[0001] 本发明涉及新型乳酸菌菌株和利用该乳酸菌菌株制备的发酵饮食品(food or drink，食品或饮品)，以及利用该乳酸菌菌株制备发酵饮食品的方法。

[0002] 本申请要求2007年5月31日申请的特愿2007-145678的优先权，并将该申请的内容并入本文。

[0003] 乳酸菌现已用于各种发酵饮食品的制造中，且由于该菌自身具有调整肠道的效果或抑制病原菌等优异的生理活性，因此这样有用的乳酸菌不仅用于发酵饮食品的制造，其自身可以以活的状态残留于发酵饮食品中，并作为以促进健康为目的的优异的饮食品。

[0004] 一方面，伴随着近年来饮食生活的欧美化，蔬菜摄取不足这一严重的问题成为人们关注的重点，在这种现状下，在由蔬菜等植物性原料加工后得到的饮食品的开发方面投入了较大的精力。

[0005] 其中，利用乳酸菌对植物性原料进行发酵后制成的发酵饮食品备受人们关注。该发酵饮食品具有特有的良好风味，不但可以补充蔬菜摄取的不足，还可以摄取活的状态下的有用的乳酸菌。

[0006] 目前，作为利用乳酸菌发酵植物性原料的发酵饮食品的制造方法，已经公开了下述方法：向植物性原料中添加乳制品使其进行乳酸发酵的方法(例如，参照专利文献1、2)、向植物性原料中添加糖类(特别是乳糖)使其进行乳酸发酵的方法(例如，参照专利文献3、4)、以及使用能够仅以植物性原料进行发酵的乳酸菌菌株的方法(例如，参照专利文献
5、6、7)。

[0007] 专利文献1：日本特开昭60-248131号公报

[0008] 专利文献2：日本特开平1-179646号公报

[0009] 专利文献3：日本特开平1-247035号公报

[0010] 专利文献4：日本特开平7-236417号公报

[0011] 专利文献5：日本特开平5-84065号公报

[0012] 专利文献6：日本特开平5-84066号公报

[0013] 专利文献7：日本特开2007-37503号公报

[0014] 发明所要解决的问题

[0015] 但是，以往的方法具有发酵时的条件受到限制这样的缺点，对于乳糖含量极低的大豆而言，如果不同时使用乳糖则难以充分地对大豆进行发酵，因此，以大豆作为主要原料使用时，难以调节使发酵饮食品具有任意的风味。另外，由于发酵不充分也难以形成凝乳(カ一ド)，因此，具有例如，难以得到可以任意调整香味的硬型(ハ一ドタイプ)发酵产物，及可以得到的发酵产物的种类受到限制这样的问题。

[0016] 此外，对于利用能够仅以植物性原料进行发酵的乳酸菌菌株得到的发酵饮食品而言，具有其香味的改善未必充分，以及在冷藏保存时没有足够高的品质稳定性这样的问题。

[0017] 另一方面，属于戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的乳酸菌菌株中，例如，T如戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)JCM1558 这样的菌株，该菌株能够在不同时使用乳糖时较好地对大豆进行发酵。但是，该方法具有下述缺点：不能同时满足凝乳形成能力(カ一ド形成能)、冷藏保存时的品质稳定性，且还会产生腌渍物的臭味使得在香味上出现问题。

[0018] 鉴于上述的事实，本发明的课题是提供一种新型乳酸菌菌株和使用该乳酸菌菌株制备发酵饮食品，以及使用该乳酸菌菌株制造发酵饮食品的方法，其具有下述特点：香味优异、在冷藏保存时品质变化少且在发酵时凝乳形成能力高。

[0019] 解决问题的方法

[0020] 本发明的第一方面为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)FERMBP-10958。

[0021] 本发明的第二方面为制造发酵饮食品的方法，该方法包括利用上述第一实施方式中的乳酸菌菌株进行发酵的步骤。

[0022] 本发明的第三方面为发酵饮食品，该饮食品是利用上述第一实施方式中的乳酸菌菌株进行发酵而得到的饮食品。

[0023] 本发明的第四方面为一种组合物，该组合物含有培养上述第一实施方式中的乳酸菌菌株而得到的培养物。

[0024] 发明的效果

[0025] 通过使用本发明的乳酸菌菌株，可以得到香味优异、且冷藏保存时品质变化少的发酵饮食品。另外，以大豆作为原料进行发酵时，由于凝乳形成能力较高，因此可以得到硬型的发酵饮食品。附图说明

[0026] 图1是本菌株的照片。(a)表示的是菌落的照片，(b)表示的是染色的照片。

[0027] 图2是表示实施例以及比较例的培养物中的活菌数的图表。(a)表示的是培养开始时及培养结束时的测定结果，(b)表示的是在冷藏保存时的测定结果。

[0028] 图3是表示实施例以及比较例的培养物的pH的图。(a)表示的是培养开始时及培养结束时的测定结果，(b)表示的是在冷藏保存时的测定结果。

[0029] 图4是表示实施例以及比较例的培养物的乳酸换算酸度的图。(a)表示的是培养开始时及培养结束时的测定结果，(b)表示的是在冷藏保存时的测定结果。

[0030] 以下，对本发明进行详细地说明。

[0031] <戊糖乳杆菌FERM BP-10958的获取>

[0032] 对于取自京都市左京区大原地区的糟腌酱菜(しぼ漬け)，用灭过菌的手术刀将其精细地切割到5mm见方以下，并以用无菌的生理盐水稀释10倍为一个梯度，逐级稀释8个梯度，分别配制得到8个梯度的稀释系列。

[0033] 从上述各稀释系列中取1mL稀释液滴加到平皿上，利用加入了0.5％(w/v)沉淀性碳酸钙的MRS琼脂培养基，通过混合稀释法(混积法)在无菌条件下制成琼脂平板，随后在30℃下厌氧培养48小时。

[0034] 培养后，观察在琼脂中间形成的菌落的立体形态，挑取白色、双凸透镜型、直径为1mm左右的菌落，无菌地在保存用深层培养基(高 培地)(加入了0.5％(w/v)沉淀性碳酸钙的MRS琼脂培养基)中进行穿刺接种，随后在30℃下厌氧培养24小时。

[0035] 用铂金丝挑出在保存用深层培养基中长出的菌体，并悬混于1mL生理盐水中。

[0036] 使用悬混后的生理盐水和加入了0.5％(w/v)沉淀性碳酸钙的MRS琼脂培养基，通过混合稀释法在无菌条件下制成琼脂平板，随后在30℃下厌氧培养48小时。

[0037] 培养后，观察在琼脂中间形成的菌落的立体形态，挑取双凸透镜型、直径为1mm左右的菌落，无菌地在保存用深层培养基(加入了0.5％(w/v)沉淀性碳酸钙的MRS琼脂培养基)中进行穿刺接种，随后在30℃下厌氧培养24小时。

[0038] 用铂金丝挑出在保存用深层培养基中长出的菌体，并在无菌的条件下，利用铂金丝在划线培养用培养基(BL琼脂培养基)上划线，随后在30℃下厌氧培养48小时。

[0039] 培养后，确认菌落的表面形态，选择那些为圆形、边缘平滑、隆起为半圆状，且从中心到边缘颜色由红褐色变为白色的菌落，从而得到了戊糖乳杆菌FERM BP-10958(下面，也简称为本菌株)。此时本菌株的照片如图1所示。照相条件如下所述。菌落照片：数码相机COOLPIX 4500(尼康公司制造)/在距离镜头3cm的位置处近拍照相。染色照片：显微镜BX51(奥林巴斯公司制造)、数码相机DP70(奥林巴斯公司制造)/用100倍对物油镜照相。

[0040] <戊糖乳杆菌FERM BP-10958的鉴定>

[0041] (形态性质)

[0042] 利用显微镜观察在上述各培养基上培养得到的菌落从而确认本菌株的形态性质。结果显示，本细菌的细胞形态为杆菌、与戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)TJCM1558(下面，也简称为“标准株”)相同，没有孢子，且不具有运动性。

[0043] (生理学性质)

[0044] 通过公知的方法对本菌株的生理学性质进行评价，并与标准株进行比较。结果如表1所示。

[0045] 通过表1可以看出，本菌株与标准株具有相同的生理学性质。

[0046] 表1

[0047]

[0048] “+”表示阳性，“-”表示阴性。

[0049] (碳水化合物的分解性)

[0050] 使用细菌检测鉴定用试剂盒Api 50CH(bio Merieux公司制造)对本菌株对于各种碳水化合物的分解性进行评价，并与标准株进行比较。该结果如表2及表3所示。

[0051] 通过表2及表3可以确认，本菌株和标准株相比，在D-木糖、D-棉子糖的同化性方面有区别(表中，由“*”表示)。

[0052] 表2

[0053]No. 基质 标准株 本菌株
0 对照 - -
1 甘油 + +
2 赤藓醇 - -
3 D-阿拉伯糖 - -
4 L-阿拉伯糖 + +
5 核糖 + +
6 D-木糖* + -
7 L-木糖 - -
8 核糖醇 - -
9 β-甲基-D-木糖 - -
10 半乳糖 + +
11 D-葡萄糖 + +
12 D-果糖 + +
13 D-甘露糖 + +
14 L-山梨糖 - -
15 鼠李糖 - -
16 半乳糖醇 - -
17 肌醇 - -
18 甘露醇 + +
19 山梨醇 + +
20 α-甲基-D-甘露糖苷 - -
21 α-甲基-D-葡糖苷 - -
22 N-乙酰葡糖胺 + +
23 苦杏仁苷 + +
24 熊果苷 + +

[0054] “+”表示阳性，“-”表示阴性。

[0055] 表3

[0056]No. 基质 标准株 本菌株
25 七叶苷 + +
26 水杨苷 + +
27 纤维二糖 + +
28 麦芽糖 + +
29 乳糖 + +
30 蜜二糖 + +
31 蔗糖 + +
32 海藻糖 + +
33 菊糖 - -
34 松三糖 - -
35 D-棉子糖* - +
36 淀粉 - -
37 糖原 - -
38 木糖醇 - -
39 龙胆双糖 + +
40 D-松二糖 - -
41 D-来苏糖 - -
42 D-塔格糖 - -
43 D-墨角藻糖(フコ一ス) - -
44 L-墨角藻糖 - -
45 D-阿拉伯糖醇 - -
46 L-阿拉伯糖醇 - -
47 葡糖酸 - -
48 2-酮葡糖酸 - -
49 5-酮葡糖酸 - -

[0057] “+”表示阳性，“-”表示阴性。

[0058] (碱基序列)

[0059] 通过公知的方法测定了本菌株的16S rDNA的碱基序列(部分序列)。测序的碱基序列中，将从5’末端(第1个碱基)到第495个碱基为止的碱基序列用SEQ ID NO：1表示。对于测序后的碱基序列，通过由大学共同利用机关法人、情报·系统研究机构、国立遗传学研究所、生命情报·DDBJ研究中心运营的日本DNA数据库进行同源性检索(BLAST)。

[0060] 结果显示，在本菌株的SEQ ID NO：1表示的碱基序列中，除第22个碱基不清楚外，其余的碱基与标准株相同，与标准株之间具有99％以上的同源性。

[0061] 上述内容说明，本菌株与标准株相比，在16S rDNA的上述碱基序列方面具有99％以上的同源性，在上述形态性质以及生理学性质方面相同，但在对碳水化合物的分解性上表现出不同。因此，如下面将要说明的一样，在培养过程中在凝乳形成能力方面，本菌株显著地优于标准株，与以往的属于戊糖乳杆菌的乳酸菌菌株明显不同。

[0062] 根据上述结果可知，本菌株是属于戊糖乳杆菌的新乳酸菌菌株。

[0063] <乳酸菌菌株>

[0064] 本发明的乳酸菌菌株戊糖乳杆菌FERM BP-10958菌株已经于平成19年3月9日提交到独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本，茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))进行保藏，保藏号为FERM P-21248，并且以保藏号FERM BP-10958转为国际保藏。

[0065] 本发明的乳酸菌菌株，在大豆发酵时具有优异的凝乳形成能力。对于以往的方法而言，使用大豆进行发酵时，为了能够形成凝乳，必须在培养基中加入乳糖。这是因为大豆中的乳糖含量极低，难以快速地进行发酵。

[0066] 但是，如果使用本发明的乳酸菌菌株，不用添加乳糖即可以使大豆快速的发酵，并且能够形成凝乳，因此其适合用于制造例如硬型酸奶等产品。

[0067] 本发明的乳酸菌菌株特别适合用于植物性原料的发酵。可以使用的植物原料可以举出例如，蔬菜、水果、谷类以及豆类。

[0068] 作为蔬菜，可以举出例如，西红柿、红色青椒、胡萝卜、圆白菜、白菜、生菜、萝卜、菠菜、羽衣甘蓝、洋葱、茄子、Puchi Veil(注册商标)(羽衣甘蓝和芽甘蓝的杂交品种)、香菇、丛生口蘑等。

[0069] 作为水果，可以举出例如，柚子、橘子、苹果、葡萄、草莓、菠萝、猕猴桃、番石榴、芒果、黄褥花果、蓝莓、石榴、桃、洋梨、番木瓜、甜瓜、西瓜、香蕉、无花果等。

[0070] 作为谷类，可以举出例如，小麦(麦芽)、米等，作为豆类，可以举出例如，大豆、豌豆等。

[0071] 本发明中，可以单独使用这些植物性原料，也可以两种以上共同使用。根据不同的目的，可以选择合适的最佳组合。

[0072] 对于本发明的乳酸菌菌株，优选在用于发酵之前对其先进行预培养。预培养可以采用公知的方法进行，可以举出例如：采用商业购买的乳酸菌用培养基，根据需要，使用蒸馏水将其溶解到特定浓度，并通过高压灭菌锅灭菌，之后接种本发明的乳酸菌菌株，培养一定的时间。另外，可以使用上述植物性原料，优选用浓缩果汁代替商业购买的乳酸菌用培养基。在预培养时，可以将乳酸菌菌株接种于固体培养基上，也可以接种于如上所述的液体培养基中。

[0073] 使用本发明的乳酸菌菌株时，根据使用的原料以及目的可以适宜地选择发酵条件，但优选本发明的乳酸菌菌株的接种量为0.1～10容量％，发酵温度优选为20～40℃，发酵时间优选为3～72小时。

[0074] <发酵饮食品、发酵饮食品的制造方法>

[0075] 本发明的发酵饮食品是通过使用上述本发明的乳酸菌菌株进行发酵而得到的产品。

[0076] 从而，在本发明的发酵饮食品的制造方法中，存在使用上述本发明的乳酸菌菌株进行发酵的步骤。

[0077] 在使用本发明的乳酸菌菌株对原料进行发酵时，可以将该发酵物直接作为发酵的饮食品，也可以在通过适当的后处理或加工后作为发酵饮食品。发酵条件与上述条件相同。

[0078] 发酵时的原料，只要是在乳酸菌发酵时能够使用的物质即可，没有特别的限定，但优选上述植物性原料。从而，可以根据所希望的品质，适当地将原料组合使用。

[0079] 此外，对于发酵时的原料而言，根据相应的目的，可以使用对其进行过适当的加工后的状态。例如，对于植物性原料而言，可以使用榨汁液、磨碎物或破碎物、以及这些物质的浓缩物、稀释物或者干燥物等经过加工后的状态。具体来说，如果是大豆，则可以使用豆乳或微细物的悬浊液这种状态。在本发明中，特别优选液状物质作为发酵原料。

[0080] 在不损害本发明的效果的范围内，在本发明的发酵饮食品中可以添加作为食品用的通常使用的其它原料、pH调节剂、香料、糖浆等辅助材料。

[0081] 例如，在使用本发明的乳酸菌菌株进行大豆发酵时，不必须添加乳糖，但为了调节发酵饮食品的香味，也可以添加乳糖。对于乳糖而言，可以通过添加脱脂奶粉来进行添加。

[0082] 本发明的发酵饮食品和使用以往的属于戊糖乳杆菌的乳酸菌菌株得到的发酵饮食品相比较，腌渍物的臭味较少香味优异，感官性能上更为优选。此外，本发明的发酵饮食品在冷藏保存中，由于pH、酸度等物性的变化较少，发酵刚结束时的良好香味可以得到保存，因此保存性能优异。

[0083] 实施例

[0084] 下面，通过具体的实施例对本发明进行进一步的详细说明，但，本发明并不受限于下述的实施例。

[0085] <大豆培养基的发酵特性>

[0086] [实施例]

[0087] 用蒸馏水稀释Brix.42％的胡萝卜浓缩果汁，调节成为pH 6.4、Brix.12％的胡萝卜培养基，向该培养基中接种本菌株的冷冻保存菌，接种量为1％(v/v)，在30℃下培养18个小时进行活化，之后在同样的条件下进行传代，并以此作为预培养液。

[0088] 然后，在分别含有25％(w/v)商业购买的大豆粉、2％(w/v)葡萄糖、4％(w/v)果糖的50mL培养基中，接种上述预培养液，接种量为1％(v/v)，并在30℃下培养9个小时。

[0089] 随后，将得到的培养物放在5℃或10℃下冷藏保存21天。

[0090] 在此之间，对培养基的发酵特性进行下述评价。即，对在培养开始时、培养结束时以及冷藏保存时培养物中的活菌数、以及培养物的pH及酸度通过下述方法进行测定。此外，对于培养物的凝乳，按下述方法通过目测观察。另外，对于培养物的香味，通过10名男性、10名女性、共20名的评价员进行感官评价。

[0091] [比较例]

[0092] 除使用标准株代替本菌株之外，采用和上述实施例相同的培养及评价方法。

[0093] (测定方法)

[0094] (1)培养物中的活菌数

[0095] 将1mL梯度稀释的培养物分别加入到平皿上，并加入约20mL的MRS琼脂培养基(OXOID公司制造)，制成混合稀释平板，在30℃下培养2天，通过计数形成的菌落来计算。

[0096] (2)培养物的pH

[0097] 使用pH计F-52(株式会社崛场制作所制造)进行测定。

[0098] (3)培养物的酸度

[0099] 通过滴定法进行计算。即，称量约5g样品，加入约500μL的酚酞溶液后，滴加0.1N氢氧化钠水溶液，以出现淡红色的点作为终点。由达到终点时的滴定量利用下述公式计算得到酸度。

[0100] 计算式：酸度(％)＝(氢氧化钠水溶液的当量浓度(规定数))×(氢氧化钠水溶液的滴定量(L))×(乳酸1g当量)÷(取样的样品量)×100

[0101] (4)培养物的凝乳

[0102] 在菌株接种前以及培养结束后，将容器倒立，60秒以上凝乳没有被破坏的用“○”表示，60秒内凝乳被破坏的用“△”表示，没有形成凝乳时用“×”表示。

[0103] (评价结果)

[0104] 评价结果和图表如下所示。图2是表示培养物中的活菌数、图3是表示培养物的pH、图4是表示培养物的酸度的图表。图2(a)～图4(a)表示培养开始时以及培养结束时的测定结果，图2(b)～图4(b)表示冷藏保存时的测定结果。

[0105] (a)培养开始时以及培养结束时

[0106] 对于通过活菌数观察到的增殖速度而言，本菌株和标准株之间没有明显的区别。

[0107] 另外，对培养开始时及培养结束时pH的变化，酸度的变化而言，本菌株和标准株之间没有明显的区别

[0108] 另一方面，对于凝乳的形成能力而言，与标准株相比本菌株更为优异，可以认为这是由生成的酸的影响以外的原因造成的。结果如表4所示。

[0109] 表4

[0110] (凝乳)

[0111]接种前 培养结束时
标准株 × △
本菌株 × ○

[0112] 另外，根据对培养结束时培养物的香味进行的感官性能上的评价(感官评价1)可知，标准株的培养物具有腌渍物的臭味，而本菌株的培养物没有腌渍物的臭味，因此在感官性能上更为优选。结果如表5所示。

[0113] 表5

[0114] (感官评价1)

[0115]评价为优选的人数
标准株 1
本菌株 19

[0116] ※在0.1％水平上有显著性差异

[0117] (b)冷藏保存时

[0118] 在10℃下保存时，标准株的培养物的活菌数基本没有减少，但在5℃下保存时，活菌数明显减少。另一方面，对于本菌株的培养物来说，无论在5℃还是10℃下，活菌数都明显减少。

[0119] 另外，保存温度在5℃和10℃时，在保存中的pH及酸度的变化方面，本菌株的培养物比标准株的培养物变化小。

[0120] 进一步，对于本菌株的培养物及标准株的培养物，将培养刚结束后的培养物进行冷冻保存，在解冻后对样品的香味进行感官性能上的评价，以及在10℃下保存21天后对样品的香味进行感官性能上的评价(感官评价2)，结果显示，本菌株的培养物，相对于解冻后的样品，冷藏保存后样品在香味上几乎没有变化，培养结束时和保存后在感官性能上都较为优异。与此相对，标准株的培养物，保存后香味明显发生变化，在感官性能上变得更差。结果如表6所示。

[0121] 根据上述结果可知，与标准株相比本菌株对温度的感受性更高，培养物在低温下保存时，品质的变化较小。

[0122] [表6]

[0123] (感官评价2)

[0124]将培养刚结束后的培养物评价为优选的人数
标准株 17(※)
本菌株 13

[0125] ※在0.1％水平上有显著性差异

[0126] 如上所述，确认了本发明的乳酸菌菌株，在以大豆作为原料时也具有优异的凝乳形成能力，且通过使用该乳酸菌菌株可以得到在冷藏时品质保存性好、香味良好的发酵饮食品。

[0127] 工业实用性

[0128] 本发明可以用于发酵饮食品的制造。