피브로인 유래 단백질 조성물

피브로인 유래 단백질 조성물{FIBROIN-DERIVED PROTEIN COMPOSITION}

관련 출원

본 출원은 2014년 8월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/039,675호 및 2015년 7월 17일에 출원된 미국 가출원 제62/193,790호에 대하여 35 USC §119(e) 하에 우선권을 주장하며, 상기 우선권 출원은 모두 본 출원에 참고로 인용된다.

실크 섬유와 사육된 누에( Bombyx mori )로부터 분비된 단백질은 섬유산업에서 수세기동안 이용되어 왔다. 분비된 단백질은 최근에 들어서 구조적 성분과 단백질 용액을 포함하는 생의학 용도의 생체 물질로 이용되고 있다. 천연적으로 누에 단백질은 실크 단백질인 피브로인(fibroin)과 세리신(sericin)의 혼합물로서 존재하는데, 세리신은 피브로인과 결합하는 접착제와 같은 물질로 작용하며 고치의 형태를 유지시킨다. 세제를 통한 추출이나 또는 고열 고알칼리 세척에 의해 세리신을 제거하면, 단일 디설피드 연결을 통해 이어진 중쇄 및 경쇄 피브로인 단백질을 포함하는 세리신이 없는 피브로인 섬유가 된다. 이들 원섬유를 수용성 실크 피브로인 단백질로 전환하려면 농축된 염(예를 들어, 8-10M 리튬 브로미드)을 추가하여야 하는데, 이는 피브로인 단백질을 불수용성으로 만드는 분자간 및 분자내 이온 및 수소 결합을 저해한다.

실크 피브로인 단백질을 응용하려면, 염이 주어진 환경에서 물질의 적절한 기능을 저해하지 못 하도록, 통상적으로 투석의 이용을 통해서와 같이 고농도 LiBr 염의 제거를 필요로 한다. 용해된 실크 피브로인의 이온 및 수소 결합과 경쟁하는 이러한 염이 없으면, 실크 피브로인 단백질 용액은 상대적으로 불안정하고, 단백질 응집에 취약하며, 종종 수용액으로부터 침전한다. 응집은 피브로인 단백질들 간의 상호작용과, 그 뒤에 잇따르는 피브로인 중쇄의 소수성 아미노산 모티프들 간의 베타-병풍 2차 단백질 구조 형성에 의한 물질의 겔화를 통해 일어나는 것으로 여겨진다. 이러한 구조들이 형성되면, 가용성 피브로인 용액의 비가용성 피브로인 겔로의 전환이 빠르고 또 대체로 비가역적으로 되며, 한정적인 물질의 저장 수명 때문에 상기 용액을 수용액에 기반한 응용에 적용하는 것을 제한시킨다.

수용액의 피브로인이 겔화하는 경향과 싸우기 위하여, 단백질 응집과 잇따르는 베타-병풍의 형성을 최소화하고자 하는 시도들이 있어 왔다. 용액에서 피브로인 농도를 낮추는 것은 이러한 구조의 형성에 선행하는 단백질-단백질 상호작용을 약화시키기 위한 목적의 총괄적 접근법이지만, 적절한 단백질 응용에는 너무 묽은 피브로인 용액이 형성될 수 있다. 다른 방법으로, 단백질 응집 및/또는 베타-병풍 형성을 방해하는 수용액의 조절(예를 들어, 용액 pH, 안정화 첨가제의 추가)은 이러한 일들을 미연에 방지할 수 있다. 그러나 이러한 조절과 화학물질의 추가는 생물학적 독성을 증가시키거나 용액에 공존할 수 없는 제제를 도입하여 다음 단계의 응용을 제한할 수 있다. 따라서 응집에 저항성이 있고 다양한 산업에 걸쳐 유용한 저장 수명 안정성 수준을 갖는 실크 유래 단백질(SDP; silk-derived protein)을 필요로 한다.

수용성 실크 피브로인의 상술한 취약점을 방지하기 위한 새로운 전략으로, 수용액 환경을 변화시키기보다 실크 피브로인 단백질 자체의 생화학적 구조 및 특성을 변화시키는 것이 있다. 이 목적을 위해, 실크 섬유 추출 과정 및/또는 수용성 실크 피브로인의 생산과 관련한 조건을 변화시키면 아미노산의 1차 서열과 이에 따라 단백질 응집 및 베타-병풍 형성의 원인이 되는 화학에 영향을 줄 수 있다. 이와 같이, 실크 피브로인 물질을 변화시키는 공정을 개발하는 것은 실크 용액 제품의 안정성 및 저장 수명을 극적으로 확장시킬 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 실크 피브로인으로부터 유래한 단백질 조성물을 제공한다. 본 조성물은 본질적으로 수용액에서 향상된 용해성 및 안정성을 갖는다. 한 양태에서, 본 발명은 승압에서 피브로인 수용액을 가열하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 단백질 조성물을 제공한다. 피브로인 수용액은 적어도 8M의 농도에서 리튬 브로미드를 포함한다. 피브로인 수용액은 적어도 약 20분 동안 적어도 약 10PSI의 압력 하에서 적어도 약 105℃(221℉)로 가열되어 단백질 조성물을 제공한다. 단백질 조성물의 폴리펩티드는 8.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하고, 단백질 조성물은 물의 10%(w/w) 용액으로서 5 cP 미만의 수성 점도를 갖는다.

다른 양태에서, 본 발명은 피브로인 수용액을 승압에서 피브로인 수용액을 가열하고, 이때 피브로인 수용액은 적어도 9-10M의 농도에서 리튬 브로미드를 포함하고, 피브로인 수용액은 적어도 약 20분 동안 약 14PSI 내지 약 20PSI의 압력 하에서 약 115℃(239℉) 내지 약 125℃(257℉)의 온도 범위로 가열되어 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된 단백질 조성물을 제공한다. 단백질 조성물은 6.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 단백질 조성물은 물의 15%(w/w) 용액으로서 10 cP 미만의 수성 점도를 가질 수 있다.

또한 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에서 천연 피브로인과 적어도 4%가 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 제거되었으며, 조성물은 천연 피브로인 단백질에 비해 25%를 초과하여 감소한 세린 함량을 갖고, 실크 유래 단백질의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이다.

다른 양태에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에서 천연 피브로인과 적어도 6%가 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 제거되었으며, 조성물은 천연 피브로인 단백질에 비해 40%를 초과하여 감소한 세린 함량을 갖고, 실크 유래 단백질의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이다.

나아가 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되었고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 제거되었으며, 실크 유래 단백질의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지한다.

다른 양태에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되어 세린, 글리신 및 알라닌의 혼합된 함량에서 적어도 5%가 천연 피브로인과 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 제거되었으며, 실크 유래 단백질의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.2 미만의 흡광도를 유지한다.

본 피브로인 유래 단백질 조성물은 예를 들어 투석 및/또는 여과에 의하여 건조 분말 또는 필름으로 분리 및/또는 정제될 수 있다. 다른 방안으로, 본 피브로인 유래 단백질 조성물은 식품 또는 음료 조성물로 사용하거나 또는 안과 제제와 같은 치료용 제제로 사용할 수 있게 조절될 수 있는 안정한 수용액으로 분리 및/또는 정제될 수 있다.

다음의 도면은 본 명세서의 한 부분을 형성하며, 본 발명의 어떠한 양태 또는 다양한 측면을 더 보여주기 위하여 포함된다. 몇몇 예에서, 본 발명의 양태는 첨부한 도면을 여기에 제시된 상세한 설명과 함께 조합하여 참조함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 설명 및 첨부한 도면은 어떠한 특정의 예 또는 본 발명의 어떠한 측면을 강조할 수 있다. 그러나 본 분야의 통상의 기술자라면 그러한 예 또는 측면이 본 발명의 다른 예 또는 측면과 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1. SDP 용액 및 종래기술의 실크 피브로인 용액을 제조하는 중요한 공정 단계를 설명하는 흐름도. SDP 제조 공정은 시간에 대한 용액 안정성을 향상시키는 추가 단계(가운데에서 이탤릭체로 표기)를 포함하고 있는데, 이는 종래기술의 실크 피브로인 용액 제조공정에서는 수행되지 않는 것이다.
도 2. 안정한 SDP 용액(실시예 1에 기재된 방법에 의해 제조된 시료 1, 좌측) 및 종래기술의 실크 피브로인 용액(표준 가수분해 조건에 의해 제조된 시료 2, 우측)에 대한 로렌스 안정성 시험의 결과를 보여주는 사진. 육안으로 검사하여, 시료 1은 겔화되지 않은 안정한 수용액인 반면에, 시료 2는 겔화되어 안정하지 않은 수용액임을 확인하였다.
도 3. 공정을 통해 수용액의 실크 피브로인 단백질을 SDP 용액으로 변화시키는 것을 보여주는 겔의 사진. 본 사진은 종래기술의 실크 피브로인 용액(2번 레인, 오토클레이브(autoclave) 처리되지 않음)에 대한 SDP 용액(3번 레인, 오토클레이브 처리됨)의 분자량(MW) 분포를 보여준다. 단백질 표준 시료(1번 레인)와 그에 따른 분자량(1번 레인 좌측의 숫자)이 MW의 참조를 위해 제공된다. 2번 레인에서 23-26 kDa의 선명한 MW 밴드가 주목할 만한데, 오토클레이브 처리공정이 완전히 없는 것으로, 피브로인 경쇄의 분해가 SDP 단백질 물질의 향상된 안정성에 기여한 것임을 나타낸다. 또한 오토클레이브 처리한 피브로인 단백질(3번 레인)의 MW 범위에서 변화가 분명하게 관찰되는데, 천연 실크 피브로인 단백질이 SDP 물질 조성물로 변화되었음을 나타낸다.
도 4A-B. (A) SDP 용액 물질은 겔화하지 않는 반면에, (B) 초음파 처리 후 2시간 내에 종래기술의 실크 피브로인 용액이 겔화하였음을 보여주는 사진.
도 5. 단백질 용액의 안정성 및 점도에 대한 여기서 설명된 피브로인 공정의 영향. 종래기술의 실크 피브로인(PASF), 30분 동안 225℉로 가열된 PASF(PASF-225℉) 및 SDP의 단백질 농도의 함수로서 용액 점도를 보여주는 요약 그래프. PASF 및 PASF-225℉는 >75 mg/g (7.5%(w/w))의 용액에서 점도의 급격한 증가를 나타내었고, 용액으로부터 단백질이 빠져나오지 않으면 200mg/g보다 더 농축될 수 없었다. 대조적으로, SDP는 모든 농도에 걸쳐서 낮은 점도를 유지하였고, 240mg/g를 초과한 수준으로 농축될 수 있었다.
도 6A-B. 실크 피브로인 단백질의 열처리는 피루베이트를 생성하는데, 이는 피브로인 1차 구조의 변화를 의미한다. (A) 가열하지 않거나, 또는 65℃(~150℉), 90℃(~200℉) 및 99℃(~210℉)로 가열된 실크 피브로인 단백질 용액(50 mg/mL)에서의 피루베이트 농도를 보여주는 요약 그래프. (B) 열처리를 지속하면 실크 피브로인으로부터 피루베이트가 생성되는 것을 더 향상시킨다. 수용액의 실크 단백질을 99℃(~210℉)에 30분간 노출시키면, 이 온도에 처음 도달했을 때의 피루베이트 수준에 비하여 피루베이트 수준을 거의 2배 증가시키고, 가열되지 않은 시료보다 4배 증가시킨다.
도 7A-B. 열처리로 천연 실크 단백질의 아미노산 조성을 변화시킨다. (A) 열처리 되지 않은(즉, "비열처리" / 종래기술) 실크 단백질 용액(좌측 칼럼, 10% 세린)과, 실시예 1에 기재된 공정(예를 들어, ~121℃, 17psi)에 30분간 미리 적용된 SDP 용액("열"; 우측 칼럼, 5.7% 세린)에서 피브로인 단백질의 전체 아미노산의 백분율로서 세린의 조성을 보여주는 요약 그래프. 열을 처리하면, 종래기술의 실크 피브로인 용액 시료와 비교했을 때 SDP 용액 시료에서 40%가 넘게 세린의 조성이 감소하였다. (B) 종래기술의 실크 피브로인 단백질 용액(좌측의 "비열" 칼럼)과, 열 및 압력기 가해진(~121℃, 17psi) SDP 용액(우측의 "열" 칼럼)에서 글리신 및 알라닌의 백분율 농도를 보여주는 요약 그래프. 열 및 압력을 가하는 공정이 종래기술의 실크 피브로인 용액 대조군에 비해 글리신 및 알라닌 수준의 증가를 촉진시킨다.
도 8. 다양한 시료 조성물이 소수성 왁스 표면 위에 놓여졌다: 포스페이트 완충된 살린(phosphate buffered saline; PBS), 테라티어스(TheraTears), 블린크(Blink), 시스탄 발란스(Systane Balance; BB) 및 5%(w/v)의 SDP 조성물(도면의 좌측 편에 도시됨). 조성물 용액의 퍼짐(spreading)을 시각화했고, 기계적 퍼짐을 전후한 시점에서 퍼짐 면적을 측정하였다(도면의 우측 편에 데이터를 표시함). 기계적 퍼짐 후에, SDP 조성물은 모든 다른 시료 조성물들에 비하여 현저히 향상된(세배 이상) 퍼짐을 나타내었다.
도 9A-C. SDP에서의 아미노산 변이는 2차 단백질 구조를 손상시켜 용해될 수 있도록 한다. (A) PASF 용액 및 SDP 용액의 선처리 및 후처리된 물풀림 시료의 FTIR 스펙트럼. 종래기술의 시료는 1624cm ^-1 및 1510cm ^-1 주변에서 후 물풀림에서 현저한 베타-병풍 특유의 피크를 나타낸 반면에, SDP 용액의 스펙트럼은 베타-병풍 피크의 형성을 나타내지 않고 대신에 후처리에서 현저히 감소한 베타-병풍 함량을 나타낸다. (B) 필름을 형성하도록 건조된 SDP 및 PASF 실크 용액의 대표적 이미지. (C) SDP 필름의 뒤따른 용해가 완전하게 이루어졌는데, 이는 베타-병풍 2차 구조가 형성되지 않았음을 의미한다. 반면에, PASF 필름은 완전히 용해될 수 없었고, 부분적으로 용해된 PASF 및 비용해된 베타-병풍을 함유한 단백질 응집의 혼합물이 형성되었다.
도 10. 실크 피브로인을 트립신으로 효소적 절단하면 불안정성을 증가시키고 겔 형성을 가속화하지만 SDP에는 영향을 주지 않는다. 표시된 시간 지점에서 트립신으로 사전에 처리한 초음파 처리된 PASF의 흡광도(550nm)를 나타내는 요약 그래프. 흡광도의 증가는 겔 형성으로 완결되는 피브로인 베타-병풍의 형성을 의미하며, 용액의 불안정을 나타낸다.
도 11. 초음파 처리 전에 30분간 0(대조군), 10 또는 100mM 디티오트레이톨(DTT)로 처리된 PASF 용액의 종적 흡광도(550nm)를 보여주는 요약 그래프. 본 데이터는 시간에 따라 PASF 또는 SDP 용액에서 2차 구조가 형성되는지의 가늠자를 제공한다. 증가한 흡광도로 보여지는 누적되는 베타-병풍의 형성은 PASF 용액의 음파 처리 후에 바로 나타난다(에를 들어 30분 내에, 그리고 뒤이어서 증가함). 정반대로, SDP는 2차 구조 형성으로의 경향을 나타내지 않는다. DTT로 디설피드 연결을 환원시키면 PASF 대조군에 비해 베타-병풍 및 이어지는 겔의 형성을 늦추지만, 종국적으로는 현저한 양의 베타-병풍을 형성한다. 대조적으로, SDP는 2차 구조를 형성하는 경향을 보여주지 않으며, 안정하게 유지되었다. 그러므로 천연 피브로인에서 디설피드 연결을 환원시키는 것은 안정성을 증가시키지만 겔 형성을 저해하지 않으며, PASF의 종적 불안정성이 SDP에서는 없어진다.
도 12. 리튬 브로미드(LiBr)가 없이 PASF를 가열하면 겔화를 손상시킨다. 가열되지 않거나(대조군) 또는 초음파 처리 전에 표시된 시간 동안에 ~200℉에서 가열된 PASF 용액으로부터의 흡광도(550nm)를 나타내는 요약 그래프. 용액을 가열하면 비가열된 PASF에 비하여 열처리 시간에 따라 증가하는 기저 흡광도를 증가시킨다. 모든 PASF 용액들은 시간에 걸쳐서 흡광도의 증가를 나타내었는데, 이는 단백질 성질의 변화를 의미한다. 대조적으로, SDP는 실험이 이루어지는 시간 전체에 걸쳐서 초음파 처리후에 흡광도에서 변화를 나타내지 않았다.

본 발명은 실크 피브로인으로부터 유래한 단백질 조성물을 제공한다. 본 단백질 조성물은 수용액에서 향상된 용해성 및 안정성을 갖는다. 천연 피브로인의 1차 아미노산 서열이 본 피브로인 유래 단백질 조성물에서 조절되어 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 또는 제거된다. 추가적으로, 본 조성물은 천연 피브로인 단백질에 비해 40%보다 더 많이 감소한 세린 함량을 가질 수 있으며, 조성물에서 단백질의 평균 분자량은 약 100 kDa 미만이다.

정의

다음의 정의는 명세서와 청구항을 명확하고 일관되게 이해하기 위하여 포함된다. 여기에서 언급되는 용어는 다음의 의미가 있다. 본 명세서에 사용된 모든 다른 용어 및 구절은 통상의 기술자가 이해하듯이 그 보통의 의미가 있다. 이러한 보통의 의미는, 알. 제이. 루이스(RJ Lewis)가 편집하고 뉴욕의 존 윌리 앤 선즈 출판사(John Wiley & Sons, New York)에서 2001년에 출판한 홀리의 요약 화학 사전 14판(Hawley's Condensed Chemical Dictionary 14 ^th Edition)과 같은 기술 사전을 참조하여 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 "한 양태", "양태" 등의 언급은 기재된 양태가 특정한 측면, 특징, 구조, 반응기 또는 특성을 포함할 수 있지만, 모든 양태가 반드시 그러한 측면, 특징, 구조, 반응기 또는 특성을 포함하는 것은 아니다. 또한, 그러한 구절은 본 명세서의 다른 부분에서 참조된 같은 양태를 참조할 수 있으나, 반드시 그러한 것은 아니다. 나아가, 특정한 측면, 특징, 구조, 반응기 또는 특성이 하나의 양태와 관련하여 기재되었을 때, 명시적으로 기재되어 있든 아니든 간에, 통상의 기술자의 지식의 범위 내에서 그와 같은 측면, 특징, 구조, 반응기 또는 특성을 다른 양태에 영향을 주거나 또는 다른 양태와 연결시킨다.

단수형의 "하나의(a, an)" 및 "그(the)"는 문장에서 달리 분명하게 지시하지 않는 한 복수 개를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 구성요소"에 대한 언급은 그러한 구성요소의 복수 개를 포함하여, 하나의 구성요소 X는 복수 개의 구성요소 X를 포함한다. 또한, 청구범위가 선택적 요소를 제외하도록 기재될 수 있음에 유의하여야 한다. 이처럼 본 진술은, 여기서 기재된 어떠한 요소, 및/또는 청구항 요소의 기재 또는 "부정적" 한정의 사용과 관련하여, "오로지", "단지", "외에" 및 이와 비슷한 배타적 용어의 사용에 대한 선행적 근거를 제공하기 위한 것이다.

"및/또는"이라는 용어는 항목들의 어느 하나, 항목들의 어느 조합, 또는 이 용어가 관련된 항목들의 모두를 의미한다. "하나 이상의" 및 "적어도 하나"라는 표현은 통상의 기술자에게 손쉽게 이해되는데, 특히 이 표현의 맥락에서 읽혀질 때 그러하다. 예를 들어, 이 표현은 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 열, 100, 또는 기재된 하한치보다 대략 10, 100 또는 1000배가 더 큰 어떠한 상한치를 의미할 수 있다.

"약"이라는 용어는 특정된 수치의 ±5%, ±10%, ±20% 또는 ±25%의 변동을 의미할 수 있다. 예를 들어, "약 50" 퍼센트는 몇몇 양태에서 45 내지 55퍼센트의 변동을 수반할 수 있다. 정수 범위에서, "약"이라는 용어는 범위의 각 말단의 기재된 정수보다 크거나 및/또는 작은 하나 또는 둘의 정수를 포함할 수 있다. 여기서 달리 표기되지 않는 한, "약"이란 용어는, 예를 들어, 개별 구성성분, 요소, 조성물 또는 양태의 기능성 측면에서 동등한 기재 범위에 근접한 중량 퍼센트와 같이, 수치들을 포함하는 것이다. "약"이란 용어는 또한 본 단락에서 상술한 것처럼 기재 범위의 말단점을 변화시킬 수 있다.

통상의 기술자에게 이해될 것처럼, 성분의 양, 분자량과 같은 성질, 반응 조건 및 이와 같은 것을 표현하는 것들을 포함한 모든 숫자는 근사값이며, 모든 경우에서 용어 "약"에 의하여 선택적으로 변경될 수 있는 것으로 이해된다. 이들 수치는 본 명세서의 기재를 활용하는 통상의 기술자가 얻고자 하는 바람직한 성질에 따라 달라질 수 있다. 또한, 이러한 수치는 이들 각각의 시험 측정에서 확인되는 표준 편차에 기인하는 필연적인 변동성을 본질적으로 포함하는 것으로 이해된다.

통상의 기술자에게 이해될 것처럼, 어떠한 그리고 모든 목적을 위하여, 특히 명세서 기재를 제공하는 측면에서, 여기에 기재된 모든 범위는, 그 범위를 형성하는 개별적인 수치, 특히 정수 수치뿐만이 아니라, 어떠한 그리고 모든 가능한 하부 범위와 그 하부 범위의 조합을 망라한다. 기재된 범위(예를 들어, 중량 퍼센트 또는 탄소기)는 그 범위 내에서 각각의 특정한 수치, 정수, 소수 또는 항등함수를 포함한다. 어떤 열거된 범위는 적어도 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 또는 1/10로 세분되는 동일 범위를 충분히 기재하고 또한 실시가능하게 하는 것으로 용이하게 인정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 여기서 논의된 각 범위는 3등분의 아랫부분, 중간부분 및 위부분 등으로 세분될 수 있다. 또한 통상의 기술자에게 이해될 것처럼, "까지", "적어도", "초과하는", "미만인", "보다 큰", "이상의" 및 이와 같은 모든 표현들은 기재된 숫자를 포함하고, 이와 같은 용어들은 상술한 바와 같이 결과적으로 하부 범위들로 세분될 수 있는 범위를 참조한다. 동일한 방식으로, 여기서 기재된 모든 비율은 그 더 큰 비율 내에 있는 모든 하부 비율들을 포함한다. 따라서, 라디칼, 치환기 및 범위에 대하여 기재된 특정 수치들은 설명을 위한 것일 뿐이며, 다른 정의된 수치나 또는 라디칼과 치환기에 대해 정의된 범위 내에 있는 다른 수치를 배제하지 않는다.

통상의 기술자라면, 요소들이 통상적인 방식으로 마쿠쉬 그룹과 같이 그룹화된 경우, 발명이 전체적으로 열거된 모든 그룹뿐만 아니라, 그룹의 각 요소와 메인 그룹의 모든 가능한 하부 그룹도 아우르는 것으로 이해할 것이다. 덧붙여, 모든 목적에 있어서, 발명은 메인 그룹만이 아니라 하나 이상의 그룹 요소가 결여된 메인 그룹도 아우른다. 따라서 발명은 기재된 그룹의 어떠한 하나 이상의 요소를 명시적으로 배제하는 것으로 된다. 따라서, 기재된 요소, 종(種) 또는 양태의 하나 이상이, 예를 들어 명시적인 부정적 표현의 사용으로 그러한 카테고리 또는 양태로부터 제외될 수 있는 경우, 단서조건이 어떠한 기재된 카테고리 또는 양태에 적용될 수 있다.

"접촉"이란 용어는 만지기, 접촉하기, 또는 바로 옆의 또는 가까운 근접지로 다가가는 행위를 의미하는데, 예를 들어, 용액에서, 반응 혼합물에서, 시험관 내에서( in vitro ) 또는 생체 내에서( in vivo ), 생리학적 반응, 화학적 반응, 또는 물리적 변화를 일으키는 세포 또는 분자적 수준에서의 것을 포함한다.

치료적 응용에 있어서, "유효량"은 질병, 장애 및/또는 질환을 치료하거나 또는 기재된 효과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은 치료될 장애 또는 증상의 진행 또는 심각도를 감소시키기에 효과적인 양일 수 있다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 통상의 기술자의 능력 내에 있다. "유효량"이란 용어는 여기에 기재된 조성물의 양, 또는 여기서 기재된 펩티드의 조합의 양을 포함하는 것으로 의도되며, 예를 들어, 개체에서, 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 또는 질병 또는 장애의 증상을 치료하기에 효과적인 양을 포함한다. 따라서, "유효량"은 목적으로 하는 효과를 제공하는 양을 일반적으로 의미한다.

공정 및 제법의 응용에 있어서, "유효량"은, 반응 혼합물에서 제품을 생성하기에 필요한 양과 같이, 기재된 효과를 달성하기에 효과적인 양을 의미한다. 유효량의 결정은, 특히 여기서 제공되는 상세한 설명에 근거하여, 통상의 기술자의 능력 내에 일반적으로 있다. "유효량"이란 용어는, 여기서 기재된 화합물 또는 시약의 양, 또는 여기서 기재된 화합물 또는 시약의 조합의 양, 또는, 예를 들어 반응 혼합물에서 목적으로 하는 제품을 생성하기에 효과적인, 여기서 기재된 공정과 관련한 조건을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서 "유효량"은 기재된 목적으로 하는 효과를 제공하는 양을 일반적으로 의미한다.

피브로인은 누에( Bombyx mori )의 고치로부터 유래한다. 피브로인 단백질은 분자량이 약 350-400 kDa인 중쇄와 분자량이 약 25 kDa인 경쇄를 포함하는데, 중쇄와 경쇄는 디설피드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 1차 서열은 해당 분야에 알려져 있다. 피브로인 단백질 사슬은, 소수성의 N 및 C 말단 도메인과, 용액 내의 주변 분자들과 입체적 및 정전기적의 혼합적 상호작용을 할 수 있는 소수성/친수성 아미노산 서열이 번갈아 있는 블록을 갖는다. 낮은 농도의 희석(1% 이하)에서, 피브로인 단백질 분자는 신장된 단백질 사슬로 되고 용액에서 바로 응집하지 않는다고 알려져 있다. 피브로인 단백질은 HA, PEG, 글리세린 및 CMC와 같은 수화성 분자와 혼화성이 높고, 생체 적합성이 높은 것으로 밝혀졌으며, 효소 작용을 통해 생체 내에서 자연적으로 동화되거나 분해된다. 천연 피브로인, 또는 종래기술의 실크 피브로인(PASF)이 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 다이탠카르 등(Daithankar et al.)의 문헌( Indian J. Biotechnol . 2005, 4 , 115-121)에 개시되어 있다.

"실크 유래 단백질"(silk-derived protein; SDP) 및 "피브로인 유래 단백질"이라는 용어는 여기서 상호교환적으로 사용된다. 이들 물질은 열, 압력 및 고농도의 중염 용액을 포함하는 여기서 기재된 공정에 의하여 제조된다. 따라서 "실크 유래" 및 "피브로인 유래"는, 여기서 기재된 구조적, 화학적 및 물리적 성질을 가진 단백질 조성물이 되도록 실크 피브로인 단백질을 변화시키는 공정의 출발물질을 의미한다.

피브로인 유래 단백질 조성물의 제조

여기서 기재된 피브로인 유래 단백질 조성물은 수용액에서 천연 피브로인에 비해 향상된 안정성을 갖는다. 여기서 실크 유래 단백질(SDP)로도 칭해지는 피브로인 유래 단백질 조성물에 의해 달성되는 향상된 안정성은, 천연의/종래기술의 실크 피브로인 단백질(여기서 PASF로 칭해짐)보다 그 물질이 용액에서 현저하게 더 오래 유지되도록 한다. SDP 물질의 향상된 안정성은 또한 응집, 침전 또는 겔화가 없이 고농도의 SDP 용액을 제조할 수 있도록 한다. 식품, 음료, 안약 또는 단백질이 용액에 용해될 수 있기를 요구하는 응용과 같은 상업적 응용에 있어서, 향상된 안정성은 단백질 응집을 감소시킴으로써 적절히 긴 저장수명과 제품 질의 증가를 가져다 준다. 용액에서 단백질의 잠재적 응집은 특정한 응용에 있어서 제품의 바람직한 작용에 부정적인 영향을 준다. 용액에서 SDP를 고농도(50%(w/v)를 초과 또는 >500mg/mL)로 농축하는 능력은 어떠한 응용에서도 있는 그대로 또는 희석하여 사용될 수 있는 유용한 작업 용액을 개발하는 데에 분명하게 유리하다. 그러한 응용의 예로는, 식품, 음료 또는 안과 조성물에서 단백질 보충제 또는 추가제의 성분으로 SDP를 사용하는 것이 있다.

수용액에서 향상된 안정성은 천연 피브로인 단백질의 1차 아미노산 서열을 SDP 물질로 변형시키는 것에 기인한다. 1차 서열의 변화는 응집하려는 분자의 경향을 감소시킨다. 응집은 궁극적으로 겔화로 이어진다. 천연 피브로인의 변이에 있어서, 세린 및 시스테인 아미노산이 고열 및 탈수의 조건에서 절단된다. 비슷하게는, 패트초닉 등(Patchornik et al.)의 문헌( J. Am. Chem . Soc . 1964, 86 , 1206)에서 디하이드로알라닌(DHA) 중간체가 용액에서 세린 및 시스테인으로부터 형성된다고 기재하고 있다. 아미노산의 분해는, 수소화물 시프트가 발생하여 물의 제거를 유도하는, 여기서 기재된 50-55%(w/v) LiBr 용액과 같은 강한 탈수 용매 시스템이 있을 때에 더욱 촉진된다. 분해 반응은 히드록시드 이온이 있을 때(예를 들어, pH 7.5 내지 pH 11) 일어날 수 있는데, 이 이온은 DHA 중간체의 절단을 더 일으킨다. 이 절단은 아미드, 피루보일 펩티드 및 LiBr을 형성한다. 하나의 실행 가능한 화학 메커니즘을 세린 아미노산에 대하여 도식 1에 서술하였는데, 이 도식은 또한 시스테인 아미노산에도 적용할 수 있다. PASF 단백질의 세린 및 시스테인 아미노산을 추가적인 가수분해와 함께 DHA로 화학적으로 변화시키면, SDP 제품의 향상된 용액 안정성을 이끌어낸다.

도식 1. 세린 및 시스테인의 분해에 대한 화학반응을 도식적으로 설명함. 탈수시키는 고농도의 염 환경에서 수소화물 시프트로부터 형성되는 DHA 중간체의 생산에 의하여 분해가 추동된다. 그리고 나서 DHA의 분해는 염기성 용액 환경 내에서 SN ₂ 반응을 통해 달성된다.

위에서 논의한 절단 반응은 결과로 만들어지는 펩티드의 거대분자 성질에 현저하게 영향을 주는데, 이는 안정화된 SDP 물질의 수용액으로 귀결된다. 그레빙 등(Greving et al.)의 문헌( Biomacromolecules 2012, 13(3): 676-682)에 기재된 바와 같이, 피브로인의 최초의 단백질 응집은 천연 피브로인의 중쇄 및 경쇄가 시스테인 아미노산에서 상호작용하여 시작되는 것으로 여겨진다. 피브로인 중쇄 및 경쇄 내의 시스테인 아미노산은 디설피드 연결을 통해 서로 상호작용한다. 이들 디설피드 연결은 피브로인 단백질 겔화 및 겔 네트워크 침전에 참여한다. 천연 피브로인 경쇄가 없으면, 그 단백질은 응집에 대하여 현저하게 낮은 감수성을 갖는다. 따라서 여기서 기재된 공정은 시스테인 함량을 감소시키고 이에 따라 디설피드 결합 형성 능력을 감소 또는 제거시킴으로써 천연 피브로인 경쇄의 디설피드 결합 형성 능력을 효과적으로 감소시킨다. 이 메커니즘을 통하여, 여기에 기재된 변이 공정은 시스테인에 의한 응집이 형성되는 능력을 감소 또는 제거하여 얻어지는 용액 내의 SDP를 기능적으로 안정화시킨다.

메이언 등(Mayen et al.)의 문헌( Biophysical Chemistry 2015, 197:10-17)에 기재된 바와 같이, 응집에 의해 유도되는 디설피드 결합에 더하여, 실크 피브로인이 더 응집하여 침전된 구조가 되는 감수성은 또한 단백질의 아미노산 화학에 의하여 유도된다. 실크 피브로인의 세린, 알라닌 및 글리신 아미노산 서열에 대한 분자 모델링은, 세린의 존재가 인접한 피브로인 단백질 사슬기 간의 수소 결합을 일으키는 경향을 더 크게 함으로써 최초의 단백질-단백질 상호작용을 강화시킨다는 것을 보여준다. 모델에서는 감소한 세린 및 증가한 알라닌과 글리신이 단백질 응집에 대한 처음의 경향을 감소시킨다고 보여준다. 분자 모델링 관찰은, 피브로인 단백질의 천연 아미노산 화학을 변경함으로써 수용액에서 더 안정한 물질이 만들어질 수 있음을 보여준다.

향상된 안정성을 달성하는 하나의 전략은, 히드록실과 같은 전하를 띤 기능기를 단백질로부터 제거하는 것이다. 히드록실기의 상대적으로 높은 전기음성도로 인해, 이 화학은 수소가 가용한 수소 원자와 결합하는 것과 양전하로 하전된 아미노산과의 비특이적 전하의 상호작용을 추동할 수 있다. 천연 피브로인 단백질의 함량의 약 12%가 세린으로 구성되어 있는데, 세린은 히드록실 기능기를 갖고 있다. 따라서, 수소결합을 촉진하는 히드록실기의 가용성을 감소시킴으로써, 용액에서 전체적인 단백질 안정성이 향상될 수 있다. 여기에 기재된 공정은 세린 함량을 효과적으로 감소시키고 알라닌 및 글리신의 상대적인 함량을 증가시키는데, 이는 수소결합을 만들 수 있는 가용 수소기의 숫자를 없앤다. 이 메커니즘을 통해, 여기에 기재된 공정은 용액에 만들어지는 SDP를 연장된 기간(예를 들어, 적어도 몇(6-8) 개월, 및/또는 1.5년 이상; 이어지는 연구가 진행 중에 있는데, 안정성이 2년 이상 또는 3년 이상 지속될 수 있다고 보여지고 있다)동안 효과적으로 안정화시킨다.

시스테인 및 세린의 감소에 더하여, 용매 전하 상호작용이 단백질 용액의 안정화에 중요하다. 최초 단백질 침전 후에, 겔화 과정이 계속 진행되어 천연 피브로인 중쇄 사이에 더 가까운 연결을 유도하는 것으로 보여지며, 이는 중쇄의 수소성 블록 간에서의 분자내 및 분자간 베타-병풍의 형성으로 이어진다. 일단 베타-병풍 형성이 뚜렷하게 일어나면, 피브로인 용액은 겔로 전환된다. 용액이 겔로 전환함에 따라, 피브로인은 비용해성이 되고 용액에 기반한 제품으로서는 더 이상 쓸모가 없게 된다. 겔화를 방지하기 위하여, SDP 용액의 pH는, 예를 들어 pH 7.5 초과처럼, 안정성을 향상시키는 고염기성으로 상승되어질 수 있다. 결과적으로, 증가한 pH는 용액에서 SDP 분자 주변에 원자가 방패(valence shield)를 형성하는 추가의 자유 히드록실기를 생성한다. 형성된 원자가 방패는, 수소 결합 또는 비특이적으로 하전된 및/또는 소수성의 상호작용으로부터 기인하는 단백질-단백질 상호작용을 감소시킴으로써 단백질을 안정시키는 제타 포텐셜을 생성하는 역할을 한다. 피브로인 변이 공정은, 이러한 메커니즘과 다른 메커니즘을 통해 공정을 거친 SDP를 용액에서 기능적으로 안정화시킨다.

SDP 물질은 다음의 공정에 의해 제조될 수 있다.

1. 번데기 물질을 제거하고 따뜻한 물에 미리 헹구어 실크 고치를 준비한다.

2. 통상적으로 95℃ 이상인 높은 수온과 알카리성 pH에서 고치를 물에서 세척하여, 천연 피브로인 단백질 섬유를 검과 같은 세리신 단백질로부터 추출한다.

3. 추출된 피브로인 섬유를 건조시킨 다음, 베타-병풍 간의 수소 결합을 중화시키는 용매 시스템을 사용하여 섬유를 용해시킨다. 20%(w/v) 실크 피브로인 단백질의 54% LiBr 수용액이 이 중화 단계에 효과적이다.

4. LiBr 용액에 용해된 피브로인 단백질을 고온가압 환경{~121℃(~250℉), ~15-17PSI 압력, 약 30분}에 처리한다.

5. 열처리된 피브로인 단백질 및 LiBr 용액을 투석하여 용액으로부터 리튬과 브로미드를 제거한다. 공정의 이 시점에서 물질은 화학적으로 SDP로 변이된다.

6. 투석된 SDP를 여과하여 용해되지 않은 응집체와 오염시키는 오염물을 제거한다.

도 1에 도식적으로 설명된 바에 따라, 현행의 실크 피브로인 용액 제조에 사용되는 공정과 분명하게 다른 공정을 사용하여 SDP 용액을 제조한다. 뚜렷하게, 실크 피브로인 단백질을 오토클레이브 처리하면, 실크 피브로인 단백질이 용액에서 LiBr과 조합되어 있으면서도 안정화된 SDP 물질을 생성하는 화학적 전환을 촉발시킨다. 피브로인 단백질은 LiBr 용액에 용해되어 있는데, 이 용액은 용해된 천연 피브로인 단백질의 수소 결합 및 정전기적 상호작용을 중화시킨다. 이는 단백질이 용액에서 특정한 2차 구조를 형성하지 않도록 한다. 결과적으로, 피브로인 단백질 내에서 공유결합을 가수분해할 수 있는 열역학적 에너지가 가수분해를 일으키는 최소의 에너지 요구이다.

한 양태에서, 30분의 15-17PSI 오토클레이브 조건에서 온도를 121℃로 설정한다. 그러나, 다양한 양태에서, SDP 물질을 다양한 정도로 안정화하기 위하여 처리조건이 변경될 수 있다. 다른 양태에서, 추가적인 단백질 안정화제가 공정에 사용될 수 있는데, 이는 칼슘 클로리드 및 소듐 티오시아네이트와 같은 추가의 또는 다른 할라이드염; 우레아, 구아니딘 히드로클로라이드 및 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올과 같은 유기제; 칼슘 니트레이트 및 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 클로리드와 같은 추가의 강이온 수용액 첨가제, 또는 이들의 조합을 포함한다.

피브로인 유래 단백질 조성물

본 발명은 실크 피브로인으로부터 유래한 단백질 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 수용액에서 향상된 용해도 및 안정성을 가진다. 한 양태에서, 본 발명은 피브로인 수용액을 승압에서 가열하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 단백질 조성물을 제공한다. 피브로인 수용액은 적어도 8M의 농도에서 리튬 브로미드를 포함한다. 피브로인 수용액을 적어도 약 10PSI의 압력 하에서 적어도 약 20분 동안 적어도 약 105℃(221℉)로 가열하여, 본 단백질 조성물을 제공한다. 본 단백질 조성물의 폴리펩티드는 8.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하고, 본 단백질 조성물은 10%(w/w) 물의 용액으로서 5cP 미만의 수성 점도를 갖는다.

다른 양태에서, 본 발명은 피브로인 수용액을 승압에서 가열하여 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에서, 피브로인 수용액이 리튬 브로마이드를 9-10M의 농도에서 포함하고, 피브로인 수용액이 적어도 약 20분 동안 약 15PSI 내지 약 20PSI의 압력 하에서 약 115℃(239℉) 내지 약 125℃(221℉)로 가열되어, 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질 조성물을 제공한다. 단백질 조성물은 6.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 단백질 조성물은 물의 15%(w/w) 용액으로서 10cP 미만의 수성 점도를 가질 수 있다.

또한 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 4%가 다르고(피브로인 유래 대 PASF), 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 조성물은 천연 피브로인 단백질에 비해 25%를 초과하여 감소된 세린 함량을 갖는다. 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 100 kDa 미만이고 약 25 kDa보다 클 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 6%가 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 조성물은 천연 피브로인 단백질에 비해 40%를 초과하여 감소된 세린 함량을 갖는다. 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 96 kDa 미만이고 약 25 kDa보다 클 수 있다.

나아가 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되었고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 100 kDa 미만이고 약 25 kDa보다 크고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지한다. 예를 들어, 단백질 조성물의 5%(w/w) 용액은, 여기에 기재된 초음파 처리에서 사용된 표준 조건인, 10Hz 및 20% 진폭에서의 5초간 초음파 처리 후에, 550nm에서 0.1 미만의 흡광도를 유지할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되어, 세린, 글리신 및 알라닌의 혼합된 함량에서 적어도 5%가 천연 피브로인과 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 96 kDa 미만이고 약 25 kDa보다 크고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.2 미만의 흡광도를 유지한다.

다양한 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물은, 예를 들어, 투석 및/또는 여과에 의하여, 건조분말 또는 필름으로 분리 및/또는 정제될 수 있다. 다른 방안으로, 피브로인 유래 단백질 조성물은 식품 또는 음료 조성물로 사용하거나 또는 안과 제제와 같은 치료용 제제로 사용할 수 있게 조절될 수 있는 안정한 수용액으로 분리 및/또는 정제될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 여기에 기재된 단백질 조성물과 식품 또는 음료 성분을 포함하는 식품 또는 음료 조성물을 제공한다. 식품성분으로는 간단한 설탕, 이당류, 탄수화물, 지방, 오일, 비타민, 미네랄 및 물의 하나 이상을 포함할 수 있다. 음료 성분으로는 물, 착색제(예를 들어 합성 착색체, 또는 사프란(saffron)과 같은 천연 착색제), 비타민 및 미네랄의 하나 이상을 포함할 수 있다.

다양한 양태에서, 피브로인 유래 단백질의 아미노산 조성은, 세린, 글리신 및 알라닌의 혼합된 함량에 있어서, 천연 피브로인의 아미노산 조성과 적어도 4%, 적어도 4.5%, 적어도 5%, 또는 적어도 5.5%, 또는 적어도 6%가 다르다.

조성물은 천연 피브로인 단백질의 세린 함량과 비교하여, 25%를 초과하여, 30를 초과하여, 35%를 초과하여, 40%를 초과하여, 또는 45%를 초과하여 감소된 세린 함량을 가질 수 있다.

피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 100 kDa 미만, 약 98 kDa 미만, 약 96 kDa 미만, 약 95 kDa 미만, 약 90 kDa 미만, 약 85 kDa 미만, 약 80 kDa 미만, 약 75 kDa 미만, 또는 약 70 kDa 미만일 수 있다. 다양한 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 30 kDa 초과, 약 35 kDa 초과, 약 40 kDa 초과, 약 50 kDa 초과, 약 60 kDa 초과, 또는 약 70 kDa 초과일 수 있다. 따라서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 (중량 평균) 평균 분자량은 약 30 kDa 내지 약 100 kDa, 약 30 kDa 내지 약 96 kDa, 약 30 kDa 내지 약 90 kDa, 약 35 kDa 내지 약 80 kDa, 약 35 kDa 내지 약 70 kDa, 약 40 kDa 내지 약 60 kDa일 수 있다. 다양한 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 60 kDa 내지 약 80 kDa, 약 50 kDa 내지 약 70 kDa, 약 40 kDa 내지 약 60 kDa, 약 30 kDa 내지 약 50 kDa, 약 35 kDa 내지 약 45 kDa, 또는 약 40 kDa 내지 약 43 kDa이다.

다양한 양태에서, 단백질 조성물은 10%(w/w) 물의 용액으로서 4 cP의 수성 점도를 갖는다. 추가의 양태에서, 단백질 조성물은 24%(w/w) 물의 용액으로서 10 cP의 수성 점도를 갖는다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 육안으로 관찰될 수 있는 어떠한 침전도 없이 40%(w/w)에서 물에 용해될 수 있다.

다양한 양태에서, 단백질 조성물은 10%(w/w)까지의 농도에서 단백질 조성물의 수용액을 초음파 처리해도 겔화하지 않는다. 추가의 양태에서, 단백질 조성물은 15%(w/w)까지의 농도, 20%(w/w)까지의 농도, 25%(w/w)까지의 농도, 30%(w/w)까지의 농도, 35%(w/w)까지의 농도, 또는 40%(w/w)까지의 농도에서 단백질 조성물의 수용액을 초음파 처리해도 겔화하지 않는다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 8% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 양태에서, 단백질 조성물은 7.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를, 7% 미만의 세린 아미노산 잔기를, 6,5% 미만의 세린 아미노산 잔기를, 또는 6% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함한다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 단백질 조성물의 전체 아미노산 함량에 대해 상대적으로, 46.5%를 초과하는 글리신 아미노산을 포함한다. 다른 양태에서, 단백질 조성물은 47%를 초과하는 글리신 아미노산을, 47.5%를 초과하는 글리신 아미노산을, 또는 48%를 초과하는 글리신 아미노산을 포함한다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 단백질 조성물의 전체 아미노산 함량에 대해 상대적으로, 30%를 초과하는 알라닌 아미노산을 포함한다. 다른 양태에서, 단백질 조성물은 30.5%를 초과하는 알라닌 아미노산을, 31%를 초과하는 알라닌 아미노산을, 또는 31.5%를 초과하는 알라닌 아미노산을 포함한다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 박막에 건조된 후에 완전하게 재용해된다. 다양한 양태에서, 단백질 조성물은 수용액에서 베타-병풍 단백질 구조가 없다. 어떤 양태에서, 단백질 조성물은 적어도 5초의 초음파 처리 후에 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 수용액에서 유지한다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 물과 조합한다. 단백질 조성물은 10%(w/w) 농도에서, 또는 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w) 또는 40%(w/w)과 같은 더 높은 농도에서 물에 완전히 용해될 수 있다. 몇몇 양태에서, 단백질 조성물은, 예를 들어, 투석, 여과 또는 이들의 조합에 의하여 분리 또는 정제될 수 있다.

다양한 양태에서, 단백질 조성물은, 예를 들어, 단백질 조성물을 포함하지 않는 대조되는 조성물의 퍼짐에 비하여, 단백질 조성물 및 안과 제제 성분을 포함하는 수용액의 퍼짐을 향상시킨다. 향상된 퍼짐은 수용액의 표면적을 2배, 또는 3배보다 더 증가시키는 결과를 가져올 수 있다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 20%(w/v)까지의 농도에서, 30%(w/v)까지의 농도에서, 또는 40%(w/v)까지의 농도에서 겔을 형성하지 않는다. 단백질 조성물은 적어도 9.8 cP의 점도까지 용액으로 남아있을 수 있다.

몇몇 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물은 피브로인 유래 단백질 조성물의 아미노산의 적어도 약 47.5%를 포함하는 아미노산의 글리신-알라닌-글리신-알라닌(GAGA) 단편을 가질 수 있다. 또한 피브로인 유래 단백질 조성물은 피브로인 유래 단백질 조성물의 아미노산의 적어도 약 48%를, 적어도 약 48.5%를, 적어도 약 49%를, 적어도 약 49.5%를, 또는 적어도 약 50%를 포함하는 아미노산의 글리신-알라닌-글리신-알라닌(GAGA) 단편을 가질 수 있다.

다양한 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물은 피브로인 유래 단백질 조성물의 아미노산의 적어도 약 59%를 포함하는 아미노산의 글리신-알라닌(GA) 단편을 가질 수 있다. 또한 피브로인 유래 단백질 조성물은 피브로인 유래 단백질 조성물의 아미노산의 적어도 약 59.5%를, 적어도 약 60%를, 적어도 약 60.5%를, 적어도 약 61%를, 또는 적어도 약 61.5%를 포함하는 아미노산의 글리신-알라닌(GA) 단편을 가질 수 있다.

다른 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 6%가 다르고, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량은 약 100 kDa 미만이며, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지한다. 따라서, 한 특정한 태양에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 6%가 다르고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 조성물이 천연 피브로인 단백질에 비하여 40%를 초과하여 감소된 세린 함량을 가지고, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이다.

다른 태양에서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 피브로인로부터 변이되었고, 피브로인 중쇄 및 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 또는 제거되며, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지한다. 한 특정한 양태에서, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되어, 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 5%가 다르고, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이며, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.2 미만의 흡광도를 유지한다.

따라서, 한 특정한 양태에서, 본 발명은 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열은 천연 실크 피브로인으로부터 변이되어, 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 5%가 다르고, 피브로인 중쇄 및 피브로인 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소하거나 또는 제거되며, 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이고, 피브로인 유래 단백질 조성물은 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안에 550nm에서 0.2 미만의 흡광도를 유지한다.

또한 본 발명은 피브로인 수용액을 승압에서 가열하여 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 수용액이 리튬 브로마이드를 적어도 8M의 농도에서 포함하고, 피브로인 수용액이 적어도 약 20분 동안 적어도 약 10PSI의 압력 하에서 적어도 약 105℃(221℉)로 가열되며, 단백질 조성물이 8.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하고, 단백질 조성물이 물의 10%(w/w) 용액으로서 5 cP 미만의 수성 점도를 갖는다. 그러므로 본 발명은 여기에 기재된 하나 이상의 공정 단계를 포함하는 피브로인 유래 단백질 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

한 양태에서, 리튬 브로미드의 농도는 약 8.5M 내지 약 11M이다. 몇몇 양태에서, 리튬 브로미드의 농도는 약 9M 내지 약 10M, 또는 약 9.5M 내지 약 10M이다.

몇몇 양태에서, 리튬 브로미드를 함유한 피브로인 수용액은 적어도 약 107℃(225℉)로, 적어도 약 110℃(230℉)로, 적어도 약 113℃(235℉)로, 적어도 약 115℃(239℉)로, 또는 적어도 약 120℃(248℉)로 가열된다.

몇몇 양태에서, 리튬 브로미드를 함유한 피브로인 수용액은 적어도 약 12PSI, 적어도 약 14PSI, 적어도 약 15PSI, 또는 적어도 약 16PSI, 약 18PSI까지, 또는 약 20PSI까지의 압력 하에서 가열된다.

몇몇 양태에서, 리튬 브로미드를 함유한 피브로인 수용액은 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 45분, 또는 적어도 약 1시간, 몇(예를 들어, 12-24) 시간까지의 시간 동안 가열된다.

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은 물의 10%(w/w)의 용액에서 4 cP 미만의 수성 점도를 갖는다. 다양한 양태에서, 단백질 조성물은 물의 24%(w/w)의 용액에서 10 cP 미만의 수성 점도를 갖는다

몇몇 양태에서, 단백질 조성물은, 관찰될 수 있는 침전이 없이, 40%(w/w)에서 물에 용해될 수 있다.

몇몇 양태에서, 피브로인은 세리신으로부터 분리된 것이다.

몇몇 양태에서, 리튬 브로미드가 단백질 조성물로부터 제거되어 정제된 단백질 조성물을 제공한다. 다양한 양태에서, 단백질 조성물은, 예를 들어, 투석, 여과 또는 이들의 조합에 의하여 분리 또는 정제된 것이다.

다양한 양태에서, 단백질 조성물은 10%(w/w)까지, 15%(w/w)까지, 20%(w/w)까지, 25%(w/w)까지, 30%(w/w)까지, 35%(w/w)까지, 또는 40%(w/w)까지의 농도에서 조성물의 수용액을 초음파 처리하여도 겔화하지 않는다.

추가적인 양태에서, 단백질 조성물은 상기에 기재한 성질과, 세린, 글리신 및 알라닌 함량과 관련하여 상기에 기재한 아미노산 조성을 갖는다.

다양한 양태에서, 단백질 조성물은 박막으로 건조한 후에 재용해된다. 단백질 조성물은 용액에서 베타-병풍 단백질 구조가 없을 수 있다. 단백질 조성물은 적어도 5초의 초음파 처리 후에 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 용액에서 유지할 수 있다.

한 특정한 양태에서, 본 발명은 피브로인 수용액을 승압에서 가열하여 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 수용액이 리튬 브로마이드를 9-10M의 농도에서 포함하고, 피브로인 수용액이 적어도 약 30분 동안 약 15PSI 내지 약 20PSI의 압력 하에서 약 115℃(239℉) 내지 약 125℃(257℉)의 범위의 온도로 가열되며, 단백질 조성물이 6.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하고, 단백질 조성물이 물의 15%(w/w) 용액으로서 10 cP 미만의 수성 점도를 갖는다.

본 발명의 더 나아간 양태를 이하에서 설명한다.

본 발명은 천연 실크 피브로인 단백질과 화학적으로 구별되는 신규한 실크 유래 단백질(silk-derived protein; SDP)을 제공한다. SDP는 수용액에서 향상된 안정성을 갖는다. SDP는 여기서 기재된 단백질 조성물, 예를 들어 단백질 조성물의 수용액과 식품, 음료 또는 안과제제 성분을 조합하여 포함하는 식품 조성물, 음료 또는 안과 제제를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 용액은 약 0.01%(w/v) 내지 약 92%(w/v)의 SDP를 포함할 수 있다. 용액은 약 8%(w/v) 내지 약 99.9%(w/v)의 물일 수 있다.

한 양태에서, 향상된 용액 안정성을 갖는 SDP 물질은, 스포츠 음료, 영양 음료, 소프트 음료 또는 병에 담긴 물의 성분 또는 첨가제와 같이, 인간 또는 동물이 소비하는 음료에서 성분으로 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 향상된 용액 안정성을 갖는 SDP 물질은, 일일 식품, 시리얼 또는 가공 음식과 같은 식품에서 성분으로 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 향상된 용액 안정성을 갖는 SDP 물질은, 인공 눈물, 안구 윤활제, 리드 스크럽(lid scrub) 또는 치료용 제제와 같은 점안 제제에서 성분으로 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 피브로인 단백질의 가수분해, 아미노산 분해, 또는 이들의 조합을 유도하여, 상기 단백질의 평균 분자량을 약 100-200 kDa으로부터, 종래기술의 방법으로 제조된 실크 피브로인에 대하여는 약 30-90 kDa으로, 여기에 기재된 SDP 물질에 대하여는 약 30-50 kDa으로 감소시킨다. 결과로 얻어지는 폴리펩티드는 여기에 기재된 범위로 평균값이 되는 다양한 분자량의 펩티드의 무작위 모음일 수 있다. 더하여, 아미노산 화학이 표준 시험 방법에 의해 측정될 수 없는 수준으로 시스테인 함량을 감소시켜서 변경될 수 있다. 예를 들어, 세린 함량은 천연 피브로인에서 발견되는 수준으로부터 50%가 넘게 감소될 수 있는데, 이는 표준 시험 방법에 의해 측정하였을 때 전체 알라닌 및 글리신 함량의 5%(상대적인 아미노산 함량)를 증가시킬 수 있다. 방법은 피브로인 경쇄 단백질이 처리 후 뿐만 아니라 시료를 표준 SDS-PAGE 전기영동에 적용할 때에도 구분할 수 없는 단백질 조성물을 제공할 수 있다. 나아가, 얻어지는 SDP 물질은 처리 후 베타-병풍 단백질 2차 구조가 최소이거나 없고, 반면에 종래기술의 방법을 사용하여 제조된 실크 피브로인 용액은 현저한 양의 베타-병풍 2차 구조를 형성한다. 한 양태에서, SDP 물질은 40-60%(w/v) 리튬 브로미드(LiBr) 용액에서 오토클레이브 또는 오토클레이브와 유사한 조건(즉, 대략 120℃ 및 14-18PSI) 하에서 실크 피브로인 섬유를 처리하여 얻어질 수 있다.

몇몇 양태에서, 본 발명은 SDP를 성분으로 포함하는 식품 또는 음료 제품을 제공한다. SDP는 추가적인 단백질 함량을 제공하도록 기능할 수 있는데, 식품 또는 음료를 소비하는 인간 또는 동물에게 개선된 영양적 가치, 건강상의 혜택, 및/또는 치료적 이점을 제공한다. 한 양태에서, SDP는 물, 스포츠 음료, 에너지 음료, 또는 탄산 음료와 같은 음료에 포함된다. 또 다른 양태에서, SDP는 요거트, 에너지 바, 시리얼, 빵 또는 파스타와 같은 식품 제품에 포함된다.

식품 또는 음료 제품은 약 0.01 중량% 내지 약 92 중량%의 SDP와 같은 유효량의 SDP를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, SDP는 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 1 중량% 내지 약 10 중량%로 존재할 수 있다. 어떠한 특정 양태에서, SDP는 누에( Bombyx mori ) 피브로인으로부터 유래될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 인간 또는 포유동물의 건조 안구 질환의 치료용 안과 조성물을 제공한다. 조성물은 건조 안구 질환에 효과적인 양의 SDP를 포함하는 수용액일 수 있다. 예를 들어, 수용액은 약 0.01 중량% 내지 약 80 중량%의 SDP를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 수용액은 SDP를 약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.5 중량% 내지 약 2 중량%로 포함할 수 있다. 어떠한 특정 양태에서, 안과 조성물은 약 0,05%(w/v)의 SDP, 약 0.1%(w/v)의 SDP, 약 0.2%(w/v)의 SDP, 약 0.25%(w/v)의 SDP, 약 0.5%(w/v)의 SDP, 약 0.75%(w/v)의 SDP, 약 1%(w/v)의 SDP, 약 1.5%(w/v)의 SDP, 약 2%(w/v)의 SDP, 약 2.5%(w/v)의 SDP, 약 5%(w/v)의 SDP, 약 8%(w/v)의 SDP, 또는 약 10%(w/v)의 SDP를 포함할 수 있다. SDP는 누에( Bombyx mori ) 피브로인으로부터 유래될 수 있다.

다양한 양태에서, 안과 제제는 완화제, 완충제 및/또는 안정화제와 같은 추가적인 성분을 수용액에 포함할 수 있다. 완화제로는, 예를 들어, 히알루론산(HA), 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 덱스트란, 젤라틴, 폴리올, 카르복시메틸 셀룰로스(CMC), 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜(PG), 히프로멜로스, 글리세린, 폴리소르베이트 80, 폴리비닐 알코올, 또는 포비돈일 수 있다. 완화제는, 예를 들어, 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.2 중량% 내지 약 2 중량%로 존재할 수 있다. 한 특정한 양태에서, 완화제는 HA이다. 다양한 양태에서, HA는 제제에서 약 0.2 중량%로 존재할 수 있다.

안과 제제의 완충제 또는 안정화제는, 포스페이트로 완충된 살린, 보레이트로 완충된 살린, 시트레이트로 완충된 살린, 소듐 클로리드, 칼슘 클로리드, 마그네슘 클로리드, 포타슘 클로리드, 소듐 비카르보네이트, 아연 클로리드, 히드로클로르산, 소듐 히드록시드, 에데테이트 디소듐, 또는 이들의 조합일 수 있다.

안과 제제는 추가로 유효량의 항균성 보존제를 포함할 수 있다. 항균성 보존제는, 예를 들어, 소듐 퍼보레이트, 폴리쿼터늄-I(예를 들어, 폴리쿼드 ^® 보존제), 벤즈알코늄(BAK) 클로리드, 소듐 클로리트, 브리모니딘, 브리모니딘 퓨리트, 폴엑시토늄, 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한 안과 제제는 유효량의 혈관수축제, 항히스타민제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 혈관수축제 또는 항히스타민제는 나파졸린 히드로클로리드, 에페드린 히드로클로리드, 페닐에프린 히드로클로리드, 테트라히드로졸린 히드로클로리드, 페니라민 말레이트, 또는 이들의 조합일 수 있다.

한 양태에서, 안과 제제는 유효량의 여기서 기재된 피브로인 유래 단백질을 물과 하나 이상의 안과 성분과 함께 포함할 수 있다. 안과 성분은, 예를 들어, a) 폴리비닐 알코올, b) PEG-400 및 히알루론산, c) PEG-400 및 프로필렌 글리콜, d) CMC 및 글리세린, e) 프로필렌 글리콜 및 글리세린, f) 글리세린, 히프로멜로스 및 PEG-400, 또는 상기 성분들의 임의의 하나 이상의 조합일 수 있다. 안과 제제는 HP-구아, 보레이트, 칼슘 클로리드, 마그네슘 클로리드, 포타슘 클로리드, 아연 클로리드 등과 같은 하나 이상의 비활성 성분을 포함할 수 있다. 안과 제제는 또한, 소듐 클로리트(퓨리트 ^® 보존제(NaClO ₂ )), 폴리쿼드, BAK, EDTA, 소르브산, 벤질 알코올 등과 같은 하나 이상의 안과 보존제를 포함할 수 있다. 안과 성분, 비활성 성분 및 보존제는 약 0.1% 내지 약 5%(w/v), 예를 들어 약 0.25%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1%, 2%, 2.5%, 또는 5%, 또는 상기 수치들의 임의의 두 수치의 범위 내로 포함될 수 있다.

따라서, 본 발명은 천연 피브로인의 1차 아미노산 서열이 천연 실크 피브로인으로부터 변이된, 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 실크 유래 단백질(SDP) 조성물을 제공하는데, 이때, 피브로인 중쇄 및 피브로인 경쇄 간의 시스테인 디설피드 결합이 감소되거나 제거되고, 조성물이 천연 피브로인 단백질에 비해 40%를 초과하여 감소된 세린 함량을 가지며, 실크 유래 단백질의 평균 분자량이 약 96 kDa 미만이다.

또한 본 발명은 인간 또는 포유동물에서 안과 질환을 치료하기 위한 안과 제제를 제공하는데, 이때 안과 제제는 물과 상기에 기재된 SDP의 유효량을 포함한다. 나아가 본 발명은 인간 또는 포유동물에서의 안과 치료용의 안과 조성물을 제공하는데, 이때 안과 조성물은 물, 하나 이상의 완충제 및 안정화제, 및 상기에 기재된 SDP의 유효량을 포함한다.

SDP는 물에서 매우 안정하며, 저장수명의 용액 안정성이 용액 내의 천연 실크 피브로인보다 2배 이상이다. 예를 들어, SDP는 물에 매우 안정하며, 저장수명의 용액 안정성이 용액 내의 천연 실크 피브로인에 비해 10배 이상이다. SDP 물질은 수용액에 있을 때, 5% (50mg/mL) 농도로 용액을 음파처리 하여도 겔화하지 않는다. 다른 양태에서, SDP 물질은 수용액에 있을 때, 10% (100mg/mL) 농도로 용액을 음파처리 하여도 겔화하지 않는다.

SDP 물질은 천연 실크 피브로인 단백질에 비하여 피브로인 경쇄가 50% 넘게 제거되어 있다. SDP 물질은 상대적 아미노산 함량보다 약 8% 미만으로 세린 함량을, 또는 상대적 아미노산 함량보다 약 6% 미만으로 세린 함량을 가질 수 있다.

SDP 물질은 약 46.5%를 초과한 글리신 아미노산 함량을 가질 수 있다. SDP 물질은 약 30%를 초과한, 또는 약 30.5%를 초과한 알라닌 아미노산 함량을 가질 수 있다. SDP 물질은, 예를 들어, 단백질 조성물의 가수분해된 폴리펩티드를 HPLC 분석으로 결정하였을 때, 탐지되지 않는 시스테인 아미노산 함량을 가질 수 있다.

SDP 물질은 천연 실크 피브로인과 비교하여, 예를 들어, 하기의 실시예 8에 기재된 FTIR 분석에 의해 결정하였을 때, 90%, 95%, 또는 98%가 더 적게 베타-병풍 2차 단백질 구조를 형성할 수 있다.

본 발명은 추가적으로 인간 또는 포유동물에서 눈 치료 용도의 안과 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 상기에 기재된 SDP 물질의 유효량, 및 완충제 또는 안정화제를 함유하는 수용액을 포함한다.

본 발명은 더 나아가 인간 또는 포유동물에서 안과 질환의 치료를 위한 안과 제제를 제공하는데, 상기 조성물은 여기에 기재된 향상된 안정성을 갖는 SDP 물질의 유효량을 함유하는 수용액을 포함한다.

또한 본 발명은 식품, 음료, 또는 안과 성분을 여기에 기재된 피브로인 유래 단백질 조성물과 조합하는 것을 포함하는, 실크 단백질과 함께 음료 혼합물, 식품 조성물, 또는 안과 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

다음의 실시예들은 상기 발명을 설명하기 위한 것으로 그 범위를 좁게 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 통상의 기술자라면 실시예들이 본 발명이 실시될 수 있는 많은 다른 방법들을 제시하고 있음을 이해할 것이다. 다양한 변화와 변이가 본 발명의 범위 내에 있으면서도 만들어질 수 있다고 이해되어야 한다.

실시예

실시예 1. 실크 유래 단백질의 제조 및 로렌스 안정성 시험

재료. 누에 고치를 일본의 타지마 쇼지 사(Tajima Shoji Co., Ltd.)로부터 입수하였다. 리튬 브로미드(LiBr)을 에프엠씨 리튬 인코포레이티드(FMC Lithium, Inc., NC)로부터 입수하였다. 오토클레이브 장치를 투트나우어 사(Tuttnauer Ltd., NY)로부터 입수하였다. 3,500 달톤(Da)의 분자량 컷오프(MWCO) 투석 멤브레인을 써모사이언티픽 사(ThermoScientific, Inc., MA)로부터 입수하였다. 오크톤 브로미드(Br ^- )의 겹접촉 이온-선택적 전극을 아이에스이 오크톤 인스트루먼츠(ISE, Oakton Instruments, IL)로부터 입수하였다.

공정. 두 시료인 SDP 및 종래기술의 실크 피브로인을 도 1에 기재된 바에 따라 제조하였다. 간략히 설명하면, SDP를 번데기가 없는 절단된 누에 고치(고치당 3-5 절단)를 95℃로 가열된 0.3 중량%의 NaCO ₃ 를 함유한 탈이온수(diH ₂ O)로 고치의 그램당 233mL 물이 되도록 담그어 제조하였다. 고치를 이 용액에서 75분간 교반하여 세리신을 용해함으로써, 이를 실크 섬유로부터 분리하였다. 고치를 헹굼당 20분 동안 diH ₂ O의 희석액에 4번 세척하여, 세척된 실크 섬유로부터 잔류 세리신을 제거하였다. 섬유를 60℃에서 2시간 동안 대류식 오븐에서 건조하고, 무게를 재고, 추출된 섬유의 그램 당 4X LiBr 부피의 비율로 54 중량%의 물 내의 LiBr에 용해시켰다. 이 용액을 덮은 다음, 60℃에서 2시간 동안 대류식 오븐에서 따뜻하게 하여, 추출된 섬유의 용해를 촉진하였다. 용액을 오토클레이브 장치에 위치시키고, 오토클레이브 조건(121℃, 17PSI, 90-100% 습도)에 30분 동안 노출시켜, 피브로인 변이를 촉진하였다. 얻어진 용액을 실온으로 냉각시킨 다음, diH ₂ O로 5% 피브로인이 되도록 희석하고, 3,500 달톤 MWCO 멤브레인으로 투석하여 LiBr 염을 제거하였다. 오크톤 브로미드(Br ^- )의 겹접촉 이온-선택적 전극에서 가수분해된 피브로인 용액으로 측정하였을 때 Br ^- 이온이 1 ppm 미만이 될 때까지, diH ₂ O에서 여러 번 교환하였다. 용액을 1-5㎛ 공극 필터로 여과한 다음, 0.2㎛ 연마 필터로 여과시켰다. 이 산물을 도 2에서 "SDP 용액"으로 표시한다.

"대조군" 실크 피브로인 용액을 도 1에 설명한 대로 제조하여, 도 2에 나타난 "종래기술의 실크 피브로인 용액"을 제공하였다. 오토클레이브 단계를 제외하고는, 상기에 기재된 동일한 공정을 수행하였다. 각 시료로부터 시험 부피(5mL)를 분리된 20mL 유리 비이커에 놓고, 비이커를 호일로 밀봉하였다. 시료를 로렌스 안정성 시험에 투입하였다.

로렌스 안정성 시험은, 단백질 시험 수용액(5%(w/v), 50mg/mL)을 오토클레이브 장치의 챔버에 위치시킴으로써 수행한다. 오토클레이브를 121℃, 17PSI의 사이클로 30분간 97-100% 습도로 진행한다. 사이클이 완료된 후에, 용액을 냉각시키고 오토클레이브 챔버로부터 제거한다. 그 다음 용액을 흔들어서 용액의 겔화 거동을 관찰한다. 용액을 ∼10초 동안 흔들어서 겔화되면, 시료는 로렌스 안정성 시험에 불합격한 것이다. 시험의 불합격은 물질이 본질적으로 단백질 용액으로서는 불안정하다는 것을 의미한다.

로렌스 안정성 시험을 SDP 용액 및 종래기술의 실크 피브로인 용액에 대해 수행하였다. 종래기술의 실크 피브로인 용액 시료는 바로 겔화되었고, 따라서 로렌스 안정성 시험에 불합격하였다. 반대로, SDP 용액은 무한히 용액으로 유지되었고, 따라서 로렌스 안정성 시험을 통과하였다. 겔화가 없는 것은 SDP 용액의 제조에서 도 1에 나타낸 오토클레이브 단계를 채택한 사실에 따른 것일 수 있다. 서로 다른 시험 결과(겔화되지 않음 대 겔화됨)의 이미지를 도 2에서 보여준다.

실시예 2. 실크 유래 단백질의 분자량 분석

용해된 단백질의 분자량 분포에 대한 공정의 영향을 평가하기 위하여, SDP 용액 및 종래기술의 실크 피브로인 용액을, 단백질을 분자량에 따라 분리하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 적용하였다. 구체적으로, 각 시료의 15㎍을 소듐 도데실 설페이트 및 디티오트레이톨(바이오라드 사(Biorad Inc., CA)을 함유한 운동 완충액과 혼합하여, 각각 2차 폴딩 구조 및 디설피드 결합을 제거하였다. 그 다음 혼합물을 70℃로 5분간 가열하였다. 미리 캐스트된, 비스-트리스(Bis-Tris) 완충 염(라이프 테크놀로지스(Life Technologies, CA))를 함유한 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔에 혼합물을 2.5-200 kDa 분자량 사다리(라이프 테크놀로지스)와 나란히 적재한 다음, 바이오라드 파워팩 파워 서플라이(바이오라드 인코포레이티드(BioRad Inc., CA)) 상의 120V 전기장에 90분 동안 노출시켰다. 그 다음 겔을 제거하고, 쿠마지 블루 염색액에 12시간 동안 위치하여 단백질을 염색하고, diH ₂ O에서 6시간 동안 세척하였다. 그 다음 겔을 바이오라드 GS-800 눈금 농도계(바이오라드 인코포레이티드 )로 스캔하였다.

얻어진 겔은 도 3에 도시하였다. 결과에 따르면, SDP 용액을 제조하기 위해 사용된 공정은 평균 분자량을 150-200 kDa으로부터 80 kDa 미만으로 뚜렷하게 이동시킨다(도 3). 분자량의 이동은 원래의 천연 피브로인의 1차 및/또는 2차 구조가 변한 것을 의미한다. 더하여, 피브로인의 피브로인 경쇄가 오토클레이브 공정 후의 SDP에서는 나타나지 않는데(종래기술의 피브로인에 관한 2번 레인에서는 23-26 kDa에서 관찰됨), 단백질의 피브로인 경쇄 부분이 공정에 의해 분해되거나 또는 제거되었음을 의미한다. 이러한 결과는 오토클레이브 공정이 천연 피브로인 단백질을 천연 피브로인 단백질보다 더 작은 펩티드 절편을 갖는 새로운 물질로 변이시켰음을 보여준다. 공정은 피브로인 경쇄를 더 분해/변화시킨다. 이러한 변이는 이러한 화학적 변화의 결과로서 향상된 용액 안정성을 갖는 SDP 물질을 만들어낸다.

실시예 3. 실크 유래 단백질의 안정성 연구

종래기술의 피브로인의 안정성와 비교하여 오토클레이브 공정이 수득된 SDP의 안정성에 끼치는 기능적 영향을 더 알아보기 위하여, 실크 피브로인 단백질 겔화의 잘 연구된 모델을 모방한 것인 모델 왕 등(Wang et al.)의 문헌( Biomaterials 2008, 29(8):1054-1064)의 방법을 사용하여, 시료들을 분석하였다. 두 시료의 일정 부피(0.5mL, SDP 및 PASF)를 1.7mL의 깨끗한 원심분리 튜브에 가하고, 초음파 처리하였다(20% 진폭, 10Hz, 15초). 그 다음에 겔화를 가려내기 위하여 용액을 함유한 튜브를 겔 형성에 대한 영상으로 모니터하였다.

도 4A에 도시한 바와 같이, SDP 용액 시료는 겔을 형성하지 않았다. 심지어 음파처리 후 3개월 후에도, SDP 시료는 여전히 용액이었고 영상 검사에서 확인되는 단백질 응집이 없었다. 종래기술의 실크 피브로인 용액 시료는 음파 처리 후에 재빨리(2시간 내에) 겔화하였다. 겔화된 종래기술의 실크 피브로인을 도 4B에 도시한다. 이러한 결과는, 오토클레이브 공정이 종래기술의 피브로인을 새로운 물질로 변이시키고 얻어지는 SDP 물질에 안정성을 부여함을 의미한다.

실시예 4. 실크 수용액의 점도 프로파일에 대한 열처리의 영향

PASF 및 SDP의 물리화학적 성질을, 용액 점도에 대한 단백질 농도의 영향에 특히 주의하면서 조사하였다. 자파 등(Zafar et al.)의 문헌( Biomacromolecules 2015, 16(2):606-614)에서 실크 피브로인의 중쇄 및 경쇄가 그 유동학적 성질에서 구분된다는 것이 밝혀졌으므로, 따라서 PASF에서 이들 구성성분의 차등 분해 속도는 주어진 용액의 점도에 시간이 흐름에 따라 예측할 수 없는 변화를 가져올 것이다. 나아가, 자파 등에 의해 밝혀진 바와 같이, 전체 피브로인 단백질 농도의 점도에 대한 영향은 비선형이고, 정제된 피브로인 용액이 100mg/mL를 넘어서면서 급격하게 상승하며, 이에 따라 단백질 용액을 특정 용도에 사용할 수 있는 농도를 제한한다.

SDP가 만들어지는 아미노산 변이를 통해 이러한 제한이 극복될 수 있는지를 평가하기 위하여, 80-100mL의 PASF 또는 오토클레이브 처리된 SDP를 50-80mg/mL로 준비하였다. PASF를 오토클레이브 조건보다 낮은 수준으로 가열하는 것의 영향을 알아보기 위하여, PASF를 상기에 기재한 것처럼 덮혀진 반응기에서 225℉로 30분간 가열하였다. 정제된 용액을 층류 후드(베이커 스터릴가드(Baker Sterilgard) 56400, 등급 II) 내의 140 mm의 좁은 플라스틱 무게 보트에 ∼22℃에서 위치시켜, 증발을 촉진하였다. 일정 간격으로, 농축된 시료를 수집하여 단백질 함량(%(w/w)로 계산함)을 측정하고, 점도계(브룩필드(Brookfield) LVDV-E, 스핀들 00)로 점도를 측정하였다. 25℃에서 16mL의 시료 부피에 대해 측정하였을 때, 정확한 점도 측정이 가능한 토르크 범위를 가능케 하는 분당 스핀들 회전수(약 1-100rpm)에서 측정이 이루어졌다.

도 5에 요약한 바와 같이, PASF의 점도가 용액이 75mg/g를 넘어설 때 가파르게 증가하였다. 나아가, PASF는 피브로인 단백질이 비용해성으로 되기 시작하는 >200mg/g으로 농축될 수 없었다. 투석 전에 225℉로 가열된 PASF 용액은 용액 점도에 대한 가열의 영향을 보여주었다. 구체적으로, 가열된 PASF는 비가열된 PASF에 비해 어떠한 농도에서도 감소한 점도를 나타내었다. 대조적으로, SDP는 140mg/g 또는 그 이하의 농도에서 용액 농도에서 최소의 변화만을 나타내었다(도 5). 나아가, SDP의 점도는 PASF가 더 이상 용액 상태로 유지되지 않는 단백질 농도(예를 들어, 240mg/g)에서 ∼10cP 미만으로 유지되었다. 중요한 점은, SDP는 점도가 150cP 미만인 400mg/g을 초과하는 농도에서도 균일함을 유지하는 능력이 있었다.

따라서 SDP의 수용액은 4%(w/w)보다 높은 모든 농도에서 PASF와 비교했을 때 더 낮은 점도를 나타낸다. 덧붙여, PASF 용액의 경우 정확한 점도 측정이 불가능한 약 20%(w/w)에서 겔화가 시작되는 반면에, SDP 물질은 25%(w/w) 용액으로 농도가 증가하여도 겔화, 응집 거동, 또는 현저한 점도의 증가가 나타나지 않는다.

종합하면, 이러한 결과는, SDP의 제조를 위해 여기서 기재된 공정 관련 단백질의 변이가 고농축되고 저점도의 단백질 용액을 생산하는 데에 필요하다는 것을 분명하게 보여준다.

실시예 5. 피루보일 펩티드의 형성

상기에 설명된 도식 1에서 도시된 화학반응은 피루보일 펩티드를 생산한다. 피루보일 펩티드는 피루베이트로 분해되는데, 피루베이트는 표준 피루베이트 분석에 의해 바로 탐지될 수 있다. 열 및 압력의 적용(예를 들어, 오토클레이브에서의 환경)이 실크 피브로인 단백질 처리에서 피루보일의 생성을 촉진할 수 있음을 보이기 위하여, 실크 피브로인 용액(물에서 5%(w/v))을 상기에 기재된 종래기술의 방법으로 제조하였다. 그 다음에 물질을 열적으로 덮혀진 비이커(켐글라스(ChemGlass, NJ))에서 210℉까지의 특정 온도들에서, 또는 단백질 용액의 끓는점보다 바로 낮은 온도에서 가열하였다. 구체적으로, 종래기술의 실크 피브로인 단백질 용액을 ∼65℃(∼150℉), ∼90℃(∼200℉), 또는 ∼99℃(∼210℉)로 가열하고, 그 다음에 이들 온도에 도달하였을 때에 시료를 추출하여 비색법(피루베이트 분석 키트, MAK071, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 피루베이트 농도를 측정하였다.

피루베이트의 생성이 90℃ 및 99℃로 가열된 시료에서 증가하였다. 피루베이트는 99℃에서 50% 증가하였다(도 6A). 피루베이트로의 전환이 시간에 따라 더 증가하는지를 판단하기 위하여, 시료를 99℃로 가열하고 이 온도에서 30분간 유지하였다(도 6B). 가열의 유지는 피루베이트의 형성을 크게 증가시켜, 비가열된 시료에 비해 피루베이트를 4배가 넘게 증가시켰다. 이러한 결과는, 실크 피브로인 단백질을 가열하면, 피루베이트 분석에 의해 탐지되는 피루보일 함유 물질로의 화학적 전환이 있음을 의미한다. 이 데이터로부터, 오토클레이브 처리와 같은 더 극단적인 가열 환경에서, 실크 피브로인 단백질이 자극되어 훨씬 더 많은 정도로 피루베이트를 생성할 것이라는 결론을 내릴 수 있다. 이는 최종 SDP 산물이 종래기술의 실크 피브로인과 화학적으로 분명하게 다른 것라는 심층 증거이다.

실시예 6. 아미노산 프로파일 분석

9.3M LiBr 용액에 용해된 실크 피브로인 섬유를 가열하는 것이 아미노산 프로파일에 미치는 영향을 이온 교환 크로마토그래피(AOAC 공식 방법 994.12, 아미노 애씨즈 닷컴(Amino Acids.com, MN))으로 연구하였다. SDP 용액과 종래기술의 실크 피브로인 용액에 대해 실시예 1에 기재된 공정을 사용하여 시료를 제조하였다. 그 다음에 용액을 크로마토그래피에 의한 평가를 위해 유사 농도에 놓았다. 아미노산 세린, 글리신 및 알라닌의 실크 피브로인 단백질 1차 서열에서의 뚜렷한 구성과 2차 구조 형성에서의 핵심 역할을 고려하여, 이들 아미노산에 특별히 주의하였다.

SDP 용액 시료는 종래기술의 실크 피브로인 용액 시료에 비해 40% 더 적은 세린을 함유하고(도 7A), 글리신과 알라닌은 상응하는 수준으로 증가한 것으로 밝혀졌다(도 7B). 이러한 결과는 아미노산 함량의 현저한 변화를 의미하는데, 아미노산 함량의 변화는 오토클레이브 공정의 결과로서 다른(그리고 향상된) 화학적 및 물리적 성질을 만들어낸다. 이러한 결과는 또한 메이엔 등(Mayen et al.)의 문헌( Biophysical Chemistry 2015, 197:10-17)에 의하여 뒷받침되는데, 증가한 세린 함량이 실크 피브로인 단백질의 최초 응집을 증가시키는 반면에, 증가한 글리신 및 알라닌 함량을 갖는 실크 피브로인 단백질은 최초로 응집하기 위한 더 높은 문턱 에너지를 필요로 한다. 따라서, 세린을 감소시키고 알라닌 및 글리신 함량을 증가시킴으로써, 응집에 대한 경향(및/또는 가능성)을 감소시키거나 또는 제거하며, SDP의 더 큰 안정성을 가져온다.

실시예 7. 인공 눈물 조성물

SDP 용액을 안과 장애 또는 질환을 치료하는 용도의 인공 눈물을 조제하는 데에 사용하였다. 인공 눈물은 "안구 건조" 질환을 치료하는 데에 조제하여 사용할 수 있다. 또한 인공 눈물은 사고 또는 외과적 손상에 의한 눈의 부상을 치료하는 데에 조제하여 사용할 수 있다.

SDP를 인공 눈물 제제에 적용하는 것은 SDP가 그 제제의 퍼짐성을 증가시키기 때문에 특히 장점이 있다. SDP 함유 인공 눈물은 또한 그 용액 안정성으로 인해 극히 긴 저장수명을 갖는다. SDP 단백질의 뼈대에 위치한 친수성 및 소수성 아미노산 그룹의 블록 공중합체 배치는, 분자가 눈물막에서 수용성 및 비수용성 화학물질과 상호작용할 수 있도록 한다. 인공 눈물의 점안 제제의 성분으로 포함되었을 때, SDP 성분은 인공 눈물의 퍼짐성을 향상시키는 역할을 하며, 이는 환자에게 추가적인 편안함을 주고 제제에 약효의 지속을 부여한다. 종래기술의 실크 피브로인 용액의 응집 그룹은 이러한 퍼짐 성질에 필요하지 않으며, 따라서 이들 그룹을 제거하여 시간에 따라 단백질 산물의 용액 내 안정성을 향상시키는 것이 바람직하다.

인공 눈물의 향상된 퍼짐성을 인기 브랜드의 인공 눈물 제품과 SDP 성분을 사용하여 제조된 인공 눈물을 비교하여 실험하였다. 한 시험 방법을 사용하여 다양한 점안 제품의 습윤성에 대한 기계적 퍼짐의 효과를 평가하였다. 포스페이트 완충된 살린(PBS), 에이브이알(AVR)의 테라티어즈(TheraTears ^® ; TT) 인공 눈물, 에이엠오(AMO)의 블린크(Blink ^® ) 눈물 점안액, 알콘(Alcon)의 시스탄 발란스(Systane Balance ^® ; SB) 점안액, 및 SDP를 함유하는 제제를 실험에서 비교하였다. 참고로, PBS는 물에 100mmol의 PBS 염을 함유하고, TT는 물에 추가적인 완충염과 함께 0.25 중량%의 카르복시메틸 셀룰로스(CMC)를 활성성분으로 함유하며, 블린크는 물에 완충염과 함께 0.2 중량%의 히알루론산(HA)를 활성성분으로 함유하고, SB는 증강 부형제로서 HP-구아와 미네랄 오일을 완충염과 함께 가지면서 0.6 중량%의 프로필렌 글리콜(PG)를 활성성분으로 함유하며, SDP 용액은 1% (w/v)의 SDP와 완충염(즉, 137mM NaCl을 함유하는 0.01M 포스페이트 완충액)과 함께 0.25 중량%의 CMC를 함유하였다.

이 그룹의 비교된 제품들은 여러 완화제와 추가의 활성 성분-강화용 부형제를 함유하였다. 도 8은 SDP 성분의 함유가 인기 브랜드의 제제에 비해 4배 가까이 기계적 퍼짐성을 향상시킴을 보여준다. 이러한 퍼짐 후 향상은 안구 표면을 눈꺼풀로 훔쳐내는 것에 비교될 수 있다. 즉 SDP 성분은 환자에게 더 양호한 편안함을 주면서 제품의 효과 및 안정성을 향상시킨다. 나아가, 종래기술의 실크 피브로인 용액이 제품의 수명 동안에 겔화하여 응집하기 때문에, 종래기술의 실크 피브로인에 비해 SDP를 성분으로 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 응집물은 현행 미국 약전(USP) 규정(주사제의 입자상 물질: USP <788-789>)에 따른 안과 제제에서 허용되지 않는다.

실시예 8. 단백질 2차 구조의 분석

2차 구조 형성에 대한 오토클레이브 처리의 영향을 평가하였다. 5%(w/v) SDP 용액 및 5%(w/v) 종래기술의 실크 피브로인 용액(각각 100μL)을 14mm 직경의 실리콘 고무 표면에 적용하고(n=6), 수시간에 걸쳐 공기 건조되어 고체 필름이 되도록 하였다. 그 다음에 필름을 각각 4nm의 해상도의 16번의 스캔에서 ATR-FTIR(니콜렛(Nicolet) iS10, 써모사이언티픽(ThermoScientific, MA))으로 평가하였다.

또한 필름을 5시간 동안 물풀림 챔버에서 처리하였는데, 이 챔버는 100% 상대습도 환경을 만드는 물로 채워진 대야를 가진 진공 컨테이너이다. 수증기는 피브로인 단백질 필름의 2차 구조 형성을 유도하는데, 진 등(Jin et al.)의 문헌( Advanced Functional Materials 2005, 15:1241-1247)에서 보여지듯이 대부분 베타-병풍 구조이다. 그 다음에 필름 시료를 상기에 기재된 FTIR로 재분석하였다. 스펙트럼 분석 결과, SDP와 종래기술의 실크 피브로인 필름은 물질 처리 전에 유사한 IR 특징을 나타내었지만, SDP 물질은, 각각의 1624cm ^-1 및 1510cm ^-1 에서 IR 스펙트럼의 아미드 I 및 II 지역에서 잘 알려진 베타-병풍 흡수 피크가 나타나지 않는 것으로 보여지듯이, 처리 후에 베타-병풍 2차 구조를 형성하는 능력이 상실되었다(도 9A). 이러한 발견은 두 시료의 물질 구성이 분명하게 다름을 의미하는데, SDP 및 PASF 시료에서 아미노산 화학이 본질적으로 다르다는 것을 직접적으로 나타낸다.

2차 구조의 영향을 기능적으로 보여주기 위하여, 두 용액의 150mL 시료를 대류식의 깨끗한 공기 환경 내에 실온에서 48시간 동안 건조하였다. 이로부터 두 용액 간의 외관에 현저한 차이를 보여주는 고체 단백질 물질이 형성되었다(도 9B). 주목할 만하게, 오토클레이브 처리된 SDP 물질은, 투명하고 티 없이 깨끗한 PASF 물질과 비교하였을 때, 방향족 아미노산으로의 화학적 변화를 의미하는 더 짙은 노랑의 반투명을 나타내었다. 더하여, SDP 물질은 부피의 아랫 부분이 완전히 탈수되는 것을 방지하는 건조 표면을 형성하였고, 이에 따라 부분적으로 액체로 유지되었다. 이는 종래기술의 실크 피브로인 물질에서는 나타나지 않았는데, 이 물질은 완전히 건조되고 물리적으로 뒤틀려서 물결 모양의 물질로 되었다. 이러한 결과는, SDP 물질을 형성하는 오토클레이브 처리의 결과로, 물질의 기계적 성질에 분명한 변화와 이에 따른 화학적 상호작용이 있음을 의미한다.

오토클레이브 처리의 함수로서 용해도를 평가하기 위하여, 두 건조 물질의 시료의 무게를 재고, 탈이온수(diH ₂ O)에서 재구성하였다. SDP 물질에 대하여는, 거친 외부 표면을 나중에 벗겨내어 무게를 재었으며, 종래기술의 실크 피브로인에 대하여는 물질의 일부를 부수어 무게를 재었다. 두 시료에 대하여, 물질의 500mg을 25mL의 diH ₂ O(2%(w/v) 용액)에 가하고, 10분간 빠른 속도로 와동시켰다. 흥미롭게도, SDP 물질은 상기 diH ₂ O 부피에서 완전히 용해된 반면에, 종래기술의 실크 피브로인 물질은 극히 작은 양으로 용해되었다(도 9C). 이러한 결과는 물질의 용해도 및 용해도 화학이 오토클레이브 처리로 인하여 SDP 및 종래기술의 실크 피브로인 물질 간에 뚜렷하게 바뀌었음을 의미한다.

실시예 9. 용액 안정성에 대한 효소적 피브로인 절단의 영향

SDP의 증가된 안정성이 아미노산 변이의 직접적 결과인지 아니면 단지 가수분해에 의한 더 작은 피브로인 단백질의 생성에 기인한 것인지를 확인하기 위하여, 종래기술의 실크 피브로인(PASF)를, 쇼(Shaw)의 문헌( Biochem . J. 1964, 93(1), 45-54)에서 수행된 것과 같이, 세린 프로테아제 트립신으로 처리하여 피브로인을 효소적으로 분해하였다. 간략히 말하면, 소의 췌장으로부터 분리된 트립신(시그마-알드리치, T1426, MO)의 0.5-1.0mg/mL을 HEPES 완충염을 함유한 PASF 용액(78mg/mL)에 가하고, 혼합한 다음, 1, 2, 4 또는 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 2mM 페닐메틸술포닐 플루오리드(PMSF)를 가하여 반응을 중단시키고, 피브로인의 절단화 정도를 실시예 3에 기재된 1D-PAGE와 농도계에 의하여 측정하였다.

표 1에서 보여지듯이, 트립신 처리는 4시간까지 PASF의 평균 분자량을 급진적으로 감소시키는 데에 효과적임이 밝혀졌다. 그 다음에 이들 물질을 왕 등(Wang et al.)의 문헌(Biomaterials 2008, 29(8):1054-1064)에서 수행되고 기재된 것처럼 초음파 처리하여, 베타-병풍의 형성과 겔화를 개시시켰다. 도 10에 요약된 바와 같이, 트립신으로 PASF를 절단화 하면 겔화의 반응속도를 극적으로 가속화시킨다. 구체적으로, PASF를 1시간 트립신으로 처리하면 ∼40분의 이어지는 음파처리에 의해 겔 형성이 유도되고, 트립신에 4시간 동안 노출된 PASF에서 ∼60분까지 느려진다. 대조군의 PASF(비활성화된 트립신이 있는)는 시간에 따라 증가하는 불안정성을 나타내어, 대략 1300분까지는 최대의 베타-병풍 형성(550nm에서의 흡광도로 나타냄, 도 10)에 도달한다(데이터는 기재하지 않음). 대조적으로, 실크 유래 단백질(SDP)은, 550nm에서 최소의 변하지 않는 흡광도로 증명되듯이, 이 시간대에서 불안정성으로 변하는 경향을 보여주지 않았다(도 10). 이러한 결과는, 아미노산의 변이 없이 선택적 펩티드 결합을 효소적으로 절단하여 PASF를 절단화하는 것이 비효과적이고, 베타-병풍 형성, 불안정성 및 겔 형성을 방지하는 데에 사실상 역효과를 낸다는 것을 보여준다.

실시예 10. 피브로인 안정성에 대한 디설피드 결합의 영향

타나카 등(Tanaka et al.)의 문헌( Biochem Biophys Acta . 1999, 1432(1):92-103)에 의해 밝혀졌듯이, 피브로인 중쇄 및 경쇄의 2량체의 연결은 단일의 공유 디설피드 결합에 의해 존재한다. 2량체의 분리는 피브로인의 펩티드-펩티드 상호작용을 일으키는데, 베타-병풍 형성 및 겔화(나가카르 등(Nagarkar et al.), Phys. Chem. Chem . Phys. 2010, 12:3834-3844)에 선행하는 비용해성 단백질 응집으로 이어진다(슐하 등(Shulha et al.), Polymer 2006, 47:5821-5830). 따라서, 피브로인의 중쇄-경쇄 2량체의 파괴가 단백질 응집과 그에 따른 불안정성을 촉발하는지를 확인하기 위하여, PASF를 디설피드 결합 환원제인 디티오트레이톨(DTT, 시그마-알드리치, MO)로 0(대조군), 10, 또는 100mM에서 처리한 다음, 초음파 처리하여 베타-병풍 및 겔 형성을 일으켰다. 도 11에 도시된 바와 같이, 10mM DTT로 PASF의 디설피드 결합의 환원이 감속하였으나, 대조군 시료에 대해 상대적으로 550nm 흡광도가 증가함에 의해 보여지듯이, 불안정성을 억제하지 않았다. 이러한 효과는 100mM DTT에서 더 현저하였으나, 불안정성을 억제하는 데에는 여전히 비효과적이었다. 대조적으로, SDP는 변하지 않는 기저 흡광도에서 보여지듯이, 초음파 처리 후에 불안정성으로의 경향을 나타내지 않았으며, 이는 DTT의 추가에 의해서 영향을 받지 않았다(도 11). 종합하면, 이러한 결과는, 피브로인의 디설피드 연결이 PASF의 불안정성과 관련한 메커니즘에 관여하지만, 이들의 환원이 베타-병풍 형성 및 겔화를 방지하는 데에 효과가 없음을 의미한다.

실시예 11. 피브로인의 안정성은 리튬 브로미드의 존재에서 열을 필요로 한다

PASF에서 열을 매개로 한 아미노산의 변이가 리튬 브로미드를 필요로 하는지를 확인하기 위하여, PASF를 최종 수용액(리튬 브로미드가 없음)에서 가열하였을 때 유사한 안정성이 달성되는지를 확인하는 연구를 수행하였다. 이를 위하여, PASF를 50mg/mL 농도로 (추가적인 가열 없이) 제조하고, 그 다음에 실리콘 오일 열 교환 액(에이스글라스(AceGlass), 14115-05, NJ)을 적극적으로 순환시키는 가열기/냉각기(네스랩(Neslab), RTE-7, 써모사이언티픽(ThermoScientific), MA)에 연결된 덮혀진 반응 비이커(켐글라스(Chemglass), CG-1103-01, NJ)에서 가열하였다. 순환기를 리튬 브로미드 염이 없는 PASF의 끓는점 바로 아래의 온도인 ∼200℉로 설정하고, 15±1분 동안 안정화하였다. PASF(25mL)를 PTFE로 코팅된 교반 막대로 반응 비이커에서 배양하고 교반 플레이트(아이케이에이(IKA) C-MAG HS7, NC)에 위치시켜 용액 온도의 균일성을 확실하게 하였다. PASF의 온도는 가열 기간 동안 외부의 열전쌍(오메가(Omega) HH-603, 오메가 엔지니어링(Omega Engineering), CT)을 사용하여 적극적으로 모니터하였고, 시료(3mL)를 다음의 시간점에서 제거하였다.

그 다음에 뽑아낸 시료를, 왕 등(Wang et al.)의 문헌( Biomaterials 2008, 29(8):1054-1064)에 전에 기재된 바와 같이, 초음파 처리하여 베타-병풍 형성 및 겔화를 촉발시켰다. 이들 결과를 리튬 브로미드의 존재 하에 가열되었던 PASF와 비교하기 위하여, SDP도 별도로 초음파 처리하였고, 550nm의 흡광도를 종단적으로 모니터하여 피브로인 불안정성의 반응속도를 비교하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 열을 PASF에 가하면 실제로 기저 흡광도를 증가시키고, 이에 따라 비가열된 대조군 시료에 비해 불안정성을 증가시켰다. 나아가, PASF에 대한 열 노출의 시간(30분부터 120분까지)은 기저 흡광도에 반비례하였는데, 이는 SDP의 제조에서 리튬 브로미드의 존재가 이 후자의 용액에서 관찰되는 최소의 흡광도를 달성하는 데에 필요하다는 것을 의미한다(도 12). 나아가, 550nm 흡광도는 모든 가열된 PASF 용액에서 시간에 따라 계속해서 증가하였으나, 초음파 처리된 SDP 용액에서는 기저선으로부터 변화하지 않았으며, 이는 열처리 시료가 베타-병풍 형성을 진행하여 불안정하게 되었음을 분명하게 보여준다. 종합하면, 이러한 결과는, 리튬 브로미드가 없는 열을 매개한 PASF의 가수분해는, 여기에 기재된 SDP에서와 동일한 정도로 단백질 안정성을 촉진하는 아미노산 변이를 매개하기에는 부족함을 의미한다.

본 발명의 양태는 다음에 나열된 양태를 포함한다.

1. 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물에서, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 아미노산 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 4%가 다르고, 피브로인의 피브로인 중쇄 및 피브로인 경쇄 간에서의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 또는 제거되며, 상기 조성물이 천연 피브로인 단백질에 비해 25%를 초과하여 감소한 세린 함량을 가지고, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이고 선택적으로 20 kDa를 초과하는 단백질 조성물.

2. 제 1 양태에 있어서, 상기 단백질 조성물이 10% (w/w) 물의 용액으로서 4 cP 미만의 수성 점도를 갖는, 단백질 조성물.

3. 제 1 양태 또는 제 2 양태에 있어서, 상기 단백질 조성물이 24% (w/w) 물의 용액으로서 10 cP 미만의 수성 점도를 갖는, 단백질 조성물.

4. 제 1 양태 내지 제 3 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 40%(w/w)에서 침전이 없이 물에 용해되는, 단백질 조성물.

5. 제 1 양태 내지 제 4 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 10%(w/w)까지의 농도에서 상기 단백질 조성물의 수용액의 초음파 처리에서 겔화되지 않는, 단백질 조성물.

6. 제 1 양태 내지 제 5 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 8% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하는, 단백질 조성물.

7. 제 1 양태 내지 제 6 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 6% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하는, 단백질 조성물.

8. 제 1 양태 내지 제 7 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 46.5%보다 많은 글리신 아미노산을 포함하는, 단백질 조성물.

9. 제 1 양태 내지 제 8 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 48%보다 많은 글리신 아미노산을 포함하는, 단백질 조성물.

10. 제 1 양태 내지 제 9 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 30%보다 많은 알라닌 아미노산을 포함하는, 단백질 조성물.

11. 제 1 양태 내지 제 10 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 31.5%보다 많은 알라닌 아미노산을 포함하는, 단백질 조성물.

12. 제 1 양태 내지 제 11 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 박막으로 건조된 이후 물에 완전히 재용해되는, 단백질 조성물.

13. 제 1 양태 내지 제 12 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 수용액에서 베타-병풍 단백질 구조가 없는, 단백질 조성물.

14. 제 1 양태 내지 제 13 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 적어도 5초의 초음파 처리 후에 550nm에서 0.25 미만의 수용액에서의 흡광도를 유지하는, 단백질 조성물.

15. 제 1 양태 내지 제 14 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 조성물이 40%(w/w)에서 물에 완전히 용해되는, 단백질 조성물.

16. 제 1 양태 내지 제 15 양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 6%가 다르고, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이고 약 30 kDa보다 크며, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물이 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지하는, 단백질 조성물.

17. 수용액에서 향상된 안정성을 갖는 피브로인 유래 단백질 조성물에서, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 천연 실크 피브로인으로부터 변이되고, 피브로인 중쇄 및 피브로인 경쇄 간에서의 시스테인 디설피드 결합이 환원되거나 또는 제거되며, 상기 피브로인 유래 단백질의 평균 분자량이 약 100 kDa 미만이고 약 25 kDa보다 크며, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물이 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지하는, 단백질 조성물.

17A. 제 1 양태 내지 제 15 양태 중 어느 하나의 하나 이상의 요소를 포함하는, 제 17 양태의 피브로인 유래 단백질 조성물.

18. 제 17 양태 또는 제 17A 양태에 있어서, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 1차 아미노산 서열이 천연 실크 피브로인으로부터 변이되어, 상기 1차 아미노산 서열이 세린, 글리신 및 알라닌의 조합된 아미노산 함량에 있어서 천연 피브로인과 적어도 5%가 다르고, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물의 평균 분자량이 약 70 kDa 미만이며, 상기 피브로인 유래 단백질 조성물이 5초의 초음파 처리 후에 적어도 2시간 동안 550nm에서 0.25 미만의 흡광도를 유지하는, 피브로인 유래 단백질 조성물.

19. 피브로인 수용액을 승압에서 가열하여 단백질 조성물을 제공하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된 단백질 조성물에서, 상기 피브로인 수용액이 리튬 브로마이드를 적어도 8M의 농도에서 포함하고, 상기 피브로인 수용액이 적어도 약 20분 동안 적어도 약 10PSI의 압력 하에서 적어도 약 105℃(221℉)로 가열되며, 상기 단백질 조성물이 8.5% 미만의 세린 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 단백질 조성물이 물의 10%(w/w) 용액으로서 5 cP 미만의 수성 점도를 갖는, 단백질 조성물.

19A. 제 1 양태 내지 제 15 양태 중 어느 하나의 하나 이상의 요소를 포함하는, 제 19 양태의 단백질 조성물.

20. 제 1 양태 내지 제 19 양태 중 어느 하나의 단백질 조성물, 및 식품 또는 음료 성분을 포함하는, 식품 또는 음료 조성물.

특정 양태가 개시된 양태 및 실시예에 대한 참조로 상기에 기재되었지만, 이러한 양태는 단지 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 다음의 청구범위에 기재된 바와 같은 더 넓은 측면에서 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 본 분야의 통상의 기술에 의하여 변화와 조절이 있을 수 있다.

여기서 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허문서는 마치 개별적으로 참조로 인용된 것처럼 본 명세서에 참조로 인용된다. 여기서의 기재와 일치하지 않는 어떠한 한정도 이들로부터 이해되어서는 안 된다. 본 발명이 여러 특정한 및 바람직한 양태와 기술을 참조하여 기재되었다. 하지만 본 발명의 정신과 범위 내에 있으면서도 많은 변이와 변형이 만들어질 수 있다고 이해되어야 한다.