来自放线菌放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的能在酸性pH水解谷蛋白肽和蛋白的新蛋白酶 |
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| 申请号 | CN201280060514.5 | 申请日 | 2012-11-05 | 公开(公告)号 | CN104039345A | 公开(公告)日 | 2014-09-10 |
| 申请人 | 英萨博瑞克寻找生命基础研究所; | 发明人 | L·卡瓦莱逖; L·卡拉诺; M·阿邦迪; M·布鲁纳提; A·塔拉维拉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及具有在pH3和8之间 水 解 谷蛋白寡肽的能 力 的蛋白水解酶新家族，所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶切割，和其在肠腔中存在导致毒性效应。酶已被鉴定为S8/S53家族的内肽酶及由放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株产生。本发明的目的也包括通过培养天然放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株，其突变体或包含编码内肽酶的核酸的重组宿主细胞来产生包含内肽酶的酶组合物的方法。所述核酸构成本发明的另一目的。包含至少一种本发明的内肽酶的酶组合物作为药学制剂的成分或作为食品和饮料的添加剂而对于 治疗 和/或 预防 腹腔 口炎性腹泻，疱疹样皮炎和任何与谷蛋白不耐性关联的其他病症有用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.酶组合物，其包含在pH3和8之间有活性的至少一种S8/S53家族的内肽酶，其选自： |
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| 说明书全文 | 来自放线菌放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的能在酸性pH水解谷蛋白肽和蛋白的新蛋白酶 【技术领域】 [0001] 本发明涉及具有致使其能降解大的多肽(包括富含脯氨酸的那些)的独特催化性性质的新内肽酶家族。本发明还涉及产生酶组合物的方法，以及含有所述酶组合物的药物组合物和食品补充物和其在多肽降解中的用途。【背景技术】 [0002] 乳糜泻(CD)是慢性消化道病症，其中存在于由小麦，黑麦，大麦和它们的杂交-相关的变种制造的食品中的谷蛋白的摄入在遗传敏感的个体中导致小肠粘膜由自身免疫机理 的损 伤(Green P.H.R.，Cellier C.”Celiac Disease”N.Engl.J.Med.，2007，357，1731-1743；Kagnoff M.F.“Celiac disease：pathogenesis of a model immunogenetic disease”J.Clin.Invest.，2007，117，41-9)。已在近年解释谷蛋白诱导其病原性效应的机理。先天性和适应性免疫机理二者涉及及负责最终粘膜损伤。 [0003] 谷蛋白由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白(存在于谷物谷粒中的储藏蛋白的水/盐不溶性级分)组成。谷蛋白网络通过当在面团制备中面粉和水混合时2种蛋白之间的相互作用来产生。 [0004] 一旦摄入，谷蛋白经历由胃-胰腺和刷状缘蛋白水解酶的部分消化，这产生由于高含量的脯氨酸残基而抵抗进一步被消化(由于许多蛋白酶不能切割位于脯氨酸的N-或C-端的肽键)的许多不同长度(几个至多于30个氨基酸)的肽(Hausch F.，Shan L.，Santiago N.A.，Gray G.M.，Khosla C.“Intestinal digestive resistance of immunodominant gliadin peptides”.Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，2002，283，996-1003；Shan L.，Molberg O.，Parrot I.，Hausch F.，Filiz F.，Gray G.M.，Sollid L.M.，Khosla C.“Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue”Science， 2002，297，2275-2279)。如过去提出，脯氨酸-特异性切割酶的缺乏在乳糜泻受试者中不是特定酶缺乏，而是对哺乳动物消化器官(其未进化至消费在其膳食中具有如此高脯氨酸含量的蛋白)适当的。 [0005] 尽管已最近提出连蛋白-介导的细胞旁通道及跨细胞方式，经胞吞转运和反胞吞转运，未消化的谷蛋白肽可通过尚未明确解释的机理经过上皮屏障(Drago S.，El Asmar R.，Di Pierro M.，Grazia Clemente M.，Tripathi A.，Sapone A.，Thakar M.，Iacono G.，Carroccio A.，D ′ Agate C.，Not T.，Zampini L.，Catassi C.，Fasano A.“Gliadin，zonulin and gut permeability：Effects on celiac and non-celiac intestinal mucosa and intestinal cell lines”Scand.J.Gastroenterol.，2006，41，408-19；Schumann M.，Richter J.F.，Wedell I.，Moos V.，Zimmermann-Kordmann M.，Schneider T.，Daum S.，Zeitz M.，Fromm M.，Schulzke J.D.“Mechanisms of epithelial translocation of the alpha(2)-gliadin-33mer in coeliac sprue”Gut，2008，57，747-754；Matysiak-Budnik T.，Moura I.C.，Arcos-Fajardo M.，Lebreton C.，Ménard S.，Candalh C.，Ben-Khalifa K.，Dugave C.，Tamouza H.，van Niel G.，Bouhnik Y.，Lamarque D.，Chaussade S.，Malamut G.，Cellier C.，Cerf-Bensussan N.，Monteiro R.C.，Heyman M.“Secretory IgA mediates retrotranscytosis of intact gliadin peptides via the transferrin receptor in celiac disease”J.Exp.Med.，2008，205，143-154)。 [0006] 一旦在固有层(LM)中，由组织转谷氨酰胺酶所致的谷氨酰胺至谷氨酸残基的脱酰胺(tTG，CD中的自身抗原)强化它们呈递至与作为主要细胞因子效应子的产生的DQ2或DQ8CD4+T细胞，产生以干扰素-γ(IFN-γ)作为主要细胞因子效应子的促-炎性应答(Molberg O.，McAdam S.，Lundin K.E.，Kristiansen C.，Arentz-Hansen H.，Kett K.，Sollid L.M.“T cells from celiac disease lesions recognize gliadin epitopes deamidated in situ by endogenous tissue transglutaminase”Eur.J.Immunol.，2001，31，1317-23)。几种谷蛋白肽已也显示自被CD4+T-淋巴细胞特异性识别独立地导致粘膜损伤，但通过上调LM单核细胞中IL-15，环-加氧酶-2和活化标志物CD25和CD83的表达来诱导先天性免疫应答：在它们之中，最佳表征的是α1-麦醇溶蛋白的肽p31-43/49(PGQQQPFPPQQPY/PQPQPF)(Ciccocioppo R.，Di Sabatino A.，Corazza G.R.“The immune recognition of gluten in coeliac disease”Clin.Exp.Immunol.，2005，140，408-16)。 [0007] CD被估计影响约1％的欧洲和北美人口，自芬兰的研究显示在老年人比率增加 (1∶ 47)(Vilppula A.，Kaukinen K.，Luostarinen L.， I.，Patrikainen H.，Valve R.， M.，Collin P.“Increasing prcvalence and high incidence of celiac disease in elderly people：a population-based study”BMC Gastroenterol.，2009，29，9-49)。但是，许多研究指出，CD以类似的流行值扩散到全世界(Barada K.，Bitar A.，Mokadem M.A.，Hashash J.G.，Green P.“Celiac disease in Middle Eastern and North African countries：a new burden ？”World J.Gastroenterol.，2010，16， 1449-57；Dalgic B.，Sari S.，Basturk B.，Ensari A.，Egritas O.，Bukulmez A.，Baris Z.，Turkish Celiac Study Group“Prevalence of celiac disease in healthy Turkish school children”Am.J.Gastroenterol.，2011，106，1512-7；Makharia G.K.，Verma A.K.，Amarchand R.，Bhatnagar S.，Das P.，Goswami A.，Bhatia V.，Ahuja V.，Datta Gupta S.，Anand K.“Prevalenee of celiac disease in the northern part of India：a community based study”J.Gastroenterol.Hepatol.，2011，26，894-900；Wang X.Q.，Liu W.，Xu C.D.，Mei H.，Gao Y.，Peng H.M.，Yuan L.，Xu J.J.“Celiac disease in children with diarrhea in4cities in China”J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.，2011，53，368-70)。 [0008] 此时无可利用的治疗，和对此疾病仅有的补救措施是对于预防不仅是CD特定粘膜损伤和作为结果的吸收不良-相关的病症(如铁-缺陷型贫血或骨质疏松症)而且是已相关于CD的其他自身免疫疾病，如1型糖尿病和自身免疫甲状腺炎，或更重并发症如肠病-关联的T-细胞淋巴瘤而言必需的严格的、终生无谷蛋白的膳食。 [0009] 谷蛋白的总回避(安全的谷蛋白摄入阈值通常指示为50mg/天，尽管10mg/天被认为更安全)总体维持缓解CD，但在小百分率的遭受非-响应形式的患者(2～5％)中例外。但是，患者强烈需求该膳食，同进患者在它们的共同活动中受限及遭受社会隔离。谷蛋白在食品加工中作为添加剂使用起广泛的，且是谷蛋白的未察觉的摄入的主要原因，使得此膳食真正难以维持。 [0010] 由于这些理由，允许他们在它们的每天膳食摄取至少最小量的谷蛋白的任何替代性的方案会是受CD患者强烈欢迎的。 [0011] 使用用于谷蛋白脱毒的外源蛋白水解酶是对于CD治疗最有希望的策略之一。不同方式的应用可开发这些酶潜力：在面团发酵之前或期间处理含有谷蛋白的面粉，由此生产“新食品”，以及谷蛋白和适合的蛋白水解酶的相伴的消费，由此作为“食品补充物”，类似于为乳糖不耐性使用乳糖酶。必然，要求不同酶性质，以符合不同目的。 [0012] 用于CD治疗的酶方法基于由Shan等人(科学，2002)展示的微生物酶在特定残基切割谷蛋白肽及去除毒性/免疫毒性特定肽序列的能力。尤其是，他们显示，外源性的源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的脯氨酰-特异性内切蛋白酶(FM-PEP)有利地导致麦醇溶蛋白肽的消化。在刷状缘膜(BBM)提取物的存在下体外添加PEP或在大鼠小肠体内灌注期间添加PEP导致免疫显性33聚体肽(“33聚体”)的快速降解和刺激麦醇溶蛋白-特异性T-细胞的能力损失(Hausch等人，2002)。 [0013] 已为此目的由相同的作者评价来自其他细菌株(即荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulata)及 黄色粘球菌(Myxococcus xanthus))的相同的 家族 (EC.3.4.21.26) 的 其 他 酶 (Shan L.，Marti T.，Sollid L.M.，Gray G.M.，Khosla C.“Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases： implications for coeliac sprue”Biochem.J.，2004，383，311-318)。在全世界，这些研究显示在3种酶之中关于链-长度和亚位点特异性的实质性差异，及确认了口服酶治疗法的潜力，尽管关于它们的可能的体内功效的关心被提起，这是由于在底物特异性的限制、活性pH(几乎中性pH的最佳活性而非在胃中发挥作用需要的酸性pH)、毒性肽完全消化必需的长时间和对被胃蛋白酶降解的抗性。然后推荐了具有胃活性和互补底物特异性的 2种酶的组合(Gass J.，Bethune M.T.，Siegel M.，Spencer A.，Khosla C.“Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue”Gastroenterology，2007，133，472-480)：来自与EP-B2关联的荚膜鞘氨醇单胞菌(S.capsulata)的PEP，来自大麦(Hordeum vulgare)的谷氨酰胺-特异性内切蛋白酶B同种型2，源于在酸性pH及被胃蛋白酶活化的发芽大麦种子的半胱氨酸-蛋白酶(Bethune M.T.，Strop P.，Tang Y.，Sollid L.M.，Khosla C.“Heterologous expression，purification，refolding，and structural-functional characterization of EP-B2，a self-activating barley cysteine endoprotease”Chem.Biol.，2006，13，637-47)被显示为潜在地更有力的治疗性工具。另一研究报道，源于黑曲霉(Aspergillus niger)的PEP，在酸条件下在胃中施展其主要活性，可在其达到肠腔之前开始降解麦醇溶蛋白(Stepniak D.，Spaenij-Dekking L.，Mitea C.，Moester M.，de Ru A.，Baak-Pablo R.van Veelen P.，Edens L.，Koning F.“Highly efficient gluten degradation with a newly identified prolyl endoprotease： implications for celiac disease”Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，2006， 291，G621-9)。 [0014] 几个专利文献已提到这些发现。在WO2003/068170(EP572127)中，发明人要求保护给乳糜泻或疱疹样皮炎患者施用有效剂量的谷蛋白酶减少毒性谷蛋白寡肽的水平，由此衰减或消除谷蛋白的损伤效应。在WO2005/107786(EP1740197)中给出对此方法的进一步支持，其中公开了用于治疗乳糜泻或疱疹样皮炎患者的谷蛋白酶的药学制剂。 [0015] WO2005/027953(EP16663298)描述用新的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的脯氨酰-特异性内切蛋白酶(AN-PEP)治疗，其有利地导致毒性谷蛋白肽的消化。WO2005/019251提供2种不同真菌物种(深红色发癣菌(Trichophyton rubrum)及烟曲霉(Aspergillus fumigatus))的亮氨酸氨肽酶(LAP)组合二肽基肽酶IV(DppIV)。已就在中性pH条件下33聚体的切割评价了这些酶，由于LAP的最佳活性被估计为约7.0(活性范围在pH6和8之间)，由此排除或限制胃液中麦醇溶蛋白的可能的断裂。 [0016] 也已显示，烟曲霉(A.fumigatus)三肽基肽酶可在酸性pH降解蛋白(Reichard U.，Lechenne B.，Asif A.R.，Streit F.，Grouzmann E.，Jousson O.，Monod M.“Sedolisins，a new class of secreted proteases from Aspergillus fumigatus with endoprotease or tripeptidyl-peptidase activity at acidic pHs”Appl.Environ.Microb.，2006，72，1739-48)。在WO2011/077359中提供了由脯氨酰-蛋白酶(AfuS28)和待用作也对于CD治疗有用的食品补充物的属于SEDOLISIN家族的至少一种三肽基蛋白酶组成的试剂盒。 [0017] 已清楚，用于CD治疗的酶或酶组合物的治疗价值涉及如下的酶，其(a)抵抗被其他胃肠酶降解，(b)在33聚体和其他毒性肽产生的环境中有效，及(c)呈现向谷蛋白肽快速和高蛋白水解活性。这些酶应在酸性pH有活性，和应能接近烘烤的或烹饪的正常食料的其他组分阻碍的谷蛋白的复杂组成。 [0018] 【发明概述】 [0019] 申请人在本发明中鉴定了新家族的酶及提供具有独特催化性能的此酶家族的酶或组合物。 [0020] 申请人鉴定了作为此酶家族的生产者的放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)。本发明的内肽酶通过在适当的培养基(例如含有大豆的)中培养放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)来产生。从意大利土壤分离原本以申请人编码A8鉴定的株，并根据布达佩斯条约于2011年6月24日保藏于DSMZ，-德意志微生物和细胞培养物保藏中心GmbH，(现在Leibniz-Institut DSMZ-德意志微生物和细胞培养物保藏中心GmbH)，Inhoffenstarsse7b，D-38124Braunschweig，德国。株被赋予登录号No.DSM24988。 [0021] 本发明的内肽酶能水解特定谷蛋白寡肽，所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶的切割，和其在肠腔中存在导致毒性效应。酶处理可移除该肽和它们的毒性效应；其可无需任何PEP添加而降解麦醇溶蛋白和因此对谷蛋白脱毒。本发明的肽酶具有广范围的pH活性和能在pH3～pH8发挥蛋白水解活性。该活性会被定义为谷蛋白酶活性。 [0022] 这些谷蛋白酶提供通过降低在被患者摄入之前或之后食料中毒性谷蛋白寡肽的水平来预防口炎性腹泻和/或疱疹样皮炎症状的方法。这些酶可与其他蛋白水解酶诸如蛋白酶和氨肽酶一起使用而有效产生用于食品和饮料，及医学的蛋白水解产物。 [0023] 这些酶通过在适合的培养基中培养由不同放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株分泌，且它们的活性可通过使用发色底物和酶谱分析评价。 [0025] 图1：自本发明的谷蛋白酶和SEDOLISIN或KUMAMOLISIN蛋白酶的序列推知的系统树。 [0026] 蛋白序列用CLUSTALW程序比对，和通过使用MEGA5软件计算具有自展值(bootstrap ualue)的最大似然性树。放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)内肽酶以粗体显示。将SedE用作外类群。树然后用MEGA5软件可视化。等于或高于50％的自展值指示为节点。比例尺指示每位点氨基酸取代数。 [0027] SedE＝来自烟曲霉(A.fumigatus)Af293(EAL86850)的SEDOLISIN E；SedB＝来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Af293(CAE17674)的SEDOLISIN B；TPPa＝来自米曲霉(A.oryzae)RIB40(BAC56232)的三肽基肽酶A；SedD＝来自烟曲霉(A.fumigatus)Af293(CAE17675)的SEDOLISIN D；SedC＝来自烟曲霉(A.fumigatus)Af293(CAE46473)的SEDOLISIN C；SedA＝来自烟曲霉(A.fumigatus)Af293(CAE51075)的SEDOLISIN A；KumaA＝Alicyclobacillus sendaiensis(Q8GB88)的KUMAMOLISIN-A；KumaB＝来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)MN-32(Q8RR56)的KUMAMOLISIN；SEDOLISINA＝来自假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)101(P42790)的SEDOLISIN；SEDOLISINB＝来自黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.)T-22(Q60106)的SEDOLISIN-B；Endopep-是本发明的谷蛋白酶。蛋白序列登录号以括弧显示。 [0028] 图2：在各种pH条件下，对荧光底物琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC测量endopep-140(＞100kDa)和endopep-40(＜100kDa)的活性特征。在2h后于37℃测量荧光。在X-轴给出特定pH值，在Y-轴给出相对活性的百分率。 [0029] 图3：在pH3和 pH5，对 荧 光 底 物 琥 珀 酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC 测 量endopep-140(＞100kDa)和endopep-40(＜100kDa)的内肽酶活性。于37℃，以各种时间间隔测量荧光。在X-轴给出温育时间，在Y-轴给出任意荧光单位(rfu)。 [0031] 用IPTG0.2μM，于22℃过夜诱导蛋白表达。S1指示用pET28b-endopep-140转化的大肠埃希氏菌(E.coli)株；S3指示用pET28b-endopep-40转化的大肠埃希氏菌(E.coli)株。使用的标志物的分子量显示在左侧。 [0032] 自左：泳道1＝分子量标志物；泳道2＝未诱导的S1；泳道3＝诱导的S1，3h收获；泳道4＝诱导的S1，过夜(o.n.)收获；泳道5＝空白；泳道6＝未诱导的S3；泳道7＝诱导的S3，3h收获；泳道8＝诱导的S3，o.n.收获。 [0033] 图5：由endopep-140所致的33聚体麦醇溶蛋白肽的断裂。 [0034] 时间进程反应产物由逆相HPLC分离。图5A：MS踪迹，离子计数m/z＝300-2000；图5B：UV-表征230nm，μAU是吸光度微单元。比较在0，30min，2h时间获得的特征。在0时间仅存在一个对应于完整33聚体肽的信号([M-2H]＝1957)。此信号随时间有效降低。 在30min温育之后呈现几个峰，和它们的量在2h时间增加。观察到的全部分子离子显示于表2。图中凸显最特征性峰的尺寸。 [0035] 图6：在胃蛋白酶的存在下(1mg/ml)由endopep-140所致的33聚体麦醇溶蛋白肽的断裂。 [0036] 时间进程反应产物由逆相HPLC分离。图6A：MS踪迹，离子计数m/z＝300-2000；图6B：UV-谱230nm，μAU是吸光度微单元。比较在0，30min，2h时间获得的特征。在0时间仅存在一个对应于完整33聚体肽的信号([M～2H]＝1957)，在30min温育之后呈现几个峰，和它们的量在2h时间增加。观察到的全部分子离子显示于表3。图中凸显最特征性峰的尺寸。在([M-H]＝1068)的信号对应于存在于33聚体序列中的9个氨基酸的肽。信号689.7是由于胃蛋白酶。 [0037] 图7：HPLC-MS分析。使33聚体麦醇溶蛋白肽与胃蛋白酶温育。图7A：MS踪迹；图7B：UV-谱230nm，μAU是吸光度微单元。比较在0和2h时间获得的特征。观察到几乎无33聚体的降解。 [0038] 图8：用考马斯蓝染色的麦醇溶蛋白SDS-PAGE的蛋白水解。 [0039] 在胃蛋白酶的存在或缺失下由2种不同谷蛋白酶的麦醇溶蛋白消化。使麦醇溶蛋白于37℃温育2h。 [0040] 从左到右：泳道1＝分子量标志物；泳道2＝麦醇溶蛋白；泳道3＝麦醇溶蛋白+endopep-40(＜100kDa)；泳道4＝麦醇溶蛋白+endopep-40(＜100kDa)+胃蛋白酶；泳道5＝在10min温育之后停止的反应3；泳道6＝麦醇溶蛋白+endopep-140(＞100kDa)；泳道7＝麦醇溶蛋白+endopep-140(＞100kDa)+胃蛋白酶。 [0041] 【表简述】 [0042] 表1.自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)分泌蛋白质组纯化的推定的蛋白。 [0043] 表2.由用endopep-140的33聚体消化释放的肽。 [0044] 表3.由用endopep-40的33聚体消化释放的肽。 [0045] 【发明详述】 [0046] 放线菌是丝状革兰氏阳性细菌，主要知道它们产生二级生物活性代谢物的能力。放线菌已被用作水解酶的源，尽管至今仅少数放线菌，特别是嗜碱性放线菌，已被探索它们的酶促潜力(Endo A.，Murakawa S.，Shimizu H.，Shiraishi Y.“Purification and properties of collagenase from a Streptomyces species”J.Biochem.，1987，102，163-70；Sakurai Y.，Inoue H.，Nishii W.，Takahashi T.，Iino Y.，Yamamoto M.，Takahashi K.“Purification and Characterization of a Major Collagenase from Streptomyces parvulus”Biosci.Biotechnol.Biochem.，2009，73，21-28；Mehta V.J.，Thumar J.T.，Singh S.P.，“Production of alkaline protease from an alkaliphilic actinomycete”Bioresource Technology，2006，97，1650-1654)。 [0047] 而且，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)的全基因组序列预测了在819中潜在分泌的蛋白之中60种分泌的推定的蛋白酶和肽酶的存在(Bentley S.D.，Chater K.F.， -Tárraga A.M.，Challis G.L.，Thomson N.R.，James K.D.，Harris D.E.，Quail M.A.，Kieser H，.Harper D.，Bateman A.，Brown S.，Chandra G.，Chen C.W.，Collins M.，Cronin A.，Fraser A.，Goble A.，Hidalgo J.，Hornsby T.，Howarth S.，Huang C.H.，Kieser T.，Larke L.，Murphy L.，Oliver K.，O′Neil S.，Rabbinowitsch E.，Rajandream M.A.，Rutherford K.，Rutter S.，Seeger K.，Saunders D.，Sharp S.，Squares R.，Squares S.，Taylor K.，Warren T.，Wietzorrek A.，Woodward J.，Barrell B.G.，Parkhill J.，Hopwood D.A.“Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)”Nature，2002，417，141-7)，这还给放线菌作为新水解性酶的潜在来源的价值。在放线菌中，嗜酸性株提供产生具有最佳符合在CD中有效的需求的性质(即在酸性pH的活性)的酶的更高机会。近年已首次描述了几种新属的嗜酸性放线菌(即.细链孢菌属(Catenulispora)，丛生放线菌属(Actinospica)，皱纹单孢菌属(Rugosimonospora)，链嗜酸菌属(Streptacidiphilus))以及属于之前未知的细菌系的具有嗜酸性性质的丝状细菌(即.纤线杆菌属(Ktedonobacter))(Busti E.，Cavaletti L.，Monciardini P.，Schumann P.，Rohde M.，Sosio M.，Donadio S.“Catenulispora acidiphila gen.nov.，sp.nov.，a novel，mycelium-forming actinomycete，and proposal of Catenulisporaceae fam.nov.”Int.J.Syst.Evol.Bacteriol.，2006，56，1741-1746；Cavaletti L.，Monciardini P.，Bamonte R.，Schumann P.，Rohde M.，Sosio M.，Donadio S.”New lineage of filamentous，spore-forming，gram-positive bacteria from soil”Appl.Env.Microbiol.，2006， 72，4360-4369；Cavaletti L.，Monciardini P.，Schumann P.，Rohde M.，Bamonte R.，Busti E.，Sosio M.，Donadio S.“Actinospica acidiphila gen.nov.，sp.nov.and Actinospica robiniae gen.nov.，sp.nov.；proposal for Actinospicaceae fam.nov.and Catenulisporinae subordo.nov.in the order Actinomycetales”Int.J.Syst.Evol.Bacteriol.，2006，56，1747-1753；Monciardini P.，Cavaletti L.，Ranghetti A.，Schumann P.，Rohde M.，Bamonte R.，Sosio M.，Mezzelani A.，Donadio S.“Novel members of the family Micromonosporaceae，Rugosimonospora acidiphila gen.nov.，sp.nov.and Rugosimonospora africana sp.nov”Int.J.Syst.Evol.Bacteriol.，2009，59，2752-2758； Kim S.B.，Lonsdale J.，Seong C.M.，Goodfellow M.“Streptacidiphilus gen.nov.，acidophilic actinomycetes with wall chemotype I and emendation of the family AL Streptomycetaceae(Waksman and Henrici(1943) )emend.Rainey et al.1997)”Antonie van Leewenhoek，2003，83，107-116)。 [0048] 放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)，如许多其他放线菌，可在含有蛋白作为单独的氮和碳源的培养基中生长。此在蛋白培养基中生长的能力依赖于分泌的内-及外蛋白酶的协同作用，由于仅氨基酸和短肽可经膜转运子同化。放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株在稍微酸性pH具有最佳生长，由此提示，蛋白水解酶可在此pH表达，和可能在酸性条件中消化复合蛋白。据申请人所知，尚无其他报道描述自放线菌产生在酸性pH发挥作用的蛋白酶。 [0049] 放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988由申请人自意大利土壤分离，储藏在申请人菌株收集处，根据布达佩斯条约于2011年6月24日保藏在DSMZ，德意志微生物和细胞培养物保藏中心GmbH，Inhoffenstr.7b，D-38124Braunschweig，德国(现在Leibniz-Institut DSMZ-德意志微生物和细胞培养物保藏中心GmbH)。该株被赋予登录号No.DSM24988。放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988在用HCl酸化为pH5.5的各种标准固体培养基上生长(Shirling E.B.，Gottlieb D.“Method of characterization of Streptomyces species”Int.J.Syst.Bacteriol.，1966，16，313-340)。在于28℃经15天的温育之后，基内菌丝体是卷曲的，其颜色是乳色的，随老化成为紫色，及在ISP2琼脂上无气生菌丝体产生。当在HSA5上形成时，气生菌丝体的颜色是白色(Busti等人，2006)。在15天的温育之后，在ISP3琼脂上观察到卷曲的乳色/棕色植物性菌丝体的丰富的生长和产生。在20天的温育之后存在褐可溶性色素的轻微产生。该株可在21℃和35℃之间的温度生长，在ISP2和HSA5上最佳温度是28℃。放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988能在达2.5％(w/v)的NaCl存在下生长；在1％(w/v)和更高浓度，株不分化紫植物性菌丝体，但仅分化卷曲的乳色基内菌丝体。平铺在用HCl或NaOH调至期望的pH值的ISP2琼脂上的株在pH4.0和7.0之间生长良好，最佳pH是5.5。 当在添加谷蛋白的酸性ISP9上生长时，观察到丰富的卷曲的乳色植物性菌丝体。不产生气生菌丝体和可溶性色素。 [0050] 分泌的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)蛋白的蛋白质组学调查确认，分泌出在中性，碱性或酸性pH有活性的不同组的蛋白酶，尤其是，S8/S53肽酶家族的几个成员。 [0051] 本发明的谷蛋白酶属于MEROPS肽酶S8[亚家族S8A(枯草杆菌蛋白，Substilisin)和S8B(KEXIN)]和S53(SEDOLISIN)家族(Rawlings N.D.，Barrett A.J.，Bateman A.“MEROPS：the peptidase database”Nucleic Acid Res.，2010，38，D227-D233)。 [0052] 谷蛋白是小麦，大麦，黑麦及相关的物种的蛋白组分，独特在于其为面团和许多其他食品提供弹性和其他期望的特征的能力。谷蛋白富含谷氨酰胺(35％)和脯氨酸(15％)残基，其是在被疾病-特异性T细胞识别的谷蛋白表位之中尤其可注意的特征。小麦谷蛋白的主毒性组分是麦醇溶蛋白，其为含有几个T-细胞刺激性表位的富含脯氨酸-及谷氨酰胺的蛋白家族。它们在消化道中被胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶部分降解导致几种毒性肽的形成，其中肽p31-49和其α1-麦醇溶蛋白级分的衍生的p31-43，及α2-级分的p56～88(33聚体)被最佳表征。33聚体是也由体外模拟生理学胃肠酶促消化获得的33个残基的肽片段(Shan等人，2002)，其氨基酸序列是LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID NO：6)。其是最强免疫刺激物肽，因为其携带多个拷贝的在患乳糜泻的患者中是免疫原性的3个表位；其由此负责强免疫毒性应答(Qiao S.W.，Bergseng E.，Molberg O.，Xia J.，Fleckenstein B.，Khosla C.，Sollid M.L.”Antigen Presentation to Celiac Lesion-Derived T Cell of a33-mer Gliadin Peptide Naturally Formed by Gastrointestinal Digestion”J.Immunol.，2004，173，1757-1762)，由此其被用作谷蛋白脱毒的模型。33聚体肽是使固有层中的麦醇溶蛋白肽脱酰氨基化的酶转谷氨酰胺酶2(TG2)的优良的底物，增加它们对人白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8分子的亲和性，由此增强导致临床结果的T细胞-介导的粘膜免疫应答。跨肠细胞层的完整33聚体的肠运输可由于CD中转铁蛋白受体的过表达和/或由于增强的粘膜通透性。无论如何，肽可逃逸被酸性内体-溶酶体通路降解，和可未变化地达到浆膜边缘。33聚体麦醇溶蛋白肽降解为含有少于9个残基的肽，这导致无谷蛋白毒性。 [0053] 由于消化道不具有酶促器官以有效切割源于谷蛋白的富含脯氨酸的肽，驱使患乳糜泻的患者异常免疫肠应答，使用经口活性蛋白酶而在毒性麦醇溶蛋白肽到达粘膜之前降解它们可被认为是膳食的替代性的处理。 [0054] 申请人鉴定了在酸性pH(对应于胃液的pH)对肽(诸如富含脯氨酸的肽)呈现蛋白水解活性的新的蛋白亚-家族，并发现，此酶组合物是也能降解33聚体麦醇溶蛋白肽。基于由生物信息学分析获得的结构性质，申请人显示，此新亚家族属于肽酶S8/S53(subtilisin KEXIN SEDOLISIN)和可分组至不同于已知道的属于S53家族的SEDOLISIN或KUMAMOLISIN的新亚组(图1)。 [0055] 申请人开发了这些内肽酶的特定组合物。此组合物包含由放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)产生的肽酶S8/S53(subtilisin KEXIN SEDOLISIN)家族的内切蛋白酶中的至少一种，所述酶消化全长多肽及降解已知抵抗蛋白酶作用的麦醇溶蛋白的片段。如此，至少一种内切蛋白酶可用于治疗乳糜泻或消化过程的任何疾病，诸如吸收不良。而且，由于该酶抵抗胃蛋白酶，这2种蛋白水解活性的组合可导致多肽和蛋白诸如麦醇溶蛋白的更扩展的降解。申请人发现，33聚体被降解为6个氨基酸的肽(表2和3)。尽管本发明的酶单独就有活性，向它们添加作用于富含脯氨酸的肽的一种或更多肽酶，诸如脯氨酰-内切蛋白酶和/或x-脯氨酰-二肽基氨肽酶和/或脯氨酰-氨肽酶可导致更快速作用。 [0056] 本发明的S8/S53蛋白家族单独或任选地与其他蛋白酶组合可在食品工业中有用，诸如但不限于降解苦味用底物，肉处理，肥皂工业或将朊病毒，病毒和毒性或污染物蛋白降解为短肽和/或游离的氨基酸。 [0057] 由此，本发明提供酶组合物，其包含在3和8之间的pH(含端值)有活性的至少一种S8/S53内肽酶，选自： [0058] (a)endopep-140，其包含SEQ ID NO：1，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0059] (b)endopep-40，其包含SEQ ID NO：2，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0060] (c)endopep-120，其包含SEQ ID NO：3，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0061] (d)endopep-60，其包含SEQ ID NO：4，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列 [0062] (e)endopep-41，其包含SEQ ID NO：5，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列。 [0063] 本文所用的术语“本发明的肽酶”，“本发明的蛋白酶”，或“本发明的内肽酶”指以上定义的一种或更多内肽酶。 [0064] 本发明也包括源于以上指定的序列中的任何一种的内肽酶，其中任何氨基酸可从SEQ ID NO：1，2，3，4或5中显示的对应残基变化，仍维持其生物学活性和生理学功能，或其生物学活性片段。本发明的目的也包括在天然氨基酸序列的氨基酸序列之内的特定位置含有取代，缺失，侧链修饰和/或插入，而保存所述天然氨基酸序列的生物学活性和生理学功能的任何肽酶变体。取代的例为本领域技术人员所熟知及显示于，例如，WO2011/077359。 [0065] 在另一方面，本发明针对分离的本发明的蛋白酶，及其生物学活性片段(或其衍生物，部分，类似物或同源物)。生物学活性片段指对于特定蛋白酶活性必要的本发明的蛋白酶的区。 [0066] 在进一步实施方式中，本发明的蛋白酶是这样的蛋白酶，其包含与包含SEQ ID NO：1，2，3，4或5的氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选 80％，仍更优选90％和最优选95％同一性的氨基酸序列，及保留包含SEQ ID NO：1，2，3，4或 5的蛋白酶的活性。 [0067] 当提到核苷酸或氨基酸序列时，术语″同一性″和“同源性”在本文互换使用，及指称2个多核苷酸或多肽序列在比较的特定区上以残基-残基为基础的同一或同源的程度。比对和百分率同一性或同源性可通过使用本领域知道的任何适合的软件程序确定，例如描述于Current Protocols in Molecular Biology的那些(Ausubel F.M.et al.，″Commercially Available Software″，Current Protocols in Molecular Biology，1987，Supplement30，Section7.7.18，Table7.7.1)。优选的程序包括GCG Pileup程序，FASTA(Pearson R.and Lipman D.J. ″ Improved Tools for Biological Sequence Analysis”Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，1988，85，2444-2448)和BLAST(Altschul S.F.，Gish W.，Miller W.，Myers E.W.，Lipman D.J.″Basic local alignment search tool″J.Mol.Biol.，1990，215，403-410)。 [0068] 本发明也提供与另一多肽可操作地-融合的本发明的蛋白酶，其被本领域技术人员称为嵌合或标记的蛋白。多肽可融合到本发明的蛋白酶的N-端和/或C-端。不同标记的融合蛋白可由本领域技术人员进行，及由标准重组DNA技术或常规技术，包括自动化的DNA合成仪产生。该融合蛋白可辅助本发明的重组蛋白酶的纯化或宿主细胞中它们的表达和分泌。这些技术为本领域技术人员所熟知。 [0069] 申请人显示，大肽，如33聚体麦醇溶蛋白肽可在酸性pH被内肽酶降解。分泌的endopep-140通过在几个点切割多肽链发挥作用，产生不同的6个氨基酸的小肽(表2，图5)。此内肽酶对在位置P1具有酪氨酸或亮氨酸或苯丙氨酸和在位置P2和P1’具有脯氨酸的位点显示偏好。增加内肽酶的量和/或温育时间导致33聚体多肽的完全降解。根据检测的分子量，似乎谷氨酰胺残基转化为谷氨酸残基，由此提示涉及酰胺转移酶活性。本发明的酶组合物的内肽酶可在哺乳动物胃蛋白酶的存在下操作(表2，图6)。 [0070] 用endopep-40实施相同的分析和获得的结果显示于表3，指示此谷蛋白酶具有类似的行为。 [0071] endopep-140含有与其他本发明的内肽酶具有高同源性的结构域。例如，BLAST比对给出endopep-140和endopep-40之间同一性＝223/370(60％)，阳性(Positives)＝261/370(71％)，或endopep-140和endopep-41之间同一性＝227/431(53％)，阳性＝273/431(63％)。由endopep-40和endopep-41之间的BLAST比对获得类似结果，同一性＝230/419(55％)，阳性＝278/419(66％)。阳性是在它们的如用BLOSUM62矩阵测定的物理-化学特征中彼此同一或非常类似的氨基酸残基。 [0072] 本发明的酶组合物的内肽酶可通过培养天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株或能产生以上定义的至少一种S8/S53内肽酶的其突变体或由重组DNA技术获得的宿主细胞而产生。 [0073] 术语″重组体″，当参照细胞使用时，指示细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸编码的肽或蛋白。未在天然(非-重组体)形式的细胞之内发现的基因或在基因被修饰及再由人工手段导入细胞的天然形式的细胞中发现的基因可含于重组体细胞中。 [0074] 本领域技术人员会认可，这些细胞可为单细胞或多细胞转基因生物。 [0076] 术语″等位基因变体″表示占据相同的染色体座位的基因的任何2种或更多替代性的形式。等位基因变异通过突变天然地出现，及可在群体之内导致表型多态性。基因突变可为沉默(编码的多肽无变化)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位基因变体也指称由基因的等位基因变体编码的蛋白。 [0077] 由此，本发明提供产生本发明的酶组合物的方法，其包括： [0078] (A)培养能产生以上定义的至少一种S8/S53内肽酶的天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株及自培养批回收内肽酶；或者 [0079] (B)培养由常规突变和/或选择技术源于能产生以上定义的至少一种S8/S53内肽酶的天然存在的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株，其维持产生至少一种以上定义的内肽酶的能力及自培养批回收内肽酶；或者 [0080] (C)重组DNA技术，其包括下列步骤： [0081] (1)向宿主细胞导入编码选自下列的S8/S53SubtilisinKEXIN SEDOLISIN类的至少一种内肽酶的核酸： [0082] (a)endopep-140，其包含SEQ ID NO：1，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0083] (b)endopep-40，其包含SEQ ID NO：2，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0084] (c)endopep-120，其包含SEQ ID NO：3，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0085] (d)endopep-60，其包含SEQ ID NO：4，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列，以及[0086] (e)endopep-41，其包含SEQ ID NO：5，其生物学活性片段，其天然存在的等位基因变体，或与之具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95％同一性的序列， [0087] (2)在适合于产生内肽酶的条件下，在培养基中培养步骤(1)的细胞，以及[0088] (3)自培养批回收内肽酶。 [0089] 本发明的一种或更多内肽酶可在实施以上定义的一种方法中产生。当单内肽酶是实施以上定义的方法单独地产生的时，本发明任选地包括组合2种或更多获得的内肽酶的步骤而提供含有所述的内肽酶的混合物的酶组合物。所述内肽酶可作为分离的内肽酶获得。术语“分离的内肽酶”，如本文所用，指纯化的形式的内肽酶，其基本上无其他蛋白或来自内肽酶所来源的细胞的细胞物质。 [0090] 还参照本文使用的它们的相关的操作技术在的全部DNA/RNA核酸术语为分子生物学领域的那些专家所熟知，和至今这些术语以全部它们的宽和常见的含义使用，如报 道 于 Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook J.“Molecular cloning：a laboratory manual”Cold Spring Harbor，NY，1982or Ausubel F.M.“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley&Sons，New York，NY，1993or Sambrook et al.，“Molecular Cloning：a Laboratory Manual2nd Ed.”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。 [0091] 编码本发明的酶组合物的内肽酶的核酸是本发明的另一目的，其包括其序列在本文提供及定义为SEQ ID NO：7，8，9，10或其11的核酸或片段。本发明也包括这些核酸的突变体或变体核酸或部分。 [0092] 因此，本发明的核酸包括SEQ ID NO：7，8，9，10或11所示的多核苷酸序列，或者与包含SEQ ID NO：7，8，9，10或11的核酸序列具有至少50％，优选60％，更优选至少70％，甚至更优选80％，仍更优选90％和最优选至少95％同一性、且编码仍维持所述氨基酸序列的生物学活性和生理学功能的氨基酸序列的序列。 [0093] 由核苷酸水平的同一性表征的序列在本文也称为″同源核酸序列″或其变异。同源核苷酸序列编码那些编码本发明的蛋白酶的同种型的序列。同种型可在相同的生物中作为，例如，RNA可变剪接的结果表达。或者，同种型可由不同基因编码。 [0094] 同源核苷酸序列也包括，但不限于，本文所述的核苷酸序列的天然存在的等位基因变异和突变。同源核酸序列包括编码SEQ ID NO：1，2，3，4或5中的保守性氨基酸取代的那些核酸序列。 [0095] 在本发明中，同源核苷酸序列可包括编码属于放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的其他物种以及放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)之外的属的本发明的蛋白酶的核苷酸序列，诸如例如细链孢菌属(Catenulispora)，丛生放线菌属(Actinospica)，纤线杆菌属(Ktedonobacter)，链霉菌属(Streptomyces)，链嗜酸菌属(Streptacidiphilus)，小单孢菌属(Micromonospora)，皱纹单孢菌属(Rugosimonospora)。 [0096] 申请人由BLAST分析确定，细链孢菌属(Catenulispora)，纤线杆菌属(Ktedonobacter)，链霉菌属(Streptomyces)基因组含有编码与本发明的对应蛋白酶具有大于50％同源性的蛋白的基因；例如，嗜酸细链孢菌(Catenulispora acidiphila)的登录号No.ACU72534和ACU72320的推定的蛋白分别与endopep-40SEQ ID NO：2具有同一性＝261/400(65％)，阳性＝295/400(74％)，和与endopep-140SEQ ID NO：1具有同一性＝705/1342(53％)，阳性＝878/1342(65％)，或消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)的登录号No.EFH81837的推定的蛋白与endopep-40SEQ ID NO：2具有同一性＝ 244/402(61％)，阳性＝299/402(74％)，或登录号No.EFF91270的链霉菌属(Streptomyces sp.)e14蛋白序列也与endopep-40SEQ ID NO：2具有同一性＝230/371(62％)，阳性＝ 274/371(74％)。编码同源内肽酶的基因可存在于属于与上述的其基因组序列不是由公共数据库可利用的系统发生地相关的属的株。 [0097] 本发明的内切蛋白酶的″生物学活性片段”可如下制备：分离编码具有与本发明的内切蛋白酶相同的生物学活性的切蛋白酶的SEQ ID NO：7，8，9，10或11的核酸片段，表达内切蛋白酶的编码的部分(例如，由体外重组表达)，及评定内切蛋白酶的编码的片段的活性。本发明还包括由于遗传密码的简并性不同于SEQ ID NO：7，8，9，10或11所示的核酸序列，由此编码由SEQ ID NO：7，8，9，10或11所示的核酸序列编码的相同的蛋白酶的核酸分子。 [0098] 基因操作和蛋白表达技术为本领域技术人员和可所知，也见于Kriegler M.“Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual”Stockton Press，NY，1990。 [0099] 申请人指出术语″生物学活性″或″功能活性″指本发明的蛋白酶的天然的或正常功能，例如，降解其他蛋白的能力。在本发明的蛋白酶之中保守的氨基酸残基被预测特别难以改变。可制造保守性取代的氨基酸为本领域所熟知。如全部本领域技术人员认可，核酸中的各密码子(除了AUG，其通常仅是甲硫氨酸的密码子)可由标准技术被修饰而产生功能相同的分子。此外，编码的序列中改变，添加或删除单氨基酸或小百分率的氨基酸(一般少于5％，更一般少于1％)的个体取代，缺失或添加是″保守性突变″，其中改变导致氨基酸被化学类似氨基酸取代。 [0100] 本发明的另一方面属于编码含有对活性不是必需的氨基酸残基的变化的本发明的蛋白酶的核酸分子。本发明的该蛋白酶氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1，2，3，4或5，但仍保留生物学活性。在一实施方式中，分离的核酸分子包含编码蛋白酶的核苷酸序列，其中蛋白酶包含与SEQ ID NO：1，2，3，4或5的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。 [0101] 术语“分离的核酸”或“分离的多核苷酸序列”，如本文所用，指从存在于核酸所来源的细胞的其他核酸分子分离，且当所述核酸分子从天然存在的微生物，源于其的微生物，或由重组技术获得的微生物得到时，基本上无其他细胞物质或培养基物质的核酸分子。 [0102] 编码与SEQ ID NO：1，2，3，4或5的蛋白同源的本发明的内切蛋白酶的分离的核酸分子，可通过向SEQ ID NO：7，8，9，10或11的核酸序列导入一个或更多核苷酸取代，添加或缺失而产生，使得一个或更多氨基酸取代，添加或缺失被导入编码的蛋白酶。可由标准技术，诸如定点诱变，PCR-介导的诱变和DNA改组将突变导入SEQ ID NO：7，8，9，10或11。或者，突变可沿着本发明的蛋白酶的编码序列的全部或部分随机导入，诸如由饱和诱变，且得到的突变体可就本发明的蛋白酶的生物学活性进行筛选，以鉴定保留活性的突变体。 [0103] 本发明的谷蛋白酶组合物也可以固定的形式使用及用于，例如，处理液体食品。本发明的酶组合物也可用于果实及酿造工业，用于设备清洁及维持。例如，含有谷蛋白的液体食品允许沿着嵌入本发明的酶组合物的谷蛋白可渗透的基质流动。谷蛋白从食品提取和通过酶的作用消化。本发明的酶组合物也可贡献于食品的可利用的能量。例如，部分或不可消化的包含脯氨酸的蛋白被本发明的酶组合物完全或部分降解，导致人或动物更可消化的食品的利用度。如此，人或动物的生长速率和/或食品转变比(即摄入的食品重量相对于体重增长)改善。 [0104] 【产生内肽酶的方法和它们的表征】 [0105] 本发明也涉及产生本发明的酶的方法，包括培养(a)株，其处于野生型形式，或(b)由常见的突变技术源于其的形式，例如，由用诱变剂或用电离辐射处理，或(c)能产生本发明的多肽的宿主细胞，及自培养批回收所述多肽。在本发明的产生方法中，用于细胞培养的培养基根据野生型株，源于其的株，或重组宿主细胞的培养，在本领域知道用于蛋白产生的那些之中区别性地选择。培养在包含碳和氮源和无机盐的适合的营养培养基中，使用本领域知道的过程发生。适合的培养基可获自商业提供商或可根据出版的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。例如，含有大豆的培养基更适合于允许由野生型微生物产生本发明的酶。 [0106] 细胞可由摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续，批，补给分批或固态发酵)来培养，其中在适合的培养基中及在允许多肽表达和/或分离的条件下实施。如果多肽分泌到营养培养基中，多肽可直接自培养基回收。如果多肽未分泌，其可自细胞裂解物回收。产生几种蛋白水解活性，及当内肽酶产生达到最大时，使培养物悬浮。在培养完成之后，将培养基过滤出，以分离微生物体，及以通常方式，通过几个过程组合处理滤出物来收集内肽酶，诸如超滤，在减压下浓缩，盐析，由有机溶剂沉淀，透析，凝胶过滤，吸附层析，离子交换层析，电聚焦和冷冻干燥。考虑到内肽酶的期望的物理和化学性质，应选择充分的过程。 [0107] 本发明的内肽酶的产生的代表性的实例通过培养在下文实施例1中提供的野生型放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株。本发明的内肽酶可依赖于目的用途及依赖于内肽酶的比活性而可被纯化至期望的纯度程度。 [0108] 【宿主细胞中的异源表达】 [0109] 重组体细胞和微生物可用于产生本发明的内肽酶。宿主细胞可为本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞，真核生物细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，真菌细胞，酵母细胞和/或植物细胞。适当的宿主的选择在本领域技术人员的能力之内。 [0110] 有用的微生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus))或链霉菌属(Streptomyces)细胞，或乳酸细菌的细胞，或革兰氏阴性细菌诸如大肠埃希氏菌(E.coli)和假单胞菌属(Pseudomonas)。优选的生产性细胞包括来自那些知道通常被认为安全的生物的那些，诸如原核生物乳杆菌属(Lactobacillus)，火球菌属(Pyrococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，及真核生物曲霉属(Aspergillus)。更优选的细胞包括已在食料制备中使用的那些，诸如乳杆菌属(Lactobacillus spp.)物种和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)。 [0111] 酶的细胞外产生可从微生物诸如米曲霉(Aspergillus oryzae)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)得到。 [0112] 载体导入细菌宿主细胞可，例如，由原生质体转化(例如，Chang S.，Cohen S.N.“High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA”Mol.Gen.Genet.，1979，168，111-115)，使 用 感 受 态 细 胞( 例 如，Dubnau D.，Davidoff-Abelson R.“Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis.I.Formation and properties of the donor-recipient complex”J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)，电 穿 孔 ( 例 如，Shigekawa，K.，Dower W.J.“Electroporation of eukaryotes and prokaryotes：a general approach to the introduction of macromolecules into cells”Biotechniques，1988，6，742-751)或缀合(例如，Koehler T.M.，Thorne C.B.“Bacillus subtilis(natto)plasmid pLS20mediates interspecies plasmid transfer”J.Bacteriol.，1987，169，5771-5278)进行。 [0113] 待用作宿主细胞的有用的多细胞生物是，例如，植物，植物部分，种子或植物细胞。优选的生产性多细胞生物是含有编码本发明的蛋白酶的核酸的，例如，转基因食品作物，诸如谷物，或蔬菜，诸如番茄。 [0114] 在重组宿主细胞中生产本发明的内肽酶的代表性的例在下文实施例2中给出。 [0115] 【药学制剂】 [0116] 本发明的内肽酶剂可单独施用或合并入各种制剂。本发明的药物组合物被配制为与其旨在的施用途径(优选是口服施用)相容。例如，由于本发明的酶组合物的一些内肽酶分泌，可经口施用自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)或其他有用的单细胞重组微生物诸如革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，链霉菌属(Streptomyces)细胞，乳酸细菌细胞，革兰氏阴性细菌诸如大肠埃希氏菌(E.coli)的细胞培养基获得的粗制备物。乳酸细菌包括，但不限于，乳球菌属(Lactococcus)物种，乳杆菌属(Lactobacillus)，明串球菌属(Leuconostoc)，链球菌属(Streptococcus)，片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)。或者，本发明的酶组合物可在纯化之后经口施用。 [0117] 该制剂可用适当的成分制备，以产生液体形式的，例如溶液形式，乳剂或固体形式，诸如片剂，胶囊或半固体的制备物。酶组合物的制剂可以各种方式施用，包括特别适合于与食料混合的那些。酶组分可在摄入之前或期间有活性，及可，例如，通过适合的包裹处理，以控制活性时机。 [0118] 为了制备本发明的内肽酶的适当的药物组合物，可使用本领域知道的稳定化化学或生物材料的任何方法，包含基于辐射或温度调节或它们的组合的那些。 [0119] 为治疗乳糜泻，采用的药物组合物优选配制成在胃液中释放它们的活性。此类型的制剂会在正确的地点提供最佳活性，例如在胃中释放本发明的内切蛋白酶。 [0120] 替代性地，可将能产生活性剂的微生物，诸如细菌或酵母培养物施用于患者。该培养可与食品制备物混合或配制为，例如，肠溶胶囊。 [0121] 本发明还提供包含本发明的酶组合物的食品补充物。在本发明的情景中，术语″食品补充物″是与术语食品添加剂，饮食补充物和营养物补充物可互换的。 [0122] 本发明的食品补充物可配制，制备，供给及分注，如描述于有关本发明的领域的其他现有文献(WO2011/077359，WO 2003/068170，WO2005107786)，其提供治疗和/或预防与人疾病关联的综合征的方法，所述疾病选自：乳糜泻，疱疹样皮炎，消化道吸收不良，过敏性反应，酶缺乏，真菌感染，Crohn病，真菌病和口炎性腹泻。 [0123] 作为一例，本发明的食品补充物可为可容易与食品组分混合的粒化的酶包被的或未包被的产物，替代性地，本发明的食品补充物可形成预混物组分。或者，本发明的食品补充物可为稳定化的液体，水性或基于油的浆。本发明的酶组合物可通过在转基因食品作物(例如，转基因植物，种子等)，诸如谷粒，谷物，玉米，大豆，油菜籽，羽扇豆中直接表达酶来供给。 [0124] 本发明的药物组合物或食品补充物可在膳食之前，在即将膳食之前，随膳食或在膳食之后立即提供，从而本发明的酶组合物的内切蛋白酶在上胃肠腔中释放或活化，其中内切蛋白酶可补助胃和胰腺酶，而对摄入的谷蛋白脱毒及防止有害肽经过肠细胞层。 [0125] 本发明的酶组合物在食品加工工业中具有多种应用，尤其是它们可用于制备食品补充物，如描述于上述的现有文献。 [0126] 自本说明书证实，本发明的另一目的包括提供降解谷蛋白寡肽的方法，所述谷蛋白寡肽抵抗被胃酶和胰腺酶切割，和其在内腔中存在导致毒性效应，所述方法包括使所述谷蛋白寡肽接触酶组合物或至少一种分离的本发明的内肽酶。 [0127] 尤其是，所述方法的一方面包括治疗或预防腹腔口炎性腹泻，疱疹样皮炎和/或任何与谷蛋白不耐性关联的其他病症，所述方法包括给有需求的患者施用有效量的酶组合物或至少一种分离的本发明的内肽酶，优选地，其被掺入药学制剂，食品补充物，饮料或饮料。【实施例】 [0128] 【实施例1：放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988内肽酶鉴定和表征】 [0129] 【1.1株培养和蛋白产生】 [0130] 根据本发明使用的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)株源于申请人菌株收集处。 [0131] 将放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988维持在用HCl酸化为pH5.5的ISP2琼脂培养基(Shirling和Gottlieb，1966)上。将一板的微生物内容物刮下，及接种进一个含有15ml的培养基AF5的50ml锥形瓶中，所述培养基AF5组成为：(g/l)右旋糖20，酵母提取物2，大豆膳食8，NaCl1和MES10。在蒸馏水中制备培养基和pH调整至5.5，之后于121℃灭菌20min。使接种的细颈瓶于28℃，在以200rpm操作的旋转摇床上生长。在5～6天温育之后，5％的培养物接种于含有100ml的相同的发酵培养基的第2系列 500ml锥形瓶。于28℃，在以200rpm操作的旋转摇床上温育15天的细颈瓶中实施蛋白产生。由以下描述的生物测定监测蛋白产生。 [0132] 产生几种蛋白水解活性，及当在以下描述的测定后内肽酶产生达到最大时使培养悬浮。发酵在15天之后收获，和使肉汤以4000rpm离心15分钟。将培养基过滤出，以分离微生物体，及处理滤出液。考虑到内肽酶的期望的物理和化学性质而选择充分的过程。 [0133] 【1.2蛋白水解活性测定】 [0134] 以不同pH，在乙酸盐缓冲剂(乙酸铵-AMAC，50mM终浓度，pH4.0～8.0；乙酸20mM，pH3.0)中，于37℃，在0.2ml的总体积中测量酶活性。 [0135] 内肽酶的酶活性通过测量作为底物的琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC(氨基-甲基-香豆素)的水解来测定(Bachem AG，Hauptstrasse144，4416Bubendorf，Switzerland)。 [0136] 以10mM 浓 度 制 备 底 物 原 液 并 存 储 于-20 ℃。 由 含 有2mM 琥 珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC的10～20μl的60％甲醇溶液和50～150μl乙酸缓冲溶液制备底物。反应混合物在不同pH值的200μl乙酸盐缓冲剂中含有0.2mM浓度底物和酶制备物(每测定10～40μl之间或1.0μg)。 [0137] 向已之前加热至37℃10分钟的底物添加10～40μl的酶溶液，及使反应于37℃实施达2小时。用融合微-平板读数仪(Perkin Elmer Italia SpA，Monza，Italia)，以360nm的激发波长和460nm的发射波长测量释放的AMC。 [0138] 作为对照，无酶地底物温育。 [0139] 在1分钟内释放1mmol的AMC的酶活性定义为1个单位。 [0140] 【1.3内肽酶纯化】 [0141] 将菌丝体从培养基由纸过滤(Miracloth，来自Calbiochem，USA)分离。然后，将200ml的上清液以5000rpm离心10分钟，以移出碎片，然后上清液再于4℃以10000rpm离心 20min，以移出不溶性级分。蛋白自上清由乙醇(1∶4v/v)或硫酸铵20～75％饱和沉淀。 使沉淀重悬浮及透析，发生时通过使用Centricon管Plus-70，以5kDa截止值(Millipore，Bedford，Mass.，USA)浓缩。当在pH5测试时，凸显能水解琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC的蛋白酶的存在。在透析之后，将等份的蛋白悬浮液热沸，以供MS-鸟枪法分析。热沸过程是必需的，以便避免自消化。检测到属于S8/S53家族蛋白酶的至少5种蛋白。 [0142] 将重悬浮的蛋白在离子交换树脂Amberlite IRA900(Alfa Aesar GmbH，Karlsruhe，76185Germany)或DE-52纤维素(Whatman Inter.ltd，Maidstone England)或其他基质上层析；测试获得的级分的琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC水解，和使合并的有活性的级分经历1D-SDS-PAGE和酶谱分析。 [0143] 蛋白还由尺寸排阻过滤，在分子量截止值300kDa，100kDa，50kDa，30kDa，10kDa分级分离(Nanosep Pall，Michigan.USA，Vivaspin Sartorius GmbH37070Goettingen，德国)。它们的活性如描述测试。获得具有不同分子量的有活性的级分。使这些级分的等份热沸及由MS-鸟枪法分析。 [0144] 蛋白由电泳(在均质10％或盘式-凝胶4～15％或任何-kd聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，9640，CA，USA)上)分离，之后是用考马斯亮蓝R-250(Bio-Rad)或银(SIGMA-Aldrich，USA)染色或由通过使凝胶于37℃与50～100μM荧光底物琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC在期望的pH温育来实施的酶活性染色(酶谱法)染色。 [0145] 将属于S8/S53家族的2种内肽酶纯化直到电泳分析显示如由银染色及酶谱法二者检测的单条带的存在。 [0146] 在分子量过滤之后获得第1内肽酶：其保持在＞100kDa的截止值。对应热沸的等份的MS-鸟枪法分析揭示endopep-140，SEQ ID NO：1(表1A)的存在，具有142449.4的分子量和5.18的理论pI；检测到2种其他蛋白的踪迹。此蛋白级分在4～8的pH有活性，最佳pH是5(图2)。当以pH3测试时，在于37℃30分钟的温育之后，酶显示在pH5时的95％的其活性(图3)。如显示在实施例3中，相比琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC的水解，此蛋白级分在33聚体消化方面更有效。 [0147] 第2谷蛋白酶，其被称为endopep-40，SEQ ID NO：2，含于＜100kDa截止值蛋白级分(表1B)，具有39908.4的分子量和5.94的理论pI。此蛋白在4～6的pH有活性，最佳pH是5。当在pH3测试时，在于37℃30分钟的温育后，酶显示在pH5时的85％的其活性(图3)。由酶谱法凸显的荧光条带显示约40kDa的分子量。表征自凝胶条带洗脱的有活性的蛋白或对应分子大小截止值渗余物的酶活性。MS-鸟枪法分析揭示其他蛋白的存在；指示endopep-140序列存在的信号可为由于由其降解形成的更小多肽(＜100kDa)。 [0148] 其他3种内肽酶(称为endopep-120，SEQ ID NO：3，endopep-60，SEQ ID NO：4，endopep-41，SEQ ID NO：5)未纯化至同质。它们的存在在分泌蛋白质组中及在第1纯化步骤的有活性的级分中由MS-鸟枪法检测。MS-鸟枪法分析允许鉴定这里报道的它们的氨基酸序列。申请人根据它们的推知的分子量命名蛋白。如此，endopep-120具有112012.8的分子量和6.75的理论pI，endopep-60具有59646.0的分子量和6.02的理论pI，endopep-41具有41646.1的分子量和5.22的理论pI。 [0149] 【1.4蛋白MS分析：鸟枪法MS实验】 [0150] 今天，蛋白质组学方法对发现-驱动的生物标志物或蛋白表征研究具有第一重要性。 [0151] 典型蛋白质组学方法基于2-维凝胶电泳(2DG)，其中目标蛋白斑点被分离及由质谱法(MS)鉴定。2DG方法具有相对高分辨率，但是，其受检测特定类的蛋白的困难限制。这些包括膜蛋白(由于它们在凝胶电泳缓冲剂中的低溶解度)、具有低(＜10kDa)或高(＞200kDa)分子量的蛋白、以及具有极端等电点(pI＜4或＞9)的那些。此方法的另外的限制在于分析欠表达的蛋白中的困难及其是繁琐和耗时的事实。 [0152] 这些问题通过使用基于与串联质量光谱法(2DC-MS/MS)偶联的2-维毛细管层析，也命名为MudPIT(多维蛋白鉴定技术)的新蛋白质组学方法解决(Washburn，M.P.，Wolters D.，Yates J.R.3rd“Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology”Nat.Biotechnol.，2001，19，242-7)。其涉及自酶促消化复合蛋白混合物产生肽，它们的分离利用2微-HPLC柱及洗脱的峰由MS/MS的直接分析。2DC-MS/MS将离子交换与自总(或预分级分离的)蛋白的直接消化获得的肽混合物的逆相分离组合。尤其是，肽混合物首先利用离子交换层析(SCX柱，5μm，0.3ID×150mm)，使用7个增加氯化铵浓度(0～1000mM)的步骤分离。各盐步骤直接装载进逆相柱(C18，0.180ID×100mm)，用乙腈梯度分离：洗脱液A，水中的0.1％甲酸；洗脱液B，乙腈中的 0.1％甲酸。将自C18柱洗脱的肽直接用离子阱质谱仪分析；检测限是约10fmol或更小。为MS/MS分析，以阳性模式(一般在400～1600m/z范围)，使用动态排除获取谱。使用不同蛋白酶消化来自样品的蛋白提取物(胰蛋白酶，胃蛋白酶或蛋白酶K)。 [0153] 然后用适当的软件，诸如用于质谱的数据处理的SEQUEST算法通过自动化的数据库搜索来获得对应蛋白的鉴定(Eng，J.K.，McKormack，A.L.，Yates，J.R.“An Approach to Correlate Tandem Mass Spectra Data of Peptides with Amino Aminoacid Sequences in a Protein Database”J.Am.Soc.Mass Spectrom.，1994，5，976-984)。产生的实验质谱关联于由与自NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)或其他网站下载的蛋白数据库中的理论质谱比较获得的肽序列。 [0154] 【1.5蛋白鉴定的标准】 [0155] 如果肽鉴定可如由肽Prophet算法确定，以大于90.0％概率成立，则肽鉴定被接受(Keller A.，Nesvizhskii A.I.，Kolker E.，Aebersold R.”Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search”Anal.Chem.，2002，15，5383-92)。如果蛋白鉴定可以大于95.0％概率成立及含有至少一种鉴定的肽，则蛋白鉴定被接受。因为被发现与蛋白公共数据库不大于50％同一性，对放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的基因组测序及在6种可能的阅读框中翻译。随后，检测的肽针对放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)推定的蛋白的由BLAST的比对鉴定了已知的同源物蛋白。 [0156] 在放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的分泌蛋白质组中推定地鉴定总94种蛋白。酶构成它们的显著部分，检测到17种蛋白水解酶，及也发现糖苷酶，脂肪酶，酸性磷酸酶及二脂酶。无功能可由BLAST分析分配给25种序列。 [0157] 在蛋白酶之中，可检测属于S8/S53肽酶家族的5种蛋白，其中2种尤其是最代表的蛋白。 [0158] 对全部随后纯化步骤实施相同的分析，直到仅检测到少数序列。 [0159] 由热沸的有活性的级分的MS分析获得的数据显示少数蛋白序列，尽管在银染色的SDS-PAGE凝胶上存在单条带。如显示于表1，endopep-140(SEQ ID NO：1)和endopep-40(SEQ ID NO：2)被检测为负责2种描述的活性的蛋白。样品中鉴定为＜100kDa的endopep-140的存在可能是由于更小多肽中蛋白的部分降解。 [0160] 电子分析显示，endopep-140和endopep-40二者是含有导致分泌的信号肽的糖基化的蛋白，提示它们可作为前原酶产生。 [0161] 电子分析将全部5种endopep分组进S8/S53家族及显示全部是糖基化的蛋白。在endopep-140，endopep-40和endopep-41(SEQ ID NO：5)之间发现高同源性，允许它们在图1的系统树显示的亚组中聚类。也对endopep-60(SEQ ID NO：4)检测到信号肽序列，而其在endopep-120(SEQ ID NO：3)和endopep-41中缺乏。 [0162] 显示于图1的系统树凸显这些S8/S53谷蛋白酶的新颖性，其不与WO 2011/077359中公开的属于S53家族的KUMAMOLISIN聚类，也不与SEDOLISIN聚类，也不与三肽基-肽酶聚类(sedA～sedD)。 [0163] 这些酶的新颖性还被底物特异性支持，如显示于实施例3。通过用endopep-140或endopep-40消化获得的33聚体的降解模式显示内-蛋白水解活性。 [0164] 【实施例2：重组宿主细胞中的内肽酶产生】 [0165] 【2.1株和质粒】 [0166] 将放线异壁酸菌属物种(Actinoallomurus sp.)DSM24988用于此研究。全部质粒亚克隆实验在大肠埃希氏菌(E.coli)DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，使用质粒pTZ57R/T(Fermentas，UAB，Lithuania)实施。 [0167] 将 大 肠 埃 希 氏 菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)Star(Novagen Italia，Podenzano，PC)用于产生异源(重组体)肽酶。 [0168] 【2.2重组蛋白酶产生】 [0169] 自用作表达系统的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Bl21(DE3)Star产生并纯化重组放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)蛋白酶。 [0170] 为了构建产生Endopep-140和Endopep-40的大肠埃希氏菌(E.coli)株，通过使用以下组的引物扩增基因的核苷酸序列： [0171] Fendopep-140 [0172] 5’-AAAAAGCTTCAGCTACAGGTGTGGTCGG-3’SEQ ID NO：12 [0173] Rendopep-140 [0174] 5’-AAAAAAACATATGCCCGATCTTCCCACCC-3’SEQ ID NO：13 [0175] Fendopep-40 5’-AAAAAGCTTCAGAAGGCTCCGGTGCC-3’SEQ ID NO：14 [0176] Rendopep-40 [0177] 5’-AAAAAAACATATGTCACGACGCGTGACCG-3’SEQ ID NO：15 [0178] 将PCR产物克隆进pTZ57R/T载体，及在克隆进表达载体之前测序，以确证在PCR扩增期间无突变导入。 [0179] 然后，将endopep-基因克隆进pET28b质粒(Novagen)的NdeI-HindIII位点及转化进表达宿主BL21(DE3)Star。 [0180] 使转化的细胞于37℃，在50ml含有30μ/ml的卡那霉素的LB培养基的培养中生长，直到OD600达到0.6～1。添加0.2μM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Sigma)而诱导谷蛋白酶的表达，和将培养物进一步于22℃温育过夜。如显示于图4，获得对应于endopep-140和endopep-40的期望的分子量的蛋白条带。 [0181] 【2.3异源产生的内肽酶的纯化】 [0182] 将表达重组内肽酶的细胞以5000g离心20分钟。沉淀重悬浮于8ml的缓冲溶液(20mM磷酸钠500mM NaCl，pH7.8)，然后加入溶菌酶1mg/ml而完全裂解细胞。 [0183] His-标记的蛋白由固定的Ni2+-亲和层析，使用Ni-NTA纯化系统(Invitrogen)，根据生产商的使用说明纯化自粗细胞提取物。使5μl等份的洗脱的级分迁移通过SDS-PAGE及用蓝色-考马斯或银染色染色而确证表达的内肽酶的存在和纯度程度。图4显示在诱导之后，相比非-诱导的对照株，对endopep-140和endopep-40获得的表达水平。 [0184] 用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC作为底物测试从分别 用pET28b空和pET28b-endopep-140或pET28b-endopep-40转化的大肠埃希氏菌(E.coli)株获得的总提取物的酶活性。在来自pET28b-endopep株的提取物中检测到酶活性，而阴性对照未显示活性。 [0185] 【实施例3：内肽酶生物学活性】 [0186] 【3.1在酸性pH麦醇溶蛋白的33聚体毒性肽的降解】 [0187] 将麦醇溶蛋白的33聚体免疫毒性肽溶液(50μM)在4μU的endopep-140或2μU endopep-40的存在下，在胃蛋白酶1mg/ml的存在或缺失下，于37℃温育达2小时。反应在乙酸20mM pH3，300μl的总体积中实施。在0～120min的不同时间(t0，t3，t15，t30，t60和t120min)于37℃监测反应。由HPLC-MS分析监测33聚体肽的消失和降解产物的呈现。取50μl等份及用50μl H2O:CH3CN50:50(+0.1％甲酸)停止酶活性。样品交付于HPLC-MS，在LTQ-XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific，San Jose，California，USA)上分析。用endopep-140，endopep-140和胃蛋白酶，胃蛋白酶单独获得的HPLC-MS特征分别报道于图5，6，7。在2h温育之后证实33聚体肽消失。 [0188] 将在33聚体肽与4μU的endopep-140或2μU的endopep-40温育之后检测的全部肽分别显示于表2和3。 [0189] 在2小时温育之后，观察到的最强峰具有1的电荷状态及对应于748.4的[MH]+，指示小肽的存在。此信号也是首次呈现。基于33聚体序列，4种(1～6，8～13，15～20，22～27)肽对应于此分子质量，全部由6个残基组成。根据消化的33聚体的MS分析，代替谷氨酰胺残基而谷氨酸残基存在于水解的肽序列中，由此提示底物的脱酰胺。 [0190] 分析显示，在33聚体与胃蛋白酶2小时的温育之后，几乎未观察到水解(图7和表2和3)，与文献数据一致。 [0191] 将endopep-140量增加达8μU或将endopep-40量增加达9μU导致在pH3在2h之后33聚体完全消失(未显示)。 [0192] 甚至在胃蛋白酶存在下，观察到相同的降解模式，尽管在2h之后完整肽的量相比其缺失时更高，提示内肽酶未被胃蛋白酶毁坏。 [0193] 【3.2HPLC/MS分析】 [0194] HPLC分析通过使用离子阱质谱仪实施。将LTQ-XL或偶联于Accela或Surveyor泵Advantage(Thermofisher Scientific，San Jose，CA，USA)用于表征由酶混合物产生的酶促蛋白水解产物。将肽通过使用与Milli Q水(Millipore，Bedford，Mass.，USA)中的0.1％甲酸梯度(溶液A)和乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)(用于洗脱)组合的Thermofisher Scientific Hypersil金或C18对称柱(Waters，Milford，Mass.，USA)分离。梯度起始于95％的溶液A及增加到60％的溶液B。通过使用“扫描依赖性”MS/MS算法(离子阱质谱仪的特征性算法)获得个体肽的详细信息。全扫描分析之后是变焦扫描分析，其用于确定全扫描质量范围内最强离子的电荷状态。33聚体(M＝3910)用于在MS模式中就最佳灵敏度进行调准及在MS/MS模式中，就最佳片段化进行调准，实施60μg/ml的恒定输注，在MS模式中导致主要双和三价物质，及在MS/MS模式中导致约35％的最佳碰撞能。 [0195] 【实施例4：内肽酶生物学活性】 [0196] 【4.1麦醇溶蛋白和谷蛋白水解的混合物的降解】 [0197] 由于特定结构特征，脯氨酰寡肽酶无法消化通常长于30个氨基酸的大肽。而且，三肽基-蛋白酶SEDOLISIN无脯氨酰蛋白酶添加就无法水解麦醇溶蛋白。此限制是酶的明显的缺点，这是因为旨在尽可能快速且有效水解全部潜在有毒性的富含脯氨酸的肽。 [0198] 将来自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)的endopep-140和endopep-40与麦醇溶蛋白温育，以看是否放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)内切蛋白酶能消化全蛋白。形成的水解产物由SDS-PAGE分析。 [0199] 麦醇溶蛋白溶液通过于70℃，以10mg/ml(20μM)浓度将麦醇溶蛋白粉(Sigma G3375)溶解于乙醇70％来制备。完整麦醇溶蛋白分子由40～55kDa的蛋白混合物组成。将麦醇溶蛋白于37℃，与10μl(5μU)的放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)内切蛋白酶，在乙酸20mM pH3中，在0.3ml的最终体积中温育。反应在1mg/ml的胃蛋白酶的缺失及存在下，在热混合器(Eppendorf AG，Hamburg，Gerrmany)中实施(图8)。以不同时间间隔监测反应，在0min，30min，1和2h时间自温育混合物取出30μl样品及于4℃保存，直到SDS-PAGE。 为SDS-PAGE及染色使用的全部材料购自Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)。通过使用样品缓冲剂，根据生产使用说明制备样品，及在任何kd Bis-Tris凝胶上，使用SDS缓冲剂系统，根据生产使用说明分离。通过使用考马斯R250或银实施染色。 [0200] 如可见于图8，麦醇溶蛋白在2小时内被放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)来源的内肽酶切割为小肽至几乎完全消化。可从SDS凝胶上条带强度的减小见到产物的衰变。此实验也显示，胃蛋白酶不影响消化功效。 [0201] 表1.自放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)分泌蛋白质组纯化的推定的蛋白[0202] 对放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)纯化的级分在100kDa分子量截止值过滤，及供于MS-鸟枪法分析。将鉴定的肽针对由放线异壁酸菌属(Actinoallomurus)基因组翻译(蛋白_Id：内部编码推定的蛋白序列)推知的蛋白进行比对，和随后由BLAST电子分析证明同源物已知的蛋白(BLAST登录号No.：序列代码；BLAST注释：蛋白名称；n.r.：无结果)。匹配的谱数给出蛋白量的半定量量度，显示为频率(F_平均)。 [0203] A：自＞100kDa级分获得的数据；B：自＜100kDa级分获得的数据 [0204] A [0205]蛋白_Id BLAST登录号No. BLAST注释 F_平均 注释 Seq_48773 YP_003835151.1 肽酶S8/S53 101，9 Endopep-140 Seq_100531 dbj|BAJ32040.1 推定的脂肪酶 20，2 Seq_293141 n.r. n.r. 10.14 [0206] B [0207]蛋白_Id BLAST登录号No. BLAST注释 F_平均 注释 Seq_44766 ZP_06921971.1 分泌的蛋白 40，14 Seq_72108 YP_003114375.1 肽酶S8/S53 30，25 Endopep-40 Seq_48773 YP_003835151.1 肽酶S8/S53 20，15 Endopep-140 Seq_293141 n.r. n.r. 10，15 [0208] 表2.由用endopep-140的33聚体消化释放的肽 [0209] 在胃蛋白酶(1mg/ml)的存在和缺失下，用4μU endopep-140消化33聚体麦醇溶蛋白肽(50μM)之后，由HPLC-MS检测的全部分子量。通过使33聚体与胃蛋白酶单独温育获得对照。于37℃，乙酸20mM，pH3温育。 [0210] [0211] [0212] 表3.由用endopep-40的33聚体消化释放的肽 [0213] 在以不同时间间隔，在胃蛋白酶(1mg/ml)的存在和缺失下，用2μU endopep-40消化33聚体麦醇溶蛋白肽(50μM)之后，由HPLC-MS检测的全部分子量。通过使33聚体与胃蛋白酶单独温育获得对照。于37℃，乙酸20mM，pH3温育。 [0214] [0215] |
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