저항원성 식품 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 저항원성 식품

저항원성 식품 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 저항원성 식품 {Method for preparing low antigenic food and hypoantigenic food produced thereby}

본 발명은 저항원성 식품 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 알레르기 유발 식품의 항원성을 감소시키는 방법, 저항원성 당단백질의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 저항원성 식품과 저항원성 당단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

알레르기 질환은 생활이 윤택해 질수록 증가되고 있는 전 세계적인 현상 중의 하나이며, 우리나라에서도 알레르기는 이미 암, 만성 성인병과 더불어 주요 만성질환의 하나로 자리잡고 있다. 특히 섭취한 식품이나 식품첨가물에 의한 이상반응 중 면역반응에 의해 일어나는 질환인 식품 알레르기는 구토, 설사 등의 위장관 증상과 두드러기, 아토피성 피부염과 같은 피부증상, 그리고 기관지 천식, 전신성의 anaphylactic shock에 이르기까지 증상이 매우 다양하고 심할 경우 사망에까지 이르게 되며, 또한 환자가 급격히 증가하고 있어 식품 알레르기 예방과 치료법의 개발이 시급히 요구되고 있다.

식품 알레르기의 예방법으로는 알레르기원의 섭취를 제한하는 방법이 보편적이지만, 알레르기원이 대부분 단백질 식품 (계란, 우유, 콩 등)에 존재하고 영양가치가 높을 뿐 아니라 일상생활에서 섭취 빈도가 높다는 점을 감안할 때 무조건적인 섭취제한은 영양문제를 야기할 수 있기 때문에 섭취제한을 하지 않더라도 알레르기를 유발하지 않는 알레르기 저감화 기술의 개발이 요구된다. 단백질 분해효소에 의한 단백질 분해, 고온에서의 열처리, 알칼리 처리와 열처리의 혼용 등 알레르기 항원성을 감소시키기 위해 다양한 방법들이 시도되고 있지만 식품의 기호성, 기능성 저하, 식품의 품질 저하 등의 문제가 발생하기 때문에 이에 대한 보완 및 대체기술의 개발이 필요하다.

당단백질은 당쇄가 단백질의 특정 아미노산에 복합체로 이루어진 생체분자로서 동식물의 세포조직에 널리 분포하고 있으며, 주로 세포외벽에 많이 존재하면서 수많은 세포표면의 반응에 관여한다. 또한 세포벽의 중요한 구성요소로서 외부 자극에 대한 방어 역할을 담당한다.

계란, 땅콩, 콩은 알레르기를 유발하는 대표적인 식품이지만, 우수한 영양적 가치를 갖고 있어 식품산업에서 매우 중요한 식품소재이기 때문에 알레르기 예방을 위해 섭취를 제한하거나 배제하기는 쉽지 않다. 따라서 국민건강 증진과 식품산업의 발전을 위해 낮은 알레르기 항원성을 나타내면서도 본래의 우수한 영양적 가치를 그대로 지닌 저항원성 식품 소재의 개발이 요구된다.

이에 본 발명자들은 알레르기 유발 식품의 항원성 저하 방법에 관하여 연구하던 중, 많은 알레르기 유발 식품의 알레르기원이 당단백질인 것에 착안하여 당단백질의 특정 당쇄구조의 변형(특정 당의 제거)을 통해 항원성을 저하시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 식품 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 오보뮤코이드(ovomucoid), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h)로 이루어진 군에서 선택된 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 당단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 당단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저항원성 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 식품조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 저항원성 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 화장료조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 식품 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 식품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 오보뮤코이드(ovomucoid), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h)로 이루어진 군에서 선택된 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 당단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 당단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 화장료조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합된 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 식품의 제조방법을 제공한다.

알레르기 유발 식품으로는 전란, 콩, 땅콩 등이 알려져 있으며, 이들에 포함되어 있는 당단백질이 알레르기를 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 당단백질은, 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만, 오브알부민, 오보뮤코이드(ovomucoid), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h2) 등이 알려져 있다. 상기 오보뮤코이드는 난백(卵白)에 포함된 단백질의 일종으로 난백단백질의 약 11%를 차지하며, 대표적인 당단백질로 20 내지 25%의 당을 함유하고 있다. 오보뮤코이드는 난백 단백질의 알레르기를 유발하는 주요 항원이다. 상기 베타-콘글리시닌(β-conglycinin)은 콩에 함유되어 있는 당단백질이고, 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h2)은 땅콩에 함유되어 있는 당단백질이다.

본 발명의 오보뮤코이드는 그 유래 조류의 종류에 상관없이 모든 종류의 조류의 난백에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 식용으로 사용되는 조류 알의 난백에서 유래된 것 일 수 있으며, 상기 난백은 예를 들어 계란, 메추리알, 타조알 또는 오리알의 난백일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 계란의 난백일 수 있다.

또한 본 발명의 오보뮤코이드는 건조, 분말화 등의 가공 공정을 거친 것을 모두 포함하며, 바람직하게는 오보뮤코이드 분말일 수 있다. 본 발명의 오보뮤코이드는 조류의 알에서 직접 분리한 것을 사용할 수 있으며, 또는 상업적으로 판매되는 오보뮤코이드 분말 등을 구입하여 사용할 수 있다.

알레르기 유발 식품의 당단백질로부터 제거되는 당은 이에 한정하지는 않지만, 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid), 자일로스(xylose), 아라비노오스(arabinose)일 수 있고, 더 바람직하게는 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid) 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)일 수 있다.

구체적으로 본 발명의 오보뮤코이드로부터 제거되는 당은 이에 한정되지는 아니하나, 특정 구조의 당쇄에 포함된 말단의 당을 포함할 수 있으며, 이는 하기 (1) 내지 (4) 중 하나 이상의 종류의 당일 수 있다.

(1) Man α1-3 (Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 구조를 가지는 당쇄 말단의 만노오스(Man)

(2) GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 또는 GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 구조를 가지는 당쇄 말단의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)

(3) (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) 또는 (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) 구조를 가지는 당쇄 말단의 N-아세틸뉴라민 산(NeuAc)

(4) (Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1- 4 GlcNAc) 구조를 가지는 당쇄 말단의 갈락토오스(Gal)

본 발명의 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 방법은 당단백질에 엑소글라이코시다제(exoglycosidase)를 처리하는 것이다.

항원성은 항체의 생성을 유발할 수 있는 능력을 말하며, 본 발명의 저항원성 당단백질은 체내 흡수 시 항체생성 가능성이 일반 알레르기 유발 당단백질보다 낮아 알레르기 유발 가능성이 낮은 당단백질을 말한다.

알레르기 유발 당단백질, 구체적으로 오보뮤코이드(ovomucoid), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h)로 이루어진 군에서 선택된 당단백질와 엑소글라이코시다제(exoglycosidase)를 혼합하면, 상기 당단백질에 포함된 당 잔기의 가수분해가 일어나며, 상기 당단백질의 당 잔기 제거에 의하여 당단백질의 항원성이 감소한다. 이러한 점은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.

상기 엑소글라이코시다제는 자일로시다제(xylosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 만노시다제(mannosidase), 갈락토시다제(galactosidase), N-아세틸글루코사미니다제(N-acetylglucosaminidase), 시알리다제(sialidase)일 수 있고, 더 바람직하게는 만노시다제(mannosidase), 갈락토시다제(galactosidase), N-아세틸글루코사미니다제(N-acetylglucosaminidase), 시알리다제(sialidase)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 N-아세틸글루코사미니다제(N-acetylglucosaminidase)일 수 있다.

또한, 상기 엑소글라이코시다제는 구입하여 사용하거나, 합성 또는 재조합 벡터로 형질전환한 균주에서 정제하여 사용할 수 있고, 엑소글라이코시다제를 분비하는 미생물을 직접적으로 사용할 수도 있다. 엑소글라이코시다제를 분비하는 미생물은 Streptococcus pneumonia , Aspergillus oryzae , Pseudomonas fluorescens , Escherichia coli , Kluyveromyces lactis , Bacteroides fragillis , Saccharomyces fragillis, Xanthomonas manihotis , Aspergillus niger 일 수 있다. S. pneumonias 는 N-acetylglucosaminidase 및 galactosidase를 분비할 수 있고, A. oryzae , P. fluorescens 는 N-acetylglucosaminidase를 분비하며, E. coli , K. lactis , B. fragillis , S. fragillis 는 galactosidase를 분비한다. 또한, X. manihotis 및 A. niger 는 mannosidase를 분비한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 알레르기 유발 식품의 당단백질 중에서 오보뮤코이드를 만노시다제(mannosidase), 갈락토시다제(galactosidase), 시알리다제(sialidase) 및 N-아세틸글루코사미니다제(N-acetylglucosaminidase)로 각각 처리하여 오보뮤코이드에 결합된 만노오스, 갈락토오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸뉴라민산을 제거하는 공정을 통해 오보뮤코이드의 항원성이 감소하는 것을 확인하였다. 그 결과 IgE와 IL-4 생성 증가가 오보뮤코이드을 처리한 대조군보다 상기 당들을 제거한 실험군들이 유의적으로 적었다(실시예 4, 도 5, 6 참조).

따라서 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합된 당을 제거하면, 당단백질의 항원성을 감소시킬 수 있고, 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합된 당을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 저항원성 식품을 제조할 수 있다. 바람직하게는 오보뮤코이드와 결합된 당을 제거하는 제조방법에 의해 저항원성 오보뮤코이드를 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 기존 오보뮤코이드에 결합되어 있는 당쇄 구조의 종류와 본 발명의 저항원성 오보뮤코이드의 당쇄 구조를 HPLC를 통하여 분석하였다. 그 결과 본 발명의 저항원성 오보뮤코이드는 Man α1-3 (Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 구조를 가지는 당쇄 말단의 만노오스(Man); GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 또는 GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 구조를 가지는 당쇄 말단의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc); 또는 (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) 또는 (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) 구조를 가지는 당쇄 말단의 N-아세틸뉴라민 산(NeuAc); 또는 (4) (Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) 구조를 가지는 당쇄 말단의 갈락토오스(Gal)이 제거된 것을 확인하였다.

본 발명의 당이 결손된 당단백질은 당단백질의 말단에 결합된 하나 이상의 종류의 당이 결손된 것을 특징으로 하며, 이로 인하여 알레르기를 일으키는 항원성이 감소된 특징을 가진다. 이러한 특정 구조의 당쇄의 말단 당이 제거된 당단백질은 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.

본 발명의 저항원성의 당단백질은 각종 당 분해 효소의 처리 등 공지의 당쇄공학적 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 오보뮤코이드(ovomucoid), 베타-콘글리시닌(β-conglycinin), 아라 h1 (Ara h1) 및 아라 h2 (Ara h)로 이루어진 군에서 선택된 당단백질에 결합되어 있는 당을 제거하는 단계를 포함하는 저항원성 당단백질의 제조방법을 제공한다.

또한 상기 방법에 의해 제조된 저항원성 당단백질을 제공한다.

본 발명의 저항원성 당단백질은 본 발명의 저항원성 당단백질의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 저항원성 당단백질은 건조, 분말화 등의 가공 공정을 거친 것을 모두 포함하며, 바람직하게는 당단백질 분말, 가장 바람직하게는 오보뮤코이드 분말일 수 있다.

본 발명의 저항원성 당단백질은 항원성이 매우 낮아 알레르기 유발이 없으며, 동시에 당단백질 고유의 우수한 영양적 가치를 그대로 유지하고 있어, 식품 또는 화장료 조성물 제조에 원료로 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 저항원성 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 저항원성 당단백질을 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(발효음료, 알코올성 음료 포함), 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류 및 면류, 과자류, 유제품, 레토르트 식품, 냉동식품 등에 본 발명의 저항원성 당단백질을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 저항원성 당단백질을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 저항원성 당단백질을 식품 조성물에 사용할 경우 상기 저항원성 당단백질을 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며 생리학적으로 허용 가능한 당류, 유기산 및 유기 중합체와 함께 사용될 수 있으며 상기 당류에는 정백당, 만니톨, 포도당, 솔비톨, 자일리톨, 이노시톨, 유당 및 과당을 포함할 수 있으며 상기 유기산은 시트르산, 아스코브빈산 그리고 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 저항원성 당단백질의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 저항원성 당단백질을 식품의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 20 내지 95 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

또한 본 발명은 본 발명의 저항원성 당단백질을 유효성분으로 포함하는 저항원성 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 저항원성 당단백질을 0.01 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 본 발명의 저항원성 당단백질을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있으며 상기 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알콜, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알콜 및 유동 파라핀 등을 포함 할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합된 당을 제거하여 당단백질의 항원성을 감소시키는 방법을 발견하였고, 이에 따라 저항원성 당단백질을 제조할 수 있는 바, 본 발명의 상기 당단백질은 알레르기 유발 가능성이 매우 낮으며, 동시에 고유의 영양가치는 그대로 유지하므로, 고 영양의 식품, 화장료 제조에 효과적이다.

도 1은 오보뮤코이드(OM)의 구성당을 분석한 결과이다(Gal: 갈락토오스, Man: 만노오스, GlcN: 글루코사민, NeuAc: N-아세틸뉴라민산).
도 2는 오보뮤코이드(OM)의 구성당을 amide column을 이용하여 HPLC로 분석한 결과 그래프이다((A): 2-아미노벤즈아미드가 표지된 glucose homopolymer standard 그래프; (B): 오보뮤코이드 올리고당의 N-glycosylation profile).
도 3은 HPLC로 분석된 오보뮤코이드 올리고당의 분자량을 matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)을 통하여 측정한 결과 그래프이다((A): 2-아미노벤즈아미드로 표지된 오보뮤코이드의 올리고당 분석결과, (B) 과메틸화된 오보뮤코이드의 올리고당 분석 결과).
도 4는 당분해효소(exoglycosidase) 처리 후 오보뮤코이드의 올리고당 변화를 HPLC를 통하여 분석한 결과 비교 그래프이다((A): 미처리 오보뮤코이드의 올리고당, (B): galactosidase 처리 오보뮤코이드의 올리고당, (C): mannosidase 처리 오보뮤코이드의 올리고당, (D): N-acetylglucosaminidase 처리 오보뮤코이드의 올리고당, (E): sialidase 처리 오보뮤코이드의 올리고당).
도 5는 당분해효소(exoglycosidase) 처리 오보뮤코이드의 면역에 의한 총 IgE 생산량을 측정한 결과 그래프이다(Nor: 면역반응 미유도군, OM: 미처리 오보뮤코이드로 면역반응을 유도한 군, G-OM: galactosidase 처리 오보뮤코이드로 면역반응을 유도한 군, M-OM: mannosidase 처리 오보뮤코이드로 면역반응을 유도한 군, N-OM: N-acetylglucosaminidase 처리 오보뮤코이드로 면역반응을 유도한 군, S-OM: sialidase 처리 오보뮤코이드로 면역반응을 유도한 군).
도 6은 당분해효소(exoglycosidase) 처리 오보뮤코이드로 면역한 마우스의 비장세포를 각각의 항원으로 재자극하여 생산되는 cytokine (IL-4)을 측정한 결과그래프이다. (Media: 재자극을 유도하지 않은 군, OM: 미처리 오보뮤코이드로 재자극을 유도한 군, G-OM: galactosidase 처리 오보뮤코이드로 재자극을 유도한 군, M-OM: mannosidase 처리 오보뮤코이드로 재자극을 유도한 군, N-OM: N-acetylglucosaminidase 처리 오보뮤코이드로 재자극을 유도한 군, S-OM: sialidase 처리 오보뮤코이드로 재자극을 유도한 군).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

오보뮤코이드(Ovomucoid, OM)의 구성당 분석

OM(Sigma-Aldrich, 미국) 1 mg에 4 N HCl을 가하고, 100℃에서 4시간동안 반응시켰다. 상온에서 식힌 시료를 Speed-vac으로 건조시키고 정제수를 이용하여 2회 더 건조과정을 반복하였다. 50 ul의 정제수로 시료를 녹인 후 50 pmol에 해당하는 양의 OM을 injection하였다. CarboPac PA1(Dionex, 미국) 컬럼을 이용하여 이동상 A: 200 mM NaOH와 B: DW으로 80분간 0.5 ml/min의 조건으로 HPAEC-PAD (ICS-3000, Dionex, 미국)를 이용하여 분석하였다. 분석은 3회 반복하여 평균값과 표준편차를 구하였다.

OM의 구성당을 분석한 결과, [도 1]에서 보는 바와 같이 OM에는 mannose (576.9±6.7 pmol)와 N-acetylglucosamine (1219.7±3.0 pmol)이 가장 큰 비율을 차지하고 있으며, galactose (167.8 ± 2.8 pmol)와 NeuAc (28.7 ± 0.5 pmol)가 소량 존재함을 알 수 있었다.

<실시예 2>

오보뮤코이드의 올리고당 분석

<2-1> 효소처리에 의한 올리고당 분리

1 mg의 OM을 0.01 M Tris-HCl (pH 8.0)으로 용해한 후 100℃에서 2분간 열처리하여 변성시키고 10 ul trypsin (1 mg/ml, Milli Q water), 10 ul chymotrypsin (1 mg/ml, Milli Q water), 1 ul 1 M CaCl ₂ 를 가한 후 37℃에서 반응시켜 글라이코펩타이드화하고 이를 건조하였다. 건조시킨 시료에 30 ul 0.5 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0)를 가하고 glycoamidase A를 20 ul(1 mU/100 ul)씩 가한 후 37℃에서 반응시켜 펩타이드로부터 당을 분리하고 이를 건조하였다.

<2-2> 2-Aminobenzamide(2-AB) labeling 및 HPLC에 의한 올리고당 분석

<2-1>에서 효소반응이 완료된 시료를 carbograph (SPE Carbo, GRACE)를 통하여 올리고당만을 분리한 후, 건조한 시료 1 mg에 20 ul 2-AB labeling solution (5 mg anthranilamide, 6 mg sodium cyanoborohydride, 70 ul DMSO, 30 ul acetic acid)을 가하여 용해시킨 후 65℃에서 3시간 동안 반응시켰으며, 반응 종료 후 cellulose column (cellulose C6413, Sigma-Aldrich, 미국)을 통해 시약을 제거하고 0.45 um filter syringe를 이용해 여과하였다. 시료 4 ug을 취하여 20 ul 용매 A (50 mM ammonium formate, pH 4.4), 80 ul 용매 B (acetonitrile, ACN)에 녹인 후 50 ul (2 ug)를 HPLC에 injection하였으며, 이때 TSK-gel amide 80 column (sigma, 미국)을 사용하여 이동상 A와 B로 160분간 0.4∼1 ml/min의 조건으로 분석하였다.

Amide column (TSK-GEL Amide-80, TOSOH, 일본)을 이용하여 OM을 HPLC로 분석한 결과 [도 2]에서 보는 바와 같이 20개의 분리된 peak를 확인할 수 있었다 (B). 이들의 retention time으로부터 glucose homopolymer standard와 비교하여 각각의 peak가 갖는 GU (glucose unit) 값을 구하였다 [표 1]. 이들의 GU값을 Glycobase (http://glycobase.nibrt.ie/glycobase/show_nibrt.action)에 보고된 올리고당들과 비교하여 그 구조를 예측하였다.

<2-3> Permethylation 및 MALDI-TOF mass에 의한 올리고당 분석

<2-1>에서 효소반응이 완료된 시료를 carbograph (SPE Carbo, GRACE, 미국)를 통하여 올리고당만을 분리한 후, 건조한 시료 50 ug에 permethylation solution (90 ul DMSO, 2.7 ul Milli Q water, 35 ul iodomethane)을 가하여 용해하였다. 이를 NaOH bead가 채워져 있는 micro spin column에 흘리고 400xg, 1분간 원심분리한 후 flow through를 회수하여 다시 micro spin column에 넣고 400xg, 1분간 원심분리하였으며, 이 과정을 8회 반복하였다. 마지막으로 micro spin column에 ACN 150 ul를 넣고 400xg, 1분간 원심분리하여 flow through를 모두 회수하였다. 모아진 flow through에 chloroform 400 ul, 500 mM NaCl 1 ml를 첨가하여 shaking 후, 200xg에서 1분간 원심분리하여 상등액을 제거하였으며, 500 mM NaCl 1 ml를 다시 가하고 shaking한 후 원심분리하여 하층액을 취하였다. 이를 건조시킨 후 50% methanol 4 ul를 가하여 용해하였고 DHB matrix와 1:1 비율로 혼합한 후 MALDI-TOF plate(Bruker Daltonics, 독일)에 올려놓고 충분히 건조시킨 후 mass(ULTRAflex III, Bruker Daltonics, 독일)를 측정하였다.

2-AB 표지된 OM과 permethylation시킨 OM을 각각 일정량 취하여 MALDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 측정한 결과 ([도 3] 참조) HPLC (TSK-gel amide 80 column)를 통해 구한 GU 값에 대응하는 대부분의 분자량을 찾아낼 수 있었다. 그 결과 complex type의 올리고당만이 존재함을 확인하였다. Mono-, penta-antennary 구조의 올리고당을 확인하였고 이중 일부가 galactose와 NeuAc를 포함함을 확인하였다([표 1] 참조). M13, M14, M15, M17, M18, M19, M20의 구조는 glycobase에 아직 보고되지 않은 구조로, 각각의 분자량과 exoglycosidase 처리시 얻어진 패턴을 이용하여 구조를 예측하였다.

^a Glycobase에 보고되어 있지 않은 구조로, exoglycosidase 처리하여 얻은 결과와 MALDI-TOF의 결과를 이용하여 예측하였다.

^b NeuAc가 있는 구조는 positive mode로는 잘 측정되지 않으며, 이는 permethylation한 올리고당으로부터 확인하였다.

nd: not detected

< 실시예 3>

오보뮤코이드의 당쇄구조 변형

<3-1> Exoglycosidase 처리에 의한 오보뮤코이드 당쇄구조 변형

OM에 결합되어 있는 당쇄의 구조 변형을 위해 exoglycosidase를 처리하였다. 구체적으로는 말단의 galactose를 가수분해하는 galactosidase, mannose를 가수분해하는 mannosidase, GlcNAc을 가수분해하는 N-acetylglucosaminidase, NeuAc를 가수분해하는 sialidase를 사용하였다. Galactosidase 반응조건은 11 mg의 OM에 997.5 ul의 50 mM sodium phosphate (pH 6.0)를 가하고 galactosidase 2.5 U/2.5 ul를 가한 후, 37℃에서 overnight incubation 하였다. Mannosidase 반응 조건은 11 mg의 OM에 982 ul의 50 mM sodium acetate (pH 4.5)를 가하고 mannosidase 2.5 U/18 ul를 가한 후, 37℃에서 overnight incubation 하였다. N-acetylglucosaminidase 반응 조건은 11 mg의 OM에 960 ul의 50 mM sodium phosphate (pH 6.0)를 가하고 N-acetylglucosaminidase 2.5 U/40 ul를 가한 후, 37℃에서 overnight incubation 하였다. Sialidase 반응 조건은 11 mg의 OM에 956 ul의 50 mM sodium phosphate (pH 6.0)를 가하고 sialidase 44 ul를 가한 후, 37℃에서 overnight incubation 하였다. 각각의 반응이 완료한 후 분자량 100 kDa 이하 cut-off인 막을 이용한 한외여과법에 의해 반응액중의 효소를 완전히 제거하고, OM로부터 mannose, galactose, GlcNAc, NeuAc가 각각 제거되어 당쇄가 변형된 exoglycosidase 유도체(G-OM, M-OM, N-OM 및 S-OM)를 얻었다.

<3-2> HPLC 분석

실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 exoglycosidase를 사용하여 올리고당의 말단 부분을 잘라낸 OM의 올리고당 변화를 HPLC를 통해 분석하였다.

그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이, OM에 galactosidase를 처리하여 제조한 유도체(이하 G-OM)의 경우 큰변화가 생기지 않음을 확인하였다.

Mannosidase를 처리하여 제조한 유도체(이하 M-OM)의 경우, Man α1-3 (Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc의 구조를 갖는 M2 peak가 (C) 크로마토그램에서 없어지고, M1 (Man α1-6 Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc) peak가 현저하게 높아지는 것을 확인하였다.

또한, OM에 N-acetylglucosaminidase를 처리하여 얻은 유도체 (이하 N-OM)의 경우 M8인 GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 과 M15인 GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc 가 (D) 크로마토그램에서 현저하게 감소하고, M2 (Man α1-3 (Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc), M4 (GlcNAc β1-4 (Man α1-3) (Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc), M5 (GlcNAc β1-2 Man α1-3 (GlcNAc β1-2 Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc), M7 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3 (GlcNAc β1-2 Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc)이 조금씩 증가한 것으로, 말단의 N-acetylglucosamine이 절단된 것을 확인하였다.

또한, OM에 sialidase를 처리하여 얻은 유도체 (이하 S-OM)에서는 2종류의 시알산 결합 올리고당인 M18 (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc), M20 (NeuAc α2-3or6 Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc)이 말단의 NeuAc가 절단되어 각각 M16 (Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc)과 M17 (Gal β1-4 | GlcNAc β1-4 (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) (GlcNAc β1-6) Man α1-3) (GlcNAc β1-2 (GlcNAc β1-4) Man α1-6) Man β1-4 GlcNAc β1-4 GlcNAc)으로 이동함을 확인하였다.

< 실시예 4>

당쇄구조 변형 오보뮤코이드의 항원성 비교실험

<4-1> 마우스의 면역 및 항혈청의 수집

항체생산을 위한 항원으로 OM 및 그의 exoglycosidase 유도체(G-OM, M-OM, N-OM 및 S-OM)를 사용하였고, 각 항원에 대한 항체의 생산을 위하여 6주령의 BALB/c 마우스를 사용하였다. 각 실험군당 5마리의 마우스에 각각의 항원 (10 ug/mouse)을 2주 간격으로 총 2회 복강주사하였다. 최종면역 1주일 후에 항원인 OM(10 ug)를 boosting 면역하였고 항혈청의 수집은 면역 5일 후에 실시하였다. 항혈청은 항체가의 측정 시까지 -20℃에 보관하였다.

<4-2> 총 IgE 생산량 측정

혈청에 존재하는 각 항원에 대한 총 IgE 함량의 측정은 마우스 IgE 측정을 위한 sandwich법 ELISA kit(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 즉, flat-bottomed microtiter plate(Nunc. USA)의 각 well에 coating 항체(anti-IgE)를 bicarbonate buffer(pH 9.4)를 이용하여 well 당 100 uL씩 분주하여 4℃에서 16시간 동안 부착시켰다. PBS-Tween 20(0.05%; PBST)으로 각 well을 3회 세척 후에 3% skim milk를 이용하여 blocking하고 PBST로서 다시 세척하였다. 준비한 각 혈청을 50배부터 희석하여 각 well에 첨가하고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 세척 후 마우스 IgE에 대한 2nd 항체 및 HRP conjugate를 반응시켰다. HRP의 작용을 위한 기질로는 TMB를 사용하였다. 발색은 2 NH ₂ SO ₄ 를 이용하여 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청중 총 IgE 함량은 IgE 표준물질을 이용한 표준곡선에 대입하여 측정하였다.

OM 및 exoglycosidase 처리에 의한 유도체의 IgE 생산효과를 조사한 결과 대조군인 OM과 비교하여 유도체의 IgE 생산이 감소하는 것으로 나타났고, 특히 N-OM의 면역은 OM에 비하여 유의하게 낮은 IgE 생산을 보여 N-OM의 경우 IgE의 생산을 촉진하는 알레르기 항원성이 많이 소실된 것으로 확인되었다([도 5] 참조). 이는 OM의 알레르기 항원성과 관련한 IgE 생산에 그의 당쇄 부분이 중요한 역할을 하며 당쇄조절에 의해 OM의 알레르기 항원성을 조절할 수 있음을 의미하는 것으로 판단된다.

<4-3> Lymphocyte 에 대한 OM 자극 및 cytokine 측정 자극실험

체액성 면역에 관여하는 effector B 세포의 기능은 Th1 세포가 생산하는 Th1 성향을 가지는 IL-2, IFN-γ, GM-CSF 등의 cytokine 혹은 Th2 type의 helper T 세포가 생산하는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10에 의하여 조절된다. 이들 cytokine들은 B 세포가 각 항원에 대항하는 여러 가지 종류의 항체를 생산하는 작동세포로의 분화 및 증식에 관여한다. 즉, 생체에 들어온 항원에 대한 IgE 항체의 생산은 주로 Th2 세포가 생산하는 cytokine (IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10) 생산으로 설명할 수 있다.

면역마우스로부터 비장을 취하여 세포의 농도가 3×10 ⁶ cells/well이 되도록 조정 후, 24-well culture plate에 분주하였다. 비장세포가 분주된 각 well에 항원 최종농도 10 ug/mL의 OM, G-OM, M-OM, N-OM, S-OM 시료를 첨가하고 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 72시간 배양시켰다. 배양완료 후 배양 상등액에 존재하는 IL-4의 양을 ELISA kit (BD Biosciences)을 이용하여 조사하였다.

OM 및 그의 유도체로 면역한 마우스로부터 얻은 비장세포를 각각의 항원으로 재자극 후에 생산되는 IL-4의 생산을 측정한 결과, [도 6]에서 보는 바와 같이 대조군인 OM에 비해 유도체 처리에 의해 IL-4의 생산이 감소하는 결과를 나타내었고, 특히 N-OM의 경우 IL-4 생산이 유의적으로 크게 감소하는 것으로 나타나 IgE 생산과 동일한 경향이었다. 따라서 OM으로부터 당쇄변형되어 제조된 유도체, 특히 N-OM은 OM에 비하여 IgE 항체를 매개로 하는 제1면역과민 반응을 억제할 뿐만 아니라 OM의 알레르기를 유발하는 특성이 거의 없는 구조로 변화된 것으로 판단된다.

본 발명은 알레르기 유발 식품의 당단백질에 결합된 당을 제거하여 당단백질의 항원성을 감소시키는 방법을 발견하였고, 이에 따라 저항원성 당단백질을 제조할 수 있는 바, 본 발명의 상기 당단백질은 알레르기 유발 가능성이 매우 낮으며, 동시에 고유의 영양가치는 그대로 유지하므로, 고 영양의 식품, 화장료를 제조할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.