在酸性条件下稳定的蛋白质水解产物组合物 |
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| 申请号 | CN200980123346.8 | 申请日 | 2009-06-19 | 公开(公告)号 | CN102387710A | 公开(公告)日 | 2012-03-21 |
| 申请人 | 索莱有限责任公司; 诺沃兹美斯公司; | 发明人 | T·M·王; P·S·克尔; P·S·高希; J·F·隆巴迪; G·B·林格莱夫; T·霍夫; L·LH克里斯滕森; P·R·厄斯特加德; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供 蛋白质 水 解 产物组合物、用于生产蛋白质水解产物组合物的方法、以及包括蛋白质水解产物组合物的食物产品。所述蛋白质水解产物组合物一般包含低聚肽的混合物，所述低聚肽具有小于约10,000道尔顿的平均分子量，其中至少约60％的低聚肽在pH小于约7.0的条件下是可溶的。 | ||||||
| 权利要求 | 1.包含低聚肽混合物的蛋白质水解产物组合物，所述低聚肽具有小于约10,000道尔顿的平均分子量，其中所述组合物具有至少约2.5％的水解度和在小于约7.0的pH下至少约60％的固体可溶性指数。 |
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| 说明书全文 | 在酸性条件下稳定的蛋白质水解产物组合物发明领域 [0001] 本发明涉及在酸性pH水平稳定的蛋白质水解产物组合物，在酸性pH水平稳定的蛋白质水解产物组合物的制备方法，以及包含在酸性pH水平稳定的蛋白质水解产物组合 物的食物产品。 背景技术[0002] 在美国和世界范围内，肥胖症及肥胖症相关疾病的发病率处于上升状态。虽然肥胖症并非由单独某个潜在因素诱发，一种致病因素可能是许多人的快节奏的、匆忙的生活 方式以及同时增加的快速食品消费。大多数快速食品趋于为高脂肪和/或高糖的。因此， 需要一种能够在忙碌时食用或饮用的有营养的方便的食物产品。该食物产品应该不但美味 而且营养合理；即，该食物应为低脂肪、高蛋白、高维生素和高抗氧化剂。 [0003] 虽然大豆是一种优异的蛋白来源，但是其趋于具有“青草味”或“豆腥味”，一些人讨厌这种味道或者认为其不可口。因此需要一种减少了“大豆”风味和苦味或收敛性的大豆分离蛋白产品。此外，如果所期望的食物产品是液体饮料，则理想条件下将被加到液体饮料中的分离蛋白产品应比原料更加清澈透明，即，分离蛋白产品应具有高溶解度。此外，大豆分离蛋白产品在所需液体饮料的pH条件下应该是稳定的。 [0004] 发明概述 [0005] 本发明的一个方面提供蛋白质水解产物组合物。所述蛋白质水解产物组合物包含具有小于约10,000道尔顿的的平均分子量的低聚肽混合物。此外所述蛋白质水解产物组 合物具有至少约2.5％，一般至少约5.0％，优选至少约7.5％，最优选至少约10％的水解 度，以及在pH值小于约7.0时至少约60％的固体可溶性指数。 [0006] 本发明的另一方面涵盖用于制备蛋白质水解产物组合物的方法，该方法包括使蛋白材料与至少一种肽链内切酶接触，该肽链内切酶裂解蛋白材料的肽键以形成具有小于约 10,000道尔顿的平均分子量的低聚肽混合物，其中所述低聚肽混合物包含蛋白质水解产物 组合物。该方法还包括将蛋白质水解产物组合物的pH值降低到小于约pH 7.0，其中所述 蛋白质水解产物组合物具有至少约60％的固体可溶性指数以及至少约2.5％，一般至少约 5.0％，优选至少约7.5％，最优选至少约10％的水解度。 [0007] 本发明的另一方面提供包含蛋白质水解产物的食物或饮料产品。所述蛋白质水解产物组合物包含具有小于约10,000道尔顿的平均分子量的低聚肽混合物，并且所述组合 物具有至少约2.5％，一般至少约5.0％，优选至少约7.5％，最优选至少约10％的水解度，以及在小于约7.0的pH下至少约60％的固体可溶性指数。 [0008] 本发明的其他方面将在下文中部分显现和部分指出。 [0011] 图2显示不同水解产物的可溶性固体对应于pH的函数。该图显示5％ALC水解产物(菱形表示)、10％ALC水解产物(方块表示)和5％ALC水解产物(三角形表示)的可 溶性固体百分比对应于pH的函数。 [0012] 图3示出了SP1或 (ALC)水解产物的不同感官特性的诊断评分。图A示出指示的水解产物与对照物(即，SP1样本)的差异，所述水解产物以在中性pH条件 下的2.5％固体浆液形式提供给评估员。图B示出指示的水解产物与对照物(即，HXP212) 的差异，所述水解产物以2.5％浆液形式提供给评估员。图C示出指示的水解产物与对照 物(即，HXP212)的差异，所述水解产物以pH 3.0、1.6％蛋白的橙运动饮料形式提供给评 估员。图D示出指示的水解产物与对照物(即，HXP212)的差异，所述水解产物以pH 3.8、 1.6％蛋白的橙运动饮料形式提供给评估员。 [0013] 图4示出SP1(浅灰色柱)和 (ALC)(暗灰色柱)水解产物中的肽片段的分子量分布。 [0014] 发明详述 [0015] 已经发现，用某些肽链内切酶裂解蛋白材料可产生包含低聚肽混合物的蛋白质水解产物组合物，其中所述低聚肽在酸性pH水平是可溶的。这些蛋白质水解产物组合物相对 于蛋白质原料还具有改善的风味特性和感官特性。具有这些特性的蛋白质水解产物组合物 在酸性pH水平是稳定的，并可用作即饮型饮料和其他食物产品的补充剂。 [0016] I.制备蛋白质水解产物组合物的方法 [0017] 本发明的一个方面提供了制备包含具有小于约10,000道尔顿的平均分子量的低聚肽混合物的蛋白质水解产物组合物的方法，其中所述组合物具有至少2.5％，一般至少约 5.0％，优选至少约7.5％，最优选至少约10％的水解度，以及在小于约7.0pH下至少60％的固体可溶性指数。所述方法包括使蛋白材料与至少一种肽链内切酶接触，其中所述蛋白材 料经水解以形成低聚肽混合物。所述方法还包括将水解产物的pH降低到小于约pH7.0。 [0018] a.水解裂解 [0019] 所述方法的第一步包括将蛋白材料裂解成较小分子量的低聚肽片段的混合物。一般来讲，蛋白材料与至少一种肽链内切酶接触以形成低聚肽的混合物。蛋白材料和适用肽 链内切酶的合适实例在下文中详述。 [0020] i.蛋白材料 [0021] 在一些实施方案中，蛋白材料可为大豆蛋白材料。可在本发明方法中使用多种大豆蛋白以生成大豆蛋白水解产物。一般来讲，大豆蛋白材料可根据本领域已知的方法源自 于全大豆。全大豆可为标准大豆(即，非转基因大豆)、转基因大豆(如具有经修饰的脂肪 的大豆、具有经修饰的碳水化合物的大豆、具有经修饰的蛋白亚基的大豆，等等)、以及它们的组合。大豆蛋白材料的合适实例包括大豆提取物、豆奶、豆奶粉、豆腐、大豆粉、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、以及它们的混合物。 [0022] 在一个替代实施方案中，该方法中使用的大豆蛋白材料可为大豆分离蛋白(也称为分离大豆蛋白或ISP)。一般来讲，大豆分离蛋白基于无水基具有至少约90％大豆蛋白 的蛋白含量。大豆分离蛋白可包括完整的大豆蛋白或部分水解的大豆蛋白。大豆分离蛋 白可具有高含量的贮藏蛋白亚基如7S、11S、2S等。可用作本发明原料的大豆分离蛋白的 非限制性实例可商购获得，例如从Solae，LLC(St.Louis，MO)商购获得，并且它们中包括 500E、 620、 670、 EX 33、 PLUS 2600F IP、 PLUS 2640DS、 PLUS 2800、 PLUS 3000、以及它们的组合。 [0023] 在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为大豆浓缩蛋白，其具有按无水基计约65％至小于约90％的蛋白质含量。可用于本发明中的适宜大豆浓缩蛋白的实例包括 产品系列、 12和 5800，所有这些产品可从Solae，LLC商 购获得。作为另外一种选择，大豆浓缩蛋白可与大豆分离蛋白共混以作为大豆蛋白材料的 来源取代部分大豆分离蛋白。通常，如果用大豆浓缩蛋白替代一部分大豆分离蛋白，则大豆浓缩蛋白最多可替代按重量计最多约40％的大豆分离蛋白，并且更优选可替代按重量计最 多约30％的大豆分离蛋白。 [0024] 在另一个实施方案中，所述大豆蛋白质材料可为大豆粉，它具有按无水基计约49％至约65％的蛋白质含量。大豆粉可为脱脂大豆粉、部分脱脂大豆粉、或全脂大豆粉。大豆粉可以与大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白共混。 [0025] 在另一个实施方案中，大豆蛋白材料可为基于离心机中的沉淀已被分成四种主要贮藏蛋白片段或亚基(15S、11S、7S和2S)的材料。一般来讲，11S片段高度富集了大豆球蛋白，而7S片段高度富集了β-大豆伴球蛋白。 [0026] 在其他实施方案中，蛋白材料可来源于非大豆的植物。作为非限制性实例，合适的植物包括苋属植物、竹芋、大麦、荞麦、低芥酸菜籽、木薯、桃豆(鹰嘴豆)、豆类、兵豆、羽扇豆、玉米、小米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、裸麦、高粱、向日葵、木薯、黑小麦、小麦、以及它们的混合物。尤其优选植物蛋白包括大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、以及它们的组合。在一个实施方案中，植物蛋白材料可为低芥酸菜籽粗粉、低芥酸菜籽分离蛋白、低芥酸菜籽浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为玉米或谷物蛋白粉、玉米或谷物浓缩蛋白、玉米或谷物分离蛋白、玉米或谷物胚芽、玉米或谷物谷蛋白、玉米或谷物谷蛋白粗粉、玉米或谷物面粉、玉米蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为大麦粉、大麦浓缩蛋白、大麦分离蛋白、大麦粗粉、大麦面粉、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为羽扇豆粉、羽扇豆分离蛋白、羽扇豆浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为燕麦片、燕麦粉、燕麦蛋白粉、燕麦分离蛋白、燕麦浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为豌豆粉、豌豆分离蛋白、豌豆浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为马铃薯蛋白粉、马铃薯分离蛋白、马铃薯浓缩蛋白、马铃薯粉、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为米粉、大米粗粉、大米蛋白粉、大米分离蛋白、大米浓缩蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，植物蛋白材料可为小麦蛋白粉、小麦谷朊粉、麦芽精、面粉、小麦分离蛋白、小麦浓缩蛋白、可溶性小麦蛋白、以及它们的组合。 [0027] 在另一个实施方案中，蛋白材料可来源于动物。在一个实施方案中，动物蛋白材料可来源于蛋类。合适的蛋类蛋白的非限制性实例包括蛋粉、干燥蛋固体、干燥蛋清蛋白、液体蛋清蛋白、蛋清蛋白粉、分离卵清蛋白、以及它们的组合。蛋类蛋白可来源于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鹌鹑蛋、或其他鸟类的蛋。在另一个实施方案中，蛋白材料可来源于乳品。合适的乳蛋白包括脱脂奶粉、分离乳蛋白、浓缩乳蛋白、酸酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙等)、乳清分离蛋白、乳清浓缩蛋白、以及它们的组合。乳蛋白材料可以来源于母牛、山羊、绵羊、驴子、骆驼、羊驼、牦牛、水牛等。在另一个实施方案中，蛋白可来源于陆栖动物或水栖动物的肌肉、器官、结缔组织、或骨骼。例如动物蛋白可为明胶，它通过部分水解胶原制备，胶原提取自牛或其他动物的骨、结缔组织、器官等等。 [0028] 在本发明的方法中也设想到使用大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合。即，可由大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组合来制备蛋白质水解产物组合物。在 一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可由大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的组 合制备，其他蛋白材料选自植物蛋白材料、动物蛋白质材料、乳品蛋白材料、卵蛋白材料、以及它们的组合。植物蛋白材料可包括大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、任何本领域已知的其他植物蛋白、以及它们的组合。 [0029] 组合使用的大豆蛋白材料和至少一种其他蛋白材料的浓度可能并且将会不同。组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约1％至约99％总蛋白的范围内。在一个实施方案 中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实 施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另 一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约40％至约80％总蛋白的范围 内。在另一个实施方案中，组合中使用的大豆蛋白材料的量可以在约80％至约99％总蛋白 的范围内。同样地，组合中使用的至少一种其他蛋白材料的量可以在约1％至约99％总蛋 白的范围内。在一个实施方案中，组合中使用的至少一种其他蛋白材料的量可以在约1％至约20％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的至少一种其他蛋白材料的量 可以在约20％至约40％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使用的至少一种其 他蛋白材料的量可以在约40％至约80％总蛋白的范围内。在另一个实施方案中，组合中使 用的至少一种其他蛋白材料的量可以在约80％至约99％总蛋白的范围内。 [0030] 在本发明的方法中，通常将蛋白材料混合或分散在水中以形成按重量计包括约1％至约20％蛋白(基于“按原样”)的浆液。在一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约1％至约5％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约6％ 至约10％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约11％至约 15％的蛋白(按原样)。在另一个实施方案中，所述浆液可包括按重量计约16％至约20％ 的蛋白(按原样)。 [0031] 在将蛋白材料分散到水中后，可将蛋白材料的浆液加热到约70℃至约90℃约2分钟至约20分钟以失活推定的内源蛋白酶抑制剂。通常，对蛋白浆液的pH和温度进行调节以 优化水解反应，特别是确保水解反应中使用的肽链内切酶的功能接近其最佳活性水平。蛋 白浆液的pH可根据本领域一般已知的方法进行调节及监控。可将蛋白浆液的pH值调节至 并保持在约pH 7.0至约pH 11.0。在一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持 在约pH 7.0至约pH 8.0。在另一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 8.0至约pH 9.0。在另一个实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 9.0至 约pH 10.0。在一个优选的实施方案中，可将蛋白浆液的pH调节至并保持在约pH 8.0至约 pH 8.5。 [0032] 根据本领域已知的方法，在水解反应期间可将蛋白浆液的温度优选地调节至并保持在约30℃，优选至少约50℃至约80℃。一般来讲，高于这一范围的温度可灭活肽链内切 酶。低于这一范围的温度趋于降低肽链内切酶的活性。在一个实施方案中，在水解反应期 间可将蛋白浆液的温度调节至并保持在约50℃至约60℃。在另一个实施方案中，在水解反 应期间可将蛋白浆液的温度调节至并保持在约60℃至约70℃。在另一个实施方案中，在水 解反应期间可将蛋白浆液的温度调节至并保持在约70℃至约80℃。 [0033] ii.肽链内切酶 [0034] 水解反应一般由将肽链内切酶加入到蛋白材料浆液中以形成反应混合物而引发。肽链内切酶催化蛋白材料蛋白内的肽键裂解以形成较小分子量的低聚肽的混合物。肽链内 切酶是一般裂解多肽链内部肽键的酶。 [0035] 几种肽链内切酶在本发明的方法中适用。一般来讲，肽链内切酶将具有广谱活性(即，将水解基本上任意两个氨基酸残基的肽键)。肽链内切酶通常可为食品级酶，在约7.0至约11.0的pH和约30℃，优选至少约50℃至约80℃具有最佳活性。肽链内切酶优选地将 为微生物来源的酶。使用微生物酶而不是动物或植物酶是有利的，因为微生物酶表现出广 谱特性(最适pH，温度等)并且可以相当大的量持续获取。一般来讲，肽链内切酶将为丝 氨酸肽酶家族的一员(参见MEROPS Peptidase Database，release 8.00A；http//merops. sanger.ac.uk)。 [0036] 在一个实施方案中，肽链内切酶可为枯草杆菌蛋白酶或其变体，它来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus lichniformis)(MEROPS登录号MER000309)，可以商品名 购自Novozymes(Bagsvaerd，Denmark)。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为枯草杆菌 蛋白酶或其变体，它来源于另一种微生物。在一个优选的实施方案中，肽链内切酶可为 丝氨酸蛋白酶(SP1)，它来源于葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsisprasina)(国际专利申请 WO02005035747，该专利申请全文以引用方式并入本文)。SP1的氨基酸序列为ADIIGGLAYT MGGRCSVGFAATNAAGQPGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG VFEQSVFPGNDAAFVRGTSN FTLTNLVSRY NTGGYATVAG HNQAPIGSSVCRSGSTTGWH CGTIQARGQS VSYPEGTVTN MTRTTVCAEPGDSGGSYISG TQAQGVTSGG SGNCRTGGTT FYQEVTPMVNSWGVRLRT(SEQ ID NO：1)。 [0037] 在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列与SEQID NO：1或其片段具有至少80％，81％，82％，83％，84％，或85％的同一性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或其片段具有 至少86％，87％，88％，89％，90％，91％，或92％的同一性。在另一个实施方案中，肽链内切酶可为丝氨酸蛋白酶，该酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或其片段具有至少93％，94％， 95％，96％，97％，98％或99％的同一性。 [0038] 对于本发明而言，可使用Needle程序测定两个氨基酸序列的比对结果，该程序来自EMBOSS软件包(Rice，P.，Longden，I.和Bleasby，A.(2000)EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite.Trends in Genetics 16，(6) 第 276-277 页；http://emboss.org)2.8.0版。Needle程序执行全序列比对算法，该算法描述于 Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453。使用的取代矩阵为 BLOSUM62，空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5。一般来讲，通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来测定序列同一性百分比，其中比较窗口中的氨基酸序列部分与参比序列 (不包括添加或删除)相比可包括添加或删除(即间隙)以达到最佳的两序列比对效果。百 分比通过以下方法进行计算：测定两序列中具有相同氨基酸以产生匹配位置的位置数目， 将该匹配位置的数目除以比较窗口两序列中最短序列的位置总数，并且所得结果乘以100 来获得序列同一性的百分比。 [0039] 技术人员将理解一个氨基酸残基可被另一个具有相似侧链、不影响多肽功能的氨基酸残基取代。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨 基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半 胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯基丙氨 酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。因此肽链内切酶可 具有至少一个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，肽链内切酶可具 有约45个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有 约35个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约 25个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约15 个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约10个 针对SEQ IDNO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约5个针对 SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，肽链内切酶可具有约一个针对SEQ ID NO：1的保守氨基酸取代。 [0040] 还可预想在本发明的方法中利用肽链内切酶的组合。例如蛋白材料可以与和SP1的混合物接触。作为另外一种选择，蛋白材料可以与SP1和肽链内 切酶的混合物接触，所述肽链内切酶与SEQ ID No：1具有至少80％的同一性。同样地，广 谱丝氨酸蛋白酶的其他组合可在不脱离本发明范围的情况下使用。 [0041] 示例性的蛋白材料和肽链内切酶的组合在表A中给出。 [0042] 表A：优选的组合。 [0043] [0044] [0045] 取决于蛋白材料、所需的水解度和水解反应的持续时间，加入到蛋白浆液中的肽链内切酶的量能够并且将会不同。一般来讲，肽链内切酶的量将在每千克蛋白原料约1mg 酶蛋白至约5000mg酶蛋白的范围内。在另一个实施方案中，肽链内切酶的量可在每千克蛋 白原料50mg酶蛋白至约1000mg酶蛋白的范围内。在另一个实施方案中，肽链内切酶的量 可在每千克蛋白原料1000mg酶蛋白至约5000mg酶蛋白的范围内。 [0046] 技术人员将会认识到，取决于例如肽链内切酶的浓度和期望的水解度，水解反应的持续时间能够并且将会不同。一般来讲，水解反应的持续时间可以在几分钟至多个小时 的范围内，例如约5分钟至约48小时。在一个优选的实施方案中，反应的持续时间可为约 30分钟至约120分钟。 [0047] 为了终止水解反应，可将反应混合物加热至足以灭活肽链内切酶的温度。例如把反应混合物加热至大约90℃将基本上热灭活大多数蛋白酶。作为另外一种选择，水解反应 可通过将反应混合物的pH降低到约4.0并将反应混合物温度加热到大于约80℃进行测 定。可用于降低反应混合物pH的酸的实例包括柠檬酸、甲酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、磷酸、以及它们的组合。 [0048] b.降低水解产物的pH [0049] 所述方法的第二步包括将蛋白质水解产物的pH值降低到小于约pH7.0。在一个实施方案中，可将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 6.0至约pH 7.0的水平。在另一个实施 方案中，可将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 5.0至约pH 6.0的水平。在另一个实施方 案中，可将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 4.0至约pH 5.0的水平。在另一个实施方案 中，可将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 3.0至约pH 4.0的水平。在另一个实施方案中， 可将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 2.0至约pH 3.0的水平。在另一个实施方案中，可 将蛋白质水解产物的pH调节到约pH 1.0至约pH2.0的水平。在优选的实施方案中，可将 蛋白质水解产物的pH值调节到小于约pH 5.0的水平。 [0050] 一般来讲，酸性溶液将用于调节蛋白质水解产物的pH水平。可用于调节水解产物pH的酸的非限制性实例包括柠檬酸、甲酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、磷酸、以及它们的组合。 [0051] II.蛋白质水解产物组合物 [0052] 本发明的另一方面涵盖包含平均分子量小于约10,000道尔顿的低聚肽混合物的蛋白质水解产物的组合物。此外所述组合物具有至少约2.5％，一般至少约5.0％，优选至 少约7.5％，最优选至少约10％的水解度，以及在pH小于约7.0时至少约60％的固体可溶 性指数。 [0053] 水解度(％DH)是指裂解的肽键对肽键起始总数的百分比。例如，如果将包含总计五百个肽键的完整蛋白水解至五十个肽键被裂解，则所得水解产物的水解度为10％。水解 度可使用如实施例中详述的邻苯二醛(OPA)方法或三硝基苯磺酸(TNBS)色度方法进行测 定。水解度越高，蛋白水解程度越大。通常，因为蛋白被进一步水解(即水解度升高)，肽 段的分子量降低，相应的肽表达谱发生改变，混合物的粘度降低。水解度可在完整水解产物(即全部片段)中进行测量或在水解产物的可溶解片段中(即水解产物在约500-1000×g 离心约5至10分钟后的上清液片段)进行测量。 [0054] 决于蛋白材料的来源、使用的肽链内切酶和水解反应的条件，蛋白质水解产物组合物的水解度能够并且将会不同。一般来讲，蛋白质水解产物组合物的水解度将大于约 10％。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物的水解度可在约10％至约15％之间。在 另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物的水解度可在约15％至约20％之间。在另一个 实施方案中，蛋白质水解产物组合物的水解度可在约20％至约25％之间。在另一个实施方 案中，蛋白质水解产物组合物的水解度可在约25％至约35％之间。 [0055] 固体可溶性指数(SSI)或可溶性固体百分比是包含蛋白质水解产物组合物的固体(即多肽及其片段)溶解度的量度。可溶性固体的量可通过在离心(例如在约 500-1000×g离心约5至10分钟)前后测量溶液中固体的量进行估计。作为另外一种选 择，可溶性固体的量可通过使用本领域熟知的技术(如二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定比色检 测分析法)估计离心前后组合物中蛋白质的量进行测定。 [0056] 一般来讲，本发明的蛋白质水解产物组合物将具有在pH值小于约pH7.0时至少60％的固体可溶性指数。在一个实施方案中，水解产物的固体可溶性指数在pH值小于约pH 7.0时可在约60％至约70％之间。在另一个实施方案中，水解产物的固体可溶性指数在pH 值小于约pH 7.0时可在约70％至约80％之间。在另一个实施方案中，水解产物的固体可 溶性指数在pH值小于约pH 7.0时可在约80％至约90％之间。在另一个实施方案中，水解 产物的固体可溶性指数在pH值小于约pH 7.0时可在约90％至约99％之间。 [0057] 一般来讲，蛋白质水解产物组合物与蛋白质原料相比将包含不同长度和分子量的低聚肽的混合物。低聚肽的分子量可在约75道尔顿(即游离甘氨酸)至约100,000道尔顿 之间。一般来讲，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽的平均分子量将小于约10,000道尔 顿。在一个实施方案中，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽的平均分子量可小于约8000 道尔顿。在另一个实施方案中，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽的平均分子量可小于 约6000道尔顿。在另一个实施方案中，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽的平均分子量 可小于约4000道尔顿。在另一个实施方案中，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽的平均 分子量可小于约2000道尔顿。在另一个实施方案中，形成蛋白质水解产物组合物的低聚肽 的平均分子量可小于约1000道尔顿。 [0058] 本发明的蛋白质水解产物组合物基本上是稳定的。如本文所用，“稳定性”指经一段时间后无沉淀物形成。蛋白质水解产物组合物可在室温(即，约23℃)下贮存或在冷藏温度(即，约4℃)下贮存。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定约一周至约 四周。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定约一个月至约六个月。在另一 个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可稳定超过约六个月。 [0059] 此外本发明的蛋白质水解产物组合物可为干燥的。例如，可以喷雾干燥蛋白质水解产物组合物。喷雾干燥机入口的温度可以在约260℃(500°F)至约316℃(600°F)的 范围内，出口温度可以在约82℃(180°F)至约38℃(100°F)的范围内。作为另外一种 选择，蛋白质水解产物组合物可以被真空干燥、冷冻干燥、或使用本领域已知的其他程序进行干燥。 [0060] 在其中蛋白材料为大豆的实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含至少一种低聚肽，所述低聚肽具有对应于或来源于SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、和45的氨基酸序列。在一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：2-45的至少十个低聚肽或它们的片段。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQID NO：2-45的至少20个低聚肽或它们的片段。在另一个实施方案 中，蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQ ID NO：2-45的至少30个低聚肽或它们的片段。 在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含选自SEQID NO：2-45的至少40个低聚 肽或它们的片段。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含对应于SEQ ID NO： 2-45的低聚肽或它们的片段。 [0061] 本发明也涵盖任何在大豆蛋白水解产物中鉴定的低聚肽。例如可通过色谱方法纯化低聚肽，如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水性交互作用色谱法、反相色谱法等。作为另外一种选择，可使用本领域技术人员已知的合成方法合成低聚肽。 [0062] 本发明的蛋白质水解产物组合物，具体地讲大豆蛋白水解产物组合物，与蛋白原料或其他水解产物组合物相比可具有提高的感官和味觉特性。除形成的多肽片段的数目以 及它们各自的大小之外，水解度通常还影响所得大豆蛋白质水解产物组合物的其他物理特 性和感官特性。一般来讲，本发明的大豆蛋白水解产物组合物比可商购获得的大豆蛋白水 解产物具有基本上较少的苦味感官特性和改善的总体嗜好评分。 [0063] III.包含蛋白质水解产物组合物的食物产品 [0064] 本发明的另一方面是提供包含本文所述的任何蛋白质水解产物组合物的食物产品。作为另外一种选择，所述食物产品可包含本文所述的任何分离多肽或其片段。 [0065] 特定蛋白水解产物组合物的选择将取决于期望的食物或饮料产品而不同。在一些实施方案中，蛋白质水解产物组合物可来源于大豆蛋白。在其他实施方案中，蛋白质水解产物组合物可来源于植物蛋白材料、动物蛋白质材料、乳品蛋白材料、卵蛋白材料、以及它们的组合。植物蛋白材料可包括大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、任何本领域已知的其他植物蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可来源于大豆和至少一种其他蛋白来源的组合，所述其他蛋白来源选自植物蛋 白材料、动物蛋白质材料、乳品蛋白材料、卵蛋白材料、以及它们的组合。植物蛋白材料可包括大麦、低芥酸菜籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、任何本领域已知的其他植物蛋白、以及它们的组合。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含不同蛋白质水解产物的组合。在另一个实施方案中，蛋白质水解产物组合物可包含分离的或合成的 多肽，该多肽选自由SEQ IDNO：2-45组成的氨基酸序列。用于制备食物产品的蛋白质水解 产物组合物的水解度也取决于例如蛋白材料的来源和期望的食物产品而不同。 [0066] 食物和饮料产品还可包括可食用材料。合适的可食用材料的选择将取决于期望的食物或饮料产品而不同。可食用材料可为植物来源的材料、动物来源的材料、或生物材料 (即蛋白、碳水化合物、脂质等)，它们分离自植物来源的材料、动物来源的材料等。 [0067] 饮料可为即饮型(RTD)饮料。饮料可为基本上清澈的饮料如果汁饮料、果味饮料、碳酸饮料、运动饮料、营养补充饮料、体重控制饮料、或醇基果汁饮料。此类基本上清澈的饮料通常具有小于约pH 5.0的pH值。在一个优选的实施方案中，基本上清澈的饮料可具有小于约pH 4.0的pH值。 [0068] 作为另外一种选择，饮料可为基本上浑浊的饮料如代餐饮料、蛋白质混合饮料、咖啡基饮料、营养补充饮料、或体重控制饮料。一般来讲，基本上浑浊的饮料将具有小于约pH7.0的pH值。 [0069] 在其中产品是饮料的实施方案中，可食用材料可包括果汁、糖、乳、脱脂奶粉、酪蛋白酸盐、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白、分离乳蛋白、巧克力、可可粉、咖啡、茶、以及它们的组合。饮料还可包含甜味剂(如葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖糊精、三氯蔗糖、玉米糖浆、蜂蜜、槭树糖浆等)、调味剂(如水果风味剂、巧克力风味剂、香草风味剂等)、乳化剂或增稠剂(如卵磷脂、角叉菜胶、纤维素胶、纤维素凝胶、淀粉、阿拉伯树胶、黄原胶等)；稳定剂、脂质材料(例如低芥酸菜籽油、向日葵油、高油酸向日葵油、脂肪粉末等)、防腐剂(例如山梨酸钾、山梨酸等)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、抗坏血酸钠等)、着色剂、维生素、矿物质、以及它们的组合。 [0070] 在另一个实施方案中，食物产品可为压成块的加工食品，如格兰诺拉干棒、干棒小吃、谷类食物干棒、早餐干棒、营养干棒、能量干棒、或体重控制干棒。 [0071] 定义 [0072] 为了更好的理解本发明，下文定义了几个术语。 [0073] 术语“水解度”指裂解的肽键占总数的百分比。 [0074] 术语“肽链内切酶”是指在低聚肽或多肽链中水解内部肽键的酶。肽链内切酶类包括酶亚类EC 3.4.21至25(国际生物化学与分子生物学联盟酶分类体系)。 [0075] “食品级酶”是公认安全(generally recognized as safe，GRAS)认可的并且当被生物体如人消耗时是安全的酶。通常，酶和可从其中得到酶的产品可根据适用的法律法规进行制备。 [0076] “水解产物”是当化合物通过水效应裂解时获得的反应产物。在热降解、化学降解或酶降解后产生蛋白质水解产物。反应期间大分子裂解成较小的蛋白、可溶性蛋白、低聚肽、肽段、和游离氨基酸。 [0077] 术语“多肽”涵盖低聚肽。 [0078] 如那些用于描述术语象“苦味”、“谷物”、或“收敛性”的术语“感官特性”，根据如实施例2中详述的SQS评分体系进行测定。 [0079] 术语“固体可溶性指数”指可溶性蛋白或可溶性固体的百分比。 [0080] 如本文所用，术语“分离大豆蛋白”或“大豆分离蛋白”是指具有基于不含水分至少约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆分离蛋白由大豆形成，其形成方式为：将大豆的皮和胚芽从子叶上去除，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，将子叶 的大豆蛋白和碳水化合物与子叶纤维分离，然后将大豆蛋白与碳水化合物分离。 [0081] 如本文所用，术语“大豆浓缩蛋白”是指具有基于不含水分约65％至小于约90％的大豆蛋白的蛋白含量的大豆材料。大豆浓缩蛋白也包含大豆子叶纤维，通常基于不含水 分按重量计约3.5％至最多约20％的大豆子叶纤维。大豆浓缩蛋白由大豆形成，其形成方 式为：去除大豆的皮和胚芽，将子叶压成片或碾碎并将片状或碾碎的子叶去油，然后将大豆蛋白和大豆子叶纤维与子叶的可溶碳水化合物分离。 [0082] 如本文所用，术语“大豆粉”是指脱脂的、部分脱脂的、或全脂的大豆材料的粉碎形式，其尺寸使得颗粒可通过100目(美国标准)筛网。利用常规的大豆研磨方法将大豆饼、碎片、薄片、粗粉、或这些材料的混合物粉碎成大豆粉。大豆粉具有基于不含水分约49％至约65％的大豆蛋白含量。优选将所述粉末研磨地非常细，最优选使得有小于约1％的粉末 保留在300目(美国标准)筛网上。 [0083] 如本文所用，术语“大豆子叶纤维”是指包含至少约70％的饮食纤维的大豆子叶多糖部分。大豆子叶纤维通常包含一些微量大豆蛋白，但是也可为100％纤维。如本文所用，大豆子叶纤维不涉及或包括大豆皮纤维。一般来讲，大豆子叶纤维由大豆形成，其形成方式为：去除大豆的外壳和胚芽，将子叶压成片或碾碎，并且从压成片或碾碎的子叶中移除油，然后将大豆子叶纤维与子叶中的大豆材料及碳水化合物分离。 [0084] 在不脱离本发明范围的条件下，可对以上化合物、产品和方法进行各种更改，这意味着可将上文描述和下文实施例中包含的所有内容理解为例证性的而非限定性的。实施例 [0085] 下列实施例示出了本发明的多种实施方案。 [0086] 实施例1：用SP1或 碱性酶水解大豆蛋白 [0087] 进行以下研究以测定是否用不同的肽链内切酶水解大豆蛋白可提高水解产物在酸性pH条件下(即，接近其等电点)的溶解度 [0088] 水解反应。原料为悬浮在pH 8.5的0.1M磷酸钠中的10％大豆分离蛋白(例如500E)。用HCl将蛋白浆液的pH调节到8.0。将蛋白浆液加热到约70℃并用来 自葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsis prasina)的丝氨酸蛋白酶(SP1)或来自地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶 水解混合物。各种肽链 内切酶的使用浓度为19.5mg、39.0mg、78.1mg、156.3mg、或312.5mg蛋白酶每千克大豆分离蛋白。水解反应在70℃进行120分钟。加入pH 3.7的1M甲酸钠终止反应，使得混合物的 pH为约4.0并且水解产物中的大豆蛋白终浓度为5％。 [0089] 溶解度分析。每种所得水解产物的可溶性固体百分比或固体可溶性指数(SSI)TM 通过用基于二喹啉甲酸(BCA)的蛋白检测分析法(例如MicroBCA Protein Assay Kit； Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)测量可溶性蛋白进行测定。为了进行这一测定，将每种水解产物在500×g离心10分钟以沉淀任何不溶解的片段。可将每个上清液部分稀释成不同浓 度(即，用蒸馏H2O稀释10-、20-、40-、和80-倍)。在这种情况下使用10倍稀释液。将每 个稀释液的20μL等分试样转移到微滴定板上并加入160μL BCA工作试剂。在37℃下孵 育30分钟后，测量562nm的吸光度。还运行BSA标准稀释(0-1mg/mL)曲线。阳性对照是 可商购获得的大豆蛋白水解产物(即，HXP114)。假定阳性对照是100％可溶的，计算溶解 度并将其表达为百分比(即，％SSI)。 [0090] 表1给出了每个水解产物中的可溶性固体百分比。在各个肽链内切酶浓度，SP1水解产物相对于 水解产物具有提高的溶解度。 [0091] 表1：水解产物的溶解度。 [0092] [0093] 水解度。使用邻苯二醛(OPA)检测分析法测定每种水解产物的水解度(％DH)。为了进行这一测定，将每个水解产物(以及未水解的原料)用水稀释50倍。每个水解产物的 20μL等分试样与180μL OPA试剂(4mM四硼酸二钠，0.1％SDS，0.24mM OPA，0.24mM DTT 在微滴定板的孔中混合。测量340nm的吸光度。还包括L-丝氨酸(0-0.5mg/mL)的标准曲 线。通过从每个水解产物的％DH值减去未水解原料的％DH值来计算水解度。 [0094] 表2给出了结果。每个水解产物的水解度在每个蛋白酶浓度上是类似的。此外如图1所示，可溶性固体百分比随着不同水解产物的水解度提高而提高，说明这些实验室研 究预示了可溶性肽的产量。 [0095] 表2：水解度。 [0096] [0097] 实施例2：SP1和 水解产物的SQS和苦味分析 [0098] 比较 SP1水 解产 物 和 水 解 产物 的 风 味特 性。 使 用SolaeQualitative Screening(SQS)测试针对苦味测试两种制剂。水解产物基本上如实施 例1所述进行制备，不同的是仅使用一个浓度的肽链内切酶(即，300mg蛋白酶/kg大豆)， 并且所述反应在60℃进行120分钟。将水解产物加热到85℃保持15分钟以灭活酶。基本 上如实施例1所述测定水解度和可溶性固体百分比。 [0099] 表3给出了每个水解产物的水解度和％可溶性固体(SSI)。 [0100] 表3：水解产物的特性。 [0101] [0102] SQS方法基于试验样本和对照样本之间的直接比较，并且提供定性的和定向定量的差异。对照样本是未处理的大豆分离蛋白的5％浆液。向一组五至十名评估员提供每个 试验样本(稀释成5％浆液)和对照样本的等分试样。在评分前平衡样本至室温。 [0103] 评估规程包括涡旋样本杯三次，保持杯底部在桌上。样本静置2秒钟后，每个评估员呷入约10mL(2茶匙)样本，在他的/她的口中漱口约10秒钟后吐出。评估员然后根据表4给出的量表评估试验样本和对照样本间的差异。 [0104] 表4：SQS评分体系 [0105] [0106] SQS评分在表5中给出。一般来讲，SP1水解产物具有比 水解产物更高的SQS评分。 [0107] 表5：SQS评分 [0108] [0109] 对每个试验样本进行进一步评估以提供关于试验样本的苦味如何不同于对照样本的诊断信息。即，如果试验样本具有比对照样本轻微更多、中度更多、或极端更多的苦味，那么赋予它们的评分分别是+1、+2、+3。同样地，如果试验样本具有比对照样本轻微更少、中度更少、或极端更少的苦味，那么赋予它们的评分分别是-1、-2、-3。该分析提供了对试验样本和对照样本之间的定向定量差异的评估。如果试验样本与对照样本无差异，赋予的 评分为零(0)。 [0110] 表6给出了用于两个不同试验的两种水解产物的苦味评分。SP1水解产物的苦味评分在每个试验中低于 水解产物的苦味评分。 [0111] 表6：苦味评分。 [0112] [0113] 实施例3：SP1和 水解产物的产量。 [0114] 基本上如实施例1所述用SP1或 (ALC)(表达为％酶蛋白)水解大豆蛋白。水解反应在pH 8.0-8.5、60℃条件下进行30-60分钟。基本上通过全部组分的 可溶性固体百分比测定可溶性固体百分比。用在pH 4.5的等电点的蛋白材料浓度计算产 量。将产量定义为待离心的总固体百分比对离心后的可溶性组分中的固体百分比的比率。 [0115] 使用简化的三硝基苯磺酸(TNBS)方法(即，按照Adler-Nissen，1979，J.Agric.Food Chem.27(6)：1256-1262)测定水解度。就该方法而言，将0.1g大豆蛋白质水解产物 溶解在100mL的0.025N氢氧化钠中。将水解产物溶液的等分试样(2.0mL)与8mL的0.05M 硼酸钠缓冲液(pH9.5)混合。用0.20mL 10％三硝基苯磺酸处理两mL经缓冲的水解产物 溶液，然后室温暗处培养15分钟。加入4mL 0.1M亚硫酸钠-0.1M磷酸钠溶液(1∶99比 率)终止反应，在420nm处读取吸光度。使用0.1mM的甘氨酸溶液作为标准品。使用以下 计算测定甘氨酸标准品溶液的回收百分比：(甘氨酸在420nm的吸光度-空白对照在420nm 的吸光度)×(100/0.710)。认为94％或更高的值是可接受的。 [0116] 表7给出固体百分比产量、可溶性固体百分比、和水解度。发现用SP1或ALC制备的水解产物在相同酶剂量或相似水解度具有相似产量。此外这些数据揭示提高的水解度或 酶含量提高产量。如图2所示，具有不同水解度的水解产物在所有pH水平上溶解度相同。 [0117] 表7：产量结果 [0118] [0119] [0120] 实施例4：SP1和 水解产物的感官分析。 [0121] 还评估了基本上如实施例3所述制备的SP1和ALC大豆水解产物的完整风味特性。水解产物与对照样本相比，针对收敛性、苦味、含盐性、和其他属性进行评分。 [0122] 如果试验样本被评价为与对照样本不同(即，如表4中规定的SQS评分为2、3、或4)，然后还可对试验样本进行进一步评估以提供关于试验样本如何不同于对照样本的诊 断信息。因此，如果试验样本具有比对照样本轻微更多、中度更多、或极端更多的某项属性(如表8中规定的以及如图3A和3B所示的)，那么赋予它们的评分分别是+1、+2、+3。同 样地，如果试验样本具有比对照样本轻微更少、中度更少、或极端更少的某项属性(如表8 中规定的以及如图3A和3B所示的)，那么赋予它们的评分分别是-1、-2、-3。该分析提供 了对试验样本和对照样本之间的定向定量差异的评估。 [0123] 表8：SQS专门词汇 [0124] [0125] [0126] 图3A和3B中给出了具有相似％DH水平的水解产物的九种风味特性的定向差异。在所有的％DH水平上，TL1水解产物与ALC水解产物相比在谷物和大豆/豆类特性方面有 较大幅度的减少，在收敛性和苦味特性方面有较小幅度的增加。％DH最高的ALC水解产物 在苦味方面相对于对照物具有尤其大的增加。 [0127] 首先，将水解产物以在中性pH条件下的2.5％浆液形式提供给评估员，其中所述对照物是SP1水解产物。具有约12％DH的ALC和SP1水解产物和可商购获得的大豆水解 产物(即，HXP 212)与SP1水解产物对照样本进行比较(参见图3A)。发现ALC样本比对 照样本稍苦并且稍成；如同预期的那样，SP1样本不显示差异；并且HXP 212样本比对照样 本咸味轻微更少、中度更苦、并且轻微更香。 [0128] 接下来，使用可商购获得的大豆水解产物(HXP 212)作为对照样本。ALC和SP1水解产物的全部或可溶性部分以及作为内部对照的可商购获得的大豆水解产物(HXP 212) 也与HXP 212对照样本进行比较(参见图3B)。发现所有ALC样本比对照样本咸味轻微更 少；SP1样本、0.038％ALC的可溶解部分、以及0.125％ALC的所有部分都比对照样本苦味 轻微更少；并且两个0.125％ALC样本比对照样本香味轻微更少。 [0129] 接下来，将水解产物分别以pH 3.0或pH 3.8、1.6％蛋白的橙运动饮料形式提供给评估员(参见图3C和3D)。在两项研究中，使用商业大豆水解产物(HXP 212)作为对照 物。如图3C所示，SP1可溶性部分比对照物苦味轻微更少，并且0.125％ALC所有部分比对 照物轻微更酸以及收敛性轻微更高。图3C中的剩余样本不显示显著差异。在图3D中给出 的研究中，0.125％ALC所有部分比对照物收敛性轻微更高。图3D中的剩余样本不显示显 著差异。 [0130] 图3C和3D的结果在表9中针对属性显示。 [0131] 表9： [0132] [0133] 实施例5：鉴定SP1和 水解产物中的肽。 [0134] 为了进一步表征用SP1或 (ALC)制备的大豆水解产物，水解产物中的肽片段通过液相色谱质谱(LC-MS)进行鉴定。 [0135] 在微型离心机管中混合包含3mg水解产物和0.1％甲酸(300μL)的等分试样，并且涡旋混合物1-2分钟来制备样本。然后将全部混合物转移到预清洁的C18枪头(Glygen Corp.，Columbia，MD)中用于肽分离。用0.1％甲酸的60％乙腈溶液(300μL)洗脱C18枪 头进行清洁，并用0.1％甲酸(600μL)进行平衡。弃去用0.1％甲酸组分洗脱的材料，用 0.1％甲酸的60％乙腈溶液(600μL)洗脱所述肽。将溶剂混合物在Genevac EZ-2蒸发器 上30℃蒸发10分钟，使得肽溶液的总体积减少到200μL。将上清液的等分试样(25μL) 注入C18 HPLC分析柱中(15cm×2.1mm id，5μm；Discovery Bio Wide Pore，Supelco， Sigma-Aldrich，St.Louis，M0)，在HP-1100(Hewlett Packard；Palo Alto，CA)HPLC仪上。 表8中给出了色谱流出曲线。溶剂A是0.1％甲酸；溶剂B是在乙腈中的0.1％甲酸，流量 为0.19mL/min，柱温为25℃。 [0136] 表10：HPLC溶剂色谱流出曲线。 [0137] [0138] 用分路器体系将LC洗脱液的等分试样(10μL)递送到ESI-MS源以进行MS分析。使用Thermo Finnigan LCQ-Deca离子阱质谱仪分析所述肽，该仪器配备具有动态排除扫描 功能的数据依赖型MS/MS。ESI-MS在阳离子模式下运行，毛细管温度为225℃，电喷雾针设 置为电压5.0kV，扫描范围为m/z 400-2000。通过Sequest搜索引擎(BIO WORKSTM软件， Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，不设置酶搜索参数去卷积原始的MS/MS数 据。通过搜索标准数据库如NCBI鉴定肽。 [0139] 表11给出在SP1水解产物中鉴定的肽，表12给出在ALC水解产物中鉴定的肽。在SP1水解产物中鉴定了总计37个不同的肽，其中33个对SP1水解产物来说是唯一的。在 ALC水解产物中鉴定了总计11个肽，其中7个对ALC水解产物来说是唯一的。 [0140] 表11：在SP1水解产物中鉴定的肽。 [0141] [0142] 表11：在SP1水解产物中鉴定的肽。 [0143]蛋白质 肽 MH+ SEQ ID NO： NTNEDTAEKL 1134.82 37 RSPDDERKQIV 1343.38 38 [0144] 表12：在ALC水解产物中鉴定的肽。 [0145] [0146] 实施例6：肽片段的分子量分布。 [0147] 用SP1或 (ALC)基本上如上所述水解大豆分离蛋白。SP1以1500mg/kg大豆使用，ALC以5.0％CBS(基于凝乳固体)使用。可溶性部分的水解度如是 上文实施例3所述进行测定。SP1水解产物的水解度是15.9％并且ALC水解产物的水解度 是21.1％。 [0148] SP1和ALC水解产物中的肽片段的分子量分布通过尺寸排阻色谱法测定。所述系统是Agilent 1100 HPLC系列(Agilent Technologies，SantaClara，CA)，它配备Zorbax GF-250柱和Zorbax保护柱(AgilentTechnologies)以及SPC GPEP-30柱(Eprogen Inc.， Darien，IL)。流动相包含磷酸盐缓冲液和10％异丙醇。也运行分子量在555道尔顿至 200,000道尔顿之间的蛋白标准品。如图4所示，SP1水解产物相对于ALC水解产物具有更 多的500-5000道尔顿的肽片段和更少的10,000-50,000道尔顿的片段。 [0149] 实施例7：能量饮料原型。 [0150] 制备包含SP1或ALC大豆水解产物的原型橙运动饮料，它与包含商业大豆水解产物(即，HXP 212)的橙运动饮料进行风味和功能比较。表13给出了所述饮料的组合物。将 每种饮料分成两部分，调节至pH 3.8或pH 3.2。每240克一份的每种饮料具有约4.0克蛋 白质。将饮料贮藏在4℃。 [0151] 表13：运动饮料配方。 [0152] [0153] 每种饮料的粘度使用粘度计(锭子S61，速度60，4℃)进行测量，并且在1分钟时读数。使用Turbiscan定位扫描在25mm测量浊度，平均1分钟进行60次扫描。表14给出 每个样本的粘度(cP)和浊度(％Tm)。所有饮料具有可接受的粘度测量值，但是包含ALC 水解产物的饮料具有低浊度值。 [0154] 表14：粘度和浊度分析。 [0155] [0156] 通过把样本置于100mL柱中测定不同饮料的沉淀物。在一天后或在两周后(4℃)测量沉淀物。表15给出了每种沉淀物的百分比。用ALC水解产物制备的饮料具有比开始 时多得多的沉淀物。 [0157] 表15：沉淀物分析。 [0158] [0159] 通过一组五名评估员对饮料的风味进行评估。评估员对已经冷藏两周的饮料进行评估，从最喜欢的(评分＝1)至最不喜欢的(评分＝6)。每种饮料的总评分在表16中给 出。包含SP1水解产物的饮料具有最令人喜欢的评分。 [0160] 表16：风味分析 [0161] [0162] 概括地说，对原型酸性饮料的这一初步分析表明SP1水解产物作用非常好。 |
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