| 说明书全文 |
섬유성 식재료{Fibrous food material}
본 발명은 섬유성(fibrous) 재료, 및 특히 섬유성 식재료, 그 생산 방법, 및 상기 섬유성 재료의 용도에 관한 것이다. 중요한 양태에서, 본 발명은 대체 단백질 공급원으로부터 육류 또는 생선 대체 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 다른 양태에서는, 유리(loose) 섬유성 입자가 다양한 용례의 용도를 갖는 성분으로서 사용된다.
지난 수십 년 동안, 섬유성 음식 조직(texture)의 형성은 음식학자들로부터 뿐만 아니라 산업계로부터 많은 관심을 받아왔다. 특히 중요한 과제는 대체 단백질 공급원으로부터의 제품으로 육류 제품을 대체하는 것이었다. 일반적으로, 이것은 비-육류 단백질계 재료를 이용하여 육류와 유사한 구조적 및 감각적 특성을 생성함을 의미하며, 즉, 비-육류 단백질계 공급원으로부터 시작하여 다양한 길이 규모와 다양한 농도 체제의 이방성 구조를 목적으로 하였다. 섬유성 단백질 재료에서 수행된 연구는 대략 소섬유로의 단백질의 자가-조립과 섬유성 조직으로의 단백질의 강제 조립으로 나눌 수 있다. β-락토글로불린, 오브알부민 및 소 혈청 알부민 단백질과 같은 다양한 단백질의 소섬유 자가-조립은 극한 pH와 온도 조건하에서 희석 및 반-희석 체제에서 이루어졌다(예를 들어, Veerman et al., J.Rheol.49(2)(2005) 355-368 참고). 생산된 소섬유는 대략 nm 두께와 ㎛ 길이였다. 자가-조립의 특별한 경우가 κ-카제인의 아밀로이드 소섬유 형성에 대해 보고되었다(Thorn et al., Biochemistry 44(51)(2005) 17027). 자가-조립과 대조적으로, 보다 농축된 체제(> 10% w/w 단백질)에서 단백질 용액의 강제 조립은, 다른 기술 역시 개시되었지만, 압출 또는 방사 기술을 이용하여 전통적으로 이루어졌다. 압출 조리는 대두가루, 밀, 및 낙농 단백질과 같은 다양한 공급원으로부터의 단백질을 조직화(texturizing)하는 데 사용되었다. 단백질의 가소화, 용융 및 분해가 압출기 통에서 발생하며 섬유성 조직은 긴 냉각 다이에서 단백질의 배열로 인해 형성될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, Aguilera & Stanley, Food Rev. Int. 9(4)(1993) 527-550; 및 Cheftel et al., Food Rev. Int. 8(2) (1992) 235-275를 참조한다. 이들 실시 형태에서, 스트레칭(stretching)에 대한 세로 및 가로 저항의 비율 값은 Thiebaud et al.(Food Science And Technology - Lebensmittel-Wissenschaft & Technoligie 29(5-6) (1996) 526-535)에 따르면 섬유 품질을 나타낸다. 스트레칭에 대한 세로 및 가로 저항의 전형적인 비율 값은 예를 들어, 통 온도와 pH에 따라, 탈지 대두 가루로부터의 섬유성 압출물의 경우에는 1-5이며(Cheftel et al., 상동); 그리고 절단에 의해 측정할 때 탈지 대두 가루와 돼지고기의 압출물의 경우에는 1-2이다(Liu et al., Food Sc.Techn.Int. 11(6) (2005) 463-470). 앞서의 두 문단에서 참고된 연구들은 허용할만한 정도의 섬유질성을 얻기 위해 동물 및 식물성 공급원의 블렌드가 필요함을 보여준다. Tolstoguzov(JAOCS, 70(4) (1993) 417-424)는 압출 동안 이방성 구조를 형성하기 위하여 비상용성 생물중합체가 필요함을 강조하였다. US-A-4,118,520호에서는, 단백질 혼합물의 젤화점 미만의 온도에서 칼슘과 포스페이트 이온을 함유한 수성 단백질 혼합물을 건조-방사하고, 이어서 얻어진 섬유를 건조시켜, 카제인과 적어도 하나의 열경화성 단백질을 함유한 단백질 섬유를 제조한다. US-A-2,830,902호와 그 일부 계속 출원인 US-A-2,879,163호는 단백질이 풍부한 원재료의 현탁액을 열의 영향하에서 응고시켜 단백질 젤을 형성하고, 이 젤을 마카로니 프레스를 이용한 압출에 의해 성형하는 것을 개시한다. 일반적으로, 압출 기술은 단백질 변성을 위해 고온을 사용하여 제어불가능한 화학적 반응을 유도하는 것, 및 심지어 분자 수준에서(Van den Einde et al., Polymer Degradation And Stability, 85(1) (2004) 589-594 참고), 구조적 요소의 분해를 야기할 수 있는 고전단력을 압출동안 사용하는 것(예를 들어, Peighambardoust et al., J.Cereal Sc.43(2006) 183-197 참고)과 같은 많은 단점을 가진다. 더욱이, 많은 다른 혼합 또는 반죽 장치에서처럼, 압출기에서는, 물리적 및/또는 화학적 공정을 위한 상이한 효과가 장치내의 위치에 따라 얻어진다. 명확한(well-defined) 섬유성 생성물을 얻기 위하여, 구조적 요소에서 분해와 조직 유도 사이에 미묘한 상호작용이 있어야 함이 명백하다. 본 발명은 명확한 섬유성 생성물을 얻도록 하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 압출 조리에 의해 제조된 생성물은 일반적으로 100 ℃를 넘는 온도에서 가열된다. 그러한 생성물은 가열될 수 있으나, 생선과 육류에서도 얻어지는 효과를 야기하는 굽기와 튀기기같은 기술을 이용하여 부엌에서 가공될 수는 없다. 상기에서 언급한 다른 기술, 즉, 생물중합체의 방사는 방적돌기에서 그리고 응고동안 전단 및 신장성 유동으로 인한 거대분자의 배열에 기초한다(예를 들어, Gallant et al. , Food Microstructure 3 (1984) 175-183 참고). 전형적으로, 생성된 섬유(~ 100 ㎛)는 산과 염 용액을 함유한 배쓰에서 응고되며, 그후에 세척된다. 카라기난(Downey & Burgess, J. Food Techn. 14(1) (1979) 21-31; Downey & Burgess, J. Food Techn. 14(1) (1979) 33-40) 및 알지네이트(Antonov et al., Die Nahrung 29(1) (1985) 39; Suchkov et al ., Nahrung-Food 24(9) (1980) 893-897)와 같은 하이드로콜로이드, 또는 대두(Suchkov et al ., Nahrung-Food 32(7) (1988) 669-678) 또는 강낭콩(field bean) 단백질(Suchkov et al ., Nahrung-Food 32(7) (1988) 679-689)과 같은 식물성 단백질은 생산된 카제인계 섬유의 물에서의 용해도를 감소시키기 위하여 2상 블렌드로 카제인과 조합되어 사용되었다. US-A-2,682,466호는 습식-방사 방법에 의해 제조된 식용 단백질 섬유질을 개시한다. 단백질이 풍부한 원재료를 알칼리성 매질에 용해시키고, 이어서 얇은 제트 형태로 산성 염 배쓰내로 압출시켜 여기서 섬유를 응고시킨다. 이러한 방사 방법의 단점은 응고 및 세척 배쓰로부터 대량의 폐수 스트림을 남긴다. 또한, 섬유를 응고시키기 위하여 낮은 pH와 높은 염 농도, 및 화학적 첨가제가 필요하여, 소비에 적합한 섬유의 생산을 위한 장치와 방법의 디자인을 복잡한 문제로 만든다. 또한, 섬유성 구조로의 방사를 통해 얻어진 섬유의 조합이 만일 가능하다 해도 복잡하다. NL-C-1019816에서는 육류와 생선을 대체할 것을 목적으로 하며 구울 수 있는 생성물이 제조된다. 이들 생성물은 응유로부터 제조되며, 응유는 물에서 알지네이트 및/또는 포스페이트와 혼합되며, 상기 혼합물은 유화되고 이어서 염 용액에서 격렬하게 교반된다. 그 후 얻어진 섬유 생성물은 세척되고 추가로 물이 제거된다. 개시된 방법은 전술한 방사 방법과 유사한 단점을 가진다. 또한 WO2005/004624호와 WO2005/004625호에서는, 적어도 +2의 전하를 갖는 금속 이온과 접촉할 때 침전하는 하이드로콜로이드와 단백질(각각, 우유 및 식물성 단백질)의 균질한 혼합물을 그러한 금속 이온을 함유한 용액과 접촉시켜 성형 섬유 함유 식품을 형성한다. 상기 두 문단의 방법에서 얻어진 생성물은 젤화된 하이드로콜로이드에 기초한 구조를 얻는다. 추가의 배경 기술은 상이한 용도를 위한 단백질 생성물을 얻기 위하여, 트랜스글루타미나제를 이용하여 단백질을 가교결합시키는 것을 포함하지만, 육류 또는 생선 대체를 위한 섬유성 조직에는 관련되지 않는다. 트랜스글루타미나제를 이용하여 단백질을 부분적으로 가교결합시키는 방법에 관련되는 EP 1 085 023호를 참고한다. 그 목적은 증점제 또는 결합제로서 음식물에서 유용한 가교결합된 단백질을 제공하는 것이다. 재료는 연속 교반된 반응기 또는 고정 베드 반응기로부터 얻어지며, 후자가 바람직하다. 또한 페이스트 음식과 유화된 음식에서 유용한 유청 단백질-함유 분말에 관련되는 EP 0 821 881호를 참고한다. 유청 단백질은 트랜스글루타미나제와 용액에서 반응한다. 다른 배경 기술은 EP 0 340 035호와 같은, 단백질 미세섬유 구조를 포함한다. 여기서 개시된 방법은 잔탄/단백질 복합체 섬유를 분쇄하고 분쇄된 섬유를 고전단에 노출시켜 미세 섬유를 얻는 것에 관련된다. 얻어진 생성물은 예를 들어, 육류 성분을 기초로 한 음식물에 사용될 수 있다. 이것은 그 자체는 육류 또는 생선 대체 구조를 갖지 않는다. EP 0 420 165호는 미분된 육류 또는 생선 단백질을 기초로 하며, 근육-유사 구조로 단백질을 재건하는 방법에 관련되는, 기본적으로 상이한 유형의 육류 또는 생선 대체물에 관한 것이다. 이 유형의 대체는 명백하게 비-육류 단백질 공급원을 사용하는 것이 바람직한 경우에는 적합하지 않다. 또한, 구형 단백질 및 카제인외에는, 여기서 사용되는 원래의 육류 단백질은 그 자체가 섬유질 단백질이다.
도면에서, 도 1은 전단 셀 장치를 보여준다. 전단 셀은 유량계 개념 및 파일럿 규모 셀에 기초한다. 원뿔 각 = 100 °; 원뿔과 플레이트 사이의 각(전단 구역) = 2.5°; R 플레이트 = 0.08508 m; R 플레이트, 돌출됨 = 0.06750 m; R 원뿔 = 0.07638 m; R 원뿔,돌출됨 = 0.05851 m. 정지 원뿔과 회전 플레이트는 물로 가열/냉각된다. 도 2는 인장 시험 후 전단되고 가교결합된 30% Ca-카제이네이트의 사진을 보여준다(A). 측정 동안 신장 후 가시적이 된 섬유를 주목한다. 동일한 샘플을 1일 동안 탈염순수(demi-water)에서 현탁시킨 후, 뚜렷한 섬유가 보였다(B). 도 3은 35분 동안 50 ℃와 50 rpm에서 전단된 30% Ca-카제이네이트와 TGA(E:P = 1:20)의, 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행한(좌측 컬럼; 속도 구배 - 전단유동 평면) 및 수직인(우측 컬럼; 속도 구배 - 소용돌이도 평면) 파단 표면의 SEM 이미지를 보여준다(C + TG - 전단). A3과 B3에서 크기 막대는 1 ㎛를 나타낸다. 도 4는 35분 동안 50 ℃와 50 rpm에서 전단된 30% Ca-카제이네이트의, 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행한(좌측 컬럼; 속도 구배 - 전단유동 평면) 및 수직인(우측 컬럼; 속도 구배 - 소용돌이도 평면) 파단 표면의 SEM 이미지를 보여준다(C - 전단). 도 5는 50 ℃에서 정지 상태에서 TGA(E:P = 1:20)에 의해 가교결합된, 30% Ca-카제이네이트의, 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행한(좌측 컬럼; 속도 구배 - 전단유동 평면) 및 수직인(우측 컬럼; 속도 구배 - 소용돌이도 평면) 파단 표면의 SEM 이미지를 보여준다(C + TG - 정지). 도 6은 35분 동안 50 ℃와 50 rpm에서 믹서에서 혼합된 30% Ca-카제이네이트와 TGA(E:P = 1:20)의, 가상의 "평행"(좌측 컬럼) 및 "수직"(우측 컬럼) 방향에서 파단 표면의 SEM 이미지를 보여준다(C + TG - 혼합). 도 7은 다양한 30% Ca-카제이네이트 구조의, 95% 신뢰구간을 가진 G' (A)와 tanδ(B)의 LVE 특성을 보여준다. C = Ca-카제이네이트; TG = TGA; (무)전단 = 전단 셀 장치에서 (비)전단됨; 혼합 = 믹서에서 혼합됨. 도 8은 전단 유동에 대하여 평행 및 수직 방향으로 신장된, 35분 동안 50 ℃와 50 rpm에서 전단된 30% Ca-카제이네이트와 TGA(E:P = 1:20)(C + TG - 전단)의 전형적인 응력-변형 곡선을 보여준다. 도 9는 다양한 30% Ca-카제이네이트 재료의, 95% 신뢰구간을 가진 인장 특성 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E. C = Ca-카제이네이트; TG = TGA; (무)전단 = 전단 셀 장치에서 (비)전단됨; 혼합 = 믹서에서 혼합됨. 도 10은 밀도 높은 Ca-카제이네이트에서 전단- 및 효소-유도된 이방성의 개략도를 보여주며; Ca-카제이네이트를 전단한 후 관찰된 층화된 구조(A) 및 TGA의 존재하에서 Ca-카제이네이트를 전단한 후 관찰된 섬유성 구조를 보여준다. 도 11은 전단되고 가교결합된 30% Ca-카제이네이트, 15% 야자 지방 및 TGA(1:20)의 거대구조를 보여준다: A. 30분 동안 120 s -1 에서 전단 후 얻어진 섬유성 거대 구조; B. 60분 동안 120 s -1 에서 얻어진 손상된 거대구조. 도 12는 30% Ca-카제이네이트와 TGA(1:20)(좌측) 및 25% Ca-카제이네이트와 TGA(1:17)(우측)를 위한, 전단 셀 장치에서의 전단 동안 토크에 대한 전단 시간의 효과를 보여준다. 모든 샘플은 15% 야자 지방을 함유하였다. 별표(*)는 전단 후 섬유성이 아닌 재료를 나타낸다. 무 TG는 TGA가 없는 30% Ca-카제이네이트 샘플을 나타낸다. 도 13은 TGA(1:20)로 가교결합된, 30% Ca-카제이네이트와 15% 야자 지방의 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행한(좌측 컬럼: 속도 구배 - 전단 유동 평면) 및 수직인(우측 컬럼; 속도 구배 - 소용돌이도 평면) 파단 표면의 SEM 이미지를 보여준다. 도 14A는 120 s -1 에서 다양한 시간에서 전단 후 얻어진 전단되고 가교결합된 25% 및 30% Ca-카제이네이트 및 15% 야자 지방 재료(TGA 각각 1:17 및1:20)의 선택된 CSLM 이미지를 보여준다. 비-가교결합된 30% Ca-카제이네이트-지방 재료 역시 포함된다. 이미지는 소용돌이도 - 전단 유동 평면으로부터 찍는다. B. 10X 확대도에서 적어도 6개 이미지를 이용한 이미지 분석으로 결정할 때, 선택된 Ca-카제이네이트-지방 샘플의 지방 소적 직경과 변형 파라미터 D의 평균 누적 도수. 도 15는 30% Ca-카제이네이트와 TGA(1:20), 25% Ca-카제이네이트와 TGA(1:17), 및 TGA가 없는 30% Ca-카제이네이트의, 95% 신뢰 구간을 가진 LVE 특성 G' 과 tanδ에 대한 전단 시간의 효과를 보여준다. 모든 샘플은 15% 야자 지방을 함유하였다. 흰색 기호(open symbol)는 전단 후 섬유성이 아닌 샘플을 나타낸다. 도 16은 30% Ca-카제이네이트, 15% 야자 지방 및 TGA(1:20)로 이루어진 재료의 변형 진폭 범위(strain amplitude sweep)로 측정할 때, 변형 γ의 함수로서 선형 점탄성(LVE) 영역내의 G' 값을 이용하여 표준화된 G' 값에 대한 전단 시간(A)과 전단 속도(B)의 효과를 보여준다. 표준화된 곡선은 두번 측정값의 평균이다. 무 TG로 나타낸 샘플은 TGA로 가교결합되지 않았다. 흰색 기호는 전단 후 섬유성이 아닌 샘플을 나타낸다. 도 17은 다양한 전단 처리 후 얻어진 25% 및 30% Ca-카제이네이트, 15% 야자 지방 및 TGA(각각 1:17 및 1:20)의 측정된 크립 곡선을 보여준다(데이터 포인트). 선은 6-요소 버거스 모델(6-elements Burgers model)로 피팅시킨(fitted) 곡선을 나타낸다. 삽입된 그래프는 비-가교결합된 전단된 Ca-카제이네이트-지방을 보여준다. 비-섬유성 샘플은 별표로 나타낸다. 도 18은 25% Ca-카제이네이트와 TGA(1:17), 30% Ca-카제이네이트와 TGA(1;20) 또는 TGA 없음(무 TG)의, 95% 신뢰구간을 가진 인장 특성 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E 에 대한 전단 시간의 효과를 보여준다. 모든 샘플은 15% 야자 지방을 함유하였다. 인장 특성은 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행하여 그리고 수직으로 측정하였다. 도 19는 30% Ca-카제이네이트와 TGA(1:20)에 대한 전단 셀 장치에서의 전단 동안 시간의 함수로서 토크에 대한 전단 속도의 효과를 보여준다. 모든 샘플은 15% 야자 지방을 함유하였다. 별표(*)는 전단 후 섬유성이 아닌 재료를 나타낸다. 도 20은 TGA(1:20)가 있거나 TGA가 없는(무 TG) 30% Ca-카제이네이트의, 95% 신뢰구간을 가진 인장 특성 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E 에 대한 전단 속도의 효과를 보여준다. 모든 샘플은 15% 야자 지방을 함유하였다. 도 21은 프로세스 시간의 함수로서 고형화 속도와 전단 속도의 비율에 기초한 다이아그램을 보여준다. 선 a , b 및 c 는 4가지 구조적 영역으로의 전이를 나타낸다: (1) 등방성 액체 재료(Il), (2) 섬유성 재료(F), (3) 등방성 고체 재료(Is) 및 (4) 손상된 "과립" 재료(G). 원, 삼각형 및 사각형은 다양한 방법 조건에서 얻어진 30% Ca-카제이네이트, 15% 야자 지방 및 TGA(1:20)에 기초하여 각각 섬유성, 과립 및 등방성 재료를 나타낸다. 실시예에서, 백분율은 조성물의 총 중량에 기초한 중량 백분율이다. 이들 실시예에서, 하기 화합물들이 사용된다: 트랜스글루타미나제(이하에서, TGA): 제조사의 설명서에 따라 81-135 유닛·g -1 의 활성을 갖는 스트렙토베르티실리움 모버란새( Streptoverticilium moberansae )로부터 유래된 미생물 Ca 2 + -독립성 트랜스글루타미나제(단백질-글루타민:아민 γ-글루타밀-트랜스퍼라제, EC 2.3.2.13)(1% TGA, 99% 말토덱스트린, 일본 동경의 아지노모토 컴퍼니.인코포레이티드로부터 구입). 20%(탈염된 물에서 w/w) TGA 용액을 1 시간 동안 실온에서 기계적 교반에 의해 실험하기 전에 새롭게 제조하였다. 칼슘 카제이네이트(Ca-카제이네이트): 제조사의 설명서에 따라 적어도 88% 단백질을 함유하였다(네델란드 베겔의 DMV 인터내셔널(International)로부터 구입). 야자 지방은 바렌츠 로 머티리얼스(Barentz Raw Materials)(네델란드 후프돌프)로부터 입수하였다. 이것은 20 ℃ 내지 37 ℃의 용융 궤도를 가져, 지방이 가공동안(50 ℃) 액체였으며, 추가 분석 동안(20 ℃) 고체였음을 의미한다. 공초점 레이저 주사 현미경을 위한 지방용 형광 염료인 나일 레드(Nile Red) (72485, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))를 0.1 g·L-1의 농도로, 용융된 야자 지방에 첨가하였다. SEM을 위한 샘플 제조에 사용된 다이메틸설폭사이드(DMSO)와 에탄올은 분석 등급이었다(네델란드 즈위진드레트의 시그마 알드리치로부터 입수). 실시예에서, 시험 데이터는 하기 방법을 이용하여 얻었다: 주사 전자 현미경: Ca-카제이네이트 재료의 미세- 및 나노구조 양상을 전계 방출 주사 전자 현미경(FESEM)으로 주위 온도에서 관찰하였다. 건조 샘플을 Muller et al . in Scanning 22 (2000) 295-303에 의해 개시된 변형된 방법에 따라 제조하였다. 전단된 Ca-카제이네이트 샘플을 사각형(< 10 x 10 mm)으로 조심스럽게 절단하고, 각각 60분 동안 DMSO(탈염수에서 농도 범위 15%, 30% 및 50% v/v)에 침잠시켰다. 여분의 50% DMSO를 필터 종이로 샘플로부터 제거하였다. 샘플의 느린 동결을 액체 질소위의 차가운 기체상 질소에서 실시하였다. 이어서, 샘플을 액체 질소와 접촉시키고, 안전면도날(단일 에지 탄소강, EMS, 미국 워싱턴)과 해머를 사용하여 황동 테이블에서 동결 파단시켰다. 동결 파단은 전단 셀 장치에서 샘플에 가해진 전단 유동에 평행하게 그리고 수직으로 실시하였다(전단 유동 - 소용돌이도 평면에 기초함). 생성된 파단 평면은 각각 속도 구배-전단 유동 평면 및 속도 구배-소용돌이도 평면이었다. 본 발명에서, 이들 방향과 생성된 파단 평면은 각각 평행 및 수직으로 정의된다. 명백한 전단 방향을 갖지 않는 혼합 샘플은 가상의 평행 및 수직 방향을 한정한 후 유사하게 처리하였다. 모든 Ca-카제이네이트 샘플이 메짐파괴(brittle fracture)를 나타냈다. 파단 후, 샘플을 60분 이상동안 50% DMSO에서 해동시키고, 이어서 역전된 DMSO 농도 범위를 통해(각각 60분) 물에 재수화시켰다. 샘플을 연속 등급의 에탄올(10%, 30%, 50%, 70%, 90% v/v)에서 100% 에탄올로 탈수시켰다(각각 20분). 100% 에탄올 중의 샘플은 이산화탄소(CPD 020, 리히텐슈타인의 발젤스(Balzers)로부터 입수)로 임계점 건조시키고, 입체현미경으로 검사하여 파단 평면을 확인하였다. 이어서, 전도성 탄소 시멘트(Leit-C, 독일의 뉴바우어 케미카리엔(Neubauer Chemicalien)으로부터 입수)를 이용하여 샘플 홀더에 샘플을 접착시키고, 20 nm 백금(JFC 1200, 일본의 제올(JEOL)로부터 입수)으로 스퍼터 코팅하였다. 3.5-5 kV에서의 SE 검출로, 8 mm의 작업 거리에서 실온에서 FESEM(제올 6300 F, 일본 동경)를 이용하여 파단된 표면을 분석하였다. 2528 x 2030, 8 비트의 크기에서 100초의 스캔 속도로(풀 프레임) 모든 이미지를 디지털방식으로 기록하였다(오리온(Orion), 6 ELI sprl., 벨기에). 노이즈 감소와 이미지의 크기 조정은 아도브 포토샵(Adobe Photoshop) CS로 이루어졌다. 공초점 주사 레이저 현미경(CSLM): 가공된 Ca-카제이네이트-지방 재료의, 미시 및 거시 길이 규모 사이의 구조로 정의된, 중간 구조를 소용돌이도-전단 유동 평면에서 CSLM으로 관찰하였다. 4 ℃에서 보관 후, 전단 셀의 중간 섹션에서 취한 단백질-지방 샘플을 조심스럽게 절단하고, 2-웰 챔버를 가진 커버글래스(미국 일리노이주 나퍼빌의 눈크(Nunc)로부터 입수)로 옮기고, 도립(inverted) LSM 510(독일 오베르코첸의 자이스(Zeiss)로부터 입수)으로 분석하였다. Ar-이온 레이저(488 nm)와 HeNe 레이저(543 nm)를 이용하여 샘플을 여기시켰다. 단백질 상의 경우, 505-530 nm의 방사 필터를 적용한 한편, 지방 상을 위해서는 600-650 nm 필터를 사용하였다. 이미지는 10x 건조 대물렌즈(NA 0.3, 줌 2x 및 4x)와 40x 오일 침잠 대물렌즈(NA 1.3)를 이용하여 디지털방식으로 기록하였다. 지방 상의 원 데이터 이미지(512 x 512 픽셀)의 이미지 분석은 맷랩(Matlab) 7.0의 이미지 툴박스(미국 매사추세츠주 나틱의 더 매스웍스 인코포레이티드(The Mathworks Inc.)로부터 입수)를 이용하여 실시하였다. 10x 확대도에서 얻은 샘플 당 적어도 6개의 이미지를 사용하여 픽셀 면적에 기초하여 직경 크기를 결정하였다(d= √(4π/면적). 또한, 타원체의 최대 축의 길이( L 최대 )와 최소 축 길이( L 최소 )로부터 변형 파라미터 D 를 계산하였다: D = (L 최대 - L 최소 )/ (L 최대 + L 최소 ) . 지방 소적 직경과 D의 누적 분포에 기초하여, 평균 누적 분포를 구성하였다. 유동학적 특성: 1Hz의 일정한 진동수와 20 ℃의 온도에서 응력-제어된 볼린(Bohlin) CVO(영국 사이렌세스터의 볼린 인스트루먼츠 엘티디(Bohlin Instruments Ltd.)로부터 입수)를 이용한 동적 진동 변형 진폭 시험으로, 선형 점탄성(LVE) 특성( G' 및 tanδ)을 두벌로 결정하였다. 20 ℃에서 LVE 영역내에서 일정한 변형에서 단일 진동수 변화폭(single frequency sweep)(0.01-100 Hz)을 실시 하였다. 크립 시험은 LVE 영역내에서 정상 응력 수준에서 20 ℃에서 두벌로 실시하였다(< 350 Pa). 크립 시간은 2000 s였다. 톱니 모양의 평행 플레이트(직경 25 mm, 갭 2 mm)를 사용하여 미끄러짐을 방지하였다. 샘플을 덮는 챔버를 사용하여 증발을 방지하였다. 측정 전에, 샘플을 5-`15분동안 안정시켜 샘플 로딩에 의해 유도된 응력을 이완시켰다. 얻어진 기계적 스펙트럼을 G' -진동수 곡선( G' ∝ ω n )에의 거듭 제곱 법칙 피트(power law fit)를 이용하여 분석하였다. 크립 곡선은 6-요소 버거스 모델로 분석하였으며, 이것은 연질 고체 재료의 점탄성 특성을 설명하기에 적합한 것으로 입증되었다(Edwards et al ., Rheologica Acta. 40 (2001) 142-153 참고). 상기 모델은 시리즈로 두 켈빈-보익트(Kelvin-Voigt) 요소를 가진 맥스웰(Maxwell) 요소를 포함한다: J (t) = 1/ G 1 + (1/ G 2 )[1 - exp(- tG 2 /η 2 )] + (1/G 3 )[1 - exp(- tG 3 /η 3 )] + t/η 1 순간 컴플라이언스(instantaneous compliance) J 1 은 1/ G 1 과 동일하며, 점성 유동은 t/η 1 에 의해 나타내지며, 그리고 식의 나머지( 두 켈빈-보익트 요소)는 지연된 컴플라이언스를 나타낸다. 실시예에서, 본 발명자들은 다양한 전단되고 가교결합된 재료간의 구별을 위하여 J , η 1 및 지연 시간 τ 2 (= G 2 /η 2 ) 및 τ 3 (= G 3 /η 3 )에 집중하였다. 기계적 특성: 큰 변형 시험을 위하여 조직 분석기 T2(영국 서레이의 스테이블 마이크로 시스템스 엘티디(Stable Micro Systems Ltd.)로부터 입수)를 이용하였다. 단일축 인장 시험은 Ca-카제이네이트 재료를 생성한 후 2 시간 이내에 실온에서 3 mm·s -1 의 일정한 변형 속도로 실시하였다. 샘플을 3-5 mm(각 개별 샘플에 대해 측정함)의 두께를 갖는 직사각형 모양(30 x 12 mm)으로 절단하였다. 연장될 부분의 길이는 15.2 mm였다. 전단 유동에 평행 및 수직한 각 방향에서 섬유성 단백질 샘플에서 적어도 3회 측정을 실시하였다(전단 유동에 기초하여 - 소용돌이도 평면, 따라서 생성되는 파단 평면은 SEM으로 본 것과 동일한 평면이었다). 샘플의 섬유성 특징으로 인하여, 파단은 때때로 한번에 일어났으며, 그리고 때로는 다중-단계 방식으로 일어나, 측정간에 편차를 야기하였다. Gunasekaran & Ak, (2003) Cheese Rheology and Texture, CRC Press에 의해 개시된 바와 같이 헨키(Hencky) 응력(ε), 인장 항복 응력(σ) 및 영스 계수( E )를 계산하였다. 겉보기 변형 경화 계수(apparent strain hardening coefficient) n 변형 은 30-100%의 측정된 ε -범위에서 σ- ε곡선에 거듭 제곱 법칙 피트(σ= k·ε n )을 적용하여 결정하였다. n 변형 이 1의 값을 초과할 때, 샘플은 변형 경화를 나타낸다.
본 발명의 목적은 섬유성 음식 구조와 조직을 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 여기서는 상기에서 확인된 문제점들이 극복된다. 본 발명의 추가의 목적은 육류 및 생선과 견줄만한 외관 및 거동을 가진 생성물 및 특히 연질 고체 생성물을 제조하는 것이다. 구체적으로, 계층적 섬유성 구조를 포함하는 조성물이 바람직하다. 이러한 면에서, 계층적 구조는 원하는 특성과 기능이 얻어질 때까지 분자 규모에서 거대 규모까지 점점 더 높은 수준의 조직의 구조가 점진적으로 조립됨을 의미한다. JM Aguilera, SW Stanley, (1999), Microstructural principles of food processing and engineering, 2 nd ed, Aspen Publishing, Inc, Gaithersburg, Maryland, (ISBN 0-8342-1256-0), page 186-187으로부터 변형된다. 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 연질 고체 음식 생성물은 응력을 가하면 탄성적 변형(탄성적 변형: G' > G")을 주로 나타내며, 그리고 낮은 탄성계수 또는 작은 항복응력으로 인하여, 상당한 변형을 얻기 위해 상대적으로 작은 응력이 필요한 음식 생성물이다. 연질 고체 음식 생성물에 대한 추가의 상세 사항은 P. Walstra (2003) Physical Chemistry of Foods; Chapter 17: Soft-solids; Marcel Dekker, New York에서 개시되며, 이 내용은 연질 고체 음식 생성물의 추가 설명을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 육류 및 생선과 견줄만한 외관 및/또는 거동은 바람직하게는 튀기기와 볶기를 비롯한 조리 동안의 가공 능력 및 소비 둘 모두에 관련된다. 구체적으로, 본 발명의 구조는 가열 동안 짧아져 닭고기에서 일어나는 것과 유사한 거동을 야기한다. 더욱이, 허브와 양념 화합물과 같은, 맛 및 향기 화합물에 대해 우수한 흡수 및 흡착 특성을 갖는 섬유성 식재료를 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 목적은 실시예를 비롯한 명세서의 나머지를 읽은 후 알게 될 것이다. 본 발명의 목적은 농축된 단백질에서, 그리고 가장 바람직하게는 농축된 칼슘 카제이네이트 조성물에서 이방성 섬유성 구조를 유도하기 위하여 단순 전단 유동과 동시에 효소적 가교결합을 적용하는 것에 기초한 기술의 사용에 의해 충족되며, 응고 배쓰가 필요하지 않으며, 고온 또는 고 전단력을 적용할 필요가 없다. 또한, 세척 단계의 수가 상당히 감소될 수 있으며 종종 세척 단계가 전혀 필요하지 않다. 제 1 양태에서, 본 발명은 계층적 섬유성 음식 구조의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은 식용 단백질 현탁액을 단순전단 유동과 효소적 가교결합에 노출시키는 것을 포함한다. 효소적 가교결합은 단순전단 유동 작업과 동시에 수행된다. 본 발명의 방법은 단순전단인 특이적인 변형 종류에 의존한다. 용어 "단순전단"은 당업계에 잘 알려져 있으며 재료 평면이 단지 한 방향으로 서로 미끄러져 움직임을 의미한다. 이와 관련하여 CW Macosko, "Rheology, Principles, Measurements and Applications", VCH Publishers Inc., New York (1994), 특히 페이지 27-29, 40 및 70-75를 참고하며, 이 문헌은 "단순전단" 개념을 정의할 목적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 상기한 선행 기술 방법의 다수가 단백질과 다당류의 상-분리된 시스템에 관련되며 여기서 하나의 상에서의 배열이 다른 상에 의해 강제되거나, 또는 고정되어 유지되며, 본 발명은 단백질/물 혼합물에서 단백질 재료의 배열을 포함한다. 즉, 배열 및 섬유성 구조 형성이 본 발명에 따라 하나의 동일한 상에서 일어난다. 본 발명에서 얻어진 구조는 젤화에 기초한 선행 기술 방법이 그러한 것과 같은 별도의 매트릭스에서의 고정을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 방법에서, 단백질 현탁액은 예를 들어, 플레이트와 원뿔 사이에, 원뿔과 원뿔 사이에, 또는 쿠에트(couette), 원뿔 및 플레이트 반응기에서 확립될 수 있는 단순 선형 전단 프로파일에 노출된다. 적합한 장치의 예는 도 1에 도시되며, 여기서 도 1a는 랩-규모 셀 장치의 사진을 보여주며, 도 1b는 상기 장치의 전단 구역의 개략도이다. 구체적으로, 중합체는 도 1의 실시형태에서는 플레이트와 원뿔을 이용하여 단순 선형 전단 프로파일에 노출될 수 있으며, 여기서 각도 α 플레이트 는 예를 들어, 약 105°이고 α 원뿔 은 예를 들어 100°이다. 도 1의 전단 셀 장치는 약 70 ml의 부피를 갖는다. 회전 플레이트와 정지 원뿔은 물로 가열된다(또는 냉각된다). 재료의 온도는 원뿔내에 위치한 열전쌍으로 측정한다. 장치는 전단 속도 제어, 및 토크와 온도 판독이 가능하도록 브라벤더 도-코더(Brabender Do-Corder) 330(독일 두이스버그 소재의 브라벤더 오에이치지(Brabender OHG))에 부착된다. 도 1의 장치는 Peighambardoust et al . in: Journal of Cereal Science. 42(1) (2005) 59-68에서 개시된 장치에 기초하며, 이 문헌은 본 발명에 사용하기 적합한 장치의 추가 정의를 위해 참고로 본원에 포함된다. 전단 동안 가해지는 응력은 단백질의 분해를 야기해서는 안된다. 일반적으로, 가해지는 응력은 (플레이트의 돌출된 반경에 기초하여 계산할 때) 25 kPa를 초과하지 않아야 하며, 바람직하게는 20 kPa를 초과하지 않아야 한다. 이 방법에서, 단순전단 유동은 단백질의 배열을 야기하는 한편, 효소적 가교결합은 고형화를 야기한다. 물론, 여전히 섬유성 재료를 제공하는, 단순전단 유동 프로파일의 작은 변형 또한 본 발명에 의해 포함된다. 본 발명의 지식을 기초로, 바람직하지는 않더라도, "비-전단 장비", 즉, 믹서와 같은, 전단을 가하기 위해 보통 사용되지 않는 장비에서 단순전단 프로파일을 실현하는 것도 생각할 수 있다. 그러한 장비에서는, 사실상 단순전단이 일어나는 가공 도메인이 존재할 수 있다. 만일 그러하다면, 비-전단 장비에서 단순전단 도메인에 노출된 재료의 부분들만을, 예를 들어, 교반된 장비의 벽으로부터, 얻기 위해 주의해야 한다. 또한, 만일 믹서와 같은 비-전단 장비가 사용되면, 성분을 첨가하는 순서가 섬유성 구조의 형성에 더욱 중요할 것이다. 그러한 장비에서는, 액체상(물, 오일), 및 효소적 가교결합제가 단백질에 앞서 첨가되어야 한다. 일부 용도의 경우 단지 일부만이 이방성인(그리고 예를 들어, 등방성 매트릭스에 함유된) 재료가 충분할 수 있음을 생각할 수 있다. 단순전단 가공 단계는 바람직하게는 칼슘 카제이네이트에서처럼, 변성 온도를 갖지 않는 단백질 재료로 수행되거나(또한 하기를 참조), 또는 바람직하게는 단백질 재료의 변성 온도 미만의 온도에서 수행된다. 단순전단 자체와 관련하여, 단백질 용액 또는 분산액이 유동할 수 있는 한, 온도의 하한은 중요하지 않다. 효과적으로, 온건한 가열 단계는 보다 신속한 배열을 유도한다. 동시적인 효소 가교결합을 위한 온도 요건이 더욱 중요할 수 있다. 실제로, 본 발명의 방법은 약 15-60 ℃, 바람직하게는 주위 온도, 즉 20-25 ℃ 내지 최대 55 ℃, 그리고 더욱 바람직하게는 35-50 ℃의 온도 범위에서 적합하게 수행된다. 본 발명의 방법은 다른 비-변성화 용매 또한 사용될 수 있지만, 바람직하게는 물 또는 적어도 수성 시스템 중의, 다소 밀도가 높은 단백질 용액 또는 분산액을 필요로 한다. 바람직하게는, 단백질의 농도는 전체 용액 또는 분산액의 중량 기준으로, 적어도 5 wt%, 바람직하게는 적어도 10 wt%, 더욱 바람직하게는 적어도 15 wt%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 20 wt%이며, 지금까지 발견된 최상의 양태에서는 바람직하게는 적어도 25 wt% 그리고 더욱 바람직하게는 30 wt% 이상의 단백질이 사용된다. 단백질 농도의 상한은 단백질 재료가 매질에서 배열되기 위하여 충분히 이동성이어야 하는 요건에 의해 지배된다. 이것은 본 출원을 기초로 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 실제로, 단백질 함량은 약 60 wt%보다 높지 않을 것이며 그리고 바람직하게는 50 wt%보다 높지 않을 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서 식용 단백질은 카제인, 그리고 구체적으로는 소 우유 카제인에 기초한다. 소 우유 카제인은 주로 4:4:2:1의 비율의 α S1 -, α S2 -, β- 및 κ-카제인으로 구성된다. α- 및 β- 카제인의 세린과 트레오닐 포스페이트는 칼슘(Ca 2 + ) 및 다른 2가 및 3가 이온과 상호작용할 수 있다. 이 상호작용으로 인하여, 칼슘 카제이네이트 분산액은 우유중의 카제인 미셀(~ 100-300 nm)과 견줄만한 단백질 응집물을 함유하며; 소듐 카제이네이트는 보다 개방된 3차 구조를 가지며 약 50 nm의 단백질 응집물을 형성한다. 소비에 안전해야 하는, 2가 및 그 이상의 양이온을 함유한, 그리고 가장 바람직하게는 칼슘 이온을 함유한, 카제이네이트 분산액중의 더 큰 단백질 응집물때문에, 카제이네이트의 2가 및 그 이상의 양이온 형태가 특히 본 발명에 사용하기 바람직하다. 그러나, 또한 유성 종자로부터 유도가능한 (풍미제거된) 대두 및 다른 식물성 단백질; 일반적인 식물성 단백질, 유장 단백질 농축물(WPC 분말), 유장 투과물, 우유 단백질, 카베인, 감자 단백질, 오브알부민 및 그러한 단백질의 혼합물이 사용될 수 있다. 단백질-가교결합을 위하여, 단백질 다이설파이드 아이소머라제, 설프하이드릴 옥시다제, 폴리페놀 옥시다제, 라이실 옥시다제, 퍼옥시다제, 트랜스글루타미나제, 버섯 티로시나제, 리폭시게나제 및 글루코스 옥시다제와 같은 상대적으로 많은 수의 효소 유형이 원칙적으로 적격이다. 언급된 효소들은 상이한 반응을 촉매하며, 배열될 출발 생성물에 존재하는 단백질에 따라, 당업자는 적합한 효소를 선택할 수 있다. 특히 그들의 이용가능성때문에, 트랜스글루타미나제, 퍼옥시다제 및 글루코스 옥시다제가 매우 적합하다. 바람직한 실시 형태에서, 트랜스글루타미나제가 단백질-가교결합 효소로서 사용된다. 두 가지 유형의 트랜스글루타미나제가 알려져 있다: 동물 및 미생물. 동물 트랜스글루타미나제와는 반대로, 미생물적으로 생산된 트랜스글루타미나제의 활성은 칼슘 이온의 존재와 무관하다. 효소 트랜스글루타미나제는 단백질간의 특이적 가교결합 반응을 촉매한다. 보다 구체적으로, 단백질 분자의 글루타민 기는 공유 결합을 통하여 단백질 분자의 라이신 기와 결합되며, 그로인해 분자간 결합이 형성될 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용될 바람직한 단백질은 카제인에 기초하며, 더욱 바람직하게는 칼슘 카제이네이트이다. 카제인은 트랜스글루타미나제를 위한 적합한 기질을 형성한다. 이 효소의 추가 설명을 위해서는, Bulletin of the IDF 332, pages 47-53, Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 49(3) 221-227 (1997), 및 Nahrung-Food 42(3-4) (1998) 151-154에서 Lorenzen와 Schlimme에 의해 개시된 내용, Nonaka et al ., J. Food Sc. 57(5) (1992) 1214, 및 EP-A-0 610 649호를 참고한다. 트랜스글루타미나제는 특히 일본 동경의 아지노모토 컴퍼니 인코포레이티드(Ajinomoto CO.,Inc.)로부터 구매가능하다. 가교결합 효소를 이용한 고형화는 원하는 이방성 구조 형성을 이루는 데 필수적인 것으로 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 섬유성 재료는 각각 주사 전자 현미경(SEM) 및 기계적 분석으로 결정될 수 있는 것처럼 미시규모 및 거시규모 둘 모두에서 이방성을 나타냈다. SEM은 ~ 100-200 nm의 직경을 가진 단백질 섬유를 밝혔으며, 시각적으로는 최대 1 mm의 섬유가 관찰되었다. 단순전단 및 가교결합 효소, 바람직하게는 트랜스글루타미나제, 둘 모두는 상당한 정도로 섬유의 강화에 영향을 미친 한편, 전단 유동에 수직인 방향에서 기계적 특성은 일정하게 남아 있었다. 유동학적 특성은 등방성이었으며 가교결합 효소에 의해서만 영향을 받았다. 트랜스글루타미나제없이 Ca-카제이네이트를 전단한 후, 약간 이방성인 층화된 구조가 발견되었으나 섬유는 형성되지 않았다. 전단의 부재하에서의 가교결합, 및 혼합동안의 가교결합 둘 모두가 어떤 배열도 없는 Ca-카제이네이트 젤을 생성하였다. 따라서, 본 발명은 단순전단과 효소에 의한 가교결합의 조합된 적용에 의해 얻어진 상승적 효과에 기초한다. 이 효과는 단순전단과 트랜스글루타미나제(TGA; TG아제로도 불림)를 이용하여, Ca-카제이네이트를 위해, 하기의 실시예 1의 표 2에서 예시된다. Ca-카제이네이트 샘플의 상응하는 값으로 표준화되어, 전단(정지 조건하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트로 표준화된, 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트) 및 TGA(TGA없이 전단된 Ca-카제이네이트로 표준화된, 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트)의 효과가 추론될 수 있는, 인장 특성의 값들이 얻어진다. 전단과 TGA 둘 모두가 평행한 방향에서 상당한 정도로 인장 특성에 영향을 미쳐, 이방성 미세구조의 방향에서 인장 특성에 영향을 주었다. 더욱이, 표준화된 항복 응력 값을 고려할 때, (TGA의 존재하에서)전단의 강화 효과는 TGA만의 효과의 거의 두배의 크기였다. 본 발명의 방법에서, 층화된 구조가 형성된다. 구체적으로, 단순전단동안 효소적 가교결합은 단백질 응집물의 형태를 섬유로 변화시킨다. 두번째 주요 양태에서, 본 발명은 따라서 미시규모에서 이방성을 가지며(즉, SEM을 이용하여 형태를 연구할 때 배향된 구조를 가짐) 그리고 거시규모에서 이방성을 가지는(즉, 육안으로 형태를 연구할 때 배향된 구조를 가짐), 섬유성 계층적 식용 단백질 구조에 관한 것이다. 거시규모에서의 이방성은 또한 인장 강도 시험을 이용하여 결정할 수 있다: 거시규모에서의 이방성의 경우 상이한 방향에서 시험 조각을 측정할 때 상이한 인장 강도가 얻어진다. 이들 단백질 구조는 육류처럼 거동하며 심지어 구울 때 갈변화를 나타낸다. 이 갈변화를 더욱 명백하게 하기 위하여, 소량의 환원당, 바람직하게는 락토스를 첨가할 수 있다. 세번째 주요 양태에서, 본 발명은 음식 용도를 위한 성분으로 사용하기에 적합한 이방성 섬유 형태를 갖는 유리 섬유성 입자에 관한 것이다. 미립자 특징때문에, 이들 입자는 점도 증가 효과를 갖는다. 이들 입자는 매우 액체에서 거의 고체 생성물까지를 비롯한, 넓은 범위에 걸쳐 생성물의 점도를 조절하도록 한다. 또한, 섬유성 입자는 (진한) 액체 생성물의 유동 거동에 영향을 줄 수 있다. 입자의 이방성 특징은 그러한 섬유가 사용되는 시스템의 관성의 증가에 추가의 효과를 제공한다. 유사한 효과는 항복 거동을 가진 보다 고체인 시스템에 적용된다. 단백질의 구조의 미세 조절에 의해, 즉, 미시 또는 거시 규모에서 더 높거나 더 낮은 양의 이방성을 구조에 제공함으로써, 완전히 상이한 점도 및/또는 유동 거동을 갖는, 동일한 단백질 함량을 가진 생성물이 제조될 수 있다. 분산된 상의 이방성 특징은 또한 전단 박화 거동 및, 선택적으로 항복 거동을 생성물에 제공할 기회를 제공한다. 즉, 진한 생성물이 전단을 거칠 경우, 상기 생성물의 점도는 감소한다. 진한 생성물은 유동성이 되거나 또는 스푼으로 떠낼 수 있게 될 수 있으며 그리고 이어서 다시 진해질 수 있다. "비-전단 장비"와 관련하여 상기에서 언급한 것처럼, 일부 용례의 경우 이방성 부분이 등방성 매트릭스에 함유된 재료를 얻는 것도 생각할 수 있다. 이 예는 또한 유리 섬유, 즉, 반드시 계층적 구조의 일부는 아니지만 대부분 매트릭스에 의해 서로 분리되는 섬유를 제조하는 방법이다. 그러한 유리 섬유를 제조하기 위하여, 전단될 현탁액에 존재하는 추가의 상을 갖는 것이 필수적으로 보인다. 구체적으로, 화학적 결합에 참여하지 않을 다당류 또는 단백질이 유리 섬유를 생성할 수 있다. 이러한 추가의 상이 존재하면, 계층적 조직중에 보다 유리된 관계가 발생하며, 이는 유리 섬유로 귀결될 수 있다. 따라서, 현탁애에 존재하는 추가 상의 존재에 따라, 그리고 가공 파라미터에 따라, 계층적 구조 또는 유리 섬유, 또는 유리 섬유와 계층적 구조 사이의 전체 회색 영역이 얻어질 수 있다. 이와 관련하여 또한 하기의 실시예 3을 참고한다. 본 방법에 사용될 적합한 다당류는 잔탄, 카라기난, 갈락토만난, 구아 고무, 타라 고무, 카로브 콩(carob bean) 고무, 아라비아 고무, 펙틴, 카르복시 메틸셀룰로오스(CMC), 메틸셀룰로오스(MC), 및 하이드록시 프로필셀룰로오스(HPC)를 비롯한 셀룰로오스, 및 변성 전분을 비롯한 전분이다. 다당류는 본 발명에 따라 가공될 현탁액중의 단백질 함량을 감소시키도록 하며 및/또는 섬유의 결합력 및/또는 조직 형성 능력의 변화를 가능하게 하며 그리고 궁극적으로는 유리 섬유의 형성을 야기할 수 있다. 현탁액에 첨가될 그러한 단백질 또는 다당류의 적합한 양은 일반적으로 0.01-5 wt%, 바람직하게는 0.05-3 wt%, 더욱 바람직하게는 0.1-1.5 wt%이며 및/또는 추가 단백질 또는 다당류의 양(중량) 대 배열될 단백질의 중량은 1:1000-1:5, 바람직하게는 1:500-1:8, 더욱 바람직하게는 1:100-1:10의 범위이다. 바람직한 실시 형태에서 이들 섬유성 구조는 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 트랜스글루타미나제에 의해 가교결합된 카제이네이트에 기초한 섬유성 구조가 매우 바람직하다. 본 발명의 이방성 섬유성 샘플은 수직 방향에 비하여 평행 방향에서 훨씬 더 강하다. 이것은 특히 항복 응력 비율에 의해 반영될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 섬유성 구조는 적어도 6, 바람직하게는 적어도 7 그리고 가장 바람직하게는 적어도 8의 항복 응력 비율 σ 평행 /σ 수직 을 갖는다. 칼슘 카제이네이트의 경우, 항복 응력 비율 σ 평행 /σ 수직 은 적합하게는 약 9일 수 있다. 전단- 및 효소-유도된 이방성 구조의 형성은 전단 및 배열된 단백질 응집물의 동시적인 고형화로 인한 단백질 응집물의 향상된 상 분리에 의해 설명되었다. 단순전단과 효소적 가교결합을 이용한 칼슘 카제이네이트의 효소적 젤화는 신규한 섬유성 단백질 구조를 유도한다. 생성된 미세구조 특성은 SEM 분석으로 연구하였다. 바람직한 선형 점탄성 특성과 바람직한 기계적 특성을 야기하는 작고 큰 변형을 가진 구조적 특징이 밝혀지며, 이들 특성은 트랜스글루타미나제로 가교결합된 칼슘 카제이네이트 구조를 위해 하기에서 보다 상세히 설명될 것이다. 실제로, 먼저 적합한 매질, 바람직하게는 수성 매질중의 단백질의 용액 또는 분산액을 프리믹스로서 제조한다. 이 프리믹스를 전단 셀로 옮기고, 바람직하게는 35 내지 50 ℃의 온도로 가열한다. 가교결합 효소를 전단 셀에 도입하거나 또는 바람직하게는 이미 프리믹스에 도입하며, 그리고 혼합물을 단순전단을 거친다. 적절한 결과를 위하여, 즉 명확한 전단 필드를 위해, 전단 셀을 완전히 충전시키는 것이 필요하다. 전단은 단백질 재료의 배열을 일으키기에 충분히 높아야 하지만, 구조가 파괴될 수 있으므로 너무 높지 않아야 한다. 본 발명에 따라, 전단-유도 구조 형성 및 동시의 고형화에 기초한 기술을 이용하여, 이방성 섬유성 단백질 구조, 및 바람직하게는 이방성 Ca-카제이네이트 구조가 형성되었다. 전단 동안 효소적 가교결합은 이방성 구조 형성에 필수적인 것으로 보인다. 얻어진 높은 이방성과 조합된 방법의 단순함은 신규한 음식 구조 및 용례를 위한 본 기술의 높은 잠재성을 보여준다. 상기한 바와 같이 전단 동안의 가교결합은 필수적이며, 사용되는 구체적인 단백질에 대한, 효소 유형과 활성, 전단 속도 및 가공 시간의 조정은 구체적인 단백질에 의존한다. 25-30 wt% 칼슘 카제이네이트를 함유한 수성 매질의 경우, 예를 들어, 트랜스글루타미나제(TGA)를 이용하는 도 1에서 나타난 장치에서의 최소 전단 속도(하기 참고)는 24 s -1 이며, 가공 시간은 300 내지 3600 초이다. 최적 온도는 사용되는 효소에 의해 결정된다. TGA의 경우, 이것은 약 50 ℃이다. 하기의 실시예에서, TGA와 조합된 칼슘 카제이네이트가 본 발명을 위한 모델 시스템으로 사용된다. 전단 및 TGA를 이용한 효소적 가교결합 후, 이방성 섬유성 구조가 거시- 및 미시규모에서 농축된 Ca-카제이네이트 매트릭스에서 형성된 것으로 나타난다. 최대 1 mm의 섬유가 시각적으로 관찰된 한편, SEM 이미지는 사슬형 단백질 도메인으로 구성된, ~ 50-200 nm의 직경을 가진 단백질 섬유를 보여주었다. TGA가 없는 경우에는, 층화되고 약간 이방성인 구조가 발견되었으나 섬유는 형성되지 않았다. 전단의 부재하에서의 가교결합은 어떤 배열도 없는 강한 Ca-카제이네이트 젤을 야기하였다. LVE 특성은 TGA의 첨가로 인한 G' 의 증가 및 tanδ의 감소를 나타냈다. 이들 특성은 등방성이었다(즉, 변형의 방향과 무관하였다). 대조적으로, 인장 특성은 특히 가해진 전단 유동에 비교하여 평행 방향과 수직 방향에서의 항복 응력 값 사이의 큰 차이를 기초로, 이방성 구조의 존재를 확인하였다(하기 참고). 전단은 이방성 섬유의 강화에 상당히 영향을 주는 한편, 수직 방향의 특성은 일정하게 남아 있었다. TGA는 또한 전단 방향에서 구조 형성에 상당히 영향을 미쳤다. 농축된 단백질 분산액을 전단할 때, 층화된 구조가 형성되었으며, 이 구조는 도 10에서 개략적으로 도시된다. 전단동안의 효소적 가교결합은 단백질의 형태를 섬유로 변화시켰다. 어떤 특정한 이론에 얽매임 없이, 본 발명의 방법에서 전단으로 인한 분자 수준에서의 단백질 응집물의 상 분리는 전단- 및 효소-유도된 이방성 구조로 유도하는 것으로 생각된다. 효소적 가교결합은 가능하게는 고형화 제제가 존재하지 않을 때 전단을 중단하면 완화될, 배열된 단백질 응집물을 고형화하는 데 필요하다. 하기의 실시예에서는, 카제인 응집물이 조밀하게 채워지거나 잼 상태인, 고도로 농축된 카제이네이트 시스템이 사용된다. 정지시에 시스템에 이미 존재했을 수 있는, 낮은 계면 장력을 가진 단백질-풍부 상과 단백질-부족 상으로의 국소적 상 분리는 전단에 의해 향상되어 이들 상의 배열을 야기하였다. TGA의 부재하에서, 전단과 Ca 2 + -상호작용의 조합 효과는 층화된 Ca-카제이네이트 거대구조로 유도하였으며, 이 구조는 인장 시험 동안 이방성 거동을 나타냈다. 대조적으로, 미세구조는 전단에 의해 거의 영향을 받지 않았다. 이것은 도 10A에 도시된 것과 유사하게 층화된 구조를 야기할 것이다. 미시규모에서 Ca-카제이네이트에서의 배열은 상분리와 전단으로 인하여 존재하였지만, 사용된 고형화 방법, 즉, 냉각의 시간 규모는 배열된 단백질 조립체의 이완 시간보다 훨씬 더 길었을 것이다. 따라서, 전단된 Ca-카제이네이트는 섬유성 구조를 야기하지 않았다. TGA의 존재하에서, 가교결합은 가능하게는 Ca-카제이네이트 응집물의 크기를 증가시켜, 이들을 전단에 의한 배열에 더욱 더 민감하도록 만들었다. 추가로, 상분리된 단백질-풍부 상에서는, TGA는 유동 방향에서 공유 결합을 유도하였다. 고형화는 이완보다 더 짧은 시간 규모에서 발생하였기 때문에, 섬유성 미세- 및 거대구조는 전단의 중단 후에 보존되었다. Ca-카제이네이트와 Na-카제이네이트는 상이한 물리적 특성을 가지며 따라서 이방성 구조를 얻기 위하여 상이한 체제를 요구한다. 밀도 높은 카제이네이트 분산액의 전단-유도 구조 형성에서의 차이를 위하여 하기 구성이 고려된다. 본 발명자들은 밀도 높은 카제이네이트 분산액을 콜로이드성의 빽빽하게 채워진 연질 구형을 포함하는 시스템으로, 그리고 시간과 전단 유동에 따라 형성되고 파괴될 수 있는 얽힘을 가진 반-희석 중합체-유사 시스템으로 간주한다. 전단은 시스템의 이동성에 의해 그 효과가 보상될 수 없다면 이들 시스템에서 구조를 유도할수만 있다. 이것은 Ca-카제이네이트의 고유의 물리적 특성이 전단-유도된 구조 형성이 본 발명자들이 조사한 시간 규모에서 선호되도록 함을 나타낸다. Ca-카제이네이트를 기초로 얻어진 결과를 참고하여, 다른 식용 단백질을 기초로 어떻게 유사한, 새롭고 유용한 이방성 섬유성 구조를 얻을 수 있는지가 당업자에게 명백할 것이다. 구체적인 조건은 단백질에 따라 변할 수 있지만, 당업자는 선택된 조건이 요구된 이방성을 생산하기에 적합한지 여부를 평가할 수 있을 것이다. 임의의 주어진 식용 단백질로 본 발명을 해결할 때 고려되어야 할 조건은 전단 속도, 전단 기간, 온도, 전단 점도, 반대이온, 단백질 농도, 단백질 입자 크기, 상호 인력 상호작용의 강도, 비-단조 유동 거동, 유의한 법선 응력을 포함한다. 이론에 얽매임없이, 본 발명의 지식으로, 방법 조건을 결정하기 위하여 이론적 모델을 적용할 수 있다. 이것은 Na-카제이네이트를 참고로 예시된다. 일반적으로, 전단 유동은 수력학 힘이 브라운 운동을 지배할 때 구조적 요소를 전단 유동 방향을 향하여 배열시키는 경향을 가질 것이며, 이는 페크렛 수(Peclet number)에 의해 표현된다(Macosko, CW (1994). Rheology: Principles, measurements, and applications . New York: Wiley-VCH): 구조적 요소의 반경은 a 로 나타내며, 는 전단 속도이고,η 은 용액의 (전단) 점도이며, k 는 볼츠만 상수이고 T 는 온도이다. Pe 수는 입자, 또는 이 경우에는 미셀 단백질의 전단 유도 배열에 관련된 주요 파라미터(즉, 입자 크기와 전단 속도)를 요약한다. Pe 가 Ca- 및 Na-카제이네이트를 위한 측정 규격(sc aling rule)으로 적용될 경우, Na-카제이네이트가 전단 유동에 의해 영향을 받을 전단 속도가 예측될 수 있다: Na-카제이네이트 응집물의 크기 a NA 가 Ca-카제이네이트 응집물의 크기 a CA 보다 5배 만큼 작다고 가정하고( a NA ~ 25 nm 및 a CA ~ 125 nm 로 가정 (De Kruif, CG (1998). Supra-aggregates of casein micelles as a prelude to coagulation. Journal Of Dairy Science , 81(11), 3019-3028. Lucey, JA, Srinivasan, M., Singh, H. & Munro, PA (2000). Characterization of commercial and experimental sodium caseinates by multiangle laser light scattering and size-exclusion chromatography. Journal Of Agricultural And Food Chemistry , 48(5), 1610-1616. Dickinson, E., Semenova, MG, Belyakova, LE, Antipova, AS, Il'in, MM, Tsapkina, EN & Ritzoulis, C. (2001). Analysis of light scattering data on the calcium ion sensitivity of caseinate solution thermodynamics: Relationship to emulsion flocculation. Journal Of Colloid And Interface Science , 239(1), 87-97), 그리고 전단 점도 η 에 대해 약 2배의 차이가 있다고(~ 120 s -1 의 전단 속도에서 η CA ( ) 2·η NA ) 가정하면, Na-카제이네이트에서 배열을 유도하는 데 필요한 전단 속도는 Ca-카제이네이트에 비하여 약 2.5·10 2 배 더 큰 것으로 유추될 수 있다. 전단-유도 배열을 위한 다른 기준은 드보라 수(Deborah number)( De ), 즉, τ와 전단 속도의 곱에 기초하며, 이것은 1의 값을 초과하여야 한다: ( )(Forster, S., Konrad, M. & Lindner, P. (2005). Shear thinning and orientational ordering of wormlike micelles.Physical Review Letters , 94(1), 17803-17801-17804). 그러면 상호작용을 포함하는 하기 측정 규격이 적용가능하다: Ca- 및 Na-카제이네이트를 위한 측정 규격으로서 De 수를 이용하면, Na-카제이네이트에서 배열을 유도하는 데 필요한 전단 속도 또한 Ca-카제이네이트에 필요한 전단 속도에 비하여 2 차수(10 2 ) 더 큰 양으로 결론지을 수 있으며, 이것은 Pe 수에 기초한 예측과 일치한다. Pe 와 De 둘 모두 전단 속도, 전단 점도, 입자 크기, 및 단백질 상호작용과 같은, 전단 유도 구조 형성에 중요한 인자를 나타낸다. 이들 인자는 성분 특성과 가공 둘 모두에 의해 영향을 받으며, 카제이네이트의 구조 형성을 위해 당업자가 이들 양상을 매치시키는 것이 중요함을 강조한다. 더욱이, 이들 무치수 수의 사용은 한편으로는 빽빽하게 채워진 구형이며 다른 한편으로는 얽힌 중합체 네트워크로서 카제이네이트 시스템의 기계학적 접근과 일치한다. 당업자는 산업적으로 관련된 재료에서 전단-유도 구조 형성에 관련된 일부 인자들의 중요성을 알 것이다: 1. 전단 및 효소적 가교결합으로 인한 섬유 형성은 예를 들어, 유동학적 거동에 상당히 영향을 미치는, 존재하는 반대 이온 및 이방성 구조를 얻기 위한 단백질 농도에 의해 영향을 받는다. 2. 만일 출발 재료가 전단에 의한 질서화에 민감하면 전단-유도 구조 형성이 일어나기 쉽다. Na-카제이네이트에 비하여 Ca-카제이네이트에서의 더 큰 미셀 구조 요소와 상당한 인력 상호작용은 구조 형성에서 발견되는 차이를 설명한다. 일반적으로, 본 발명의 지식으로, 단백질에 따라, 이온 농도(예를 들어, 칼슘 카제이네이트의 경우에는 칼슘) 역시 얻어지는 이방성을 결정할 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 3. 산업적으로 관련된 단백질 혼합물은 구조의 유형 및 유동학적 거동과 같은, 전단-유도 구조 형성을 연구하기 위해 종종 사용되는 모델 재료와 유사성을 나타내는 것으로 보인다. 후자 거동에서 관찰된 주요 유사성은 비-단조 유동 거동, 상당한 법선 응력, 및 인력 상호작용이며, 그와 함께 유동학적 측정이 단백질의 구조 형성 능력의 분석에 유용함을 나타낸다. 본 발명의 지식으로, 이완 시간 및 전단 박화 또는 증점화와 같은 파라미터를 사용하여 과도한 실험없이, 본 발명에 따라 계층적 섬유성 구조를 얻기 위해 단백질 현탁액의 잠재적 적합성을 평가할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 섬유성 식재료는 첨가제를 함유할 수 있다. 따라서, 혼합물은 하나 이상의 첨가제, 구체적으로 향미료, 추가의 영양 성분, 건강에 유익한 성분, 및 착색제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 함유할 수 있다. 하나 이상의 적절한 향미료 및/또는 착색제를 첨가함으로써 원하는 맛 및/또는 외관을 얻을 수 있다. 다른 첨가제는 예를 들어, 방부제이며, 소듐 벤조에이트가 잘 알려진 그 예이다. 본 발명으로, 소듐 벤조에이트가 필요에 따라 섬유의 형성을 촉진하는 데도 바람직한 성분임이 밝혀졌다. 이론에 얽매임없이, 소듐 벤조에이트와 같은 추가된 염은 단백질 용액의 이온 강도를 증가시킴으로서, 단백질-단백질 상호작용에 영향을 주는 능력을 가지며, 이는 시스템의 열동력학에 영향을 미친다는 것이 본 발명자들의 현재의 생각이다. 구체적으로, 칼슘 카제이네이트의 경우, 적합한 이온 강도의 염은 칼슘 결합을 위하여 카제이네이트와 경쟁할 수 있다. 따라서, 그 칼슘 결합의 일부를 손실함으로써, 카제이네이트 구조는 내부 응집력을 잃게 되며, 그리고 따라서 전단에 보다 수용적이 되며, 그리고 더 잘 배열될 수 있는 것으로 생각된다. 역시, 당업자는 첨가된 염이 있거나 없는 주어진 단백질 시스템을 위하여, 선택된 조건이 단순 전단에 의해 필요한 이방성을 얻는데 충분한지 여부를 적절히 직접적인 방식으로 결정할 수 있을 것이다. 염은 바람직하게는 1가 양이온 및 음식 등급 2가 음이온을 포함한다. 실시예는 소듐 락테이트, 소듐 시트레이트, 및 소듐 포스페이트와 같은 가공 치즈 제조로부터 알려진 것과 같은 염, 및 단백질에 결합된 칼슘과 경쟁하기 위하여, 칼슘 결합에 대한 견줄만한 친화성을 가진 다른 염을 포함한다. 소듐 D-락테이트와 소듐 트라이폴리포스페이트가 특히 적합하다. 이들 염은 일반적으로 0.1 내지 10 wt%, 바람직하게는 0.1 내지 4 wt% 그리고 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2.5 wt%의 범위로 사용될 수 있다. 소듐 카제이네이트 또한 사용될 수 있으며, 전형적으로 1 내지 40 wt%의 더 높은 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, 본 방법은 지방의 추가 존재를 이용한다. 방법에 사용되는 조성물에 지방이 존재할 경우, 지방은 단백질-물 시스템에 이미 존재하는 미시- 및 거시규모의 이방성에 더하여, 중간규모 수준의 구조를 유도한다. 지방은 최대 30 wt%의 양으로 그리고 때로는 심지어 더 높은 양으로 현탁액에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 지방의 양은 25 wt% 미만이며, 더욱 바람직하게는 20 wt% 미만이다. 적합한 지방은 모든 종류의 식물성 및 동물성 지방을 포함한다. 바람직한 동물성 지방은 유지방 및 특히 소의 우유 지방을 포함한다. 바람직한 식물성 지방은 해바라기 지방, 대두 지방, 평지씨 지방, 곡식 및 옥수수 지방 및 그 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서 유제품 지방에 비교할 때 증가된 다중불포화 지방 대 포화 지방(pufa/safa) 비율을 가진 지방이 사용된다. 사용되는 지방은 가공 동안 액체여야 한다. 두번째 상으로서 지방을 사용하면 단일 상 단백질에 비하여 계층적 단백질-지방 재료에서 추가의 길이 규모에서의 구조화를 가능하게 한다. 트랜스글루타미나제(TGA)를 이용한 동시의 효소적 가교결합은 전단-유도 구조의 고정화를 가능하게 한다. 실시예에서, 전단 속도, 전단 시간 및 단백질 농도의 효과는 단순 전단 및 TGA를 이용한 효소적 가교결합을 적용함으로써 Ca-카제이네이트와 야자 지방에 기초한 이방성 구조의 형성에 대해 나타난다. Ca-카제이네이트-지방 구조는 공초점 주사 레이저 현미경(confocal scanning laser microscopy)(CSLM) 및 주사 전자 현미경(SEM)으로 조사하였다. 작고 큰 변형은 각각 독특한 Ca-카제이네이트-지방 재료의 크립 거동(creep behavior)을 비롯한 선형 점탄성 (LVE) 특성, 및 인장 특성에 대한 통찰을 제공하였다. 보다 상세하게는, 칼슘 카제이네이트 분산액과 야자 지방 계층적 섬유성 재료에 기초한 시험 시스템이 명확한 변형하에서 효소적 가교결합후에 형성된다. 연장된 전단 시간은 섬유성 재료에서 시네레시스(syneresis)를 수반한 손상된 구조로의 전이에 영향을 미쳤다. 구조 형성에 대한 지방의 효과와 관련하여, 지방을 함유한 전단되고 가교결합된 섬유성 Ca-카제이네이트 구조가 SEM 이미지에 기초할 때 지방이 없는 섬유성 구조와 거의 차이를 나타내지 않았음이 주목된다. 추정된 섬유 두께는 다소 유사하였으며(~ 100-200 nm), 카제인 미셀의 범위 이내였다. 그러나, CSLM에서는, 단백질-지방 재료에서 추가의 길이 규모가 관찰되었으며, 여기서는 단백질 번들과 신장되거나 변형된 지방 구조가 보였다. 결합은 전단 유동 방향에서만 생성되며, 이것은 전단에 의해 유도된 단백질 배열에 의해 이미 촉진되었을 가능성이 높다. 지방의 존재는 유동에 수직인 방향에서 공유 결합의 형성을 방해하여, 가능하게는 재료의 섬유성 특성을 향상시킨다. 지방을 함유한 섬유성 샘플의 기계적 특성의 값은 지방이 없는 섬유성 단백질 샘플에 비하여 약간 더 높아서, 고형 지방 상에 의한 구조의 강화를 제안하였다. 전단 유동에 평행하여 그리고 수직하여 측정된 기계적 특성의 비율은 지방이 없는 섬유성 샘플과 유사하여, 약 8-9의 높은 항복 응력 비율을 가졌다. TGA의 부재하에선, 지방 소적은 TGA를 함유한 섬유성 구조에 존재하는 지방 소적에 비하여 등방성 Ca-카제이네이트-지방 재료에서 더 크고 덜 변형되었다. TGA의 존재하에서는, 매트릭스에서의 점도가 전단 시간 증가에 따라 증가하여, 큰 점성력 및 따라서 소적 분해로 유도할 것이다. 그러나, 매트릭스 탄성의 증가는 분산된 상의 신장을 향상시킬 것이며, 그리고 일시적으로는 유동 방향을 향한 배향을 향상시킬 것이다. 상의 점도 비율 또한 명확한 변형동안 구조 형성에 영향을 주며: Ca-카제이네이트와 지방의 전단과 가교결합동안의 경우이기 쉬운, 분산된 상의 점도가 매트릭스 상의 점도보다 낮을 경우, 소적은 전단 동안 신장될 것이다. 구조 형성에 대한 단백질 농도의 효과에 대하여, Ca-카제이네이트 분산액이 우유중의 카제인 미셀(~ 100-300 nm)에 견줄만한 단백질 응집물을 포함함이 주목된다. 이들 구조적 요소는 수력학적 힘이 우세할 때 전단에 의한 배열에 민감하기 쉽다. TGA는 단백질 상에서 공유 결합을 유도하여, 카제인 클러스터의 크기를 증가시키며, 이는 전단에 의한 배열에 대한 그들의 민감성을 향상시킬 것이다. 24 s -1 에서의 전단 후 등방성 재료가 형성된 사실에 기초할 때, 적용된 전단 속도가 구조적 요소, 즉, 카제인 분자 또는 더 낫게는 상대적으로 더 높은 속도에서 가교결합된 카제인 미셀을 배열시키기에 너무 낮았던 것으로 가정된다. 배열과 섬유의 형성을 위해 상대적으로 높은 전단 속도(> 120 s -1 )에서의 전단이 필요하였다. 전단 속도가 너무 낮을 경우, 단백질 매트릭스는 전단 박화 거동으로 인하여 더욱 점성이다. 따라서, 더욱 랜덤한 공유 네트워크가 형성되기 쉬우며, 이 네트워크는 신속하게 삼투된 상태에 도달할 것이다. 높은 전단 속도(240 s -1 )에서의 전단은 기계적 특성에 의해 반영되는 바와 같이 향상된 섬유질성(fibrousness)을 야기하였다. 이것은 높은 전단 속도로 인한 미세 상 분리의 증가로 인한 더 많은 섬유, 및 얇은 층에서 작은 지방 소적의 존재에 의해 설명될 수 있다. 요약하면, 전단 속도는 Ca-카제이네이트와 지방에 기초한 섬유성 재료의 생성 및 섬유질성 정도에 영향을 주는 필수적인 도구로 보인다. 본 발명에 따라, 가교결합 속도와 전단 속도 사이의 상호작용이 섬유성 구조의 형성을 결정한다. 그 결과는 얻어질 수 있는 구조의 유형의 개요를 제공하기 위하여 다이아그램(도 21)으로 요약된다. y-축에는 r s /j s 를 산출하는, 고형화 속도( r s ) 및 전단 속도가 프로세스 시간의 함수로서 그려진다. 효소적 가교결합의 경우에는, π s 는 [E/P]에 비례하는 한편, 전단 속도는 배열의 척도로서 해석된다. [E/P]에 영향을 주는 단백질 농도 효과, 및 점도를 배제하기 위하여 25% Ca-카제이네이트-지방 재료를 제외하고, 30% Ca-카제이네이트-지방 재료를 위한 모든 실험 데이터 포인트가 다이아그램에 도시된다. 후자의 효과는 매우 비-선형인 것으로 예상되며 추가 조사를 요한다. 실험 데이터와 이론적 고려사항에 기초할 때, 4 개의 구조 영역이 다이아그램에서 구성될 수 있다: (1) F로 표시되는 섬유성 구조, (2) G로 표시되는, 과전단 후 손상되고 분해되는 구조인 '과립' 구조, (3) Is로 표시되는, 고체로 가교결합되지만 배열되지 않는 등방성 고체 재료, 및 (4) Il로 표시되는, 출발 재료와 동일한 농도를 함유한 재료인 등방성 액체 재료. 6.10 -4 미만인 고정된 [E/P]/γ 비율에서, 세 가지 구조적 전이가 프로세스 시간 증가에 따라 발생할 수 있다. 먼저, γ→ ∞ 또는 [E/P]→ 0일 때, 짧은 프로세스 시간에서 등방성 액체가 형성된다. 수력학적 힘이 우세할 때 전단 배열되기 쉬운 구조적 요소는 높은 전단 속도에서 배열될 것이지만, 고형화가 적용되지 않을 때 그들의 배향을 잃을 것이다. 그러나, 매우 낮은 고형화 속도에서, 배향은 더 긴 시간 규모에서 고정되어 섬유성 재료를 야기할 것이다. 이러한 전이는 선 a 로 표시된다. 더 긴 프로세스 시간에서는 배열된 구조가 분해되어, 시네레시스를 수반한 '과립' 구조를 야기할 것이며, 이것은 시간-의존성 전이 선 b 로 도시된다. 고형화 속도가 전단 속도를 지배하는 일부 지점에서는([E/P]/γ > ~ 8.10 -4 ), 섬유성 재료에서 등방성 고체로의 시간에 무관한 전이가 발생하며, 선 c 로 예시된다. γ→ 0 또는 [E/P]→ ∞일 때, 역시 세 가지 시간-의존성 전이가 존재한다. 매우 짧은 시간 규모에서는 등방성 액체가 형성되며, 이것은 랜덤한 매우 삼투된 네트워크를 가진 등방성 고체로 신속하게 전환된다(선 a ). 프로세스 시간에 따라 네트워크 강도가 증가할 때, 구조의 분해로 인한, 과립 영역으로의 전이(선 b )가 에상될 수 있다. 증가된 고형화 속도에서는, 등방성 고체에서 과립 재료로의 전이가 더 짧은 시간에서 발생할 것이며, 이것은 선 b 의 점근선 거동을 설명한다. 유사하게, 선 a 는 또한 y-축을 향하여 점근선이다. [E/P]/γ의 값이 임의적이며 조사중인 시스템에 대하여 특이적임을 주목하여야 한다. 그러나, 구조적 다이아그램을 네 가지 구별되는 영역(그중 섬유성 영역이 가장 좁은 영역임)으로 나누는 두 가지의 시간-의존성( a,b ) 및 한 가지의 시간-비의존성( c ) 전이의 존재는 명확한 유동과 고형화에 기초한 구조화 방법에 대해 일반적인 것으로 예상된다. 다이아그램은 명확한 유동 방법 외의 구조화 방법이 왜 고도로 배열되고 섬유성인 구조를 생성하지 않는지에 대한 설명을 제공한다. 혼합 동안, 생물중합체는 상대적으로 낮은 전단 속도에 노출되며, 그리고 때로는 높은 피크 전단 속도에 노출된다. 혼합 동안 고유한 운동으로 인하여, 거대분자는 연속적으로 재배향되며, 그리고 결국에는 전체 재료가 이들 높은 피크 응력에서 처리될 것이며, 이는 구조의 분해를 야기할 수 있다. 따라서, 혼합 동안, 재료는 등방성 고체(영역 Is) 또는 심지어 과립 구조(영역 G)가 신속하게 형성될 것이므로 섬유성 영역에 결코 도달하지 않을 것이다. 다른 구조화 방법은 압출이며 그동안 생물중합체는 층류(laminar flow)로 인하여 슬릿 다이에서 배열되는 경향이 있는 한편, 구조는 다이설파이드 결합 및 냉각동안의 소수성 상호작용에 의해 고정된다. 섬유질성의 정도는 냉각 속도 및 슬릿 다이의 길이에 의해 크게 결정되며, 이는 각각 고형화 속도와 프로세스 시간과 동등하다. 분자 규모에서의 배열은 단백질을 기초로 한 압출된 섬유성 재료에 대해서는 보고되지 않았다. 고온과 조합되어 다이를 통해 재료를 밀어넣는데 필요한 고압은 압출기내의 재료에 대한 높은 전단 응력으로 유도하여, 심각한 단백질 손상과 시네레시스의 위험을 야기한다. 명확한 전단 유동과 효소적 가교결합에 기초한 본 발명의 신규한 구조화 방법은 밀도 높은 Ca-카제이네이트 분산액에서 거시- 및 미시규모에서 매우 섬유성인 구조를 야기한다. 지방의 존재는 중간규모 수준에서 추가의 길이 규모를 유도하였으며, 단백질 섬유(~ 100-200 nm)의 번들(~ 40 ㎛)이 지방과 변형된 지방 소적의 층(~ 10 ㎛)에 의해 분리되었다. 전단 시간과 전단 속도 둘 모두가 섬유성 구조의 형성에 매우 영향을 주었다. 30% Ca-카제이네이트의 경우, 120 s -1 에서의 5분 전단 후 이미 섬유성 구조가 관찰되었으나, 60분 동안의 연장된 전단 후에는 섬유성 구조의 분해가 관찰되었다. 25% Ca-카제이네이트의 경우에는, 이 시스템에서 상대적인 가교결합 속도가 증가함에 따라 분해가 더 빨리 관찰되었다. 낮은 전단 속도(24s -1 )는 등방성 구조를 생성한 한편, 높은 전단 속도(240 s -1 )에서의 전단은 더 높은 정도의 섬유질성을 야기하였다. LVE 특성과 크립 거동은 그들의 배향에 관계없이 구조 형성 동안 효소에 의해 유도된 공유 결합의 효과에 대한 통찰을 제공하였다. 인장 시험은 공유 결합이 전단 유동 방향에서 형성되었음을 나타냈다. 섬유성 구조는 전단에 의해 배열되기 쉬운 구조적 요소를 요구하는 초기 생성물 특성, 및 선형 전단 유동과 배열된 구조의 고형화를 함축하는 명확한 방법 조건의 조합으로 인하여 형성된다. 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예와 도면을 참고하여 보다 상세히 설명될 것이다.
실시예 1 30% w/w Ca-카제이네이트, TGA(중량 기준으로 효소-단백질(E:P) 비율 1:20) 및 탈염수로 이루어진 단백질 프리믹스(pH 6.8-7.0)를 가공 전에 실온에서 저속의 부엌 믹서에서 제조하였다. 보존을 위하여 1%(w/w) 소듐 벤조에이트(네델란드 즈위진드레트의 시그마 알드리치로부터 입수)를 첨가하였다. 부엌 믹서에서 제조된 단백질 프리믹스를 50 ℃의 일정한 온도에서 유지된 사전가열된 전단 셀(도 1에 나타나며 상기 설명에서 상세히 개시됨)로 옮겼다. 전단 셀을 충전시킨 후, 혼합물을 하기 전단 처리를 가하였다: 5 rpm(12s -1 )에서 4분, 이어서 1분내에 5에서 50 rpm(12 내지 120 s -1 )으로 증가, 그리고 50 rpm(120 s -1 )에서 30분. 정지 처리의 경우에, 혼합물을 30초 동안 5 rpm에 노출시키고, 이어서 전단 셀을 35분 동안 중단시켰다(0 rpm). 추가로, 전단 셀 장치에서 제조된 전단된 샘플과 동일한 회전 속도에서, 브라벤더 도-코더에 부착된, 반대 회전 요소를 가진 혼합 보울(W-50)에서 Ca-카제이네이트 샘플을 제조하였다. (NA2100 질소와 단백질 분석기(이태리 밀라노의 CE 인스트루먼츠(Instruments)로부터 입수)를 이용하여 두마스(Dumas) 방법에 의해, 가공된 샘플의 단백질 함량을 결정하였다. 질소-단백질 전환 인자는 6.38이었다(Grappin & Lefier, Proc. Int. Dairy Fed. Seminar (1993), Cork; 및 Guo et al ., Int. Dairy J. 6(5) (1996) 473-483 참고). 95% 신뢰 구간내에서 28.43% ± 1.12%였던 평균 측정 단백질 함량은 30%의 목표 단백질 함량과 일치하였다. 혼합되고 가교결합된 Ca-카제이네이트 샘플은 35.39%의 단백질 함량을 가졌으며, 이것은 시네레시스로 인한 것이었다.) 가공 후, 재료를 수조로 ~ 10분내에 약 12 ℃로 정지 전단 셀에서 냉각시켰다. 혼합된 재료는 냉각시키지 않았으나 샘플은 50 ℃에서 즉시 취하였다. 가공된 재료를 두 개의 사각형 평행 플레이트(100 x 100 mm)로 이루어진 주형으로 옮겼으며, 이것은 3 mm의 제어된 샘플 높이를 제공하였다. 추가 분석(인장 시험 및 SEM을 위한 샘플 제조)을 위하여 재료의 일부를 2 시간 이내에 사용하였으며, 일부는 추가 분석(단백질 함량 및 LVE 측정)때까지 4 ℃의 냉장고에서 보관하였다. 거대구조 양상과 관련하여, 전단 동안의 TGA를 이용한 가교결합은 전단 유동의 방향을 따라 파괴될 수 있는 실제 섬유성 거대구조를 야기하였음이 주목된다. 얻어진 구조는 백색이고 광택이 났다. 도 2는 전단 셀에서 전단 유동에 평행한 방향으로 실시된 인장 시험 후, 전단되고 가교결합된 단백질 샘플을 보여준다. 1 mm 미만의 전형적인 크기를 가지는 것으로 추정된 개별 거시적 섬유는 도 2B에 나타난 바와 같이, 탈염수에서 1일 동안 샘플 조각을 분산시킨 후 관찰될 수 있었다. TGA없는 30% Ca-카제이네이트의 전단은 미묘한 이방성 특징을 가진 주목할만하게 층화된 구조를 생성하였다. 단백질 매트릭스만을 전단한 후, 불투명한 백색 구조가 cm 크기의 길이 규모에 걸쳐 전단 유동의 방향으로 박리될 수 있었다. 정지 조건하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트는 어떤 관찰가능한 배열도 없는 단단한 단백질 젤을 생성하였다. 마지막으로, 35분간의 Ca-카제이네이트와 TGA의 보통 혼합은 시네레시스를 유도하고 치밀한 단백질 젤을 생성하였다. 시네레시스 후, 나머지 샘플의 단백질 함량은 첨가된 30% 대신 35%였다. 거대구조 관찰에 기초할 때, 전단 및 TGA를 이용한 가교결합은 이방성 섬유성 Ca-카제이네이트 구조를 생성하는 데 필수적인 것으로 나타났다. 미세구조에 대한 전단과 가교결합의 효과에 대하여, 하기가 주목된다. 가공된 Ca-카제이네이트 재료의 미시- 및 나노규모 구조를 SEM으로 연구하였다. 도 3A는 전단된 및 비전단된 가교결합 Ca-카제이네이트의 SEM 이미지를 도시한다. 전단-유도 배열이 전단 유동에 평행한 미세구조에서 보였다. 비전단 가교결합 단백질 구조의 대부분은 매우 치밀하였으며, 명백한 배열을 나타내지 않았다. 전단되고 가교결합된 단백질 구조는 또한 개방 공간과 기포를 함유하여, 명백한 배향을 가진 섬유를 볼 수 있도록 하였다. 도 3A.3은 기포 표면의 섬유의 예이다. 일부 경우에, 섬유 배향은 전단 방향에서 벗어났다. 명백하게, SEM으로 본 섬유는 거대구조에서 시각적으로 관찰된 섬유와 완전히 상이한 규모, 즉 nm 대 mm 규모였으며, 이는 계층적 섬유성 구조를 나타낸다. 전단 유동에 수직하여, 두 가지 유형의 미세구조, 즉 섬유의 단부를 나타낼 수 있는 밀도 높은 단백질의 구형 도메인, 및 다시 배열된 단백질 구조가 관찰되었다(도 3B). 후자 배열은 사슬형 단백질 입자에 의해, 또는 관찰된 속도 구배-소용돌이도 평면의 광학적 눈속임 돌출에 의해 야기될 수 있다. 그러나, 이 평면에서의 배열은 거시규모에서는 관찰되지 않았다. 이미지에 기초하여, ~ 100-200 nm의 전형적인 섬유 직경이 유추될 수 있었다. TGA의 사용없이 전단된 칼슘 카제이네이트의 미세구조는 전단되고 동시에 가교결합된 단백질 미세구조에 비하여 큰 차이를 나타냈다. 거시규모에서, 섬유가 보이지 않았으나, 박리될 수 있는 층화된 구조가 형성되었다. 미시규모에서는, 전단 유동에 평행한 평면으로부터 미묘한 배향이 유추될 수 있었으며(도 4A), 이것은 전단 유동에 수직인 평면에 대해서는 덜 명확하였다(도 4B). 단백질 네트워크는 가교결합된 단백질 네트워크에 비하여 더 다공성인 것으로 나타나, 자유수(free water)가 이들 기공에 위치하거나, 또는 섬유의 수축이 가교결합된 재료에서 발생하였음을 제안할 수 있다. 단백질 도메인의 크기는 가교결합된 단백질 네트워크에 존재하는 구형의 크기에 견줄만하였다(~ 100-200 nm). 도 5는 정지 조건하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트의 SEM 이미지를 보여준다. 가상 전단 유동에 평행한(도 5A) 및 수직인(도 5B) 파단 표면의 미세구조는 서로 유사하였다. 단백질 도메인을 함유한 덜 치밀한 영역으로 둘러싸인 치밀한 영역(~ 0.5 ㎛)을 관찰할 수 있다. TGA는 이들 치밀한 영역에 존재했을 수 있으며, 가교결합은 반발하는 자유수를 수반한 그러한 치밀함으로 유도하여, 치밀한 영역 사이에 약간 팽윤되고 다공성인 단백질 구조를 유도하였을 수 있다. 마지막으로, 혼합되고 가교결합된 Ca-카제이네이트는 도 6에 나타난 것처럼, ~ 100 nm의 단백질 구형으로 이루어진 치밀한 미세구조를 생성하였다. 치밀함은 혼합 동안 발생한 시네레시스에 의해 설명될 수 있다. 랜덤하게 선택된 "평행" 방향과, 상응하는 수직 방향 사이에 차이가 관찰되지 않았다. 요약하면, TGA의 존재하에서, 단순 전단은 거시규모에서 강한 이방성을 유도하였다. 미시규모에서의 배열 또한 관찰되었으나, 전단 유동 방향과 항상 일치하지는 않았다. 전단과 TGA의 조합된 작용만이 이방성 Ca-카제이네이트 구조를 생성하였다. 측정된 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트 구조의 재료 특성은 유동학적 특성과 기계적 특성이었다. 후자는 가공된 단백질 재료의 이방성 특성을 밝혔다. 도 7은 다양한 Ca-카제이네이트 샘플의 LVE 영역내의 G' 과 tanδ를 보여준다. 효소적 가교결합은 G' 을 증가시킨 한편, tanδ는 감소되었으며, 이는 공유 결합이 도입된 구조의 전형이다. 가교결합된 Ca-카제이네이트의 전단 및 정지 처리 사이에서 G' 과 tanδ에서의 차이는 발견되지 않았다. 따라서, 전단은 공유 결합의 형성에 영향을 주지 않았다. 혼합되고 가교결합된 Ca-카제이네이트 샘플은 더 큰 G' 과 약간 더 낮은 tanδ 값을 나타냈으며, 이것은 효과적인 더 높은 단백질 농도에 의해 설명될 수 있다. 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트 샘플의 이방성 거동은 LVE 특성에서 발견되지 않았다. TGA의 존재만이 G' 과 tanδ에서의 뚜렷한 차이를 생성하였다. 따라서, 이방성 섬유가 작은 변형으로 검사된 길이 규모에서 등방성 연속체로서 작용한 것으로 결론지을 수 있다. 도 8은 가공 동안 샘플에 가해진 전단 유동에 대하여 두 방향에서의 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트의 인장 거동의 전형적인 응력-변형 곡선을 도시한다. 평행 방향에서의, 따라서 섬유의 방향에서의, 항복 (최대) 응력과 항복 변형 둘 모두가 수직 방향에서의 값에 비하여 훨씬 더 크다는 것이 즉시 명백하다. 추가로, 평행 방향으로 신장된 샘플을 위한 응력-변형 곡선의 곡률은 변형 경화 거동을 나타낸 한편, 이것은 다른 방향에서 신장된 샘플에 대해서는 그렇지 않았다. 도 9는 파단까지 연장된 다양한 Ca-카제이네이트 샘플을 위한 인장 특성: 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E 를 예시한다. 이들 인장 특성에 기초하여, 가교결합되고 전단된 Ca-카제이네이트는 전단 유동에 평행한 방향과 수직인 방향에서 측정된 특성들 간의 큰 차이때문에 상당한 정도의 이방성을 나타낸 것으로 결론내려진다. 전단된 Ca-카제이네이트는 이방성으로 거동하였으며, 이는 σ와 ε에서의 차이에 의해 명백하다( E 의 차이는 크지 않았다). 정지 조건하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트는 시각적으로 그리고 SEM으로 관찰할 때 이방성이 아니었다(도 5). σ, ε 및 E 의 평균 값(도 9)은 가교결합되고 전단된 Ca-카제이네이트의 수직 값과 일치하여, 전단 동안의 가교결합이 전단 유동에 수직인 방향에서 또한 발생하였음을 나타낸다. 혼합되고 가교결합된 Ca-카제이네이트는 평행 및 수직 방향에서 신장된 샘플의 측정된 응력-변형 곡선에서 차이를 나타내지 않았다. 따라서, σ,ε 및 E 의 평균 값은 재료가 매우 탄성이며(높은 E 값) 연성(높은 σ 값)이었음을 나타낸다. 표 1은 전단 유동에 평행한 방향과 수직인 방향에서 측정된 인장 특성간의 비율을 요약한다. 이미 나타낸 바와 같이, 이방성 섬유성 샘플은 수직 방향에 비하여 평행 방향에서 훨씬 더 강하였으며, 이는 특히 항복 응력 비율 σ 평행 /σ 수직 (즉, ~ 9)에 의해 반영되었다. 항복 변형과 영스 계수의 비율은 이방성 Ca-카제이네이트 구조에 대하여 ~ 2-3이었다. 인장 특성의 비율 값에 기초하여, TGA의 부재하에서 전단된 Ca-카제이네이트는 약간 이방성을 나타냈다. 표 1(전단 유동에 평행하여 그리고 수직으로 측정된 인장 특성 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E 의 비율. 이방성 30% Ca-카제이네이트 샘플은 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트(C + TG - 전단) 및 전단된 Ca-카제이네이트(C - 전단)이었다.) 비율 평행/수직 σ ε E C + TG - 전단 9.23 2.60 1.88 C - 전단 2.27 1.79 1.13 표 2는 Ca-카제이네이트 샘플의 상응하는 값으로 표준화되어 전단(정지 조건하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트로 표준화된 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트), 및 TGA(TGA 없이 전단된 Ca-카제이네이트로 표준화된 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트)의 효과를 유추할 수 있는 인장 특성의 값을 열거한다. 전단과 TGA 둘 모두가 평행 방향에서의 인장 특성에 상당히 영향을 주었으며, 따라서 이방성 미세구조의 방향에서 영향을 주었다. 더욱이, 표준화된 항복 응력 값을 고려할 때, (TGA의 존재하에서)전단의 강화 효과는 TGA만의 효과의 거의 두배만큼 컸다. 이것은 전단과 TGA의 상승적 효과에 의해 설명할 수 있다. 불행히도, 전단과 가교결합없는 Ca-카제이네이트의 기계적 특성은 약한 구조로 인하여 측정할 수 없었기 때문에, 가교결합되지 않은 Ca-카제이네이트에서 전단의 효과는 결정할 수 없었다. 전단과 TGA 둘 모두의 효과는, 표준화된 값이 1에 가까웠으므로, 수직 방향에서 표준화된 인장 특성에 대해 무시할 수 있었다. 표 2(측정된 평행 방향과 수직 방향에 대한, 표준화된 인장 특성 항복 응력 σ, 항복 변형 ε 및 영스 계수 E . 전단되고 가교결합된 Ca-카제이네이트 샘플(C + TG - 전단)은 정지 상태하에서 가교결합된 Ca-카제이네이트로(C + TG - 무전단), 그리고 전단된 Ca-카제이네이트(C - 전단)으로 표준화되어, 각각 전단과 TGA의 효과를 유도하였다.) 평행, 표준화 수직, 표준화 σ ε E σ ε E 효과 전단 7.74 2.59 1.58 0.84 1.00 0.84 효과 TGA 3.54 1.34 1.35 0.93 0.87 0.81 (효과 전단 = (C + TG) 전단 /(C + TG) 무전단 ; 효과 TGA = (C + TG) 전단 /(C) 전단 ) 표 3은 TGA가 있거나 없이, 전단, 혼합 또는 정지 처리 후, 토의된 Ca-카제이네이트 구조의 가장 중요한 거대-, 미세구조 및 기계적 특징의 개요를 제공한다. 전단과 효소적 가교결합 둘 모두가 섬유성 Ca-카제이네이트 재료의 형성에 필수였음을 볼 수 있다. 표 3에서는, 거대구조, 미세구조 및 기계적 양상이 "거대", "미세" 및 "기계"로 표시된다. 표 3 특성 Ca-카제이네이트 Ca-카제이네이트 + TG 전단 거대 층화됨 섬유 < 1 mm 미세 거의 배향되지 않음, 섬유 ~ 100-200 nm 단백질 도메인 - ~ 60-120 nm 기계 약간 이방성 강한 이방성 정지 거대 등방성, 낟알모양* 등방성 미세 단백질 도메인 ~ 50-100 nm 및 패치 ~ 200-700 nm 기계 등방성 혼합 거대 섬유 < 1 mm 미세 단백질도메인 ~100nm 기계 등방성 * 샘플이 SEM 및 기계적 분석을 실시하기에 충분히 응집성이 아니었다. 실시예 2 단백질 프리믹스가 25% 또는 30%(w/w) Ca-카제이네이트를 함유할 수 있도록, 실시예 1에 개시된 방법에 따라 단백질 함유 용액 또는 분산액을 제조하였다. 절대 효소 농도 [E 0 ]는 두 Ca-카제이네이트 농도에 대해 동일하여, 각각 30%와 25% Ca-카제이네이트 용액에 대하여 1:20과 1:17의 효소: 단백질 비율(E:P)을 유도하였다. 가공동안(50 ℃), 공초점 레이저 주사 현미경을 위한 지방용 형광 염료인 나일 레드(72485, 시그마 알드리치)를 0.1 g·L-1의 농도로 용융된 야자 지방에 첨가하였다. 이 미희석 용액중, 15% v/v를, 단백질-지방 혼합물을 전단 셀 장치로 옮기기 전에, 적절한 양의 단백질 프리믹스와 손으로 간단히 혼합하였다. 조합된 단백질-지방 프리믹스를 사전가열된(50 ℃) 전단 셀 장치로 옮겼다. 전단 셀을 충전한 후, 혼합물을 하기 전단 처리를 가하였다: 5 rpm(12s -1 )에서 4분, 이어서 설정 기간 동안 1분내에 5 rpm에서 원하는 rpm 값으로 증가(각각 24, 120 및 240 s -1 에 대등한, 10, 50 또는 100 rpm). 이 설정 기간은 전단 시간으로 불릴 것이다. 가공 후, 재료를 ~ 10분내에 약 12 ℃로 정지 전단 셀에서 냉각시켰다. 측정된 토크 곡선을 t=0에서의 측정된 토크 값에 따라 보정하였다. 가공된 재료를 3-5 mm의 제어된 샘플 높이를 제공하는, 두 개의 사각형 평행 플레이트(100 x 100 mm)로 이루어진 주형으로 옮겼다. 추가 분석(인장 시험 및 SEM을 위한 샘플 제조)을 위하여 재료의 일부를 2 시간 이내에 사용하였으며, 일부는 추가 분석(CSLM, LVE 및 크립 측정)에 앞서 4 ℃에서 보관하였다. 방법 조건과 재료 조성이 Ca-카제이네이트와 지방으로부터 섬유성 재료가 형성될지 아닐지를 결정하였다. 따라서, 전단 속도, 전단 시간 및 단백질 농도의 효과는 가공 양상 및 다양한 길이 규모에서의 결과적인 구조적 특성 면에서 토의될 것이다. Ca-카제이네이트-지방 구조에 대한 전단 시간과 단백질 농도의 효과에 대하여, 전단과 조합된 효소적 가교결합만이 섬유성 Ca-카제이네이트-지방 구조를 유도하였음이 주목된다. 지방의 존재는 구조에서 추가적인 길이 규모에서 이방성을 유도하여, 계층적 단백질-지방 구조를 생성하였다. 섬유성 구조의 형성은 시간-의존적이어서, 소정의 전단 시간이 초과될 때, 섬유성 구조에서 시네레시스를 동반한 손상 구조로의 점진적인 전이를 보여주었다. 고정된 전단 속도와 전단 시간(120 s -1 및 30분)에서 TGA의 존재하에서 30% Ca-카제이네이트와 15% 지방의 전단은 도 11A에 나타난 섬유성 거대구조를 생성하였다. 섬유성 재료는 손으로 쉽게 분리할 수 있었다(섬유 < 1mm). 대조적으로, Ca-카제이네이트와 지방이 TGA의 부재하에서 전단되었을 때는, 전단 유동에 의해 유도된 어떤 배향도 없이 균질한 거대구조가 관찰되었다. 도 12는 전단 셀 장치에서 Ca-카제이네이트와 지방을 전단하는 동안 (총)전단 시간의 함수로서 전형적인 토크 곡선을 보여준다. TGA의 존재는 단백질 상에서의 공유 결합의 형성으로 인하여 토크 반응을 증가시켰다. 25% Ca-카제이네이트에 대한 측정 토크는 30% Ca-카제이네이트에 비하여 약간 더 낮았다. 가교결합된 샘플의 조성이 유사하였음(30% Ca-카제이네이트, 15% 지방 및 (1:20) TGA)에도 불구하고, 토크 곡선은 일부 변이를 보여준다. 그럼에도 불구하고, 명백한 경향이 관찰되었다: 상대적으로 일정한 토크 값 후, 토크는 각각 45분과 30분(총 전단 시간)후에 30%와 25% Ca-카제이네이트 둘 모두에 대해 갑자기 증가하여, 생성물 특성의 급격한 변화를 제안한다. 이들 곡선에 상응하는 샘플은 손상된 구조였으며 도 11B에 나타난 대로 배출된 액체(시네레시스)가 존재하였다. 첫눈에는, 구조는 섬유성으로 보이지 않았으나, 주의깊게 검사한 후, 일부 섬유성 조각이 여전히 관찰될 수 있었다. 섬유성에서 손상된 구조로의 전이는 비제어 과정이다. 25% Ca-카제이네이트-지방을 30분 동안 120 s -1 에서 전단하는 것을 두 벌 처리한 결과, 명백한 섬유성 부분과 단지 일부의 시네레시스를 가진 덜 손상된 거대구조가 얻어졌다. 결론적으로, 단백질 농도에 따라, 단지 특정 전단 시간 조건에서만, 섬유성 구조가 얻어질 수 있었다. 미세구조에 대하여, 도 13의 SEM 이미지는 전단과 TGA(1:20)를 이용한 가교결합 후 30% Ca-카제이네이트와 지방의 미세구조를 보여준다. 전단유동에 평행한(도 13.A1-A2) 평면과 수직인(도 13.B1-2) 평면 사이의 차이는 동시에 전단되고 가교결합된 재료에 대해 매우 뚜렷하다. 전단 유동에 평행한 방향에서는 ~ 100-200 nm의 전형적인 섬유 크기를 가진 치밀한 섬유가 형성되었다. 구조내의 개방 공간에서 또는 기포의 내부 표면에서, 섬유는 더 잘 구별될 수 있었다. 기포의 내부 표면에서 섬유의 방향은 때때로 전단 방향과 상이하여, 도 13.A2에 나타난 것처럼, 전단 유동의 국소적인 방해를 나타낸다. 전단 유동에 수직에서는, 일부 단백질 입자와 일부 "용융" 구조(도 13.B2)가 관찰되었으며 여기서는 단백질이 지방 상에 의해 덮인 것처럼 보였다. 몇몇 지방 구체가 구조에서 발견되었으나, 전체적으로 단지 소량의 지방이 SEM에 의해 발견될 수 있었으며, 이는 (사용된 확대도에 따라) SEM으로 관찰된 길이 규모에 기인할 수 있다. 또한, 유기 액체(DMSO, 에탄올)에 카제이네이트-지방 구조를 침잠하는 것과 같은, SEM을 위한 샘플 제조 방법이 아마도 지방 손실을 야기하였다. 중간구조 수준에서는, 전단되고 가교결합된 30% Ca-카제이네이트의 CSLM 이미지는, 지방 상의 존재가 추가적인 길이 규모에서 이방성을 유도하여, 구조를 더욱 더 계층적으로 만들었음을 밝힌다. 도 14.A3은 120 s -1 에서의 30분 전단 후 얻어진 30% Ca-카제이네이트-지방 재료에서 두 가지 유형의 지방 구조를 구별하였다. 상대적으로 작은 그리고 큰 분산된 지방 소적이 관찰되었을 뿐만 아니라, 전단 방향으로 신장된 지방 층이 관찰되었다. 몇가지 독립적으로 가공된 샘플에 기초할 때, 지방이 대부분 소적 형태로 존재하였으나, 또한 변형 파라미터( D ) 값에 기초할 때 변형 상태로 존재하였음을 관찰할 수 있었다(도 14.B3-4). 매우 작은 지방 소적은 전단 방향과 평행하거나 경사진 배향을 가진 단백질 상중의 소정의 구조를 야기하였다. ~ 40 ㎛의 전형적인 단백질 층 두께(따라서 ~ 200 단일 단백질 섬유로 구성됨), 및 ~ 10 ㎛의 지방층 두께를 추정할 수 있다. 도 14.A1은 분산된 지방 소적을 가진 연속 단백질 상으로 이루어진, TGA가 없이 전단된 30% Ca-카제이네이트와 지방의 등방성 중간구조를 보여준다. 지방 소적 직경과 변형 파라미터 D 의 (최대) 평균 누적 분포는, TGA 없이, 지방 소적이 TGA를 함유한 섬유성 구조에 비하여 크기가 더 크며 덜 변형됨을 나타낸다(도 14.B2-4). 30% Ca-카제이네이트를 위한 120 s -1 의 일정한 전단 속도에서의 전단 시간(15 및 30분)의 효과는 도 14.A2-3에서 예시된다. 30% Ca-카제이네이트와 지방의 5분 및 15분 전단 후, 섬유성 거대구조가 이미 육안으로 관찰되었다. 그러나, 일부 지방 소적 배향에 대해서를 제외하고는, 이것은 30분동안 전단된 기준 샘플에 비하여, 15분의 전단에 대해 나타난 것처럼 CSLM 이미지로부터 명백하지 않다. 15분 전단 후에 얻은 CSLM 이미지에서 흑색 영역은 이 샘플에 공기가 함유되었음을 나타내며, 공기 함유는 5분의 전단에 대해서도 관찰되었다. 지방 소적 직경은 전단 시간 증가에 따라 감소한 한편, D 는 변화를 거의 나타내지 않았다(도 14.B1-3). 단백질 함량을 25%로 감소시킨 경우(E:P는 1:17로 증가됨), 17분의 전단 후에 벌써 섬유성 거대구조가 형성되었으며, 이 구조는 도 14.A4에 나타난 것처럼 미세하게 분산된 지방 소적의 배열을 나타냈다. 소적은 더 높은 단백질 함량을 가진 구조에서의 소적에 비하여 더 작았으며(도 14.B1), 지방층이 관찰되지 않았다. 결론적으로, 중간규모 지방 구조의 발생은 좁은 전단 시간 범위동안, 즉, 30% Ca-카제이네이트에 대해 15 내지 60분에서 발생한다. 단백질 농도의 감소는 섬유성 구조를 얻기 위한 전단 시간의 이 방법 범위를 더 감소시킨다. Ca-카제이네이트-지방 재료의 LVE 특성( G' 및 tanδ)이 전단 시간의 함수로서 도 15에 그려진다. 섬유성 30% Ca-카제이네이트-지방 구조의 경우, G' 의 온건한 증가가 전단 시간, 따라서 가교결합 반응 시간의 함수로서 측정되었다. G' 의 증가는 공유 결합의 증가에 의해 설명될 수 있다. 25% Ca-카제이네이트로의 단백질 함량의 감소는 17분의 전단 시간 후 25% Ca-카제이네이트-지방 재료의 G' 의 약간 더 낮은 값을 야기하였다. 균질한 분산된 구조를 생성한, TGA의 부재하에서 전단된 Ca-카제이네이트-지방 구조는 TGA로 가교결합된 샘플에 비하여 더 낮은 G' 및 더 높은 tanδ 값을 보여준다. tanδ가 5분의 전단 후에, 계속되는 전단시에 일정하게 남아 있는 값으로 이미 감소하였음이 주목할만하다. 이것은 G'' 이 5분의 전단내에 신속하게 증가하였으며, 이후에는 G' 과 동일한 경향을 따름을 나타낸다. 표 4는 모든 샘플의 G' -진동수 곡선에의 거듭 제곱 법칙 피트로부터 유도된 n -값을 요약한다. 표 4: 다양한 조건에서 처리된 Ca-카제이네이트 샘플을 위한 R 2 값을 가진 진동수의 함수(G' ∝ ω n )로서 G'에의 거듭제곱 법칙 피트로부터 추출된 n의 값. 비섬유성 샘플은 별표로 표시된다. Ca-카제이네이트 비율 전단시간 전단속도 n R 2 (%) E:P (분) (s-1) (G'∝ ω n 로부터)(-) (-) 30 0 30* 120* 0.22* 0.983 0.29(ω<1Hz) 0.991 0.19(ω>1Hz) 0.996 30 1:20 5 120 0.14 0.988 30 1:20 15 120 0.13 0.965 30 1:20 30 120 0.13 0.994 25 1:17 17 120 0.13 0.988 30 1:20 30* 24* 0.15* 0.909 30 1:20 30 240 .14 0.987 n -값의 면에서 기계적 스펙트럼은 전단 시간 또는 전단 속도에 의해 거의 영향을 받지 않았으며, 재료의 조성에만 의존하는 것으로 보인다. 재료에서 공유 결합의 존재는 가교결합된 샘플을, 고체 재료와 덜 유사하게 거동한 비가교결합된 30% Ca-카제이네이트 샘플과 비교할 때, 로그-로그 곡선의 기울기에 영향을 주었다. TGA의 존재하에서 5분의 전단은 이미 비가교결합된 재료에 비하여 Ca-카제이네이트-지방 재료의 n -값에서 최대 변화를 유도하였다. 도 16A는 30% Ca-카제이네이트-지방 샘플에 대한 LVE 영역으로부터의 상응하는 G' 값으로 표준화된, 변형의 함수로서 표준화된 G' 곡선에 대한 전단 시간의 효과를 도시한다. 30% Ca-카제이네이트에 기초한 섬유성 샘플의 경우, 전단 시간의 함수로서 LVE 영역의 한계를 위해 명백한 경향이 추론될 수 없었다. 비가교결합된 균질한 30% Ca-카제이네이트 샘플은 섬유성 샘플에 비하여 비선형 체제에서 더 가파른 감소를 나타내어, 아마도 더 약한 비 공유 결합의 존재로 인하여 높은 변형 값에서 균질한 재료가 더 급격하게 영향을 받았음을 나타낸다. Ca-카제이네이트-지방 재료의, 6-요소 버거스 모델을 이용한 피트를 포함한, 크립 곡선이 도 17에 나타나며, 이것은 점탄성 재료의 전형적인 모양을 나타낸다. 가교결합 시간의 증가, 따라서 공유 결합의 증가는, 탄성 계수에 역 비례하는, 탄성 컴플라이언스의 감소를 야기하였다. 추가로, 비가교결합되지만 전단된 Ca-카제이네이트와 지방은 도 17에서 삽입되어 도시된, 가교결합된 재료에 비하여 더욱 점성으로 거동하였다. 표 5는 피팅된 파라미터 J 1 , η 1 및 버거스 모델로부터의 지연 시간 τ 2 및 τ 3 을 요약한다. 표 5. 6-요소 버거스 모델로부터의 표준 편차를 비롯한 피팅된 크립-파라미터. LVE 영역내에서 20 ℃에서 측정된 크립 곡선에 모델을 피팅시켰다. 비섬유성 샘플은 별표로 표시된다: 표 5
| Ca-cas(%) | 비율 E:P | 전단시간(분) | γ(s -1 ) | J 1 (10 -5 Pa -1) | η 1 (10 -6 Pa.s) | τ 2 (=G 2 /η 2 ) (s) | τ 3 (=G 3 /η 3 ) (s) | | 30 | - | 30* | 120* | 15.9± 0.7* | 0.8±0.4* | 6122±8241* | 127±15* | | 30 | 1:20 | 5 | 120 | 4.0±0.2 | 11.3±1.7 | 260±11 | 11±1 | | 30 | 1:20 | 15 | 120 | 4.0±0.5 | 15.5±0.9 | 256±13 | 10±1 | | 30 | 1:20 | 30 | 120 | 3.2±0.9 | 27.7±16 | 214±17 | 8±1 | | 25 | 1:17 | 17 | 120 | 5.5±0.05 | 10.1±0.9 | 261±12 | 9±1 | | 30 | 1:20 | 30* | 24* | 2.3±0.4* | 29.6±11.9 | 210±34* | 8±1* | | 30 | 1:20 | 30 | 240 | 3.5±0.5 | 26.0±6.1 | 200±28 | 8±1 |
비가교결합된 재료에 비하여 5분의 전단과 가교결합 후 J 1 및 지연 시간의 큰 감소, 및 η 1 의 증가는 TGA의 존재가 크립 파라미터에 최대의 영향을 주었음을 명백히 나타낸다. 지연 시간의 가파른 감소는 Ca-카제이네이트 매트릭스가 다소 점성인 단백질 매트릭스로부터 탄성 재료로 효소에 의해 신속하게 변형되었음을 나타낸다. 공유 결합의 존재는 구조내에서 덜 이동성인 분자를 야기하였으며, η 1 의 상승에 의해 반영되는 것처럼 더 긴 시간 규모에서 유동에 대한 더 큰 저항을 야기하였다. 전단(반응) 시간의 추가 증가는 J 1 , τ 2 및 τ 3 에 대한 미묘한 감소 효과를 가졌다. 지연 시간을 결정하는 파라미터 G 2 , G 3 , τ 2 및 τ 3 은 전단 시간 증가에 따라 증가하였다. 도 18은 섬유성 25% 및 30% Ca-카제이네이트-지방 재료를 위한 전단 시간의 함수로서 기계적 특성(항복 응력 σ, 항복 변형 ε, 영스 계수 E 및 겉보기 변형 경화 계수 n )을 도시한다. 비가교결합된 30% Ca-카제이네이트-지방 재료의 기계적 특성 또한 도 18에 포함된다. 120 s -1 에서 5분 전단 후 이미, 섬유 방향에 평행 및 수직한 기계적 특성이 차이를 나타냈기 때문에 이방성이 30% Ca-카제이네이트-지방 재료에서 관찰되었다. 추가로, 수직 방향에서 측정된 기계적 특성은 전단 시간의 함수로서 다소 일정하게 남아 있었다. 이것은 공유 결합을 통한 섬유성 구조의 강화가 주로 유동 방향에서 발생하였음을 나타낸다. 평행 방향에서의 항복 응력을 특징으로 하는 이방성은 30% Ca-카제이네이트와 지방에 대해 전단 시간 증가에 따라 급격하게 증가하였다. 17분 동안 전단된, 25% Ca-카제이네이트와 지방의 기계적 특성은 15분 동안 전단된 30% Ca-카제이네이트 샘플의 특성과 다소 유사하였다. 30% Ca-카제이네이트와 지방에 기초한 비가교결합된 재료는 모든 인장 파라미터에 대해 등방성 재료로서 거동하였다. 주목할만하게, 비가교결합된 등방성 재료의 기계적 특성은 전단 유동에 수직으로 측정된 섬유성 재료의 기계적 특성과 다소 동일하였다. 이것은 다시 전단 유동에 수직으로 공유 결합이 형성되지 않았음을 의미한다. 영스 계수는 15분의 전단 후에 증가하기 시작한 한편(30% Ca-카제이네이트), 항복 변형과 변형 경화 계수는 처음 15분의 전단에서 증가하였으며 그후에는 일정하게 남아 있었다. 일반적으로, 섬유성 30% Ca-카제이네이트-지방 재료는 더욱 연성이 되었으며 섬유 방향에서 변형 경화를 나타낸 한편(항복 응력과 항복 변형의 증가), 그들은 수직 방향에서는 부서지기 쉬운채로 남아 있었다(낮은 항복 응력과 항복 변형). 표 6은 섬유 방향에 평행하게 그리고 수직으로 측정된 기계적 특성의 비율에 대한 전단 시간의 효과를 요약하며, 이는 섬유 품질의 척도로서 해석될 수 있다. 전단 시간의 증가는 섬유성 30% Ca-카제이네이트 재료의 모든 네 가지 기계적 파라미터에 긍정적으로 영향을 주었으며, 그 중 항복 응력이 가장 증가하였다. 주목할만하게, 최대의 항복 응력 비율은 보다 낮은 단백질 함량(25% Ca-카제이네이트)을 가진 섬유성 구조에서 발견되었다. 표 6: 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동(120 s -1 에서)에 평행하여 그리고 수직으로 측정된 섬유성 및 비섬유성 Ca-카제이네이트-지방 재료의 인장 특성의 비율에 대한 전단 시간과 전단 속도의 효과. 비섬유성 샘플은 별표로 표시된다.
| Ca-cas(%) | 비율 E:P | 전단시간(분) | 항복 응력 σ ∥ /σ ⊥ (-) | 항복 변형ε ∥ /ε ⊥ (-) | 영스 계수 E y. ∥ /E y .⊥ (-) | 겉보기 변형 경화 n 8 . ∥ /n 8 .⊥ (-) | | 30 | - | 30* | 1.44* | 1.29* | 1.02* | 1.09* | | 30 | 1:20 | 5 | 2.70 | 1.73 | 1.49 | 1.16 | | 30 | 1:20 | 15 | 7.03 | 2.12 | 1.5 | 1.72 | | 30 | 1:20 | 30 | 8.19 | 2.59 | 1.54 | 1.96 | | 25 | 1:17 | 17 | 13.02 | 2.90 | 1.87 | 1.85 |
일정한 전단 속도에서 전단 시간의 효과를 조사한 후, 30% Ca-카제이네이트, 15% 지방 및 TGA(1:20)에 기초한 섬유성 구조의 형성에 대한 30분 고정 전단 시간에서의 전단 속도의 영향을 연구하였다. 전단 속도는 섬유성 구조의 형성과 섬유질성 정도 둘 모두를 제어하기 위한 방법 파라미터로 나타났다. 도 19는 전단 셀에서 30% Ca-카제이네이트, 지방 및 TGA의 가공 동안 전단 시간의 함수로서 토크에 대한 3 가지 전단 속도의 효과를 보여준다. 전단 속도의 증가는 더 높은 토크 반응을 야기하였으며, 이것은 25분의 (총) 전단 시간까지 유효하였다. 그러나, 24s -1 에서, 토크 곡선은 각각 30%와 25% Ca-카제이네이트-지방의 120 s -1 에서의 30분과 60분 전단에 대해 앞서 관찰되었던 것과 유사하게, 갑자기 증가하였다. 두 가지 후자 경우에서는, 손상된 구조와 시네레시스가 섬유성 구조의 과전단의 결과였다. 24 s -1 에서 30분동안 전단 후, 일부 배출된 지방과 미묘한 시네레시스를 수반한 등방성 거대구조가 관찰되었다. 아마도 분해 전에 낮은 전단 속도에서는 Ca-카제이네이트-지방 재료에서 배열은 유도되지 않았다. 측정된 토크 프로파일의 급격한 증가는 물 또는 지방-풍부 상의 배출과 함께, 전단동안 등방성 구조의 분해 또는 형성을 나타낼 수 있는 것으로 보인다. 120 s -1 (앞서 개시되었던 기준 샘플)과 240 s -1 에서의 전단 둘 모두가 섬유성 재료를 생성하였으며, 그 중 후자는 전자에 비하여 품질면에서 더욱 섬유성으로 나타났다. 낮은 전단 속도와 중간 전단 속도를 비교할 때, 낮은 전단 속도(24 s -1 )를 위한 평균 누적 소적 직경 곡선은 중간구조에서 더 작은 크기의 지방 소적의 존재를 나타낸 한편, D 파라미터의 평균 누적 곡선은 동일하였다(도 14.B2-4). 240 s -1 의 최고 전단 속도에서 얻어진 중간구조는 전단 유동 방향에서 층으로(~ 10 ㎛ 두께) 배열된 지방 구조뿐만 아니라 랜덤한 지방 소적을 가진 분산된 구조를 나타냈다. 조사된 모든 전단 속도를 고려할 때, 직경 및 D 에 대한 전단 속도의 명백한 효과는 유추될 수 없었다. TGA의 반응 시간에 따라 섬유성 재료의 LVE 특성에서의 변화는 발견되지 않아, 공유 결합의 수가 각 전단 속도에 대해 동일하였음을 제안한다. 낮은 전단 속도에서, 얻어진 등방성 재료는 약간 더 높은 G' 값을 가졌으며, 이것은 전단 유동 방향에서 모든 가교결합이 생성되지는 않았으므로 보다 상호연결된 단백질 네트워크의 존재에 의해 설명될 수 있다. 변형의 함수로서 표준화된 G' 곡선을 보여주는 도 16B는 비섬유성 샘플의 LVE 영역의 한계(24 s -1 )가 섬유성 샘플의 LVE 한계(120과 240 s -1 )에 비하여 훨씬 더 높음을 보여주며, 이는 LVE 영역을 제한하는 변형이 이방성의 척도로 사용될 수 있음을 의미한다. 전단 속도는 표 5에 나타난 바대로 크립 파라미터에 거의 영향을 미치지 않았다. 도 20은 기계적 특성에 대한 전단 속도의 효과를 요약한다. 일반적으로, 큰 95% 신뢰구간은, 특히 섬유 방향에 평행한, 섬유성 샘플의 단계적이고 점진적인 파단에 의해 설명될 수 있다. 전단 유동에 대하여 평행하게 그리고 수직으로 측정된 기계적 특성에 기초하여, 낮은 전단 속도(24 s -1 )에서 얻어진 30% Ca-카제이네이트-지방 재료가 등방성 재료로 거동하였음을 결론내릴 수 있다. 이 샘플의 영스 계수는 재료가 더 높은 전단 속도에서 생성된 섬유성 재료에 비하여 매우 탄성이었음을 확인하였다. 섬유 방향에 평행하여 측정된 항복 응력, 항복 변형 및 겉보기 변형 경화 계수는 전단 속도 증가에 따라 증가한 한편, 영스 계수는 감소하였다. 유동 방향에 수직으로 결정된 기계적 특성은 등방성 재료에서 이방성 재료로의 전이에서 전단 속도 증가에 따라(즉, 24 내지 120 s -1 ) 감소하였다. 전이 후, 섬유 방향에 수직으로 결정된 이방성 재료의 기계적 특성은 전단 속도에 의해 거의 영향을 받지 않았다. 모든 방법 파라미터(전단 속도와 전단 시간)를 고려할 때, 전단 유동에 수직으로 측정된 이방성 섬유성 재료의 모든 기계적 특성은 유사하며 처리와 독립적이었음을 결론지을 수 있다. 더욱이, 이들 기계적 특성은 등방성 비가교결합 30% Ca-카제이네이트-지방 재료의 특성과 동일하였다. 이것은 섬유성 재료에서 소용돌이도 - 전단 유동 평면에서 공유 결합이 생성되지 않았음을 확인하며, 이는 부분적으로 지방의 존재에 의해 방해된다. 표 7은 섬유 방향에 평행하여 그리고 수직으로 측정된 섬유성 재료의 기계적 특성의 비율을 요약한다. 이들 비율에 기초할 때, 최고 전단 속도(240 s -1 )에서 형성된 30% Ca-카제이네이트-지방 재료가 가장 섬유성이어서, 전단 속도가 전단되고 가교결합된 단백질-지방 재료의 섬유질성을 제어하기 위해 사용될 수 있음을 제안한다. 표 7: (30분 동안) 전단 셀 장치에서 가해진 전단 유동에 평행하게 그리고 수직으로 측정된 섬유성 및 비섬유성 30% Ca-카제이네이트-지방 재료의 인장 특성의 비율에 대한 전단 속도의 효과. 비섬유성 샘플은 별표로 표시된다.
| Ca-cas(%) | 비율 E:P | 전단시간(분) | 항복 응력 σ ∥ /σ ⊥ (-) | 항복 변형ε ∥ /ε ⊥ (-) | 영스 계수 E ∥ /E ⊥ (-) | 겉보기 변형 경화 n ∥ /n ⊥ (-) | | 30 | 1:20 | 24* | 1.22* | 1.08* | 1.06* | 1.09* | | 30 | 1:20 | 120 | 8.19 | 2.59 | 1.54 | 1.96 | | 30 | 1:20 | 240 | 14.18 | 3.58 | 1.52 | 2.42 |
실시예 3 0.5% 잔탄을 함유한 20% Ca-카제이네이트 프리믹스(100 g 당 Na-벤조에이트를 함유한 72 g 탈염순수 + 0.5 g 잔탄 + 7.5 g TGA 용액 + 20 g Ca-카제이네이트 함유)(= 샘플 1)를, 먼저 30-40 ℃에서 ~ 10분 동안 탈염순수에서 잔탄과 1% Na-벤조에이트를 혼합하고 이어서 다시 실온에서 ~ 50분 동안 혼합하여 제조하였다. 이어서 (1:20의 효소 대 단백질의 최종 비율(E:P)를 얻기 위하여)20% TGA 용액을 잔탄 용액에 첨가하고, 잠깐 혼합한 후, 몇몇 비용해된 젤-유사 입자를 함유한 이 매우 점성인 분산액을 단백질에 첨가하였다. 또한, 더 적은 양의 TGA(E:P = 1:40)를 가지며 Na-벤조에이트가 배제된 30% Ca-카제이네이트 프리믹스(= 샘플 2)를 제조하였다. 프리믹스를 사전가열된 전단 셀(50 ℃)에 옮기기 전에 실온에서 낮은 속도에서 부엌 믹서에서 모든 성분을 혼합하였다. 두 혼합물 모두를 하기와 같이 전단시켰다: 5 rpm에서 4분, rpm을 5에서 50 rpm으로 증가시키면서 1분, 그리고 20% Ca-카제이네이트-잔탄 혼합물에 대해서는 34분이며 30% Ca-카제이네이트 샘플에 대해서는 15분인 설정 기간동안 50 rpm. 전단 후, 12 ℃의 온도에 도달할 때까지 15분 동안 샘플을 냉각시켰다. 재료의 분석은 실시하지 않았다. 20% Ca-카제이네이트-잔탄(샘플 1)의 전단은 견고한 조직을 가진 섬유성 거대구조(도 22)를 생성하였다. 잔탄의 부재하에서 20% Ca-카제이네이트(TGA 1:10 및 1:20과 함께, 그리고 지방의 존재하)의 전단은 섬유성 재료를 유도하지 못했다. 소량 성분 Na-벤조에이트의 배제와 TGA의 감소(샘플 2)는 주요 시네레시스를 나타내는(초기 중량의 25%) 등방성 재료를 생성하였다. 재료는 매우 탄성이다. 황색으로 인하여, 이것은 가공 후 Na-카제이네이트와 유사하다. Na-벤조에이트의 부재하에서 더 높은 TGA 농도(1:20)는 유사한 구조를 생성하였다. 실시예 4 실시예 1과 유사하게, Ca-카제이네이트와 Na-카제이네이트의 블렌드를 단순 전단에 노출시킨다. 결과는 표 8에 나타난다. 표 8은 유동학을 이용하여 그리고 전단 셀에서 분석할 때 Na-벤조에이트(I ~ 70 mM)를 가진 Ca-카제이네이트와 Na-카제이네이트의 블렌드의 개요를 제공한다. 성공적인, 섬유성 샘플을 위한, 인장 특성의 비율이 주어진다. 표 8
| 조성 | 유동학 | 전단 셀 | 조직 분석기 | 측정규격 | | 총 단백질(g) | CA(g) | NA(g) | τ(s) | 전단속도(rpm) | 전단 속도(s -1 ) | 시간(분) | 구조 | 비율 응력(-) | 비율 변형(-) | 예상 전단 속도(s -1 ) | | 기준 30NA a | 30 | 0 | 30 | 0.0045 | 50 | 120 | 35 | 등방성 | - | - | 1.6E + 04 | | CN-9 | 30 | 28.5 | 1.5 | 8.00 | 50 | 120 | 20 | 이방성 | 10.0 | 2.2 | 9 | | CN-10 | 30 | 29 | 1 | 6.37 | | | | | | | 11 | | 기준 30CA | 30 | 30 | 0 | 0.61 | 50 | 120 | 35 | 이방성 | 9.2 | 2.6 | | | 기준 30CA신규 | 30 | 30 | 0 | 0.18 | 50 | 120 | 35 | 이방성 | 9.2 | 2.6 | | | CN-8/기준 25CA | 25 | 25 | 0 | 0.72 | 50 | 120 | 20 | 이방성 | 8.4 | 2.2 | 102 | | 기준 20CA | 20 | 20 | 0 | 0.19 | | | | | | | 382 |
|
