New lactic acid bacterial strain, fermented food and drink and method for producing fermented food and drink

本発明は、新規乳酸菌株、該乳酸菌株を用いて得られる発酵飲食品、および該乳酸菌株を用いる発酵飲食品の製造方法に関する。

乳酸菌は、各種の発酵飲食品の製造に用いられているが、菌自体が整腸効果や病原菌抑制等の優れた生理活性を有するものがあり、このような有用な乳酸菌を発酵飲食品の製造に用いるだけでなく、発酵飲食品中に生きた状態で残すことで、健康増進を志向した優れた飲食品とすることができる。
一方、近年は食生活の欧米化に伴って、野菜の摂取不足が大きな問題点として採り上げられることが多く、そのような中、野菜等の植物性原料を加工した飲食品の開発が精力的に行われている。
その中で、乳酸菌を用いて植物性原料を発酵させて得られた発酵飲食品が注目されている。 このような発酵飲食品は、特有の優れた風味が付与されたものとなり、野菜の摂取不足を補えるだけでなく、有用な乳酸菌を生きた状態で摂取できるからである。
従来、乳酸菌を用いて植物性原料を発酵させる発酵飲食品の製造方法として、植物性原料に乳製品を添加して乳酸発酵させる方法（例えば、特許文献１、２参照）や、植物性原料に糖類（特に乳糖）を添加して乳酸発酵させる方法（例えば、特許文献３、４参照）、植物性原料のみで発酵可能な乳酸菌株を用いる方法（例えば、特許文献５、６、７参照）が開示されている。

特開昭６０−２４８１３１号公報

特開平１−１７９６４６号公報

特開平１−２４７０３５号公報

特開平７−２３６４１７号公報

特開平５−８４０６５号公報

特開平５−８４０６６号公報

特開２００７−３７５０３号公報

しかしながら、従来の方法は、発酵時の条件が制限されるという問題点があり、乳糖含有量が極めて低い大豆は、乳糖の併用なしには十分に発酵させることが困難であるため、大豆を主原料として使用した場合には、発酵飲食品を任意の風味に調整することが困難であった。 また、十分に発酵させなければカード形成も困難であるため、例えば、香味を任意に調整したハードタイプの発酵物を得ることも困難であり、得られる発酵物の種類に制限があるという問題点があった。
また、植物性原料のみで発酵可能な乳酸菌株を用いた発酵飲食品は、香味の改善が必ずしも十分ではなく、さらに冷蔵保存時の品質安定性が十分に高いとは言えないという問題点があった。
一方、ラクトバチルス ペントーサス（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ）に属する乳酸菌株の中には、例えば、ラクトバチルス ペントーサス（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ）ＪＣＭ１５５８ ^Ｔ株などのように、乳糖の併用なしに大豆を比較的良好に発酵させることができるものがある。 しかし、カード形成能、冷蔵保存時の品質安定性を共に満足するものはなく、さらに、漬物臭がするなど香味に課題があるという問題点があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、香味に優れ、冷蔵保存時における品質変化が少なく、発酵時におけるカード形成能が高い新規乳酸菌株、該乳酸菌株を用いて得られる発酵飲食品、および該乳酸菌株を用いる発酵飲食品の製造方法を提供することを課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、ラクトバチルス ペントーサス（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ）ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８株である。
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有する発酵飲食品の製造方法である。
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られる発酵飲食品である。

本発明の乳酸菌株を用いることで、香味に優れ、冷蔵保存時における品質変化が少ない発酵飲食品が得られる。 また、大豆を原料としても発酵時におけるカード形成能が高いので、ハードタイプの発酵飲食品が得られる。

以下、本発明について、詳しく説明する。
＜ラクトバチルス ペントーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８株の取得＞
京都市左京区大原地区で採取したしば漬けを、滅菌済みメスを使用して５ｍｍ角以下になるまで細かく刻み、無菌的に生理食塩水で１０倍希釈を段階的に８回繰り返して、８段階それぞれの希釈系列を調製した。
各希釈系列から希釈液１ｍＬをシャーレに滴下し、０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地を用い、混釈法による寒天平板を無菌的に作製し、３０ ℃で４８時間嫌気培養を行った。
培養後、寒天の中程で形成されるコロニーの立体形態を観察し、白色、両凸レンズ型、直径が１ｍｍ程度のコロニーを釣菌して保存用高層培地（０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地）に無菌的に穿刺接種し、３０ ℃で２４時間嫌気培養した。
保存用高層培地に生育した菌体を、白金線で釣菌して生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
懸濁した生理食塩水を用いて０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地を用い、混釈法による寒天平板を無菌的に作製し、３０℃で４８時間嫌気培養を行った。
培養後、寒天の中程で形成されるコロニーの立体形態を観察し、両凸レンズ型、直径が１ｍｍ程度のコロニーを釣菌して保存用高層培地（０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地）に無菌的に穿刺接種し、３０℃で２４時間嫌気培養した。
保存用高層培地に生育した菌体を、無菌的に白金線を用いて釣菌して画線培養用培地（ＢＬ寒天培地）に画線し、３０℃で４８時間嫌気培養した。
培養後、コロニーの表面形態を確認して、円形、周縁がスムース、隆起が半円状であり、色調が中心から周縁に向かって赤茶色か白色となるコロニーを選別して、ラクトバチルス ペントーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８（以下、本菌株と略記することがある）を取得した。 この時の本菌株の撮影画像を図１に示す。 撮影条件は以下の通りである。 コロニー画像：デジタルカメラ ＣＯＯＬＰＩＸ ４５００（株式会社ニコン製）／レンズから３ｃｍの距離で接写撮影。 染色画像：顕微鏡 ＢＸ５１（オリンパス株式会社製）、デジタルカメラ ＤＰ７０（オリンパス株式会社製）／１００倍の対物油浸レンズを用いて撮影。

＜ラクトバチルス ペントーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８株の同定＞
（形態的性質）
本菌株の形態的性質は、前記各培地で培養した時のコロニーを顕微鏡観察することにより確認した。 その結果、細胞形態は桿菌であり、ラクトバチルス ペントーサス（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ）ＪＣＭ１５５８ ^Ｔ株（以下、「基準株」と略記することがある）同様、胞子を有さず、運動性も有していなかった。

（生理学的性質）
本菌株の生理学的性質を公知の方法により評価し、基準株と比較した。 結果を表１に示す。
表１に示すように、本菌株は、基準株と同じ生理学的性質を示した。

（炭水化物の分解性）
本菌株の各種炭水化物の分解性を、細菌検査同定用キットＡｐｉ ５０ ＣＨ（ｂｉｏ Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して評価し、基準株と比較した。 その結果を表２および３に示す。
表２および３から明らかなように、本菌株と基準株とは、Ｄ−キシロース、Ｄ−ラフィノースの資化性に相違が認められた（表中、「＊」で示した）。

（塩基配列）
本菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列（部分配列）を公知の方法で決定した。 決定した塩基配列のうち、５'末端（１番目）から４９５番目までの塩基配列を配列番号１に示す。 この決定した塩基配列について、大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センターが運営している日本ＤＮＡデータバンクの相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行った。
その結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、２２番目の塩基が不明であるが、それ以外は基準株と同じであり、基準株とは９９％以上の相同性を示した。

以上より、本菌株は、基準株と比較すると、１６Ｓ ｒＤＮＡの前記塩基配列が９９％以上の相同性を有し、前記形態的性質および生理学的性質は同じであるが、炭水化物の分解性が異なっていた。 そして後記するように、培養時におけるカード形成能が基準株よりも顕著に優れており、これは従来のラクトバチルス ペントーサスに属する乳酸菌株とは明らかに相違していた。
以上の結果より、本菌株は、ラクトバチルス ペントーサスに属する新規の乳酸菌株であることが示された。

＜乳酸菌株＞
本発明の乳酸菌株であるラクトバチルス ペントーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８株は、平成１９年３月９日付けで受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１２４８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

本発明の乳酸菌株は、大豆発酵時に優れたカード形成能を有する。 従来の方法では、大豆を用いて発酵を行うことでカードを形成させるためには、培地中に乳糖を添加する必要があった。 これは、大豆中の乳糖含有量が極めて低く、速やかに発酵を行うことが困難なためであった。
しかし、本発明の乳酸菌株を用いれば、乳糖を添加することなく大豆を速やかに発酵させることができ、カードを形成させることができるので、例えば、ハードタイプのヨーグルト等の製造に好適である。

本発明の乳酸菌株は、特に植物性原料の発酵に好適である。 使用可能な植物性原料としては、例えば、野菜、果実、穀類および豆類が挙げられる。
野菜としては、例えば、トマト、赤ピーマン、ニンジン、キャベツ、はくさい、レタス、大根、ほうれん草、ケール、玉葱、なす、プチヴェール（登録商標）（ケールと芽キャベツの交雑種）、しいたけ、シメジ等が挙げられる。
果実としては、例えば、グレープフルーツ、オレンジ、リンゴ、ブドウ、イチゴ、パイナップル、キウイ、グアバ、マンゴー、アセロラ、ブルーベリー、ザクロ、モモ、洋なし、パパイヤ、メロン、スイカ、バナナ、イチジク等が挙げられる。
穀類としては、例えば、麦（麦芽）、米等が、豆類としては、例えば、大豆、エンドウ等が挙げられる。
本発明においては、これら植物性原料を単独で用いても良く、二種以上を併用しても良い。 目的に応じて、適宜最適な組み合わせを選択できる。

本発明の乳酸菌株は、前培養してから発酵に用いることが好ましい。 前培養は公知の方法で行えば良く、例えば、市販の乳酸菌用培地を、必要に応じて所定の濃度となるように蒸留水に溶解させ、オートクレーブ滅菌した後、本発明の乳酸菌株を植菌して、所定時間培養する方法が挙げられる。 また、市販の乳酸菌用培地に代わり、上記植物性原料、好ましくは濃縮果汁を用いることもできる。 前培養時に乳酸菌株は、固体培地に植菌しても良いが、上記のように液体培地に植菌することが好ましい。

本発明の乳酸菌株を用いた場合の発酵条件は、用いる原料および目的に応じて適宜選択すれば良いが、本発明の乳酸菌株の植菌量は０．１〜１０容量％であることが好ましく、発酵温度は２０〜４０℃であることが好ましく、発酵時間は３〜７２時間であることが好ましい。

＜発酵飲食品、発酵飲食品の製造方法＞
本発明の発酵飲食品は、上記本発明の乳酸菌株を用いて発酵を行って得られるものである。
そして、本発明の発酵飲食品の製造方法は、上記本発明の乳酸菌株を用いて発酵を行う工程を有するものである。
本発明の乳酸菌株を用いて原料を発酵させる場合は、発酵物をそのまま発酵飲食品としても良いし、適宜後処理や加工を行って発酵飲食品としても良い。 発酵条件は先に述べた条件と同様である。

発酵時の原料は、乳酸菌発酵に使用可能なものであれば特に限定されないが、前記植物性原料が好適である。 そして所望の品質に応じて、適宜組み合わせて用いても良い。
また、発酵時の原料は、目的に応じて適宜加工した状態のものを用いることができる。 例えば、植物性原料は、搾汁液、磨砕物または破砕物、あるいはこれらを濃縮物、希釈物または乾燥物等に加工した形態で用いることができる。 具体的には、大豆であれば、豆乳や微細物の懸濁液の形態で用いることもできる。 本発明においては、発酵原料として液状のものが特に好適である。

本発明の発酵飲食品には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品用として一般的に用いられているその他の原料、ｐＨ調整剤、香料、糖液等の副資材を添加しても良い。
例えば、本発明の乳酸菌株を用いて大豆を発酵させる場合に乳糖の添加は必ずしも必要ではないが、発酵飲食品の香味調整の目的で添加しても良い。 乳糖は、例えば、脱脂粉乳を添加することで添加できる。

本発明の発酵飲食品は、従来のラクトバチルス ペントーサスに属する乳酸菌株を用いて得られた発酵飲食品と比較すると、漬物臭が少なく香味に優れており、官能上好ましいものである。 そして、冷蔵保存中もｐＨ、酸度などの物性の変化が少なく、発酵直後の優れた香味が維持されるので、保存性の優れたものである。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。 ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。

＜大豆培地の発酵特性＞
［実施例］
Ｂｒｉｘ． ４２％のニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈し、ｐＨ６．４、Ｂｒｉｘ． １２％に調整したニンジン培地に、本菌株の凍結保存菌液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。
次いで、市販の大豆粉を２５％（ｗ／ｖ）、グルコースを２％（ｗ／ｖ）、フラクトースを４％（ｗ／ｖ）それぞれ含む培地５０ｍＬに、前記前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で９時間培養した。
そして、得られた培養物を５℃または１０℃で２１日間冷蔵保存した。
この間、培地の発酵特性を以下のようにして評価した。 すなわち、培養開始時、培養終了時および冷蔵保存時における培養物中の生菌数、並びに培養物のｐＨおよび酸度を下記の方法により測定した。 また、培養物のカードについて、下記の方法により目視で観察した。 さらに、培養物の香味について、男性１０名、女性１０名、合計２０名の評価員により官能評価を行った。

［比較例］
本菌株の代わりに基準株を用いたこと以外は、上記実施例と同様に培養および評価を行った。

（測定方法）
（１）培養物中の生菌数 段階希釈した培養物１ｍＬを分注したシャーレに、ＭＲＳ寒天培地（ＯＸＯＩＤ社製）約２０ｍＬを加えて混釈プレートを作成し、３０℃で２日間培養した後、形成したコロニーをカウントして算出した。
（２）培養物のｐＨ
ｐＨメーターＦ−５２（株式会社堀場製作所製）を用いて測定した。
（３）培養物の酸度 滴定法により算出した。 すなわち、試料を約５ｇ量り採り、フェノールフタレイン溶液を約５００μＬ加えて、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、微赤色が呈する点を終点とした。 そのときの滴定量から下記式を用いて酸度を算出した。
算出式；酸度（％）＝（水酸化ナトリウム水溶液の規定数）×（水酸化ナトリウム水溶液の滴定量（Ｌ））×（乳酸１ｇ当量）÷（試料採取量）×１００
（４）培養物のカード 菌株接種前および培養終了後に容器を倒立させ、６０秒以上カードが崩れないものを「○」、６０秒経過前にカードが崩れるものを「△」、カードを形成しないものを「×」とした。

（評価結果）
評価結果を図と共に以下に示す。 図２は培養物中の生菌数、図３は培養物のｐＨ、図４は培養物の酸度を示すグラフであり、いずれも（ａ）は培養開始時および終了時の測定結果を、（ｂ）は冷蔵保存時の評価結果をそれぞれ示す。

（Ａ）培養開始時および終了時 生菌数からみた増殖速度について、本菌株と基準株との間に大きな違いは無かった。
また、培養開始時および終了時におけるｐHの変化、酸度の変化についても、本菌株と基準株との間に大きな違いは無かった。
一方、カード形成能については、本菌株の方が基準株よりも優れている事が示され、これは生成した酸の影響以外の要因によるものと考えられた。 結果を表４に示す。

また、培養終了時における培養物の香味を官能評価したところ（官能評価１）、基準株の培養物は、漬物臭があったが、本菌株の培養物は漬物臭がなく、官能上好ましいものであった。 結果を表５に示す。

（Ｂ）冷蔵保存時 基準株の培養物は、１０℃で保存した場合には生菌数があまり減少しなかったが、５℃で保存した場合には生菌数は明らかに減少した。 一方、本菌株の培養物は、５℃だけでなく１０℃で保存した場合にも生菌数は明らかに減少した。
そして、保存温度が５℃の場合と１０℃の場合とで、保存中のｐHおよび酸度の変化は、本菌株の培養物の方が基準株の培養物よりも少なかった。

さらに、本菌株の培養物および基準株の培養物について、培養終了直後の培養物を冷凍保存した後に解凍した試料の香味と、１０℃で２１日間保存した後の試料の香味とを官能評価したところ（官能評価２）、本菌株の培養物では、解凍した試料に対して冷蔵保存後の試料に香味の変化は殆ど認められず、培養終了時および保存後のどちらも官能上好ましいものであった。 これに対して、基準株の培養物では、保存による香味の変化が大きく、官能上より一層好ましくないものであった。 結果を表６に示す。
以上の結果より、本菌株の方が基準株よりも温度感受性が高く、培養物を低温で保存した際の品質変化が少ない事が示された。

このように本発明の乳酸菌株は、大豆を原料として用いてもカード形成能に優れ、該乳酸菌株を用いることで冷蔵時における品質保存性の良い、香味の優れた発酵飲食品が得られることが確認された。

本発明は、発酵飲食品の製造に利用可能である。

本菌株の撮影画像である。

実施例および比較例における培養物中の生菌数を示すグラフである。

実施例および比較例における培養物のｐＨを示すグラフである。

実施例および比較例における培養物の酸度を示すグラフである。