[0001] 本发明涉及使用如冷冻干燥方法和萃取方法等技术制备受精卵组分的方法。

[0002] 物质制备技术如萃取和冷冻干燥技术是多种工业中用于分离特定物质或组分或它们的子集，以及为储存、运输或直接使用而制备它们的常用技术。人们希望提高和加强这些技术以优化如产量、纯度和储存适宜性等的参数。

[0003] 根据本发明的第一方面，提供了一种用于制备至少一个受精卵的内含物的粉状样品的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将至少一个受精卵的内含物与壳基本分离；(ii)任选地过滤所述内含物以产生固体或者固体和半固体的保留物，(iii)冷冻所述内含物或保留物，(iv)冷冻干燥所述内含物或保留物，(v)任选地，集合一种或多种冷冻干燥的内含物或保留物，和(vi)粉碎所述内含物或保留物以形成粉末。任选地，可在所述粉末中加入防腐剂。

[0004] 根据本发明的第二方面，提供了一种用于从根据本发明的实施方案制备的浆体中生产粉状水萃取物的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将所述浆体与一种水溶液混合一段时间，(ii)澄清该混合物以产生基本不含固体物质的水溶液，(iii)将所述水溶液与所述固体物质分离，(iv)冷冻所述水溶液，和(v)冷冻干燥所述水溶液以产生粉末。任选地，可在所述粉末中加入防腐剂。

[0005] 根据本发明的第三方面，提供了一种用于从根据本发明的实施方案制备的浆体中生产浓缩的溶剂萃取物的方法。所述方法包括如下步骤：(i) 将所述浆体与一种疏水溶剂混合一段时间，(ii)澄清该混合物以产生基本不含固体物质的溶液，(iii)将所述溶液与所述固体物质分离，(iv)将所述疏水溶剂部分与任何水溶剂部分分离，和(v)浓缩所述疏水溶剂部分。

[0006] 根据本发明的第四方面，提供了一种用于制备至少一个胚胎的粉状样品的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将至少一个胚胎从至少一个受精卵中基本分离；(ii)任选地清洗所述至少一个胚胎，(iii)冷冻所述至少一个胚胎，(iv)冷冻干燥所述至少一个冷冻胚胎，和(v)粉碎所述至少一个冷冻干燥的胚胎以形成粉末。任选地，可在所述粉末中加入防腐剂。任选地，可使用所述胚胎以及部分或全部白蛋清(white albumen)部分，在这种情况下，清洗步骤可被改进或去除。

[0007] 根据本发明的第五方面，提供了一种用于从至少一个胚胎的浆体中或至少一个胚胎及部分或全部白蛋清部分的浆体中生产粉状水萃取物的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将所述浆体与一种水溶液混合一段时间，(ii)澄清该混合物以产生基本不含固体物质的水溶液，(iii)将所述水溶液与所述固体物质分离，(iv)冷冻所述水溶液，和(v)冷冻干燥所述水溶液以产生粉末。任选地，可在所述粉末中加入防腐剂。

[0008] 根据本发明的第六方面，提供了一种用于从至少一个胚胎的浆体中生产浓缩的溶剂萃取物的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将所述浆体与一种疏水溶剂混合一段时间，(ii)澄清该混合物以产生基本不含固体物质的溶液，(iii)将所述溶液与所述固体物质分离，(iv)将所述疏水溶剂部分与任何水溶剂部分分离，和(v)浓缩所述疏水溶剂部分。

[0009] 根据本发明的第七方面，提供了一种用于生产至少一个受精卵的全部或部分内含物的浆体的方法。所述方法包括如下步骤：(i)将至少一个受精卵的内含物与壳基本分离；(ii)任选地过滤所述内含物以产生保留物，(iii)将所述内含物或保留物集中在一个容器中，(iv)混合--任选在加入溶剂的情况下--所述内含物或保留物以产生浆体，(v)任选地冷冻所述浆体以保存用于进一步处理。任选地，可在过滤过程中集中多个受精卵的内含物，此时步骤(iii)是任选的。
附图说明

[0010] 本领域的技术人员会理解下述附图只是出于图示说明的目的。所述附图不欲以任何方式限制本发明的范围。

[0011] 图1是根据本发明的实施方案从一个卵中取出的一个胚胎的照片。

[0012] 图2是根据本发明的实施方案的一个冷冻干燥的胚胎的照片。

[0013] 图3是根据本发明的实施方案的一个冷冻干燥的胚胎的照片。

[0014] 图4是根据本发明的实施方案的被粉碎的冷冻干燥胚胎的照片。

[0015] 图5是根据本发明的实施方案的若干胚胎的浆体的照片。

[0016] 根据本发明的一个方面，提供了一种制备至少一个胚胎的粉状样品或从一个受精卵的部分或全部内含物制备粉状样品的方法。将至少一个受精卵从该卵受精之日起孵化约3-约15天，更优选地约3-约5天，或更优选地约6-约12天，再更优选地约7-约9天。一般说来，所述受精卵被孵化一段时间，这段时间可使血管发生开始和/或使胚胎发育成熟至肉眼可见的胚胎。所述卵可来自多个来源，如鸟类、爬行动物类或产卵哺乳动物。一般说来，可从中将胚胎或胚胎相连的血管取出的任何卵都适用。所述卵优选地为鸟类的卵，可得自任何繁殖产卵的鸟类，如鸡、鹅、鸭等。鸡卵是优选的，原因包括其可进行大量生产的可行性和能力。孵育可在任何环境中进行，只要使卵在一个可使胚胎成熟的温度下保持较长一段时间即可。适合的孵育温度范围是约20-约60℃，更优选的范围是约25-约55℃，更优选的范围是约35-约45℃。卵被孵育一段时间后，它们任选地被通过任何合适的方式处理以减少外部微生物群或杀菌，所述方式如：用如乙醇(如约50-约95％的乙醇溶液)等的溶剂清洗卵壳，然后使溶剂蒸发或干燥；或者将所述卵在紫外线(UV)光源下旋转一段合适的时间。优选地，在进一步处理卵之前将所有溶剂蒸发。然后打破卵以获得里面的内含物。
可在无菌条件下手动或使用合适的机械设备将卵打破。此过程和/或所有或大部分上下文所述的过程可在冷却的空气如约5℃的空气中进行。

[0017] 根据本发明的一个方面，所述卵的内含物被收集在一个容器如无污容器中，所述容器优选为灭菌的和/或冷却的。取自所述容器或取自卵的内含物可任选地进行过滤，例如通过置于滤网上进行过滤。滤网孔为约0.5- 约4mm，更优选地为约1mm。所述滤网优选地为无菌的。任选地，所述卵的内含物和/或部分或全部的破裂卵壳可被直接置于所述滤网上。所述卵的内含物和/或部分或全部的破裂卵壳可在所述滤网上过滤一段时间，直至基本不再有液滴通过所述滤网。破裂的壳可在过滤过程之前、之中或之后从卵的内含物中除去。过滤后，固体或固体和半固体保留物可包含胚胎、大部分或全部卵黄、血管结缔组织、大部分或全部卵清、大部分或全部卵带和清囊(clear sac)(如果其未被打破)。半固体保留物可包括固体物质及粘性物质，例如胶状物质如卵清。所述保留物或半固体保留物任选地可用合适的溶剂如缓冲溶液、无菌去离子水或任何合适的盐水溶液清洗至少一次。例如，可使用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

[0018] 可根据本文所述方法从一个卵中收集所述保留物然后对其进行冷冻干燥。

[0019] 根据本发明的另一方面，可将白蛋清部分及胚胎与卵的其他内含物基本分离。白蛋清部分可通过任何合适的方法如倾出或抽吸白蛋清部分与其他内含物基本分离。胚胎可手工或通过技术人员确定的其他合适方法与白蛋清部分基本分离。图1显示了一个从卵中取出然后用缓冲液清洗的胚胎的实例。本领域技术人员会认识到胚胎可同时与白蛋清部分和其他内含物基本分离。例如，可使用镊子或其他合适的工具手工将胚胎从白蛋清部分和其他内含物中取出。在某些情况下，胚胎可从卵黄囊上手工剥离，卵黄囊是形成其他内含物的一部分。

[0020] 胚胎与卵的白蛋清部分和其他内含物基本分离后，任选地用合适的溶剂如缓冲溶液、无菌去离子水或任何合适的盐水溶液将所述胚胎清洗至少一次。例如，可使用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

[0021] 应理解，如果对卵的内含物进行过过滤处理，那么对于以下的方法而言，言及卵的内含物时实际上是言及保留物。还应理解，可根据上述和下述的任何方法打破完整受精卵、除去壳以及冷冻和冷冻干燥整个去壳的卵。另外，可根据上述和下述的任何方法打破多个完整的受精卵、除去壳、将整个去壳的卵集中并混合成浆体，然后冷冻和冷冻干燥。

[0022] 卵的内含物或胚胎被置于至少一个可冷冻的容器中。所述容器可为例如试管、培养皿、烧杯、不锈钢托盘或塑料容器。优选地，所述内含物或胚胎在从壳中取出后很快被冷冻，如约2小时内，更优选地在约1小时内， 再更优选地在约0.5小时内或尽可能快。根据所述内含物或胚胎即将冷冻的时间，冷冻温度范围可为约-50℃到约10℃，更优选地为约-40℃到约5℃，再更优选地为约-35℃到约-25℃。优选地，将所述内含物或胚胎冷冻至少约6小时，更优选地至少约12小时，再更优选地至少约24小时。冷冻的内含物或胚胎可在一段时间后进行冷冻干燥或冻干。所述内含物或胚胎可在冷冻干燥/冻干步骤之前被完全冷冻。图2和3示出了冻干后的胚胎实例。进行冷冻干燥的优选的极限温度范围为约-80℃到约-约10℃，更优选地为约-65℃到约-15℃，再更优选地为约-40℃到约-20℃，压力为约500毫托或技术人员可确定的其他合适压力。优选地，冷冻干燥过程维持在极限温度的时间为约1-约6小时，更优选地为约2-约5小时，再更优选地为约3-约4小时。进行整个冷冻干燥过程的时间一般为约15-约45小时，更典型地为约25-约35小时，再更典型地为约28-约32小时。

[0023] 根据本发明的另一方面，冷冻干燥的内含物或冷冻干燥的胚胎在需要时可被分散或粉碎以形成基本均一的粉末。分别或成组进行冷冻干燥的内含物可在粉碎步骤之前或之后集合在一起，形成基本均一的粉末。粉碎可例如使用合适的机器如咖啡豆研磨机或锤式粉碎机机械地完成，或使用合适的工具如玻璃棒手工完成。图4显示了粉碎的冷冻干燥胚胎的实例。所述粉末任选地在储存和/或使用之前被灭菌。合适的灭菌过程不应对某些冷冻干燥组分有不利影响。例如，在某些情况下，灭菌方法可包括对所述粉末进行辐照。

[0024] 用本文所公开的方法生产的粉末可在储存之前与控制微生物生长的防腐剂相混合。合适的防腐剂包括常见的食品防腐剂如0.5％w/w的苯甲酸钠和0.2％w/w的山梨酸钾。其他合适的防腐剂可由技术人员选择。

[0025] 用本文所公开的方法生产的粉末可被储存在合适的基本气密的容器中。合适的容器包括塑料袋、桶、塑料容器、瓶、它们的组合等。例如，所述粉末可在受控无菌条件下包装至带有防损安全封的无菌聚乙烯/聚丙烯瓶中。所述粉末可储存在基本干燥的惰性气体如氮气中。所述粉末优选地存储在室温或更低温度下，例如约10℃到约25℃，更优选地约15℃到约-20℃。对于长期储存，所述粉末优选地存储在约-10℃或更低温度下，或者更优选地，约-20℃或更低温度下。所述粉末可在基本干燥的空气中存储一段时间。所述粉末也可被真空包装。

[0026] 根据本发明的另一实施方案，冷冻或未冷冻的内含物或胚胎可收集在合适的容器如烧杯或塑料容器中，并在需要时与合适的溶剂混合或混和以形成浆体。分离的内含物或胚胎可在此步骤的部分或全部过程中被冷却。例如，所述容器可置于冰上以促进冷却。所述溶剂应为合适的水性溶剂以润湿混合的内含物或胚胎，并能够在标准实验室冰箱中被冷冻。合适的溶剂包括水、缓冲水溶液等。可使用如手动搅拌器或其他合适的工具对内含物或胚胎进行混和或匀浆。图5显示了容纳胚胎浆体的容器的实例。所述浆体可部分或全部用于以下的萃取过程或进行冷冻用于进一步处理。

[0027] 将所述浆体与水溶液混合一段时间以进行水相萃取过程。所述水溶液可包括水、缓冲水溶液或任何其他水性溶剂。如果所述水溶液包含水，那么所述水优选地为蒸馏水，更优选地，还在使用前已去除离子。例如，可对所述水进行反渗透(R.O.)处理。所述浆体和水溶液可通过例如搅拌一段时间进行混合，所述时间的范围为约5-约60分钟，更优选的范围为约10-约45分钟，再更优选的范围为约15-约40分钟。理想地，所述水溶液与内含物浆体充分接触，从而使溶液中任何基本亲水的分子都溶解在所述水溶液中。使用的水溶液的体积可与浆体体积基本相等，但也可使用浆体体积的1.5倍、2倍、甚或3倍。任选地，可在混合步骤中轻微加热所述混合物。混合后，可通过合适的方法如离心或过滤基本除去混合物中的任何固体部分，从而使所述水溶液被基本澄清。澄清的水相部分随后可根据本文所述方法被冷冻和冷冻干燥以产生粉末，对所述粉末任选地进行灭菌。

[0028] 根据本发明的另一方面，通过任何上述方法产生的浆体可与基本疏水的溶剂相混合。基本疏水的溶剂优选地为冷却的。合适的疏水溶剂包括例如醚、三氯甲烷、己烷、石油醚或乙腈。例如，可使用醚尤其是乙醚。如上所述，将所述浆体与上述疏水溶剂混合一段时间。相关领域的技术人员可认识到，使用基本疏水溶剂的过程的任何步骤都应在通风橱或类似设备中进行，且所述溶剂应避开明火或热源。混合一段时间之后，所述混合物的固体部分可通过合适的方法如离心或过滤从溶剂部分中基本除去。所述溶剂部分将主要包含疏水溶剂部分，也可能包含水相部分。所述溶剂部分可被转移到一个分液漏斗或基本相当的装置中以将水相部分与疏水溶剂部分分开。对于醚，顶层是疏水溶剂部分。醚部分可从顶部吸取，或在底部水层被移除后从分液漏斗中取出。或者，底部水相部分可被冷冻，从而 使顶部醚层可被倾出。水相部分可用疏水溶剂多次萃取，如萃取约3次。使用的疏水溶剂与水相部分的体积可基本相等，或可为水相溶剂体积的1.5倍、2倍、甚或3倍。萃取过程之后，汇集所有疏水萃取物并用合适的方法浓缩。浓缩的萃取物可在低于室温的温度如约5℃下储存在基本气密的合适容器如密封的小瓶中。

[0029] 根据本发明的另一方面，通过上述任何方法生产的浆体可在萃取过程前澄清。优选的澄清步骤包括过滤法，使用过滤器如滤网或者滤纸或滤垫。其他澄清步骤可包括离心TM法。可在进一步澄清之前向过滤步骤产生的滤液中加入助滤剂如Superflow DE 。得到的部分滤液可在合适的容器中被冷冻以进行冷冻干燥。另外，得到的部分滤液可与上述疏水溶剂混合从而形成水层和疏水层。各层可如本文所述被分离、浓缩和储存。

[0030] 本领域技术人员根据细节描述会容易地明白本发明的其他目标和优点，所述细节描述只简单地通过对所考虑的实施本发明的最佳方式举例说明来描述优选的实施方案。如会被认识到的，本发明能够以其他和不同的实施方案实施，且其若干细节可在多个明显方面被修改，如明显的重排序步骤，但这些都在本发明的范围之内。因此，下面的描述和实施例被认为事实上是用于示例而非限制。实施例

[0031] 实施例1

[0032] 选择8-9日龄的受精鸡卵。用70％的乙醇对整个鸡卵消毒并置于通风橱中以使70％的乙醇挥发。打破所述鸡卵并使内含物通过无菌1.0mm滤网滴下。丢弃卵壳和滤出液。
保留物--包括固体和液体--都被收集并在冰上冷却。所述保留物在5℃下被匀浆。所述匀浆物(浆体)被注入无菌不锈钢托盘中，冷冻用于进一步处理。

[0033] 实施例2

[0034] 根据以下方法从受精鸡卵中收集8日龄的鸡胚：

[0035] (i)收集24枚红皮鸡卵；

[0036] (ii)当被打破时，发现24枚鸡卵中只有22枚受精，其中含有发育的 胚胎(91.6％的受精率)；

[0037] (iii)胚胎被取出并在无菌PBS中简单清洗(两次)，然后立即在-20℃下分别冷冻在50mL(毫升)试管中；

[0038] (iv)然后将10个试管在冷冻干燥机中进行冷冻干燥(架温＝-40℃，冷凝器温度＝-52℃)；

[0039] (v)在此操作过程(cycle)结束时，各个胚胎(仍在试管中)被无菌玻璃棒压碎，并将得到的粉末(1.7g(克))包装用于辐射照射；

[0040] (vi)最终的粉末储存在2-8℃(短期)或-20℃(长期)。

[0041] 12枚剩余的胚胎被收集在一个小烧杯中并用手持搅拌器与少量的水搅拌混合。

[0042] 结果

[0043] 干燥后，使用玻璃棒将所述粉末(1.7g，批号为EM200601)均一分散，并准备进行辐射照射。每枚胚胎产生0.17g粉末。

[0044] 使用玻璃棒将干燥的浆体(1.6g，批号为EM200602)均一分散，并准备进行辐射照射。每枚胚胎产生0.14g粉末(湿度未知)。

[0045] 实施例3

[0046] 收集60枚受精鸡卵(8日龄胚胎)。以下描述了水萃取物和乙醚萃取物的制备。

[0047] 所有鸡卵都用70％(v/v)乙醇喷雾对外表面进行灭菌，然后将鸡卵置于层流通风橱中使乙醇挥发。

[0048] 打破鸡卵，再小心地将胚胎和所附的清囊及其清水样内含物与剩余的蛋黄和血管物质分离。然后，将所有物质即胚胎和清囊收集在一个在冰上预冷的烧杯中。收集后，用手持搅拌器将所述物质搅拌成浆体。

[0049] 将得到的浆体(约200mL)分成相等的两份；一份用于用水萃取，另一份用于用乙醚萃取。

[0050] 水萃取物

[0051] 在100mL浆体中加入100mL反渗透水，再将所述物质在室温下搅拌30分钟。将所述物质通过离心使其澄清并收集水相上层(200mL 1.1％固体)。然后将水相上层冷冻，随后进行冷冻干燥。干粉为1.0g，标记为EM200603，并通过辐射照射灭菌。

[0052] 乙醚萃取物

[0053] 将100mL预冷的乙醚加入100mL浆体中。在室温下振摇该混合物，然后进行离心。在离心过程(15分钟，5℃)结束时，上面的水/乙醚层被转移到分液漏斗中，上面的乙醚层通过虹吸作用收集，或在-20℃下冷冻一段时间使下面浑浊的水层被冻结后，得到上面未冻结的黄色澄清的乙醚层，将该乙醚层倾出。

[0054] 再用等体积的乙醚如上所述萃取下面的水层，将该过程重复三次。然后乙醚萃取TM物在Rotavap 中被浓缩并干燥至很小的体积(约1mL)。所述样品被置于5℃，在运输前不需要进一步的处理。所述样品被标记为EM200604。

[0055] 实施例4

[0056] 由于早期需要10倍量的水萃取物(EM200603)和5倍体积的乙醚萃取物(EM200604)，因此需要更大量的鸡卵。收集420枚受精鸡卵(8-9日龄胚胎)。以下描述了水萃取物和乙醚萃取物的制备。

[0057] 所有鸡卵都用70％(v/v)乙醇喷雾以尽可能地对外表面进行灭菌，然后将鸡卵置于通风橱中使乙醇挥发。

[0058] 打破所述鸡卵(发现420枚中有62枚未受精，受精率为85.2％)，小心地将胚胎和所附的清囊及其清水样内含物与剩余的蛋黄和血管物质分离，再将所有物质即胚胎和清囊收集在一个在冰上预冷的烧杯中。将收集的物质(约2L)置于5℃直到收集后的某天被使用。

[0059] 水萃取物

[0060] 收集后，用手持搅拌器将所述物质搅拌成浆体。使得到的浆体(约2L)通过一个金属滤网(20号网孔)。用纸滤垫和DE 6000将滤液进一步澄清。丢弃留在滤垫上的滤饼。TM
在滤液中加入Superflow DE ，然后使物质通过滤垫以使其进一步澄清。使用布氏漏斗以实验室规模完成所有过滤。所得滤液的大部分(约1200-1300mL)被分离并立即在托盘中冷冻用于冷冻干燥(1.9％固体)。剩余的500mL与等体积的预冷的乙醚在1L的瓶中混合并置于5℃下直至分为两层。干粉被标记为EM200605并被辐射照射。

[0061] 乙醚萃取物

[0062] 将500mL预冷的乙醚加入500mL浆体中，在室温下振摇该混合物，然后进行离心。在离心过程(15分钟，5℃)结束时，上面的水/乙醚层被转移到分液漏斗中，上面的乙醚层通过虹吸作用收集，或在-20℃下冷冻一段时间使下面浑浊的水层被冻结后，倾出上面的黄色澄清乙醚层。

[0063] 再用300mL乙醚如上所述萃取下面的水层，然后将萃取物收集在一个预冷的圆底TM烧瓶中。然后所述乙醚萃取物在Rotavap 中被浓缩并干燥至很小的体积。所述样品被保存在5℃，在运输前不需要进一步的处理。所述样品被标记为EM200606。

[0064] 上述本发明的实施方案只是描述其原理，而不应被认为进行限制。相关领域的技术人员可对本文公开的本发明做出进一步的修改，并且所有这些修改都被认为处于由所附权利要求所限定的本发明的范围之内。