水解卵磷脂 |
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| 申请号 | CN201180005913.7 | 申请日 | 2011-01-17 | 公开(公告)号 | CN102906271B | 公开(公告)日 | 2016-04-06 |
| 申请人 | 凯敏工业公司; | 发明人 | S·范戴克; B·芬内肯斯; B·科庞; F·纳伊森; | ||||
| 摘要 | 本文描述了包含磷脂和溶血磷脂的特定卵磷脂组合物，其可用作用于改进消化率参数并因此改进肠健康和动物行为表现的动物 饲料 添加剂。此外，所述混合物具有有用的 生物 学和化学性质，其可用于动物饲料和人食品工业中。所述组合物借助于HPLC-ELSD、HPLC-MS/MS和31P-NMR来化学表征，且充分描述了其生物功能性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.磷脂和溶血磷脂的混合物，其包含比率为0.6/1至1.4/1的溶血磷脂和其它磷脂，其中含磷脂质的水平大于16％且小于32％，并且所述溶血磷脂包括溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酸，所述溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺与溶血磷脂酸以4.5±1:2.5±0.5:2±0.5:1±0.25的比率存在。 |
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| 说明书全文 | 水解卵磷脂[0001] 发明背景 [0003] 本发明一般涉及饲料和食品成分，更具体地，本发明涉及具有显著改进的功能性的水解卵磷脂的组合物。 [0004] 改善动物行为表现的尝试遵循多种策略，包括改善营养物的消化和吸收。为此，若干基于乳化剂的饲料添加剂在世界范围内均有销售。大概有两类产品。第一类利用合成乳化剂，例如乙氧基化的蓖麻油酸酯、聚山梨酸酯和脱水山梨糖醇酯。另一类乳化剂是天然产物，如卵磷脂。大豆卵磷脂被广泛用作动物食品添加剂。其以0.1-3%的水平掺入，并起到增加脂肪消化率和将它们向肝外转运的作用。在一些情况下，通过酶法水解修饰卵磷脂来改变其功能性。 [0005] 与卵磷脂结构相关的溶血卵磷脂也可用于改善动物行为表现。溶血卵磷脂与卵磷脂的区别在于它们表现乳化作用的方式。卵磷脂具有低HLB值(亲水/亲脂平衡)，其促进油在水中的乳化。或者，溶血卵磷脂具有较高HLB值，其促进油在水中的乳化。在营养物消化方面，这是重要的因素，因为脂质会在肠道中更好地乳化，这有助于吸收。 [0006] 溶血卵磷脂特别是溶血磷脂酰胆碱(LPC)参与多种重要的生物过程。溶血磷脂酰胆碱是磷脂酰胆碱(PC)的单酰基衍生物，且可通过磷脂酶的作用产生。PC分子通过酰基转移酶的作用而再形成，所述酰基转移酶将脂肪酸链重组到sn-2位。该酯键的断裂和再形成(而非从头合成)是活细胞膜中LPC交换动力的驱动器。 [0007] 待由酶产生的正确溶血磷脂取决于用作磷脂源的卵磷脂的组成和酶法水解的条件。 [0008] 已知溶血磷脂参与鸟苷酸和腺苷酸环化酶活性的调节；人单核细胞的趋化性；小鼠胸腺淋巴瘤细胞的趋化性；人T淋巴细胞的活化和内皮源性舒张因子介导的动脉血管舒张的损害。也已知其调节平滑肌收缩性；诱导钙调蛋白结合蛋白质的构象变化；调节蛋白激酶C活性；和刺激原癌基因产物p21的鸟苷三磷酸酶水解。 [0009] 溶血磷脂在生物系统内具有重要且不同的作用，生物系统准确地依赖于细胞可用的溶血磷脂的量和进一步调节这些浓度的负反馈过程。 [0010] 发明概述 [0011] 本发明包括新的水解卵磷脂组合物，其为农业和食品工业中已知的现有产品带来了预料不到地好的额外益处。使用新的且特定的磷脂和溶血磷脂的组合物来讨论许多功能。与可商购获得和/或现有技术中所述的其它配方相比，该配方提供改进的功能性。 [0012] 该配方可通过数种方式获得。其可通过将可商购获得的卵磷脂和溶血卵磷脂组合来配制。或者，其可从纯化合物来配制，所述纯化合物从卵磷脂中的这些化合物的有机合成或工业分离获得。另一种方式是使用酶法水解的已知方法水解卵磷脂或溶血卵磷脂。 [0013] 该配方的特征为：(a)约16%至32%，且优选约21%至24%的相对低水平的含磷脂质；(b)约1.4:1至1:0.6，且优选约1/1的高溶血磷脂与其它磷脂的比率；和(c)四种主要溶血磷脂LPC、LPI、LPE和LPA的优选比率为4.5±1/2.5±0.5/2±0.5/1±0.25，以及在这些范围内的所有值。 [0014] 在优选实施方案中，该配方提供了摩尔量为约27.71±6的溶血磷脂酰胆碱、摩尔量为约15.82±5的溶血磷脂酰肌醇、摩尔量为约13.65±3的溶血磷脂酰乙醇胺、摩尔量为约6.98±3的溶血磷脂酸和摩尔量为约35.84±10.7的其它磷脂，以及在这些范围内的所有值。 [0015] 优选实施方案详述 [0016] 可主要通过两种分析技术获得所有磷脂的鉴定和它们的比率。第一种是31P-NMR。不同的磷脂可由NMR谱中的化学位移鉴定。通过信号的整合可以定量。另一种有价值的技术是HPLC。可使用HPLC系统分离磷脂配方中的不同组分。可使用常规检测器如电子光散射检测器来定量所有化合物的浓度。 [0017] 在一优选实施方案中，所述配方具有表1列出的组成。 [0018] 表1-典型配方的磷脂部分的组成(以重量百分比和相对摩尔组成表示)[0019] [0020] 卵磷脂组成可取决于来自相同天然来源的不同批次卵磷脂或溶血卵磷脂之间的来源(大豆、向日葵等)或天然变化而发生改变。由于本发明的组合物可由这些天然产物配制，本发明公开的配方的变化范围列在表2中，其还对用于在实施例中比较的两种商购产品进行了类似分析。 [0021] 表2-典型配方的磷脂部分的组成以及浓度范围(重量百分比和相对摩尔组成)[0022] [0023]商购产品1 %w/w %mol/mol LPC 3.57±0.40 12.95±2.04 LPI 1.08±0.55 2.84±0.10 LPE 2.48±0.38 9.46±1.33 LPA 1.26±0.54 6.10±1.41 其它磷脂 29.64±1.47 68.66±1.29 总计 38.08±1.32 100±6.17 [0024]商购产品2 %w/w LPC 3.30±0.25 LPI 1.88±0.70 LPE 1.98±0.13 LPA 0.75±0.04 [0026] 该配方的特征为：(a)约16%至32%，且优选约24%的相对低水平的含磷脂质；(b)约1.4:1至1:0.61，且优选约1/1的高溶血磷脂与其它磷脂的比率；和(c)四种主要溶血磷脂LPC、LPI、LPE和LPA之间的特定优选比率，如表3所示。 [0027] 表3-溶血磷脂部分和总卵磷脂部分中组分的优选比率 [0028]溶血磷脂 比率 LPC/LPI/LPE/LPA 4.5±1/2.5±0.5/2±0.5/1±0.25 LPC/LPI 2±0.5 LPC/LPE 2±0.5 LPC/LPA 4±1.5 LPI/LPE 1±0.25 LPI/LPA 3±0.5 LPE/LPA 2±0.5 [0029] 该配方中溶血磷脂与磷脂的优选比率为1±0.2/1。 [0030] 磷脂和溶血磷脂可在sn-1和sn-2位具有若干类型的脂肪酸链。磷脂具有两条脂肪酸链，而溶血磷脂仅具有一条脂肪酸链。链长度甚至是脂肪酸取代基中不饱和键的数量对分子结构具有重要影响，并因此影响磷脂或溶血磷脂的物理化学和/或生物学性质。本领域技术人员可通过高效液相色谱结合三重四极杆线性离子阱质谱法(triple quadrapole linear ion trap mass spectrometry)来测定磷脂和溶血磷脂中脂肪酸取代基的组成。与一般大豆卵磷脂中的各溶血磷脂相比，本发明的溶血磷脂混合物的特征为LPC、LPE和LPI中极高比例的不饱和脂肪酸取代基(表4)。来自大豆卵磷脂的天然溶血磷脂中饱和脂肪酸取代基的绝对水平在水解后保持不变，而多不饱和脂肪酸取代基的重量百分比则增加数倍。对于所有溶血磷脂部分，多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率至少为5。磷脂中脂肪酸取代基的水平和类型不相关，因为水解卵磷脂中剩余磷脂具有与天然卵磷脂基本相同的分子结构并因而具有与天然卵磷脂基本相同的物理化学性质。任何本领域技术人员能够基于摩尔份数(而非重量百分比)提出类似的理论，但会得出类似的结论，因为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的分子量几乎相等，且C18脂肪酸的量远超过C16脂肪酸的份数。 [0031] 表4-溶血磷脂中脂肪酸取代基(SFA，饱和脂肪酸；UFA，不饱和脂肪酸；PUFA，多不饱和脂肪酸)的绝对和相对水平(以卵磷脂和水解卵磷脂的重量百分比计)[0032] [0033] 剂量 [0034] 通常以每公吨饲料25g至l000g的剂量配制(dose)水解卵磷脂(也称为溶血卵磷脂)。在一优选实施方案中，以每公吨饲料50g至250g的剂量配制。 [0035] 与载体的组合 [0036] 可通过将所述产品喷雾到饲料上来配制溶血卵磷脂。可使用液体载体来稀释所述产品，以促进饲料中的均匀分布。 [0038] 实施例1 [0039] 测试配方，以鉴定其改进脂质乳化和吸收的能力，并由此鉴定食物中脂肪的消化率。为此，使用小鸡(broiler)进行代谢试验。 [0040] 试验建立 [0041] 在所进行的消化率试验中共使用84只1天龄的Ross 308小公鸡，所述消化率试验由对各个实验食物的7天适应期(起始于14天龄)以及随后的随意喂养和收集全部排泄物的4天主要平衡期(21-25天龄)组成。从第1天至第14天，在常规光照、加热和通风条件下在厚垫草(deep litter)中饲养小鸡。从第14天至第24天，在单个平衡笼中饲养小鸡，所述平衡笼由金属丝底面(该底面下置有用于收集全部排泄物的塑料盘)、前部的饮水杯和饲喂槽组成。随意饲喂和喂水。在第14天，对小鸡单独称重；淘汰体重相对高或低的小鸡。将小鸡(14天龄)随机分配至84个单独的消化笼中(适应期)。在第21天，进行额外选择，以将每次处理的笼数量从12减少至10。对于每次处理(n=7)，重复10次。在主要时期(21-25天龄)，对小鸡随意水平地饲喂和喂水。平衡试验(主要时期)持续11天，其分为2个时期。使小鸡适应铁笼的初期(7天)和排泄物收集期(4天，其开始并经12小时饥饿而结束)。在适当时期，每天收集两次排泄物，并立即冷冻。在排泄物收集期，严格记录饲料摄入。所检查的混合物的组成和营养值列在表5和6中。 [0042] 表5-食物(g/kg)的组成(%) [0043] [0044] 表6-食物的营养值(g/kg) [0045] [0046] 对动物进行常规的健康和免疫程序。对动物进行23L/ID轻松日程(light schedule)。 [0047] 分析和计算 [0048] 在平衡试验后且分析前，使用stomacher匀浆器(Interscience,Paris,France)将 排 泄 物 样 品 匀化，使 用 Christ 1825 Medizinische apparatebau 326(Martin Christ,Osterode,Germany)冻干并研磨(0.5mm筛)。分析饲料和冻干排泄物的样品的氮(Kjeldahl法：粗蛋白=Nx6.25)、粗脂肪和总能量(GE:绝热量热法)。通过常规平衡法测定营养物的消化率。来自饲料的营养物的量减去粪便中排泄的量，得出被消化组分的量。以百分比表示的被消化成分与摄入成分的比率表明表观消化系数的水平。通过从GE排泄物中减去GE(总能量)摄入，并随后将这些值除以GE摄入来计算AME值。通过以下等式计算AMEn： [0049] AMEn=(饲料总能量)-([粪便+尿]能量)N [0050] 其中[粪便+尿]能量)N=([粪便+尿]能量)+34.36(N摄入-[粪便+尿]N)，并且其中34.36kJ/kg是小鸡中含氮排泄产物的平均总能量。 [0051] 使用方差分析来比较处理效果，并且使用最小显著性差异来区分处理平均值。使用SAS 程序9.1版(Statistical Analysis System Institute,Cary，NC)进行计算。 [0052] 测试产品 [0053] 将所有测试配方(包括用作阴性对照的空白)掺入到以每吨饲料5kg的剂量配制的预混合料中。所述预混合料包含酶、真菌毒素粘结剂和载体材料(预混合料基质)。将所有测试产品以500g的剂量掺入到预混合料中。该配方的组成和编号显示在表7中。 [0054] 表7-处理说明 [0055] [0056] 除了对照组(T-0)(配方中的空余位置(space)用500g载体替代)之外，还有5个处理组。 [0057] 在T-1和T-2中，其它可商购获得的溶血卵磷脂已包含在食物中。处理组3基于所公开的配方，T-4包含合成乳化剂、乙氧基化的蓖麻油酸酯，且T-5是合成乳化剂与溶血卵磷脂的组合。 [0058] 结果 [0059] 结果显示在表8中。 [0060] 表8-对于全部处理组的所检验食物的营养物消化率、排泄物/饲料比率和AMEn以及各自的标准差(SE) [0061] [0062] abc-具有不同字母的栏中的平均值具有显著差异，P≤0.05 [0063] 对于干物质消化率，在包含本发明所公开配方的第III组观察到最佳结果。该组的特征为：与全部其它组相比，其在干物质消化率上具有统计学显著较高的结果(p≤0.05)。在对照组中观察到最低的干物质消化率。 [0064] 在第II组(商购溶血卵磷脂配方2)和第V组(商购溶血卵磷脂和合成乳化剂的组合)之间观察到粗蛋白消化率的统计学显著差异(p≤0.05)。在该实验中，在第I、III、IV组中观察到粗蛋白消化率的正数值趋势。 [0065] 与第IV和V组的对照组相比，粗脂肪消化率的改进具有统计学显著性(p>0.05)。 [0066] 在校正为零氮保留的表观代谢能(AMEn)方面，在第0和IV组中观察到最低的行为表现。在第II和III组中观察到该参数的最佳结果。这一改进具有统计学显著性。 [0067] 试验中排泄物与饲料摄入的比率在对照组中统计学上显著较高，显示出次最佳的消化率。在第I、III和V组中观察到显著的改进。 [0068] 结论 [0069] 总之，可观察到本发明所公开的配方带来了完全不同的消化率曲线。与试验中的其它溶血卵磷脂相比，粗脂肪的消化率在数值上最低，而对于干物质消化率和排泄物与饲料比率有很显著的差异。整体而言，与全部其它处理组相比，这导致本发明所公开的配方具有显著较高的AMEn。 [0070] 这些结果说明本发明所公开配方的消化率的优异改进。而且，作用模式明显不同，因为与其它溶血卵磷脂相比，观察到新的消化率曲线。该作用模式也是不可预期的，因为已知溶血卵磷脂是促进脂肪消化吸收的乳化剂。本发明的配方显然未显示出这一预期效果。 [0071] 实施例2 [0072] 材料和方法 [0073] 实验产品 [0074] 在试验中使用两种不同来源的溶血磷脂。将实施例1中的商购产品1用作标准溶血磷脂混合物的实例。将该产品作为预混合物加入到饲料中，其进一步如LB I所示。该预混合物包含50%(w/w)的商购产品1、30%(w/w)的二氧化硅和20%(w/w)的石灰石。根据本发明制备新型溶血磷脂组合物(被称为LC液体)。将该产品作为替代品(包含溶血磷脂的预混合物，进一步如LB II所示)加入到饲料中。该替代的预混合物包含25%(w/w)的LC液32 体、30%(w/w)的二氧化硅和45%(w/w)的石灰石。通过 P-NMR(Spectral Service,Germany)测定两种溶血磷脂源的化学组成并列在表9中。 [0075] 表9-通过32P-NMR(Spectral Service,Germany)测定的溶血磷脂混合物的化学组成 [0076] [0077] 食物配方 [0078] 通过使用Skiold盘磨机(对于小麦和玉米将盘径设为1mm)研磨玉米和小麦来制备饲料批次。将实验产品LB I和LB II与单独用于每个处理组的10kg小麦预混合。将试验分为三个饲喂时期：开始期(starter,第0-11天)、生长期(grower,第12-20天)和结束期(finisher，第21至28天)。实验食物的组成和计算值列在表10中。试验中使用的食物以糊状形式提供并可随意使用。在食物中不使用抗生素生长促进剂和抗球虫药。在具有0.60公吨生产量和1:10000精确度的水平混合器中制备最终的饲料。通过简单混合制备用于三个实验期的基础食物。 [0079] 饲养条件 [0080] 试验在波兰波兹南大学生命科学学院的动物营养和饲料管理系进行。试验设施位于波兰Gorzyń/Miedzychód处。在波兹南大学设施中所用的笼舍管理、饲喂和饲养条件被认为是欧洲现代商业小鸡操作的代表，且与实施例1所用的类似。试验在120只1天龄的Ross 308小鸡中进行。总处理时长为28天，其具有3阶段的喂养系统(开始期、生长期和结束期)。动物从农场获得，无疾病问题。将小鸡称重并分配到食物处理组，以实现每组内最大可能的均一性和全部试验组之间的最小差异。从第0至14天，将小鸡作为代谢笼外的组饲养。在第14天时，将小鸡随机分配至120个笼的一笼中。每个笼装有一只小鸡。将每个笼分配到表11所列的6个食物处理组之一，使得每个处理组20个笼，包括装有母鸡的10个笼和装有公鸡的10个笼。进行总排泄物收集的消化率研究的平衡期出现在第24至28天。排泄物收集期开始，并经12小时饥饿结束。此外，在此期间，严格记录饲料摄入，并在该时期开始和结束时将小鸡称重。排泄物收集每天进行2次，并将样品立即冷冻以用于随后分析。 [0081] 食物的营养分析 [0082] 根据AOAC法，分析开始期、生长期和结束期食物的干物质、粗蛋白、脂肪和NDF。使用弹式量热器测定总能量，使用苯甲酸作为标准。 [0083] 环境控制 [0085] 消化率和AMEn水平测定 [0086] 分析饲料和冻干排泄物的样品的氮(Kjeldahl法：粗蛋白=Nx6.25)、粗脂肪和总能量(GE:绝热量热法)。通过常规平衡法测定营养物的消化率。来自饲料的营养物的量减去粪便中排泄的量，得出被消化组分的量。以百分比表示的被消化成分与摄入的比率表明表观消化系数的水平。按照实施例1计算AME值。 [0087] 数据的统计学分析 [0088] 按照以下公式，通过使用SAS的GLM程序(SAS Inst.Inc.,Cary，NC,U.S.)进行方差分析来评价实验食物之间的统计学差异： [0089] Yij=μ+αi+εij [0090] 其中Yij是观察到的因变量，αi表示食物的效果，且εij表示随机误差。当该模型的显著性为P<0.05时，使用Duncan平均值比较来测定食物平均值之间的差异。 [0091] 表10-标准基础食物(T0-T3)和再配制的基础食物(T4-T5)的组成和计算的营养值(开始期第0-11天、生长期第12-21天、结束期第22-28天) [0092] [0093] 计算的营养值 [0094] [0095] 1每个符号每kg饲料包含：vit.A:10.000UI;vit.D3:2.800UI;vit.E:36mg;Cu25mg。 [0096] 表11-食物处理组 [0097] [0098] 结果 [0099] 小公鸡的营养物消化率和AMEn水平 [0100] 观察到因加入溶血磷脂而导致的脂肪消化率的改进。与标准食物相比，氮保留受LB I和LB II二者的影响(P<0.05)。全部实验组特征为比用标准食物饲喂的组具有更高的氮保留(P<0.50)。在接受再配制的食物的小鸡中也观察到较好的氮保留。与标准食物相比，使用250g/mt和500g/mt LB I以及500g/mt LB II显著改进了AMEn。对于再配制的食物观察到类似的应答(P<0.05)。 [0101] 表12-小公鸡的干物质(DM)、有机干物质(ODM)、粗脂肪(CF)、粗纤维(CFi)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)的消化率、氮保留(N)和表观代谢能(AMEn)[0102] [0103] *用不同字母表示具有显著差异(P≤0.05)的栏中的平均值。 [0104] 小母鸡的营养物消化率和AMEn水平 [0105] 氮保留和AMEn受添加剂影响(P<0.05)。在标准食物的情况下观察到最低的氮保留(P<0.05)。其它实验组彼此之间无显著差异。类似地，添加有溶血磷脂的食物中的AMEn彼此间无显著差异，但全部均显著高于未添加的标准食物。 [0106] 食物配方和分析 [0107] 实验食物的营养组成列在表14中。粗蛋白的分析值符合先前表10中给出的计算值。 [0108] 健康和状况 [0109] 在整个试验期间粪便的稠度为正常，未观察到粘粪(sticky dropping)或腹泻问题。在食物处理组之间无差异。在此实验期间无死亡率。 [0110] 表13-小母鸡的干物质(DM)、有机干物质(ODM)、粗脂肪(CF)、粗纤维(CFi)、中性洗涤纤维(NDF)的消化率、氮保留(N)和表观代谢能(AMEn) [0111] [0112] *用不同字母表示具有显著差异(P≤0.05)的栏中的平均值。 [0113] 表14-实验食物的营养组成 [0114] [0115] 讨论 [0116] 商购产品1(LB I)和LC液体均为溶血磷脂源，但在若干参数上彼此不同。LC液体中的LPC、LPI和LPA浓度显著更高，而两种产品中的LPE水平相当。然而，商购产品1中的总磷脂水平显著更高，这是因为未水解的磷脂如PC、PI、PE和PA的存在。因为溶血磷脂形式为活性化合物，所以测试产品的包含率基于溶血磷脂含量。 [0117] 显著地，全部溶血磷脂的添加导致用标准结束期饲料饲喂的小公鸡和小母鸡二者中氮保留的显著改进。与在小公鸡中使用125g/mt的LC液体的标准食物相比，2.1%的氮保留的增加(90.0%减去87.9%，表12)相当于在小鸡每千克消耗饲料中多保留0.688g氮(假定粗蛋白含量为215g/kg)。此氮节约代表AMEn计算中23.9kJ或5.7kcal的贡献。相反，对于相同的处理组，观察到的总AMEn增益为188kcal(3176kcal减去2988kcal，表12)。因此氮保留的增加仅为所观察到的总AMEn增益的有限部分。对于干物质含量为900g/kg的饲料，干物质消化率增加2.5%代表约90kcal/kg的AMEn增益。对于脂肪含量为75g/kg的饲料，脂肪消化率增加1.7%代表18kcal/kg的AMEn增益。因此，通过利用溶血卵磷脂导致的AMEn的重要增加仅部分是因为氮效率的节约，且对于剩余部分是由于若干营养物部分中 |
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