架稳定的鲜奶酪。
术语“log单位”是指基于10的对数。因此，一个log单位cfu的减小，例 如是指从109减小到108cfu。换句话说，例如，一个log单位减小是指从开始值 100％减小到10％。
1个pH点的减小可以用pH从7.0减小到6.0，或pH从6.5减小到5.5的 实例来说明。2个pH点的减小，例如，可以是从pH6.7减小到pH4.7。
在一个实施方案中，本发明产品不含可被微生物代谢的碳水化合物。例如， 如果液体产品包含乳糖，则微生物优选是不能代谢乳糖的细菌。
因此，在本发明另一实施方案中，微生物不能用乳糖作为营养物。不能利 用乳糖的微生物的实例是副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei，CNCM I-2116)，或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，ATCC 53103)。
本发明的另一个实例，微生物不能用蔗糖用作营养物。Lactobacillus delbruecki subspbulgaricus(ATCC11842)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus， ATCC15009)是不能用蔗糖作为底物的菌株。
另外，本发明产品可不含另外的可被微生物代谢的碳源。
为了说明本发明的原理，在理论上假定，如果本发明任何产品不含蔗糖但 包含其他碳水化合物，那么产品中包含的微生物所能代谢或者利用其作为常量 营养物的，应当仅是该缺失的碳水化合物，如蔗糖。
本发明产品优选不含一种或多种选自果糖，葡萄糖，和蔗糖的碳水化合物。 优选地，本发明产品不含葡萄糖和/或果糖，更优选不含蔗糖。
就本发明而言，术语“不含碳水化合物”，例如“不含蔗糖”，是指碳水 化合物的量在每100ml液体产品中少于0.2g的液体产品。
优选地，碳水化合物的量少于0.1g/100ml，更优选少于0.05g/100ml，最优 选少于0.01g/100ml。
产品可在来源上就不含潜在可发酵的碳水化合物，这取决于产品成分的选 择。另外，可以从产品或其成分中除去所有潜在可发酵的碳水化合物。
因此，如果微生物能利用蔗糖，果糖和葡萄糖，液体产品则优选不含这三 种碳水化合物中的任何一种。
优选地，微生物天然不能利用液体产品中的碳水化合物。例如，微生物可 以是天然不能利用乳糖的菌株。例如，微生物是天然的突变株。另外，微生物 是经过遗传改造而不能在特定的碳水化合物上生长的。
优选地，微生物是细菌。更优选地，微生物是乳酸菌。
在优选的实施方案中，微生物是益生菌。
在本发明的实施方案中，微生物是选自由乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧 杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、Lactococcus、肠球菌属 (Enteroccus)及其组合的菌株。
优选地，微生物是乳杆菌属(Lactobacillus)菌株。更优选地，微生物选自 干酪乳杆菌(L.casei)、副干酪乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物 乳杆菌(L.plantarum)及其组合。优选地，微生物是副干酪乳酸杆菌菌株，例 如是副干酪乳酸杆菌(CNCM I-2116)。
优选地，本发明液体产品在货架期伊始包括每ml至少104 cfu的微生物。 更优选至少105，甚至更优选至少107，最优选至少108cfu/ml。例如，液体产品 包括至少106cfu/ml。
优选地，本发明液体产品在本发明定义的整个货架期，包含105-109，更优 选106-108cfu的微生物/ml。
在本发明任一液体产品的实施方案中，液体产品在20℃下有至少1个月的 货架期，在该期间，产品pH减小少于2个点且活微生物的损失少于2个log单 位。优选地，pH减小少于1个单位，更优选少于0.5个单位。
本发明液体产品优选在20℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间，产 品pH减小少于2个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，pH减 小少于1个单位，更优选少于0.5个单位。
优选地，本发明液体产品在20℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间， pH减小少于2个点，活微生物的量减小少于1.5个log单位。优选地，pH减小 少于1个单位，更优选少于0.5个单位。
优选地，本发明液体产品在20℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间， pH减小少于1个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，活微生物 的量减小少于1个log单位，更优选少于0.5个log单位。
优选地，本发明液体产品在20℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间， pH减小少于0.7个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，活微生 物的量减小少于1个log单位，更优选少于0.5个log单位。
例如，产品可以在20℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间，pH减 小小于0.7个点，活微生物的量减小少于1，优选少于0.5，更优选少于0.3个log 单位。
优选地，本发明液体产品在25℃下有至少1个月的货架期，其中在该期间， 产品pH减小少于2个点，活微生物损失少于2个log单位。优选地，pH减小 少于1个单位，更优选少于0.7个单位。
本发明液体产品优选在25℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间，产 品pH减小少于2个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，pH减 小少于1个单位，更优选少于0.5个单位。
优选地，本发明液体产品在25℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间， pH减小少于2个点，活微生物的量减小少于1.5个log单位。优选地，pH减小 少于1个log单位，更优选少于0.5个单位。
优选地，本发明液体产品在25℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间， pH减小少于1个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，活微生物 的量减小少于1个log单位，更优选少于0.5个log单位。
优选地，本发明液体产品在25℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间 pH减小少于0.7个点，活微生物的量减小少于2个log单位。优选地，活微生 物的量减小少于1个log单位，更优选少于0.5个log单位。
优选地，产品可以在25℃下有至少2个月的货架期，其中在该期间，pH减 小少于0.7个点，活细菌的量减小少于1，优选少于0.5，更优选少于0.3个log 单位。
优选地，本发明产品货架期的所有上述参数，如以储存温度(10，20，25 ℃)、pH减小(2，1，0.5，0.3个点)和cfu(2，1.5，1，0.5，0.3个log单位) 所表示的，可获得3个月或更长的货架期。
产品可以具有3.4-8范围内的任何pH值，优选4-7.5，最优选6-7，只要该 范围内特定的pH值能在本发明定义的货架期间保持稳定。
例如，本发明产品的pH在20℃2个月的货架期内保持在6-7的范围内。
在一个实施方案中，本发明液体产品的pH在上架前是3或更高。更优选 地，pH是4或更高，甚至更优选是5或更高，还更优选是6或更高。例如，产 品的pH是5.5或更高。最优选的，产品的pH在货架期伊始为6.1-7.8。
在制备方法的一个实施方案中，培养基发酵步骤在30℃以上进行至少7小 时，更优选在35℃以上，例如在37℃，进行至少8小时。
任选地，基于水或乳的液体微生物递送系统的制备方法可还包括从发酵培 养基中分离生物质的步骤和/或进一步任选地，在将生物质加入至基于水或乳的 液体之前洗涤生物质的步骤。另外任选地，培养物在加入至基于水或乳的液体 之前可以是冷冻，干燥或冷冻干燥的。
在提供给消费者活的微生物的方法中，消费者优选那些需要或想食用活的 微生物的消费者，且微生物以足够的量施用。足够的量通常是指每份施用至少 105-108个，优选106-107个活的微生物。优选地，每天食用至少一份。
本发明一方面提供液体产品或用于提供有益的活的益生菌的方法。活微生 物有许多已知的益处，同时许多更多的益处在将来可能被发现。这种益处的实 例可以是减轻肠胃疼痛，使肠胃舒适，使身体健康，增加矿物质吸收，预防或 减少便秘和/或腹泻，免受感染，预防感染，免疫调节，增加对病原体或寄生虫 的免疫应答，以及预防癌症。可以选择一种或多种微生物，并组合或混合在单 一制品中，以提供一种或多种这些示例益处。
优选地，提供活益生菌益处的产品可以在温度15℃以上储存至少2个月。 储存时间以上述定义的货架期开始计算。更优选地，提供益生菌益处的产品可 以在本发明其他产品相应的温度和时间内储存。例如，产品储存在温度接近或 高于25℃约3个月或以上。
另一方面，本发明提供了以可食用形式配送活微生物的方法。优选地，配 送是货架稳定产品的配送。货架稳定的产品和需冷藏的产品通常有不同的配送 形式，例如对于冷藏配送途径，在储存、运输以及后来的超市上架期间，均通 常要求在6℃或以下冷藏。根据本发明，配送，包括运输，以及任选地，在储藏 室和/或超市货架上的储存，可以在温度10℃以上进行，优选温度在10℃-25℃ 之间，更优选温度在14℃-20℃之间。该以可食用形式配送活微生物的方法在配 送期间有降低能耗的优点，因为基本上不必冷藏。优选地，该可食用形式的活 微生物相应于本发明的液体产品。
实施例：
按下述方法制备包含益生菌的货架稳定的乳基液体。
材料与方法
选择副干酪乳酸杆菌(CNCM I-2116)作为益生菌微生物。该菌株是β-半乳 糖苷酶缺陷型，因此不能利用乳糖作为碳源底物。
试验分别以冷冻浓缩物和起始物制品进行。
起始物制品的制备，使用以下培养基：
-1％酵母提取物
-2％葡萄糖
-1％碳酸钙
-0.05％硫酸锰
-95.05％水
将培养基在95℃热处理30分钟，然后在4℃(不超过24小时)或37℃下 冷却，用于即时接种。
用一听部分解冻的所选菌株的冷冻浓缩物，按重量0.05％接种。该浓缩物 每克浓缩物含有1-2×1010cfu的菌株。
发酵在37℃搅拌条件下持续11小时，接着在4℃冷却。
发酵结束，获得了pH4.6且每ml发酵培养基含有109cfu副干酪乳酸杆菌 菌的起始培养物。
UHT半脱脂牛奶可在超市购买。用甜味剂(0.01％重量的三氯蔗糖 (sucralose))改善口味以赋予液体产品甜味。三氯蔗糖以无菌溶液的形式加入， 该溶液经过滤除菌而制备：将5g三氯蔗糖溶解在95g水中。该5％三氯蔗糖溶 液用真空驱动一次性过滤系统(膜直径0.22μm)过滤除菌。从该无菌溶液中取 出20g(20ml)加入至980g所购买的UHT牛奶中。由此获得的UHT牛奶因 此不含任何可被CNCM I-2116代谢的碳水化合物。
然后用菌株接种牛奶，初始浓度为每ml2-5×107cfu CNCM I-2116。
平行的，将同种菌株直接以上述冷冻浓缩物的形式加入至半脱脂牛奶的另 一样品中，初始浓度相同，每ml为2-5×107cfu CNCM I-2116。
分别使接种有起始物制品和冷冻浓缩物的牛奶混合均匀，之后装入无菌玻 璃瓶中。
然后，产品在25℃下储存2个月，在储存期间分析。
分析包括测定pH、Dornic酸度以及细胞计数(cfu)。
为进行CNCM I-2116的细胞计数，需使用用于乳酸杆菌的标准MRS培养 基(Man-Rogosa-Sharpe)。在每次细胞计数前，将储存的牛奶瓶混合均匀，取 1ml进行分析。用含1.5％蛋白胨、0.85％NaCl和0.01％消泡剂的稀释液进行适 当稀释。取1ml的稀释液与MRS琼脂在培养皿中混匀。
在37℃无氧接种48小时后检查平皿，计算每ml的菌落形成单位的数量。 结果
在UHT脱脂牛奶和半脱旨牛奶中，在25℃储存时，CNCM I-2116Cfu的 损失保持在0.3个log以下，在两个月货架期后终浓度达到107cfu/ml。同时， pH从6.50-6.40降至6.30的终水平。Dornic酸度轻微增加，在25℃储存期间从 18-21°D增加至低于25°D的终水平。
图1显示了在储存期间pH的变化(方框)和Dornic值(菱形)的变化。
Dornic酸度是非常灵敏的，理论上即使pH不变，该值在货架期期间仍会 变化。尽管该值在本发明中不如pH值重要，但是货架稳定产品的酸度值可用于 说明所述产品在25℃下和延长的货架期期间的稳定性。
图2显示了在25℃98天储存期间的logcfu/ml的减小。正如所见的，在前 面70天，细菌死亡一直保持非常低的水平，cfu损失低于0.2个log。
本实验惊奇地显示，细菌制品可以以货架稳定的形式，例如在25℃两个月 内没有细胞数量的实质损失以及pH的实质降低，保存在液体，例如牛奶中。该 发现使基于水或乳的液体成为一种针对不能代谢基于水或乳的液体中所含碳水 化合物的益生菌微生物的有价值、易处理的递送系统或载体。

1、一种基于水或乳的且包含活微生物的液体产品，其特征在于所述液体产 品在10℃有至少1个月的货架期，在该期间，产品的pH减小少于2个点和/或活菌 量减小少于2个log单位，并且所述液体产品不含有所含微生物能够代谢的碳水化 合物。
2、根据权利要求1的产品，其特征在于其包含乳蛋白、乳糖和/或其它乳或 来自乳的固体。
3、根据权利要求1或2的产品，其中微生物不能利用乳糖作为营养物。
4、根据权利要求1的产品，其中微生物选自乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧 杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、Lactococcus、肠球菌属 (Enterococcus)及其组合的菌株。
5、根据权利要求1的液体产品，其中产品的货架期在20℃有至少1个月， 在该期间，产品pH减小少于2个点且活菌损失少于2个log单位。
6、根据任一项前述权利要求的产品，其中微生物是益生菌。
7、根据任一项前述权利要求的液体产品，其在货架期伊始pH为4或以上。
8、一种用于制备基于水或乳的液体微生物递送系统的方法，其中所述递送 系统在10℃有至少一个月的货架期，该方法包括以下步骤：
发酵培养基以获得活微生物的生物质，
将生物质加入基于水的液体中，其中该液体不含可被该微生物代谢的碳水化 合物。
9、根据权利要求8的方法，其中发酵培养基的步骤在30℃以上进行至少7 小时。
10、为消费者提供存在于基于水或乳的液体中的活微生物的方法，该方法包 括给予消费者根据权利要求1-3任一项的产品的步骤。
11、存在于货架稳定的基于水或乳的液体产品中的微生物的用途。
12、提供活益生菌益处的液体产品，该产品能在温度10℃以上储存至少一个 月。
13、提供给个体活益生菌益处的方法，该方法包括提供给个体根据权利要求 1-7或12中任一项的产品的步骤。
14、以可食用形式配送活微生物的方法，该方法包括配送根据权利要求1-7 或12中任一项产品的步骤。