含有乳杆菌属菌的组合物 |
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| 申请号 | CN201480021905.5 | 申请日 | 2014-04-16 | 公开(公告)号 | CN105121627B | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 三得利控股株式会社; | 发明人 | 福岛荣治; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种含有戊糖乳杆菌TUA4337L株(保藏号NITE BP‑1479)的组合物，其特征在于，到达肠管内后，具有在小肠和/或大肠内、优选在小肠内的增殖能 力 。本发明的组合物，由于含有具有在肠管内的增殖能力的乳酸菌，所以当摄入体内时，该乳酸菌到达肠管内并增殖，由此可抑制脂肪吸收及抑制体重增加，从而以减肥效果为目的被适用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种组合物，其特征在于，含有具有在肠管内的增殖能力的保藏号为NITE BP-1479的戊糖乳杆菌TUA4337L株。 |
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| 说明书全文 | 含有乳杆菌属菌的组合物技术领域[0001] 本发明涉及含有乳杆菌属菌的组合物。更详细而言，涉及含有新型戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的组合物。 背景技术[0002] 乳酸菌和双岐杆菌中存在具有调整肠胃效果及免疫赋活效果等优异生理活性的物质，根据菌种的特性被用于各种用途。尤其，近年来关于通过将这些菌种摄入体内来发挥其减肥效果的研究日益进步，可列举诸多报告。 [0003] 例如，专利文献1报道如下：鼠李糖乳杆菌ATCC53103株分解成为肥胖原因的脂质(三酰基甘油)，进而抑制其在体内的吸收。并且，作为植物性乳酸菌之一的L.brevis KB290活菌到达肠道内后，肠内存活率及肠管到达性优异(但排泄菌数比摄取菌数少)已为人所知(参照非专利文献1)。另外，下述非专利文献2关于Lactobacillus acidophilus L-92报道如下：根据摄取菌数的93％从粪便回收，可得出该菌株的肠管到达性优异；下述非专利文献6 6 3研究了L.gasseri SBT2055的肠管存活性，并报道当给药100g含1×10～5×10 cfu/g的发酵乳时，最多可从粪便中检测出1×105cfu/g左右的L.gasseri SBT2055。 [0004] 另一方面，关于双岐杆菌报道如下：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)GCL2505株，具备经口摄取后活菌到达肠道的肠管到达性，同时显示显著的肠管内增殖性(参照专利文献2)。下述非专利文献4报道如下：针对成人进行B.animalis ssp.lactis DN-173 010给药时，从粪便中检测出摄取菌数20％左右的DN-173 010。 [0005] 现有技术文献 [0006] 专利文献 [0007] 专利文献1日本国特开2011-206057号公报 [0008] 专利文献2日本国特开2011-172506号公报 [0009] 非专利文献 [0010] 非专利文献1《乳酸菌的保健功能与应用》(日文原名《乳酸菌の保健機能と応用》)2007年8月31日CMC出版160-162页 [0011] 非专利文献2日本乳酸菌学会杂志(日文原名：日本乳酸菌学会誌)2001年12号“在人肠管内持留性优异的Lactobacillus acidophilus L-92株的分离及其性质”(日文原名：ヒト腸管内で生残性の良いLactobacillus acidophilus L-92株の単離とその性質)28-35页 [0012] 非专利文献3Microbiol.Immunol.2006年50号“Monitoring and survival of Lactobacillus gasseri SBT2055 in the human intestinal tract.”867-870页[0013] 非专利文献4J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2008年14号“Survival of Bifidobacterium animalis DN-173 010in the faecal microbiota after administration in lyophilized form or in fermented product-a randomized study in healthy adults.”128-136页 发明内容[0014] 但是，由于脂肪的吸收主要是在小肠内进行，所以通常在大肠内增殖的双岐杆菌即使显示了肠管内增殖性，其对脂肪吸收的抑制也不充分。另外，虽然已知乳酸菌在大肠的更上端发挥作用，但在肠管内显示增殖性的菌种尚未见报道。 [0015] 本发明的课题在于提供含有显示肠管内增殖性的乳酸菌的组合物。 [0016] 本发明涉及含有具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株(保藏号NITE BP-1479)的组合物。 [0018] 图1是表示人工肠液中的筛选结果的图。 [0020] 图3是表示血清中的甘油三酯量的图。图中的“*”标记表示相对于高脂肪食物组具有显著性差异(p<0.05)。 具体实施方式[0021] 本发明的组合物具有如下重大特征：即含有具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株的乳酸菌(以下也称为本发明的乳酸菌)。 [0022] 本发明的乳酸菌为戊糖乳杆菌TUA4337L株，其特征在于，具有在肠管内的增殖能力。此外，在本说明书中“具有在肠管内的增殖能力”或“在肠管内增殖”，是指到达肠管内后，在小肠和/或大肠内、优选在小肠内进行增殖，增殖能力的程度在如下情况下可评价为“有增殖能力”：即在人工肠液中于37℃下培养6hr时，相对于接种时的OD660显示10倍以上的数值。 [0023] 本发明者针对本发明者所保有的约480种乳酸菌，进行了在人工肠液中的增殖能力研究，将从中选择的属于戊糖乳杆菌的菌悬液针对动物进行给药时，发现戊糖乳杆菌TUA4337L株的排出菌数与给药菌数相比显著增多，至此完成了本发明。 [0024] 戊糖乳杆菌TUA4337L株，以识别表示NRIC 0883、保藏号NITE BP-1479，于国际保藏日2012年12月10日保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(日本国千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8)。以下将戊糖乳杆菌TUA4337L株简记为TUA4337L株。 [0025] TUA4337L株的菌学性质示于表1及表2。表2的糖的可同化性是用细菌鉴定试剂盒API 50CH(BIOMETRIEUX)进行测定的结果。此外，表2中的“+”是指可同化的糖，“-”是指不可同化的糖。 [0026] [表1] [0028] [表2] [0029] [0030] TUA4337L株将在后述实施例中进行详述，其具有排出菌数相对于摄取菌数增多的特征，即具有肠管内增殖性。另外，作为肠管内增殖性，例如在人工肠液中于37℃下培养6小时后，以培养开始时的菌数为基准时，显示优选10倍以上、更优选15倍以上、进一步优选20倍以上、更进一步优选25倍以上的菌数。 [0031] 另外，由提取自TUA4337L株的DNA编码的recA基因序列(序列号1)与Lactobacillus pentosus IG1株的recA基因序列有99％的同一性。此外，在本说明书中，同一性例如通过使用检索程序BLAST，以得分表示相似度，检索程序BLAST使用的是Altschul等(The Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990))开发的算法。 [0032] 作为用于培养TUA4337L株的培养基，没有特别限制，可列举通常的含有碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等的培养基。另外，也可用琼脂培养基、液体培养基培养。培养温度优选为10～45℃、更优选为15～42℃、进一步优选为28～38℃、进一步优选为35～37℃，可增殖的pH优选为pH3.0～12.5、更优选为pH3.5～12.0。 [0033] 本发明的组合物，以各种形式含有如前所述的具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株。 [0034] 作为在本发明的组合物中含有的戊糖乳杆菌TUA4337L株的形式，可列举乳酸菌(活菌及死菌)本身、乳酸菌含有物、乳酸菌处理物等。活菌可从该乳酸菌培养液等的乳酸菌含有物中获得。死菌例如可通过对活菌进行加热、紫外线照射、福尔马林处理、酸处理等获得。得到的活菌、死菌可通过进一步磨碎、破碎等而成为处理物。另外，从充分发挥在肠管内的增殖效果的观点出发，虽然上述各形式中的乳酸菌优选活菌，但也可混合有死菌。 [0035] 作为前述乳酸菌，例如，可列举活菌体、湿菌、干菌等。作为前述乳酸菌含有物，例如，可列举乳酸菌悬浮液、乳酸菌培养物(包括菌体、培养上清、培养基成分)、乳酸菌培养液(从菌体培养物中除去固体成分的物质)。另外，作为前述乳酸菌处理物，例如，可列举磨碎物、破碎物、液状物(提取液等)、浓缩物、浆化物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、离心干燥物等)、稀释物等。 [0036] 本发明中的戊糖乳杆菌TUA4337L株只要具有在肠管内的增殖能力，则可以单独形式使用，或者也可将2种以上的形式组合使用。本发明的组合物中总含量没有特别限定，但通常为0.00001～99.9％(g/g)，其中尤其优选0.0001％～50％(g/g)左右。或者作为菌体数优选在1.0×102～1.0×1012个/g的范围内，更优选在1.0×106～1.0×1012个/g的范围内。若是活菌则上述“个/g”可表示为“CFU/g”。此外，本发明的乳酸菌也可与具有除肠管内增殖以外作用的菌株组合使用。 [0037] 本发明的组合物只要含有具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株，则可在不破坏本发明效果的范围内含有食品领域、制剂领域等中通常使用的载体、基质和/或添加剂等。具体而言，可列举公知的甜味料、酸味料、维生素等各种成分，或赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、增溶剂、悬浮剂、涂层剂、稳定剂等。 [0038] 另外，本发明的组合物为了附加其他有用作用，根据需要可含有1种或2种以上组合的美容成分、生活习惯病预防·改善成分等的公知成分。 [0039] 作为本发明的组合物的形式，只要是可将具有肠管内增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株摄入体内的形式，则没有特别限定，从菌株的效果发挥的观点出发，例示了配合了该菌株的饮料或食品；从能够轻易摄取的观点出发，例示了作为补充剂的可摄取的片剂形式等。具体而言，例如，可列举片剂、胶囊剂、饮料剂、调味料、加工食品、甜食类、糕点类等的各种形式。在这些形式中，优选作为发酵食品来提供。发酵食品是用植物性乳酸菌进行发酵的食品的总称，饮料也包含于其中。作为发酵食品的种类没有特别限定，例如，可列举发酵乳、乳酸菌饮料、发酵豆乳、腌制物、腌白菜、果酒、酱、酱油等将水果或蔬菜发酵的物质，使果汁、蔬菜果汁等发酵的发酵果汁酸奶等的发酵食品等。 [0040] 此外，配合了本发明的乳酸菌的饮料或食品，即含有具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌TUA4337L株的饮料或食品，食用时与食用不具有在肠管内的增殖能力的乳酸菌时相比，发挥了较高的脂肪吸收抑制作用，并且持续了该作用，因此，作为具有持续的脂肪吸收抑制作用的保健功能食品、健康食品，认为可提供赋予了在以下应用中被使用的物质的主旨表述：例如，体重增加的抑制用或体重下降用、或者肥胖防止用或肥胖改善用、以及减肥用。在此，保健功能食品是指厚生劳动省规定的保健功能食品，包括营养功能食品以及特定保健用食品，作为保健功能食品和健康食品，可以是食品及饮料中的任一个。 [0041] 本发明的组合物根据其形式，可以按照食品领域或制剂领域等中的公知方法进行制备。 [0042] 本发明的组合物可根据其形式、摄取目的以及该组合物的摄取对象的年龄、体重、症状等进行适当设定，而并不是固定的，例如，作为乳酸菌的量，优选以平均1天1.0×106个以上/kg体重的量，分1～数次口服摄取。此外，作为菌体的1天摄取量，以1个成人体重平均约50kg计，干重优选为0.00001～1g、更优选为0.0001～0.2g、进一步优选为0.0003～0.002g。例如，本发明的组合物因为本发明的乳酸菌具有抑制脂肪吸收这样的特性且具有在肠管内的增殖能力，因此，也可与高脂肪食物一起或者在食用高脂肪食物前摄取前述范围内的量的乳酸菌，并且因为可产生持续的脂肪吸收抑制作用，所以也可1日1次于早餐时摄取。此外，在本说明书中，“摄取”是指“摄取”和/或“给药”。 [0043] 作为本说明书的摄取对象，虽然优选需要脂肪吸收抑制作用的人，但也可以是宠物动物等。 [0044] 这样，通过摄取本发明的组合物，可抑制来自肠管的脂肪吸收。因此，本发明还提供一种脂肪吸收抑制剂，其由用于抑制来自食物的脂肪的自肠管的吸收且具有在肠管内的增殖能力的戊糖乳杆菌组成。 [0045] 另外，本发明提供一种以将含有前述戊糖乳杆菌TUA4337L株的组合物对需要脂肪吸收抑制的个体施用其有效量为特征的抑制脂肪吸收的方法。 [0046] 需要脂肪吸收抑制的个体，只要是通过抑制脂肪吸收可观察到治疗效果的疾病个体，则没有特别限定。例如，可例示有肥胖或由肥胖引起的糖尿病、高脂血症、高血圧、动脉硬化等疾病的个体。另外，以前述疾病的预防或改善为目的，例如，也可将在意体重、在意血糖值、在意血压的个体等包括在前述个体中。 [0047] 有效量是指将TUA4337L株针对上述个体进行给药时，与未给药的个体相比抑制脂肪吸收的量。作为具体的有效量，根据给药形式、给药方法、使用目的以及个体的年龄、体重、症状等进行适当设定，而并不是固定的。此外，在本说明书中，给药包括给药、摄取、服用、饮用的所有方式来使用。 [0048] 实施例 [0049] 以下示出实施例以具体说明本发明，但本发明并不受下述实施例的限制。 [0050] 实施例1<将人工肠液中的增殖能力作为指标的筛选> [0051] 本发明者针对保有的乳酸菌中主要为植物性乳酸菌的约480株(包括JCM株)，进行在人工肠液中的增殖能力评价。 [0052] 具体而言，首先，将各乳酸菌的甘油保存菌分别以1v/v％接种于MRS培养基(Difco Laboratories)(10mL)中，在35℃下培养16～17hr。接着，用分光光度计UV-1600(岛津制作所)测定各培养液的OD660(660nm处的吸光度)，将100μL用MRS培养基以各培养液的OD660为10制备的培养液接种于下述所示组成的人工肠液(10mL)中。其后，在37℃下缓慢震荡培养6hr，然后测定OD660，并求出增殖倍率(6hr后的OD660/接种时的OD660)。代表性的筛选结果示于表3及图1。 [0053] <人工肠液(pH6.45)> [0054] MRS培养基 9mL [0055] 10w/v％胆汁(和光纯药工业株式会社)溶液 1mL [0056] 1w/v％胰酶(from Porcine：SIGMA) 100μL [0057] 此外，胆汁溶液及胰酶溶液，使用经过0.22μm的滤纸(PVDF membrane、Millipore公司制)处理的无菌胆汁溶液及胰酶溶液。 [0058] [表3] [0059] [0060] 由结果可知，戊糖乳杆菌及植物乳杆菌有增殖倍率增高的趋势，其中戊糖乳杆菌TUA4337L株增殖倍率尤其高，在肠管内的增殖性优异。 [0061] 实施例2<体内肠管增殖能力评价> [0062] 将如下制备的TUA4337L株，针对自由摄取高脂肪食物的小鼠进行给药，并定量排泄菌数。具体而言，使用如下制备的给药样品，在上午10点左右将约10亿cells(1.0×109cells)份(相当于菌悬液250μL)的乳酸菌针对C57BL/6J小鼠(10周龄，雄性)给药1次(n＝5)。 [0063] <给药样品(含活菌的样品)的制备> [0064] 〔1〕TUA4337L株的甘油保存菌以1v/v％接种于MRS培养基(30mL) [0065] 〔2〕培养(35℃、20hr) [0066] 〔3〕将培养液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用30mL PBS(-)悬浮[0067] 〔4〕将〔3〕的悬浮液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mL PBS(-)再悬浮[0068] 〔5〕用显微镜计数菌数 [0069] 〔6〕在15mL离心管中分取200亿cells份的溶液，离心(8000rpm、5min)并除去上清后，悬浮于5mL液状饲料(高脂肪食物60kcal％FAT：Research Diet)中，从而制备菌悬液(液状饲料用PBS(-)制备) [0070] 其后，将2天的全糞便分4次进行回收(试验开始日的下午、次日上午和下午、次次日的上午)，用以下方法定量各份全糞便的菌数，计算各小鼠中的TUA4337L株的肠内增加率(各份全糞便的菌数/给药菌数)。结果示于表4。 [0071] <通过实时PCR的菌数测定法> [0072] 〔1〕相对于100mg(湿重)糞便添加1mL PBS(-)后，用刮刀破碎 [0073] 〔2〕用Eppendorf管(注册商标)采取100mg份糞便后，离心(15000rpm、5min)并除去上清，再用1mL PBS(-)悬浮(重复从离心到悬浮的操作2次) [0074] 〔3〕从〔2〕的悬浮液中除去上清后，用试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit：QIAGEN)提取DNA(通过重复以下操作3次进行细胞破碎：添加300mg Glass beads(150～212μm：SIGMA)、300μL phenol/chloroform/isoamylalcohol(25：24：1)以及900μL buffer ASL(试剂盒中的试剂)，用MULTI-BEADS SHOCKER MB-200(YASUI KIKAI)进行3000rpm、1min离心后，在冰上静置1min) [0075] 〔4〕由下述所示条件的实时PCR定量肠管内容物中的乳酸菌 [0076] (实时PCR条件) [0077] (1)将10μL SYBR Premix Ex Taq ll(Takara Bio)、0.8μL each primer(10μM)、0.4μL ROX reference DyeII、6μL灭菌水、2μL DNA溶液混合，从而制备PCR反应液。引物采用特异性检测戊糖乳杆菌及植物乳杆菌的16S rDNA的以下引物(戊糖乳杆菌和植物乳杆菌的16S rDNA序列为100％同一)。 [0078] primer1：5’-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3’(序列号2) [0079] primer2：5’-CGGACCATGCGGTCCAA-3’(序列号3) [0080] (2)PCR使用7500Real Time PCR System(Applied Biosystems)，95℃、30秒后，以95℃、5秒，60℃、34秒作为1个循环，进行共计60个循环反应，从获得的荧光强度、肠管内容物的总量和稀释倍率中，求得每1g肠管内容物的拷贝数。 [0081] (3)另外求得每1个cell的16S rDNA的拷贝数，并换算成菌数。此外，确认了未进行乳酸菌给药的小鼠中，通过前述实时PCR均未检测到戊糖乳杆菌及植物乳杆菌。 [0082] [表4] [0083] [0084] 实施例3<体重增加抑制效果> [0085] 将C57BL/6J小鼠(8周龄，雄性)分为以下4组：通常食物组、高脂肪食物组、高脂肪食物+活菌组、高脂肪食物+死菌组(各n＝10)，持续32天分别喂食以下表5所示食物，每天测定体重并计算平均值。平均值的推移如图2所示。此外，组间比较采用显著水平0.05的t检验来进行。 [0086] 具体而言，由表5中的各组自由摄取各自的固体食物。高脂肪食物+活菌组为与实施例2同样进行制备的给药样品、高脂肪食物+死菌组为如下进行制备的给药样品，分别进行乳酸菌每天约10亿cells份的量的给药。另一方面，通常食物组中为250μL不加乳酸菌的PBS(-)、高脂肪食物组中为250μL不加乳酸菌的液状饲料，进行给药。 [0087] [表5] [0088] [0089] *10kcal％FAT(Research Diet) [0090] 60kcal％FAT(Research Diet) [0091] <给药样品(含有死菌的样品)的制备> [0092] 〔1〕TUA4337L株的甘油保存菌以1v/v％接种于MRS培养基(30mL) [0093] 〔2〕培养(35℃、20hr) [0094] 〔3〕将培养液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用30mL PBS(-)悬浮[0095] 〔4〕将〔3〕的悬浮液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mL PBS(-)再悬浮[0096] 〔5〕用显微镜计数菌数 [0097] 〔6〕用15mL的离心管分取200亿cells份的溶液，离心(8000rpm、5min)并除去上清后，添加5mL人工胃液(125mM NaCl、7mM KCl、pH1.0)搅拌后静置60min [0098] 〔7〕将〔6〕的溶液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mL液状饲料(60kcal％FAT)悬浮，从而制备菌悬液 [0099] 结果，相对于对照(高脂肪食物组)，显示了TUA4337L活菌给药组的显著的体重增加抑制效果。并且活菌给药比死菌给药更有效。认为戊糖乳杆菌TUA4337L株通过在肠管内增殖，有效地对宿主产生了影响。 [0100] 实施例4<脂肪吸收抑制效果> [0101] 以实施例3中的通常食物组、高脂肪食物组、高脂肪食物+活菌组的组结构(各n＝12)，持续2周分别喂食与实施例3相同内容的食物。其后，禁食过夜后，进行橄榄油(nacalai tesque)给药(5mL/kg)，并且在3小时后解剖，从大静脉采集血清。用甘油三酯E-test Wako(和光纯药工业株式会社)测定血清中的甘油三酯(TG)。结果示于图3。此外，组间比较由显著水平0.05通过t检验进行显著差异判定。 [0102] 结果，相对于通常食物组，高脂肪食物组的血中TG的显著增加趋势得到了确认。因此，会认为如果持续食用高脂肪食物则会成为易于吸收脂肪的体质。此外，相对于对照(高脂肪食物组)，TUA4337L活菌给药组的血中TG的增加抑制得到了确认。因此，可以推测脂肪吸收抑制是体重增加抑制效果的机理之一，并且由TUA4337L活菌给药开始1天后就已经有效，可推测为持续发挥效果。 [0103] 以下例示含有本发明的戊糖乳杆菌TUA4337L株的组合物的具体处方。 [0104] [制造例1：片剂] [0105] 根据以下所示的方法，制造含有TUA4337L株的医药品(片剂)。 [0107] [制造例2：酸奶] [0108] 制备将牛奶、脱脂奶粉、水进行混合的混合物，加热灭菌后，冷却至40℃左右，接种作为起始的TUA4337L株后，置于发酵室内使之静置发酵。在此，静置发酵的温度可适当选择。此外，为了控制发酵开始时的溶解氧浓度，也可由氮等非活性气体进行置換处理。这样将制得的TUA4337L发酵乳添加于市售的牛奶中，静置3天进而制备酸奶。 [0109] [制造例3：乳酸菌饮料] [0110] 用TUA4337L株混合表6所示的原料，从而制备乳酸菌饮料。 [0111] [表6] [0113] [制造例4：果汁发酵饮料、蔬菜汁发酵饮料] [0114] 在桃汁中接种2重量％的TUA4337L，在30℃下培养38小时，从而制备桃发酵果汁。此外，同样地制备将胡萝卜汁发酵的胡萝卜发酵汁。 [0115] 产业上的可利用性 [0116] 本发明的组合物含有具有在肠管内的增殖能力的乳酸菌，由此，当摄入体内时，该乳酸菌通过到达肠管内后的增殖，可抑制脂肪吸收并抑制体重增加，从而可以减肥效果为目的而被适用。 [0118] 序列表的序列号1为戊糖乳杆菌TUA4337L的recA的碱基序列。 [0119] 序列表的序列号2为戊糖乳杆菌/植物乳杆菌特异性引物的碱基序列。 [0120] 序列表的序列号3为戊糖乳杆菌/植物乳杆菌特异性引物的碱基序列。 |
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