発明の詳細な説明 〔技術分野〕
本発明は、免疫調節作用を有するラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）を含む組成物に関するものである。 〔背景技術〕
乳酸菌は整腸作用や免疫賦活作用といった有益な生理活性を有することが知られている。 このような有益な生理活性を有する乳酸菌の多くは動物性の発酵乳製品や腸管から分離された乳酸菌であるが、植物性乳酸菌においても免疫賦活作用を有する株が見出されている。 例えば、特許文献１には免疫賦活作用を有する乳酸菌として、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）Ｌ−１３７株について記載されている。 また、京都の伝統的な漬物である「すぐき」から分離されたラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）Ｌａｂｒｅ株や、「しば漬け」から分離されたラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）ＤＡ７４Ｎ株なども免疫賦活作用を有することが知られている（非特許文献１、２参照）。 〔特許文献１〕
特開平１０−１６７９７２号公報（公開日：平成１０年６月２３日）
〔非特許文献１〕
岸惇子、小久保あおい、赤谷薫、扇谷えり子、藤田晢也、岸田綱太郎：有用乳酸菌選定のためのスクリーニング（１）ヒト末梢血における植物性乳酸菌のin vitro免疫賦活効果、Pasken Journal 15. 21-26, 2002
〔非特許文献２〕
赤谷薫、岸惇子、扇谷えり子、小久保あおい、藤田晢也、岸田綱太郎：第６回 腸内細菌学会（2002.05.30-31）要旨 京都の伝統的な漬物からは多くの菌が分離可能であり、上記Ｌａｂｒｅ株以外にも免疫賦活作用等の有用な生理活性を有する菌株が存在すると考えられる。 上記漬物から分離される菌株で、最も分離頻度が高い株はラクトバチルス・プランタラムおよびラクトバチルス・ペントーサスであるが、漬物から分離された菌の効能については、従来あまり研究されていない。 さらに、漬物から分離される乳酸菌は、元々食品に含まれている菌であるため、それを生体内に取り込んだとしても、安全性は高いものと考えられる。 それゆえ、漬物から有用性の高い乳酸菌が分離されれば、当該乳酸菌を含む有用な組成物を構成することができる。 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、京都の伝統的な漬物から分離された有用な生理活性を有する乳酸菌を含む安全性の高い飲食品や医薬品等を提供することにある。 〔発明の開示〕
本発明者らは、上記の課題を解決するために、漬物から分離された１６種類の乳酸菌について、その免疫調節作用を調査し、その中から選択したラクトバチルス・ペントーサスに属する乳酸菌について、より詳細に免疫調節作用を調査した結果、当該乳酸菌を飲料水に混ぜて動物に摂取させた場合や、当該乳酸菌の懸濁液を動物に投与した場合に、免疫賦活作用や抗アレルギー作用等の免疫調節作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 すなわち、本発明に係る組成物は、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）に属し、かつ、グリセロールの資化性が無いまたは弱い乳酸菌を含むことを特徴としている。 本乳酸菌は、免疫調節作用を有することが好ましく、また、細胞外多糖産生株であることが好ましい。 好適な乳酸菌としては、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株を挙げることができる。 本ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株は、本発明者らがしば漬けから分離し、高い免疫調節作用を有することを見出した株である。 本菌は、ＤＳ８４Ｃ株とも称される。 本菌は独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており（Lactobacillus pentosus SAM 2336）、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００２８、受領番号は ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１００２８である。 したがって、本発明に係る組成物は、上記ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株を含むものであることが好ましい。 本発明に係る組成物は、上記の乳酸菌を含む組成物であって、免疫調節作用を有する組成物である。 また、本発明に係る組成物は、上記の乳酸菌を含む組成物であって、抗アレルギー作用を有する組成物である。 さらに、本発明に係る組成物には、乳酸菌を生菌として含むものであってもよい。 これらの組成物は、免疫調節作用および／または抗アレルギー作用を有する飲食品や医薬品として有用である。 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。 また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。 〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。 なお、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明に係る組成物に含まれる乳酸菌は、ラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）に属し、かつ、グリセロールの資化性が無いまたは弱い乳酸菌であればよい。 このような乳酸菌を含む組成物は、当該乳酸菌が有する有用な生理活性を発揮できる組成物として高い価値がある。 なかでも、免疫調節作用を有するものであることが好ましい。 免疫調節作用を有するとは、定常状態や免疫機能が低下している場合にこれを活性化する作用（免疫賦活作用）、または免疫機能が過度に亢進しているときにこれを抑制して適切な免疫状態とする作用（免疫抑制作用）、細胞性免疫と液性免疫のバランスを最適化する作用の少なくともいずれか一方の作用を有することを意味する。 免疫調節作用としては、例えば、サイトカイン産生の促進または抑制作用、リンパ球活性化作用、ＮＫ（ナチュラル・キラー）活性増強作用、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス改善作用、免疫低下抑制作用、抗アレルギー作用等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。 本発明に係る組成物に含まれる乳酸菌は、さらに、細胞外多糖（Extracelluler Polysaccharide：以下「ＥＰＳ」と略記する。）産生株であることが好ましい。 ＥＰＳは、菌の属、種、株によって様々な性質や化学構造をしているが、本乳酸菌のＥＰＳは、菌体表面に留まる莢膜多糖であり、墨汁染色により容易に確認できる。 ＥＰＳ産生株は非産生株と比較すると親水性が高いため、食品に応用しやすいという利点を有する。 本発明に係る組成物に含まれる乳酸菌の代表的なものとして、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株を挙げることができる。 本菌は独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１００２８、受領番号は ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１００２８である。 以下に、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株（以下、「Ｓ−ＰＴ８４」と略記する。）について説明する。 本発明者らは、次のような基準を設定し、しば漬けから分離された乳酸菌１６種類（Lactobacillus plantarum ４種類、Lactobacillus pentosus １２種類）を選択した。 すなわち、植物性乳酸菌のうち、乳酸桿菌（Lactobacillus属）であること、同じ性状を持つ株が複数分離されていること、培地中で良好な増殖を示すこと、および漬物に特徴的な菌であること、の４つの基準に適合する１６種類の乳酸菌を選択した。 これら１６種類の乳酸菌について、インターロイキン１２（以下「ＩＬ−１２」と略記する。）誘導能を比較した結果、ラクトバチルス・ペントーサスＳ−ＰＴ８４株が、マウスに菌体を腹腔内投与した場合に血清ＩＬ−１２濃度を最も上昇させることを見出した。 その後、当該Ｓ−ＰＴ８４の免疫調節作用について詳細に検討したところ、以下に記載する知見を得た。 （１）マウスから調製した脾細胞に対してin vitro で処理した場合、Ｔｈ１型サイトカインのＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）の産生を誘導し、ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞を増加させる、すなわち、Ｓ−ＰＴ８４はヘルパーＴやキラーＴを活性化させる作用がある。 （２）マウスに腹腔内投与した場合、肝リンパ球のＮＫ活性を増強させる作用がある。 またＣＤ８＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞を増加させ、細胞性免疫を増強する。 （３）マウスに経口摂取させた場合、血清ＩＬ−１２濃度を上昇させ、脾細胞のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋の細胞数を増加させ、脾細胞のＮＫ活性を増強させ、脾細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位に変化させる。 （４）マウスに経口摂取させた場合、シクロフォスファミド投与による体重減少を抑制し、免疫反応の低下を抑制する。 （５）マウスに経口摂取させた場合、卵白アルブミン（ＯＶＡ）で感作しても、ＯＶＡ特異的ＩｇＥおよび総ＩｇＥの上昇を抑制する。 （６）マウスに経口摂取させた場合、ストレスによるＮＫ活性の低下を抑制する。 以上の知見により、Ｓ−ＰＴ８４は免疫調節作用を有する株であることが明らかとなった。 Ｓ−ＰＴ８４の菌学的性質を表１に示した。
通常ラクトバチルス・ペントーサスはグリセロールの資化性が高いことが知られているが、表１に示したように、Ｓ−ＰＴ８４はグリセロールの資化性が弱く、これまでに知られているラクトバチルス・ペントーサスとは異なることがわかった。 Ｓ−ＰＴ８４よりＤＮＡを抽出後、Microseq Full Gene 16S rDNAキット（Applied Biosystems社製）を用いて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子全領域約500bpについて解読を行なった。 解読されたＳ−ＰＴ８４の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１）は、ラクトバチルス・ペントーサスJCM T （D79211）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と100％相同性が得られたためラクトバチルス・ペントーサスと同定された。 Ｓ−ＰＴ８４は、ＥＰＳを産生しない菌と比較して親水性が高く、プラスチック面へもほとんど付着しない。 また、酵母の凝集作用もほとんど示さない性質を示す。 本発明に係る組成物は、ラクトバチルス・ペントーサスに属し、かつ、グリセロールの資化性が無いまたは弱い乳酸菌を含むものであればよいが、免疫調節作用を有するもの、または抗アレルギー作用を有するものであることが好ましい。 もちろん、免疫調節作用と抗アレルギー作用の両方を併せ持つものであれば、一層有用である。 本発明に係る組成物は、免疫調節作用および／または抗アレルギー作用を有する飲食品や医薬品として有効に利用することができる。 すなわち、免疫調節作用および／または抗アレルギー作用を有する薬学的組成物としての利用が好適である。 上記組成物に含有される乳酸菌としては、乳酸菌（生菌および死菌）、乳酸菌含有物、乳酸菌処理物等を挙げることができる。 生菌は当該乳酸菌培養液等の乳酸菌含有物から得ることができる。 死菌は、例えば、生菌に対して加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などを行うことにより得ることができる。 得られた生菌、死菌は、さらに磨砕や破砕等により、処理物とすることができる。 すなわち、本発明に係る組成物は、乳酸菌、乳酸菌含有物、乳酸菌処理物の少なくともいずれか１つを含有していればよい。 上記乳酸菌としては、例えば、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等を挙げることができる。 上記乳酸菌含有物としては、例えば、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物（菌体、培養上清、培地成分を含む）、乳酸菌培養液（菌培養物から固形分を除去したもの）、乳酸菌発酵乳（乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等）を挙げることができる。 また、乳酸菌処理物としては、例えば、磨砕物、破砕物、液状物（抽出液等）、濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等）、希釈物等を挙げることができる。 また、本発明に係る組成物に含まれるＳ−ＰＴ８４は元々発酵食品であるしば漬けから分離されたものであるので、例えば、果菜類や穀類をＳ−ＰＴ８４により発酵させた発酵物を含有するものも本発明に係る組成物の１形態として好適である。 なお、上述のように、Ｓ−ＰＴ８４は元々食品から分離されたものであるため、Ｓ−ＰＴ８４を含む組成物の安全性は高い。 本発明に係る組成物は、上述のように飲食品や医薬品等、すなわち免疫調節作用を有する薬学的組成物として用いることが好ましい。 飲食品に用いる場合には、免疫調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。 また、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。 例えば、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子等の形態で提供することが可能である。 医薬品とする場合には、免疫賦活剤や抗アレルギー剤を挙げることができる。 また、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。 剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。 本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 〔実施例〕
〔使用乳酸菌株〕
京都の伝統的な漬物であるしば漬けから、Lactobacillus plantarum を４種、Lactobacillus pentosus を１２種分離し、Ｔｈ１型免疫賦活能の高い菌株を選択するためインターロイキン１２（ＩＬ−１２）誘導能を比較する実験に供した。 使用菌株については、表２に株名、種名およびＥＰＳの有無を示した。 ＩＬ−１２誘導能を比較した結果、ＤＳ８４Ｃ株（Ｓ−ＰＴ８４）に特に強い活性を見出したため、以後の実験はＳ−ＰＴ８４のみを用いて行った。
〔in vitro 刺激によるＩＬ−１２誘導〕
BALB/c マウス（７週齢・雄）に4.05％チオグリコレートを腹腔内投与し、４日後にＰＢＳを用いて腹腔内マクロファージを回収し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を用いて2×10 6 cells/ mLに調整した後、24ｗｅｌｌプレートに0.5mLずつ播き込んだ。 各ｗｅｌｌに各菌株の加熱死菌（１0μｇ/mL）を添加し２４時間培養後の培養上清中のＩＬ−１２濃度を測定した。 ＩＬ−１２の活性型はｐ35とｐ40のサブユニットが結合したｐ70であることから、ＩＬ−１２（ｐ70）を測定した。 なおＩＬ−１２の測定にはOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Pharmingen社製）を使用した。 結果を図１に示した。 図１から明らかなように、種や親株が同じ菌株であってもＩＬ−１２の誘導能は様々であったが、ＤＷ６９Ｎ、Ｓ−ＰＴ８４（ＤＳ８４Ｃ）、ＤＳ２５Ｃがとくに高い活性を示した。 〔in vivo 刺激によるＩＬ−１２誘導〕
BALB/c マウス（７週齢・雄）に各菌株の加熱死菌（500μｇ/0.2mL/mouse）の懸濁液（溶媒：生理的食塩水）を腹腔内投与し、６時間後に頚椎脱臼後、心臓より採血した。 なお、ｃｏｎｔｒｏｌのマウスには生理的食塩水を等量投与した。 採血を投与後６時間としたのは、Ｓ−ＰＴ８４を用いた予備検討の結果、死菌投与後の血清IL-12濃度のピークが投与後６時間であったことによる（図２参照）。 採血後、遠心分離により血清を採取し、血清中のＩＬ−１２濃度をOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Pharmingen社製）を用いて測定した。 結果を図３に示した。 図３から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４（ＤＳ８４Ｃ）、ＤＳ５１ＣおよびＤＳ２５Ｃの３菌株を投与した場合の血清ＩＬ−１２濃度は、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して有意に高かった。 中でもＳ−ＰＴ８４（ＤＳ８４Ｃ）が最も高濃度であったため、以下の実験にはＳ−ＰＴ８４のみを用いた。 〔Ｓ−ＰＴ８４がリンパ球に及ぼす影響〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）から脾臓を摘出し、常法に従い脾細胞を調製した。 上記Ｓ−ＰＴ８４の加熱死菌（1μｇ/mL）を含む培地で２４時間培養した。 対照として、培地に何も添加せずに培養したもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）と、コンカナバリンＡ（2.5μｇ/mL）を添加して培養したもの（ＣｏｎＡ）とを設けた。 Ｓ−ＰＴ８４死菌の刺激により、どのようなサイトカインが産生されるかを調べるため、各培養上清中のサイトカイン濃度をCBAkit（BD Pharmingen社製）を用いて測定した。 また、脾細胞を回収し、蛍光ラベルされた抗CD4抗体（CY-CHCROME TMラベル、BD bioscience社製）、抗CD8抗体（FITCラベル、Immunotech社製）、抗CD69抗体（PEラベル、BD bioscience社製）を用いて細胞を標識し、CD4、CD8およびCD69陽性細胞の割合をフローサイトメトリー（Beckman Coulter社製）を用いて測定した。 サイトカイン産生の結果を図４に示した。 図４（ａ）は培地に何も添加していないもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示し、図４（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの（Ｓ−ＰＴ８４）の結果を示し、図４（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したもの（ＣｏｎＡ）の結果を示している。 図４から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４の刺激により、ｃｏｎｔｒｏｌでは産生が認められないＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）の産生が認められた。 これらのサイトカインはＴｈ１型サイトカインであり、Ｓ−ＰＴ８４はＴｈ１型サイトカインを特異的に誘導するものと考えられた。 一方、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４やＩＬ−５は全く産生されなかった。 なお、コンカナバリンＡで刺激した場合は、別のＴｈ１型サイトカインのＩＬ−２（インターロイキン２）の産生が認められた。 ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響の結果を図５に示した。 図５（ａ）は培地に何も添加していないもの（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示し、図５（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌（１μｇ／ｍｌ）を培地に添加したもの（Ｓ−ＰＴ８４）の結果を示し、図５（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したもの（ＣｏｎＡ）の結果を示している。 また、図５中、矢印は上または右に行くほど各表面抗原の陽性細胞が多いことを表す。 図５から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４によりヘルパーＴ細胞やキラーＴ細胞が活性化することが分かった。 〔Ｓ−ＰＴ８４腹腔内投与後の肝リンパ球の変化〕
C57BL/6マウス（7週齢・雄）に、Ｓ−ＰＴ８４の加熱死菌（500μｇ/0.2mL/mouse）の懸濁液（溶媒：生理的食塩水）を腹腔内投与し、24時間後に肝臓を摘出し、遠心法により肝リンパ球を調製した。 対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）は生理的食塩水のみを腹腔内投与した。 調製した肝リンパ球のＮＫ活性をＰＩＮＫ法を用いて測定した。 ＰＩＮＫ法とは、標的細胞であるYac-1を疎水性膜系蛍光色素3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio)で標識し、さらに、死細胞の核を膜不透過性核酸結合蛍光色素propidium iodide (PI)により二重染色し、傷害されなかったYac-1はDio単染色、傷害されたYac-1は二重染色でフローサイトメトリーで検出することにより、マウスリンパ球の細胞障害活性を算出する方法である。 また、蛍光ラベルされた抗CD4抗体（CY-CHCROME TMラベル、BD bioscience社製）、抗CD8抗体（FITCラベル、Immunotech社製）、抗CD69抗体（PEラベル、BD bioscience社製）を用いて細胞を標識し、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリー（Beckman Coulter社製）を用いて測定した。 ＮＫ活性測定の結果を図６に示した。 図６中、NK activity（％）はマウス肝リンパ球のYac-1に対する細胞傷害性を表し、E:T ratioは、反応させた肝リンパ球数：Yac-1数を表す。 図６から明らかなように、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、Ｓ−ＰＴ８４を投与したマウスから調製した肝リンパ球のＮＫ活性は明らかに上昇していた。 ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞の結果を図７に示した。 図７（ａ）は対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示し、図７（ｂ）はＳ−ＰＴ８４を投与した場合の結果を示す。 また、図７中、矢印は上または右に行くほど各表面抗原の陽性細胞が多いことを表す。 図７から明らかなように、ＣＤ８＋の細胞は明らかに増加しており、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋の細胞も増えていることからＳ−ＰＴ８４を投与することによって、肝臓においてキラーＴ細胞が増加し、さらに活性化したキラーＴ細胞も多くなることが明らかとなった。 〔Ｓ−ＰＴ８４の経口摂取によるＴｈ１／Ｔｈ２バランス調節作用〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）６匹に、Ｓ−ＰＴ８４（死菌体）を１週間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させた。 また、Ｓ−ＰＴ８４を摂取させない対照群（６匹）を設けた。 １週間後に心臓より採血し、さらに脾臓を摘出した。 血液から遠心分離により血清を採取し、血清中のＩＬ−１２濃度をOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Biosciences社製）を用いて測定した。 また、摘出した脾臓から常法に従い脾細胞を調製し、脾リンパ球のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋細胞数の計測（それぞれの標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより計測した）、ＰＩＮＫ法によるＮＫ活性の測定、およびＴｈ１／Ｔｈ２の比を測定した（マウス脾細胞５×１０ 6個にコンカナバリンＡ２．５μｇ／ｍＬを２４時間作用させ、上清中に産生されるＩＬ−４およびＩＦＮ−γ濃度を測定した。Ｔｈ１／Ｔｈ２比はＩＦＮ−γ濃度をＩＬ−４濃度で除した値を用いた。）。 血清ＩＬ−１２濃度の測定結果を図８に示した。 図８から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの血清ＩＬ−１２濃度は対照群（Ｃｏｎｔ）と比較して有意に上昇していた。 ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ３＋細胞数の計測結果を表３に示した。 表３から明らかなように、脾リンパ球Ｔサブセットは増加する傾向が認められた。
ＮＫ活性測定の結果を図９に示した。 図９中、NK activity（％）はマウス脾細胞のYac-1に対する細胞傷害性を表し、E:T ratioは反応させた脾細胞数：Yac-1数を表す。 図９から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスから調製した脾細胞のＮＫ活性は対照群（Ｃｏｎｔ）と比較して有意に上昇していた。 Ｔｈ１／Ｔｈ２比の測定結果を図１０に示した。 図１０から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスから調製した脾細胞では対照群（Ｃｏｎｔ）と比較してＴｈ１サイトカイン産生の比率が顕著に増加していた。 以上のように、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおいて、Ｔｈ１型サイトカインが誘導され、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ１優位となり、ＮＫ活性が増加した。 したがって、Ｓ−ＰＴ８４は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス調節作用および免疫賦活作用を有することが明らかとなった。 〔シクロフォスファミド投与マウスにおける体重変化に及ぼす影響〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）２０匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように２群に分け、Ｓ−ＰＴ８４摂取群とＳ−ＰＴ８４非摂取群（対照群）とした。 Ｓ−ＰＴ８４摂取群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を２２日間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させた。 摂取開始８日目に、全個体に制癌化学療法剤でアルキル化剤のシクロフォスファミド（Cyclophosphamide：ＣＹ）を200mg/kgの用量で腹腔内投与した。 ＣＹ投与後１、２、３、５、８、１２および１５日目に各個体の体重を測定した。 両群の平均体重の変化を図１１に示した。 図１１から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４摂取群は対照群（Control）と比較して、ＣＹ投与に起因する体重減少を抑制した。 〔シクロフォスファミド投与マウスにおけるＩＬ−１２産生に及ぼす影響〕
BALB/c マウス（７週齢・雄）を５群に分けた。 群構成は、無処置群（５匹）、Ｓ−ＰＴ８４非摂取・ＣＹ非投与群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４非摂取・ＣＹ投与群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４摂取・ＣＹ非投与群（１０匹）およびＳ−ＰＴ８４摂取・ＣＹ投与群（１１匹）とした。 Ｓ−ＰＴ８４摂取の２群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を１２日間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させた。 摂取開始７日目に、ＣＹ投与群のマウスに制癌化学療法剤でアルキル化剤のシクロフォスファミド（Cyclophosphamide：ＣＹ）を200mg/kgの用量で腹腔内投与した。 ＣＹ投与後５日目に、無処置群を除く４群のマウスにＳ−ＰＴ８４の加熱死菌（500μｇ/0.2mL/mouse）の懸濁液（溶媒：生理的食塩水）を腹腔内投与した。 Ｓ−ＰＴ８４の死菌投与後６時間目に無処置群を含む全個体の心臓から採血した。 採血後、遠心分離により血清を採取し、血清中のＩＬ−１２濃度をOptEIA mouse IL-12測定キット（BD Pharmingen社製）を用いて測定した。 結果を図１２に示した。 図１２から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４非摂取群ではＣＹ投与により顕著に血清ＩＬ−１２濃度の減少が認められたが、Ｓ−ＰＴ８４摂取群はＣＹ投与による血清ＩＬ−１２濃度の減少を有意に抑制し、対照群とほぼ同様の血清ＩＬ−１２濃度であった。 以上の結果から、Ｓ−ＰＴ８４は、ＣＹによる体重減少および免疫低下を抑制する、すなわち免疫賦活作用を有することが明らかとなった。 〔抗アレルギー作用の検討〕
BALB/cマウス（７週齢・雄）３６匹を４群に分けた。 群構成は、無処置群（５匹）、対照群（１０匹）、Ｓ−ＰＴ８４群（１１匹）、Ｄｅｘ摂取群（１０匹）とし、Ｓ−ＰＴ８４群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を７週間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させ、Ｄｅｘ摂取群には、0.5mg/kgの用量で７週間強制経口投与を行った。 無処置群および対照群には水道水を７週間自由に摂取させた。 なお、Ｄｅｘは抗炎症、抗アレルギー作用を有するステロイド剤であり、陽性対照薬として用いた。 Ｓ−ＰＴ８４摂取またはＤｅｘ投与開始から１週間後および２週間後に、20μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）と2ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混和して、無処置群を除く３群のマウスに腹腔内投与した。 ２回目の投与日（０週目）から１週間ごとに５週目まで全個体について合計６回の採血を行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度を測定した。 ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の測定はOptEIA mouse IgE測定キット（BD Pharmingen社製）を改良し、補足用抗体の代わりにＯＶＡをコーティングしたELISA法にて測定した。 また、３週目の血液サンプルを用いて、総ＩｇＥを測定した。 総ＩｇＥの測定には、OptEIA mouse IgE測定キット（BD Pharmingen社製）を用いELISA法にて測定した。 ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の変化を図１３に示し、総ＩｇＥ濃度の測定結果を図１４に示した。 図１３から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４群では対照群（Control）と比較してＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の上昇を有意に抑制した。 Ｄｅｘ群は抑制傾向を示したものの有意差は認められなかった。 また、図１４から明らかなように、Ｓ−ＰＴ８４群およびＤｅｘ群では対照群（Control）と比較して総ＩｇＥ濃度の上昇を有意に抑制した。 以上の結果から、Ｓ−ＰＴ８４は抗アレルギー作用を有することが明らかとなった。 〔ストレスによる免疫低下の抑制効果の検討〕
C57BL/6マウス（６週齢・雄）９匹を各群の平均体重がほぼ同じになるように３群に分けた。 群構成は、対照群（３匹）、ストレス負荷群（３匹）およびＳ−ＰＴ８４摂取＋ストレス負荷群（３匹）とした。 Ｓ−ＰＴ８４摂取群にはＳ−ＰＴ８４（死菌体）を７日間飲水（２mg/day 相当）にて自由に摂取させた。 摂取開始８日目に、ストレス負荷群及びＳ−ＰＴ８４摂取＋ストレス負荷群６匹を１度水浸させた後、先端に空気穴を施した５０ｍＬのポリエチレンチューブに入れ、２４時間拘束した。 対照群は２４時間、絶水、絶食とした。 その後動物から脾臓を摘出、脾リンパ球を調製し、ＮＫ活性を測定した。 ＮＫ活性の測定についての結果を図１５に示した。 対照群に比較してストレス負荷群ではＮＫ活性が有意に低下した。 しかしＳ−ＰＴ８４摂取＋ストレス負荷群では対照群と同様のＮＫ活性に維持され、ストレス負荷群に比較し有意に高値であった。 このことからＳ−ＰＴ８４はストレスによる免疫低下を抑制することが明らかとなった。 〔死菌と生菌との間における免疫賦活作用の差異〕
図３において示した、腹腔内投与によってマウス血清ＩＬ−１２濃度を増加させた乳酸菌について、死菌と生菌との間で免疫賦活作用を比較した。 ４種の乳酸菌（ＤＢ２２Ｃ、ＤＳ５１Ｃ、ＤＳ２Ｃ、ＤＳ８４Ｃ（Ｓ−ＰＴ８４））の過熱死菌または生菌（いずれも５００μｇ（２．５×１０ 8個）／０．２ｍｌ／マウス）の懸濁液を調製し、これらをＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢・雄）に腹腔内投与し、その６時間後にマウスを頚椎脱臼させ、心臓より採血した。 なお、乳酸菌の代わりに生理食塩水を等量投与したマウスをＣｏｎｔｒｏｌとした。 採血後、遠心分離により血清を回収し、血清中のＩＬ−１２濃度をＯｐｔＥＩＡ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて測定した。 結果を図１６に示す。 図３と同様に、ＤＳ８４Ｃ（Ｓ−ＰＴ８４）を投与した群においてＩＬ−１２産生量が最も高かった。 また、図１６から明らかなように、ＤＳ８４Ｃ（Ｓ−ＰＴ８４）の生菌を投与した群は、死菌を投与した群よりもＩＬ−１２産生量が高かった。 〔製造例１：錠剤〕
以下に示す方法により、Ｓ−ＰＴ８４を含有する医薬品（錠剤）を製造した。 Ｓ−ＰＴ８４の乾燥粉砕物６６．７ｇを、乳糖２３２．０ｇおよびステアリン酸マグネシウム１．３ｇとともに混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。 〔製造例２：ヨーグルト〕
乳固形分２１％のＳ−ＰＴ８４発酵乳を、市販の牛乳に添加し３日間静置しヨーグルトを調製した。 得られたヨーグルトは良好な香味を示した。 〔製造例３：乳酸菌飲料〕
Ｓ−ＰＴ８４を用いて表４に示した組成で乳酸菌飲料を調整した。 得られた乳酸菌飲料は良好な香味を示した。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と添付の特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 〔産業上の利用の可能性〕
本発明に係る組成物は、飲食品として摂取したり、医薬品として投与すれば、免疫機能を賦活化することにより免疫機能低下を抑制でき、また、免疫機能のバランスを調節することにより生体に悪影響を及ぼす免疫機能の過度の亢進を抑制できるという効果を奏する。 本発明に係る組成物は、免疫調節作用を有する健康食品や医薬品として実施可能である。 したがって、本発明は食品産業や医薬品産業に利用することができる。
図１は、１６種類の乳酸菌のin vitro 刺激によるマクロファージＩＬ−１２誘導実験の結果を示すグラフである。 図２は、Ｓ−ＰＴ８４を腹腔内投与した後の血清ＩＬ−１２濃度の推移を示すグラフである。 図３は、１６種類の乳酸菌を腹腔内投与した後のマウス血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。 図４（ａ）〜（ｃ）は、Ｓ−ＰＴ８４の刺激によりリンパ球が産生するサイトカインを調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートであり、（ａ）は培地に何も添加していないもの、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの、（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したものの結果を示すチャートである。 図５（ａ）〜（ｃ）は、Ｓ−ＰＴ８４の刺激によりＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響を調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートである。 （ａ）は培地に何も添加していないもの、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４の死菌を培地に添加したもの、（ｃ）はコンカナバリンＡを培地に添加したものの結果を示すチャートである。 図６は、Ｓ−ＰＴ８４腹腔内投与後の肝リンパ球のＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。 図７（ａ）・（ｂ）は、Ｓ−ＰＴ８４の腹腔内投与により肝リンパ球のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ６９＋細胞に及ぼす影響を調べた結果を示す、フローサイトメーターのチャートである。 （ａ）は対照の結果を示すチャートであり、（ｂ）はＳ−ＰＴ８４を投与した場合の結果を示すチャートである。 図８は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。 図９は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの脾細胞におけるＮＫ活性を測定した結果を示すグラフである。 図１０は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスの脾細胞におけるＴｈ１／Ｔｈ２の比を測定した結果を示すグラフである。 図１１は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるシクロフォスファミド投与後の体重変化を示すグラフである。 図１２は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるシクロフォスファミド投与後の血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。 図１３は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるＯＶＡ投与後のＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度の変化を示すグラフである。 図１４は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるＯＶＡ投与３週後の総ＩｇＥ濃度を測定した結果を示すグラフである。 図１５は、Ｓ−ＰＴ８４を経口摂取したマウスにおけるストレス負荷時の免疫低下抑制効果を示すグラフである。 図１６は、４種の乳酸菌（ＤＢ２２Ｃ、ＤＳ５１Ｃ、ＤＳ２Ｃ、ＤＳ８４Ｃ（Ｓ−ＰＴ８４））の過熱死菌または生菌を腹腔内投与した後のマウス血清ＩＬ−１２濃度を測定した結果を示すグラフである。 |
