抗冻蛋白AFP在现有文献中已有描述，例如可见Marilyn Griffith和K.Vanya Ewart的《生物技术进展》(Biotechnology Advance)Vol 13，No 3，pp 375-402，1995。抗冻蛋白一般具有以下一 种或几种特征：热滞、抑制冰再结晶、控制冰晶形状以及与冰成核体 的相互作用。
热滞是AFPs最有名的特性，并且一般用该特性来测试AFPs的存 在。热滞起因于含热滞后活性AFP的溶液的表观结冻温度降低而没有 影响熔化温度。通过热滞测试AFP源的鉴别方法在很多文献中有所描 述，如可见John G.Duman的《低温生物学》(Cryobiology)30， 322-328(1993)。
抑制冰再结晶是AFPs的另一个特性。该活性还称为冰晶生长抑 制性。这个特征可以通过比较存在AFP和不存在AFP的晶体在某一时 间点的冰晶大小来测定。US专利5,118,792(DNA植物技术公司(DNA Plant Technology Corporation))中描述了该方法在测试鱼AFPs中 的应用。
AFPs的第三个特性是它们影响冰晶形状的能力。该特性来自 AFPs对冰晶某些表面的选择性结合，并因此限制了冰晶沿某个方向进 行生长。然后，六角形双锥体状冰晶的存在被认为是存在AFP的征兆。 例如在WO92/22581(滑铁卢大学(University of Waterloo))中报导 了以上述方法测试胞外冬黑麦AFPs活性。
AFPs的第四个特性是它们对冰成核物质的活性的抑制能力。AFP 和冰成核体之间的相互作用可以(例如)导致增加的热滞。这个特性在 如WO96/40973(University of Notre dame du Lac)中进行了测试。
AFPs已被提出用于改进产品的冷冻耐受性。就此内容提出了很多 申请。
例如，AFPs被提出用于增强生物材料的冷保藏性 (WO91/12718，Agouron Pharmaceuticals，WO91/10361，The Regent of the University of California)。还提出了AFPs用于防止如化 妆品和药物中的脂质体的渗漏。其它可能的应用是通过包含AFP(或在 其中转基因生产)来增加植物的冷冻耐受性(参见《细胞生物化学杂志 增刊》(J.Cell.Biochem.Suppl.)Vol.14e，1990，P303 XP002030248，Lee et al，摘要R228)。还提出鱼的AFPs可用于食品 中例如冷冻酸奶或冰淇淋(US 5,620,732 Pillsbury和 WO96/11586，HSC研究和发展有限股份公司)。
然而，至今AFPs的使用还没有形成商业规模。本申请人认为缺 乏商业实现的一个原因在于虽然描述了很多AFPs，但在实际中真正用 于商业产品时会遇到很严重的问题。
本申请人发现这些问题的一个关键原因是在现有技术中描述的 大量AFPs仅有固定的几个AFPs可以在各自的应用中适宜地使用；本 申请人还发现这种选择使用AFPs取决于所需的用途和/或所要达到的 产品的属性。
AFPs的特别理想的来源是植物原料。从植物原料中可以相当容易 地获得相对大的量，而且可以运用相对简单的分离过程来获得含AFP 的浓缩物。此外，使用来自植物原料的AFPs据信被较喜欢天然蔬菜来 源而不是例如鱼AFPs的消费者所偏爱。
Marilyn Griffith和K.Vanya Ewart在《生物技术进展》 Vol.13，No.3，pp 375-402，1995中给出了27种高等植物种类的目 录，在这些植物种类中发现了抗冻活性。该文中还提出了AFPs的可能 的广泛用途。
申请人发现，如果选择对植物AFPs用途的特定应用，则需要进 行特定的测试来选择在该应用中可以得到有利使用的AFPs的有限 组。
因此，本发明的目的是提供那些可以在冷冻糖食制品中得到有利 使用的植物AFPs。
申请人出人意料地发现了尽管事实上大量的植物包含AFPs，但仅 有限组的植物包含能够给冷冻糖食制品提供良好质地的AFPs。还出人 意料地发现了可以使用相对简单的测试方法来选择适宜的AFPs。
因此，本发明的第一个方面涉及包含一种或多种来自植物的AFPs 的冷冻糖食制品，其中AFPs在水中经过快速冷冻至-40℃接着在-6℃下储藏1 小时后具有小于15μm大小的冰晶(如下描述测定)，条件是抗冻肽不是来自小 蔓长春花的抗冻肽，它位于植物细胞的胞外空间并且具有36kD、30kD、24kD、 22kD、11kD、9kD或5kD的分子量。

很多现有文献提出可能可以使用AFPs，以便有益影响冷冻糖食制品如冰淇 淋的质地性。然而大部分这些文件没有提供怎样可以在实践中确实得到这些有 益特性的方法。
其它文件描述了鱼AFPs的使用。
WO96/11586讲述了在冷冻的发酵食品中使用鱼抗冻多肽。该文件没有讲述 在这些制品中使用得自植物的特定AFPs。
WO 96/39878描述了在冰淇淋中使用AFP。适合该应用的AFPs可以来自南 极鱼、北极鱼、虫和昆虫的血液和肌肉组织。也没有提及可以使用植物AFP。
US 5,118,792的实施例3B中描述了通过纯化的A-Saf5融合蛋白来抑制雪 糕混合物的再结晶。该文件也没有提及使用来自植物的AFPs。
WO 92/22581描述了得自冬黑麦胞外空间的多种多肽。总钵上描述了这些 多肽的很多可能的用途，其中有冰淇淋。然而没有提及到应当选择多肽来获得 良好品质的冰淇淋。申请人发现仅仅来自冬黑麦的特定蛋白质适合在冰淇淋中 使用(参见实施例)。
申请人发现至今未被列举出的许多植物中包含显著含量的AFPs。另一方 面，发现并非所有的含AFP植物提供适宜类型的AFP，以有益影响冷冻糖食的 质地。申请人的目标在于提供对植物源的新的选择，这些植物源一方面出人意 料地提供良好的AFP特性，另一方面能够有益影响冰淇淋的质地性。
具体说，申请人发现了可以选择适宜AFPs的方法，即在含水组合物中选 取包含AFP的组合物、将该组合物快速冷冻至-40℃或更低、接着在-6℃下储 藏1小时。经过这些条件下储藏1小时后，适宜的AFPs产生小于15μm大小的 冰晶，更优选5-14μm，首选8-12μm。快速冷冻的温度最好是-40℃至-100℃， 优选-80℃。
测定该特性的适宜测试方法在实施例I中作详细描述。
一般，测试可以适用于任何适宜的含AFP和水的组合物。一般来 说，测试组合物的AFP含量没有严格的限制并可以是例如0.0001- 0.5wt％，优选0.0005-0.1wt％，首选0.001-0.05wt％，例如0.0lwt％。 含水组合物中的水含量为30wt％或更高是有利的，例如50wt％- 99.999wt％。
可以使用包含AFP和水的任何适宜的组合物来进行测试。如果需 要，可以存在添加剂，例如蔗糖或缓冲剂。但一般来说不必要获得纯 化形式的AFP。为正常的实际使用，制备成植物原料的液体提取物或 汁液就可以，其中所说的提取物或汁液然后可以进行测试。实施例II 给出了制备适宜液体组合物的适宜方法。
用于测试适宜AFPs的正常植物要处于冷的条件下。例如，可以 测试在冷气候下生长的植物，如南极植物。或者，植物是可以在冬季 期间收获的，优选在12月-3月，更优选1-2月，首选1月(北半球)， 或6月-9月，更优选7-8月，首选7月(南半球)。
申请人对大量的植物作了上述的测试。结果在实施例III和IV 中给出。
AFPs的优选来源来自mohriodes耳蕨、biternatus毛茛、 antartica假山毛榉、fontanum卷耳、Colobanthus quitensis、酸 模、爆竹柳、普通帚石楠、Aceana magellanica、豌豆、saccheraroides 槭、酢浆草属、毛鹳草属、胡萝卜、小蔓长春花(长春花)、蔓长春花、 花葱属、醉鱼草属、连翘属、洋接骨木、squarrosus灯心草、aquatilis 苔草、tenuis翦股颖、antartica发草、contracta羊茅、紫羊茅、 Parodiochloa flabellata、高山梯木草、早熟禾(芨芨草)、草地早 熟禾(六月禾)、Rostkovia magallanica、竹(Bambosoideae)、 Chorisodontium aciphyllum、钩枝镰刀藓、圆枝猫尾藓、alpestre 金发藓、nigricans树发、regalis美皿衣、Himantormia lugubris、 袋衣、subrudecta梅花衣、farinaceae树花、glabrum珊瑚枝、 antartica石脐、subfloridana松萝、trivialis早熟禾、perenne 毒麦、绒毛草、sterilis雀麦和contracta羊茅。
申请人认为基于本发明说明书给出的指导，本领域技术人员将完 全能够选择来自植物的其它适宜的AFPs。这些AFPs的使用也包含在 本发明的保护范围内。
在一个实施方案中，特别适于在食品中使用的是满足上述定义的 冰晶大小并且是得自非或低毒性植物的那些植物AFP。在该内容中， 优选得自胡萝卜、草、竹子等的AFP。
从上述来源中另一个优选的选择是得自苔藓科的AFPs，具体说是 得自nigricans树发、regalis美皿衣、Himantormia lugubris、袋 衣、subrudecta梅花衣、farinaceae树花、glabrum珊瑚枝、 antartica石脐、subfloridana松萝。这些AFPs在冷冻糖食制品中 表现出特别优良的特性。
其它表现特别良好活性的AFPs得自squarrosus灯心草或毛鹳草 属。
对某些应用来说，选择那些经过60℃以上温度、首选80-105℃ 热处理至少30秒、更优选超过1分钟、10分钟甚至超过1小时后仍 保持它们限制冰晶生长能力的AFPs(如上测试所示)。具有热稳定性的 适宜植物源是例如saccheraroides槭、竹、醉鱼草属、圆枝猫尾藓、 farinaceae树花、subfloridana松萝、连翘属、酢浆草属、trivialis 早熟禾、perenne毒麦、绒毛草、sterilis雀麦、Parodiochloa flabellata、antartica发草、aquatilis苔草、Colobanthus quitensis和tenuis翦股颖、contracta羊茅、早熟禾。
除上述植物外，申请人还测试了得自黑麦(冬黑麦)的AFPs。WO 92/22581中描述了很多冬黑麦AFPs。申请人吃惊地发现得自冬黑麦 的32kDa蛋白质满足上述冰晶大小测试，而得自冬黑麦的其它蛋白质 不满足测试(参见实施例IX)。出于本发明的目的，如果利用得自冬黑 麦的AFPs，则优选使用32kDa蛋白质。
本发明的其它优选实施方案涉及满足上述测试、不是来源于冬黑 麦的织物AFP在冷冻糖食制品中的应用。
发明详述
本发明的冷冻制品包含至少一种得自植物来源的AFP。
AFPs可以通过任何适宜的方法从植物来源中获得，例如上述文件 中描述的分离方法。或者，可以通过以下方法从植物中提取AFPs，例 如通过由植物(部位)制备植物提取物然后通过可选择的浓缩步骤。实 施例中给出了获得所说提取物的示例性适宜方法。
还可以将微生物或植物进行基因修饰表达AFPs，然后将AFPs应 用于本发明中。
可以使用基因操作技术来生产与从天然含AFPs的植物来源中直 接获得的AFPs具有至少80％、更优选95％以上、首选100％同源性的 AFPs。出于本发明的目的，这些具有高水平同源性的AFPs也属于术 语“得自植物的AFP”的范围。出于本发明的目的，术语“得自植物 的AFP”优选不包括天然存在于非植物来源如鱼和通过转基因途径由 植物生产的AFPs。
基因操作技术可以如下使用：通过包含所需多肽编码区的基因构 建体来转化适宜的宿主细胞或生物。
可以将用于编码多肽的核苷酸序列插入合适的表达载体。所说的 载体编码用于转录和翻译的必要的元件，并且以它们在适宜条件下 (例如，以适当的取向和正确的读框并且具有适宜的目标和表达序列) 被表达的方式。
构建这些表达载体需要的方法对本领域技术人员来说是公知 的。
很多表达系统均可以用来表达多肽编码序列。其中包括(但不限 于此)细菌、酵母、昆虫细胞系统、植物细胞培养系统和全部用适宜 表达载体转化的植物。
可从上述来源中获得的AFPs可以用于任何适宜的冷冻糖食制品 中。本发明中术语“冷冻糖食制品”包括含乳冷冻糖食，例如冰淇淋、 冷冻酸奶、果汁冰糕(sherbet)、加果汁的冰水(sorbet)、冻牛奶和 冷冻的蛋奶糕、水冰、粗粒冰糕(granitas)以及冷冻的水果泥。出于 某些目的不优选在发酵冷冻食品中使用。
基于最终的产品，AFPs在冷冻糖食制品中的含量优选为 0.0001-0.5wt％，更优选0.0005-0.3wt％，首选0.001-0.2wt％。
冷冻糖食中固形物含量(如糖、脂肪、调味料等)优选为2wt％以 上，更优选4-70wt％。
如果需要，本发明的冷冻糖食制品可以是经过充气的，例如达到 50-500％的膨胀度。
本发明冷冻糖食制品的制备方法可以选自任何适宜的制备方 法。AFPs一般可以在制备过程的任何阶段加入，例如它可以在第一步 的成分预混合阶段加入或以后在制备过程的后期阶段加入。对一些应 用来说，有时优选在生产过程的相对晚的阶段加入AFPs，例如在制品 的(部分)预冷冻之后。
冷冻糖食制品的冷冻方法可以选自任何适宜的冷冻方法，并且可 以选择性包括充气步骤，例如充气到50-300％膨胀度。对于某些目的， 包括冷硬化步骤的冷冻方法是有利的，例如在-30°F或更低温度下。
对一些应用来说，冷冻糖食制品中包含两种或多种AFPs混合物 是有利的。一个原因例如可以是将要使用的AFP的植物来源中包含了 一种以上AFP，并且是较容易添加的，这是因为例如它们同时存在于 将要使用的植物提取物中。或者，添加来自不同来源的一种以上的AFP 有时可能是需要的。
现在，将通过以下实施例的方式举例说明本发明。
实施例I 测定快速冷却接着-6℃下储藏1小时后的冰晶颗粒大小的试验
优选的方法如下：
Ia：使用改进的“液滴(splat)测定”(Knight et al 1988)测 定抗冻活性。测定中，将2.5μl的30％(w/w)蔗糖溶液转移到干净、 适当标定的、16mm圆形盖片上。将第二个盖片放在溶液滴的顶部并且 夹在手指和拇指之间挤压在一起。将该夹层物放入到在干冰的箱中保 持在-80℃的己烷浴中。当全部夹层物制备完时，使用在干冰中预冷 的镊子将夹层物从-80℃己烷浴中转移至观察室中，其中装有保持在 -6℃下的己烷。一旦转移至-6℃，可见夹层物由透明变成不透明外 观。通过影像摄像机记录下图像并且抓拍到图像分析系统中(LUCIA， 尼康)，使用20x的物镜。在0时间记录每个液滴的图像并且在60分 钟之后再记录一次。
或者(不优选)，可以如下测定特性：
Ib：将包含水的含AFP制品的样品调整为30wt％蔗糖含量(如果 样品开始的含量超过30wt％，则采用稀释，如果开始含量低于30wt％ 则添加到30wt％)。
将3μl的样品滴放在22mm盖片上。然后将16mm直径的盖片放在 顶上并在样品上放置200g的重量以确保均匀的载片厚度。用澄清指 甲涂剂密封盖片的边缘。
将载片放在Linkham THM 600控温显微镜载片台上。将载片台快 速冷却至-40℃(每分钟50℃)，得到无数小冰晶。然后将载片台温度 快速提升至-6℃(每分钟50℃)并且保持在该温度下。
使用莱卡Aristoplan显微镜观测-6℃下的冰相。使用偏振光条 件以及λ板来增强冰晶的对比度。通过35mm显微照相术在T＝0和T＝1 小时记录冰相的状态(冰晶的大小)。平均颗粒大小(可视测定，数值 平均)小于15μm说明AFP适合在冷冻糖食制品中使用。
实施例II 含AFP和水的组合物的获得方法
A.用研杵和研钵(冷却至4℃)将植物部分的新鲜组织如根、茎、 芽或叶在保持在冰上的等体积的缓冲液A中碾磨(例如10mM EDTA，20mM抗坏血酸，用Tris缓冲至pH7.4)。将匀浆通过一层或多 层平纹细布过滤，并且在进一步使用前保持在冰上。
该方法一般可以适用于大部分植物并且提供了包含AFP的新鲜植 物汁。一般来说可以适用完整植物，但出于实际的原因有时可以仅使 用植物的部分(如木质树的叶、根类植物的根和草类植物的茎)。
B.从能够耐热的植物来源中提取AFPs的方法。该示例性的方法 是通过使用混合草。很明显，该方法可以等效应用于其它热稳定性种 类。
在1月份剪切混合草组织(trivialis早熟禾、perenne毒麦、绒 毛草、sterilis雀麦)，该月的平均温度为3.5℃，确保植物适当的 冷适应。将草组织快速运送到实验室中以进一步处理和用水彻底洗涤 除掉污垢。
将500g剪切的草放入650 Watt微波炉中并且在满功率下加热5 分钟，温度从85℃升高到100℃。然后将草剪切物冷却至室温。
加热步骤后，通过过滤从剪切物中分离出富含AFP的汁液。将剪 切物在等体积水的存在下连续搅拌5分钟，然后通过3层平纹细布压 榨。
实施例III
各种植物的筛选。在1月份(中冬季)收割非南极植物。中夏季 (2-3月份)收获南极植物。
除非另外说明，使用根来根据实施例IIa所述的方法制备含AFP 的汁液。
将样品经过实施例Ia的测试。用正号(+)表示适合在冷冻糖食制 品中使用的AFPs。
此外，如下测定汁液的热滞：将熔化的制品放在载玻片上 (Camblab Cambridge，径长0.1mm)，来测定含AFPs制品的样品热滞。 载玻片末端用软石蜡密封。使用气溶胶冷冻喷雾器将冰引入样品中。 然后玻片浸入到温度调节为-0.1℃的乙醇浴中。平衡5分钟后查看样 品，如果冰完全熔化则每次0.1℃逐步降低浴温，接着平衡。重复这 些步骤直至温度达到样品中存在少量冰晶。在该温度下平衡之后，每 分钟0.01℃地逐步降低浴温。冰从平衡晶体开始增大时的温度记录为 样品的冻结点。然后从冻结点开始每分钟0.01℃地升高温度直至所有 冰晶熔化，由此来测定样品的熔点。该温度是样品的熔化温度。熔化 温度和结冻温度之间的差是热滞。具有显著程度热滞的AFPs用正号 (+)表示。获得以下结果： 植物名称 热滞 再结晶抑制性(实施例I) 木贼 + - 白云杉 + - 兜状荷苞牡丹 + - 堇菜属sp. + - 羽衣甘蓝 + - 芜箐 + - 欧洲油菜 + - 野胡萝卜 + + 小蔓长春花 + + 马铃薯 + - 早熟禾 + - 草地早熟禾 + - 黑麦 + *) 皱叶欧芹 + - 药用鼠尾草 + - *)注：仅29-32kDa的蛋白质具有活性
这些结果清楚地说明虽然很多植物显示出热滞，但仅有少部分通 过再结晶的试验。
实施例IV
各种植物的筛选。在1月份(中冬季)收割非南极植物。中夏季 (2-3月份)收割南极植物。
除非另外说明，使用根来根据实施例IIa所述的方法制备含AFP 的汁液。
将样品经过实施例Ia的测试。适合在冷冻糖食制品中使用的 AFPs用正号(+)表示。 植物名称     RI测试 溪木贼      - scolopendrium铁角蕨      - mohriodes耳蕨      + 欧洲赤松      - glauca云杉      - 柏木属sp.      - 月桂属      - biternatus毛茛      + 荷苞牡丹属      - 三球悬铃木      - 荨麻属      - fraxinifolia枫杨      - antartica假山毛榉      + oblique假山毛榉      - 垂枝桦      - 甜菜      - fontanum卷耳      + Colobanthus quitensis(漆姑草)      + 酸模      + 芍药属   - 金丝桃属   - 蜀葵属   - 堇菜属   - 银白杨   - 白柳“Britzensis”   - daphnoides柳   - 爆竹柳   + aria花楸   - Prassica napus   - 糖芥属   - 普通帚石楠   + 报春属   - 绣球属   - 景天属   - Aceana magellanica   + 单子山楂   - 洵子属sppx2   - 草莓属x凤梨属   - 斗蓬草属   - 金雀花属   - 豌豆   + 蚕豆   - 紫苜蓿   - 瑞香属   - 按属   - 珊瑚木属   - 冬青属   - saccheraroides槭   + 漆树属   - 酢浆草属   + 毛鹳草属   + 长春藤属   - 胡萝卜   + 欧洲防风   - 蔓长春花属   + 花葱属   + 迷迭香属   - 醉鱼草属   + 连翘属   + 花白蜡树   - pileata忍冬   - 洋接骨木   + 莴苣   - 蒜叶婆罗门参   - 菊芋   - squarrosus灯心草   + aquatilis苔草   + tenuis翦股颖   + antartica发草   + contracta羊茅   + 紫羊茅   + Parodiochloa flabellata   + 高山梯木草   + 早熟禾   + 草地早熟禾   + Rostkovia magallanica(草)   + 竹(Bambosoideae sp)   + 亚美尼亚蓝壶花   - 大头蒜cv Alaska   - 洋葱   - Chorisodontium aciphyllum   + 钩枝镰刀藓   + 圆枝猫尾藓   + 扁枝平藓   - alpestre耳蕨   + 金发藓   - 拟金发藓   - Racometrium lanuginosum   - capillofolium泥炭藓   - 沼泽泥炭藓   - nigricans树发   + regalis美皿衣   + Himantormia lugubris   + 袋衣   + subrudecta梅花衣a   + farinaceae树花   + glabrum珊瑚枝   + antartica石脐   + Subfloridan松萝   + 实施例V
通过混合以下成分制作用于制备冰淇淋的液体预混物： 配料                       wt％ 脱脂奶粉                   11.390 蔗糖                       3.410 麦芽糊精(MD40)             4.000 槐树豆胶                   0.072 玉米糖浆63DE               20.705 瓜尔豆胶                   0.048 Genulacta L100             0.020 奶油                       9.015 部分水解纤维素粉RC581      0.240 明胶                    0.140 单酸甘油酯(棕榈酸酯)    0.450 香草                    0.010 AFP(实施例IIb)          0.100或没有(对照) 水                     余量 *注：所添加的AFP是使用一些外加水作为稀释剂的浓缩AFP溶液， 百分比指AFP的量。
该混合物可以方便地在85℃下巴氏灭菌15秒并且装罐冷藏。
该混合物可以用于制备冰淇淋，常规家用混合机将其搅打成约 100％的膨胀度，接着在家用冷冻机中静止冷冻。
本发明的组合物比对照样品具有明显较好的质地。
使用以下植物来源可以获得同等的结果：saccheraroides槭、 竹、醉鱼草属、圆枝猫尾藓、farinaceae树花、subfloridana松萝、 连翘属、酢浆草属、trivialis早熟禾、perenne毒麦、绒毛草、 sterilis雀麦、Parodiochloa flabellata、antartica发草、 aquatilis苔草、Colobanthus quitensis和tenuis翦股颖、 contracta羊茅、早熟禾。
实施例VI
通过混合以下成分制作用于制备冰淇淋的液体预混物： 配料                       wt％ 脱脂奶粉                   10.00 蔗糖                       13.00 麦芽糊精(MD40)             4.00 槐树豆胶                   0.14 乳脂肪                     8.00 单酸甘油酯(棕榈酸酯)       0.30 香草                       0.01 AFP(实施例IIb)             0.01或没有(对照) 水                         余量 *注：所添加的AFP是使用一些水稀释的浓缩AFP溶液，百分比指AFP 的量。
将配料在室温下混合接着在89℃下进行60秒的巴氏灭菌。将混 合物无菌分装成500ml包装，密封并在室温下储藏。
用常规的家用混合机将混合物搅打成约70％的膨胀度接着在静止 条件下用家用冷冻机冷冻制备成冰淇淋。经过两个月的储藏之后，本 发明的组合物具有比对照样品明显较好的质地。 实施例VII    
本实施例描述胡萝卜AFP的分离和测序。对其它AFPs可以使用 相似的方法。
用预冷的研杵和研钵将适应冷环境的胡萝卜的胡萝卜根组织在3 体积(w/v)缓冲液中匀浆(20mM抗坏血酸，10mM EDTA，50mM Tris/HCl，pH7.2)，并且过滤通过一层平纹细布。4℃下将滤液在 6,000g离心10分钟；收集上清液并且4℃下在100,000g下离心1小 时。该步骤中的100,000g上清液称为可溶性馏分，而沉淀物称为微 粒体馏分。
将上清液上样于30ml快速流动Q Sepharose(Pharmacia)柱，该 柱用50mM Tris/HCl pH7.4预先平衡过，流速为5ml/min，所说的流 速由HiLoad泵P-50提供，通过Gradifrac低压色谱系统(Pharmacia) 在4℃下进行控制，并且通过UV检测器(Monitor 102，Pharmacia)在 OD 280下检测洗脱液，记录在图形记录器上(REC 102，Pharmacia)。 收集5ml的馏分。用50mM Tris/HCl pH7.4以相同的流速洗涤色谱柱， 直至OD 280回到0。然后使用150ml Tris/HCl pH7.4中的0-0.4M NaCl梯度，接着用2M NaCl洗柱。按照实施例I对洗脱馏分进行液滴测定。
收集含抗冻活性的馏分并且使用聚乙二醇如下进行浓缩：将馏分 转移到10kDa截止透析管中(Sigma)，该管已在自来水中洗涤过，在 50mM EDTA pH7.5中煮沸10分钟并且在mili Q水中漂净。用分子量 15,000-20,000的固体聚乙二醇化合物(Sigma)盖住装有将要浓缩样 品的透析管，并且在4℃下保温最多4小时，或者直至透析管内的样 品体积减少达10倍。
将从Q Sepharose柱中收集的浓缩物上样于苯基Sepharose柱， 或SMART superdex 75凝胶渗透色谱柱或FPLC superdex 75凝胶渗 透色谱柱。
如下通过凝胶渗透色谱纯化胡萝卜根抗冻蛋白：
20μl等分样品上样于SMART superdex 75柱(Pharmacia)，该柱 预先用含0.15M NaCl的50mM Tris/HCl pH7.4(缓冲液E)平衡过， 流速为40μl/min，并且通过凝胶渗透以相同的流速用平衡缓冲液分 离组分。在OD 280和0D 215下检测洗脱液。在0.85和0.89ml之间 收集80μl馏分，在0.89和1.24ml之间收集40μl馏分，在1.24和 3.0ml之间收集100μl馏分。通过测定蓝色葡萄聚糖溶液的保留体积 作为柱的外水容积，为0.91ml。使用10μl含5mg/ml BSA(Mr 66kDa， 保留体积(Ve)＝1.02ml)、3mg/ml碳酸酐酶(Mr 29kDa，Ve＝1.22ml)、 2mg/ml细胞色素C(Mr 12.4kDa，Ve＝1.41ml)和2mg/ml抑酶肽(Mr 6.5kDa，Ve＝1.59ml)的溶液校准superdex柱，用Ve/Vo对分子量对 数作图得到标准曲线。通过实施例I的液滴测定鉴定含抗冻活性的馏 分，其活性峰保留体积为1.16ml，表观分子量为40kDa。这些测定证 实了冷适应胡萝卜的38kDa谱带是抗冻肽。
根据Laemmli(1970)使用Biorad微型系统进行SDS-PAGE。将要 通过SDS-PAGE分析的样品溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中(Laemmli 1970)，在干热块上(Techne)100℃下加热5分钟并且室温下在 10,000g下离心3分钟。将样品(10μl-50μl)上样于微型凝胶 (Biorad，0.75、1.0或1.5mm厚，10、12、15％丙烯酰胺或10-20％梯 度丙烯酰胺(由Biorad预先倒胶))并且电泳分离。将分离的多肽固定 在凝胶中并且用考马斯蓝(0.1％(w/v)考马斯亮蓝在乙酸/甲醇/mili Q水中(5∶4∶31体积))着色，或者使用Biorad银染试剂盒根据制造商 的说明银染。将凝胶在Biorad凝胶空气干燥机中的两片Gelair collophane之间根据制造商的说明进行干燥。使用Sigma高和低范 围分子量标记试剂盒根据制造商的说明测定SDS-PAGE上的表观分子 量。
用冷适应的胡萝卜根和非冷适应的胡萝卜根进行离子交换色 谱。所得的SDS-PAGE凝胶显示冷适应的胡萝卜根中存在约38kDa的 谱带。这个谱带在非冷适应的根中量少得多。因此这个(约)38kDa的 谱带具有抗冻活性。
对于蛋白测序，按以上实施例的描述纯化约38kDa的胡萝卜根蛋 白，然后为确保进一步纯化，从SDS PAGE凝胶上切下将要被测序的 样品，然后在聚丙烯酰胺凝胶切片中原位进行蛋白分解性消化。
将高纯度的约38 kDa蛋白质的制备物上样到12％聚丙烯酰胺凝 胶上，其中仍含有一些少量的杂质蛋白。上样3个泳道，每个泳道2μg 蛋白质，并且在凝胶中电泳直至染料前缘到达凝胶末端。然后用0.2％ 考马斯亮蓝(w/v)、30％甲醇(v/v)、1％乙酸(v/v)给凝胶着色20分钟， 然后用30％甲醇退色直至可以显现蛋白带。通过用上样在相邻泳道的 分子量标记进行比较鉴定出38 kDa条带，并且用解剖刀刀片切下各 泳道的条带，注意排除杂质条带。
将凝胶切片转移到干净的eppendorf管中并且用0.5ml的50％ 乙腈(v/v)、100mM Tris/HCl，pH8.5洗涤两次。洗涤除去一些考马斯 染剂并且还使凝胶切片部分脱水。然后从管中取出凝胶切片并且在实 验室台上进行空气干燥直至它们明显收缩并开始卷起。然后将它们转 移回eppendorf管，并且首先用含1μg内切蛋白酶Lys C(Boehringer Mannheim)的100mM Tris/HCl，pH8.5 10μl再水合。这个蛋白酶特异 裂解赖氨酸残基羧基端一侧的多肽链。向凝胶切片进一步加入Tris 缓冲液直至它们完全再水合，然后将它们在37℃下保温16小时。
保温之后将1μl的三氟乙酸添加到管中以停止反应，然后用 0.3ml的60％乙腈(v/v)、0.1％ TFA(v/v)在30℃下洗涤两次，洗涤 30分钟。这再次使凝胶切片部分脱水引起它们收缩并且洗脱产生的 肽。将上清液转移到另一干净的eppendorf管，然后在离心式蒸发器 中干燥2小时直至样品接近干燥，并且用0.1％ TFA再悬浮至0.1ml 的体积。
然后通过反相HPLC在Smart微型纯化系统(Pharmacia)中分离 肽。将肽消化物上样在用0.1％ TFA(溶剂A)平衡过的C18柱上 (2.1×100mm)，流速为0.1ml/min。然后使用0-70％梯度的溶剂B(90 ％乙腈v/v，0.085％ TFA v/v)，用70分钟的时间以相同的流速洗脱 柱。在214nm下检测光密度并且在馏分收集器中通过手工步进收集各 个肽的峰值。通过上样到492型Perkin Elmer蛋白序列分析仪使用 按制造商推荐的液相化学循环来对多肽测序。
在38kDa条带中分析了许多多肽片段(A-E)并且具有基本上同以 下一致的序列： (A)LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS (B)ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS (C)LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS (D)SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL- PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS (E)X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU- LYS
如下制作用于生成抗冻蛋白的细胞培养物：
基于Gamborg和Wetter 1975、Torres 1989、Dodds和Roberts 1985的方法开始新细胞的培养。
冷适应的胡萝卜(秋王)：首先通过用10％梯普尔洗涤剂洗涤将储 藏根表面消毒，接着在流动水下洗涤然后在流动水下漂净15分钟。 将其中可用的胡萝卜(以大小计)去皮。然后将根无菌切割成0.5cm的 切片，将其放在70％ v/v乙醇中10分钟，同时振摇，接着放入10％ v/v Domestos+2滴吐温20(Sigma)中25分钟，也同时振摇。然后， 用无菌蒸馏水洗涤切片3次。使用无菌解剖刀通过切片切割成大约 0.5cm直径的圆柱形，并将剩余部分切割成2-3mm长，将这些组织片 (外植体)无菌转移到含30g/l蔗糖、10mg/l吲哚乙酸(IAA)、0.1mg/l 激动素和8g/l专用琼脂的固体MS培养基上，该培养基装在60ml Sterilin容器中。将外植体在20℃下黑暗处培养。
当必要时，将所得的愈伤组织分成更小的部分，接种到新培养基 上。然后由活跃生长的愈伤组织开始悬浮培养。
另外，从利兹大学的生物化学和分子生物学系获得胡萝卜细胞悬 浮培养品系(NOR和OX6)。将10ml这些培养物在含25g/l蔗糖和1mg/l 2，4-D的新鲜Murashige和Skoog培养基(Sigma)每7天进行传代培 养。培养物在定轨振荡培养箱中150rpm下25℃黑暗培养。
对NOR培养物进行如下冷处理：
将18×5ml 7天NOR培养物添加到18×100ml装有45ml胡萝卜MS 培养基的锥形瓶中。按前描述将培养物在25℃下培养4天，然后将培 养箱温度降低至4℃。旋即去掉两个烧瓶并且按前述收获细胞和培养 基，此时为t＝0。剩余的烧瓶在t＝8h、1d(1天)、2d、4d、7d、9d、 11d和14d时收获，一式两份。
使用NOR和OX6的较大培养物重复冷适应性处理，在25℃下生 长4d和7d之后转移至4℃。在t＝0、t＝7d和t＝14d时收获培养物。 除收获外，在每个时间点测定每种培养物的PCV。
如下制备用于实施例I液滴测定的NOR冷适应细胞：使用研杵和 研钵将快速冷冻的细胞在液氮中研磨成细粉。将粉状样品再悬浮于2x 体积的10mM EDTA+20mM抗坏血酸中，旋转混合30秒然后在10,000g 下离心10分钟。使用缓冲液对照作为负对照对10μl等分的上清液进 行液滴测定。在冷适应的细胞和培养基中可以检测到RI活性但在非 冷适应的样品中没有。
如下分析NOR培养物的培养基样品。通过添加100μl的1M Tris/HCl pH7.4缓冲NOR胡萝卜培养基。然后上样于1mlQ Sepharose 柱(Pharmacia)，流速为1ml/min，用3ml等分的含0.5M NaCl的50mM Tris/HCl pH7.4洗脱结合的分子。收集1ml馏分。
同样使用阴离子交换法分馏出t＝0、2d、4d、7d、11d的冷适应 培养基样品和t＝7d的非冷适应培养基样品。通过实施例I描述的夹 层液滴测定法测试馏分的活性。
如下通过凝胶渗透色谱法纯化培养基的抗冻活性。将上述14个 来自Q Sepharose柱的冷适应0.5M NaCl洗脱物(馏分2)用丙酮沉淀 并且将沉淀物再悬浮于50μl的50mM Tris/HCl+0.15M NaCl pH7.2 中。然后在10,000g下离心10分钟，并且将20μl上样到Pharmacia SMART系统的Superdex 75凝胶渗透柱上。流速40μl/min且流动相 是50mM Tris/HCl+0.15M NaCl pH7.2。收集80μl的馏分并且液滴测 定。使用来自Q Sepharose柱的t＝14d非冷适应0.5M NaCl洗脱物和 新鲜培养基重复该过程。
可以按以上所述通过SDS PAGE进行活性蛋白质的进一步分离。
实施例VIII
通过将新拔的冷适应的胡萝卜在冷水中洗涤来制备来自冷适应 性胡萝卜根的根提取物。除去顶部并且使用家用榨汁机(Russell Hobbs，9915型)提取汁液。将汁液冷冻成1升的块状物并且在-20℃ 下储藏，然后再收集用于在冰淇淋中的用途试验。 将胡萝卜AFP添加到以下冰淇淋配方中 配料 重量份 脱脂奶粉 10.000 蔗糖 13.000 MD 40 4.000 槐树豆胶 0.144 Genulacta L100 0.016 MGP 0.300 乳脂肪 8.000 香草 0.012 水 64.528 胡萝卜提取物(来自冷适应胡 萝卜，每kg含1-10mg AFP) 4.472
将上述配方冷冻并且充气到106％的膨胀度制备冰淇淋。
对新鲜样品和已在-10℃下储藏10天的滥处理样品进行测定。
作为比较，按相同方式测定不合胡萝卜提取物的样品。测定如下 进行：
将样品在-18℃下于Prolan环境室中平衡大约12小时。每批冰 淇淋中选择3个样品作为代表，并且在低温控制器温度控制室中通过 从每个块的中央涂一薄片冰淇淋到显微玻片上来制备每个的载片。向 载片滴加一滴白色酒精然后盖上盖片。之后将每个载片转移到控温显 微镜载物台(Leit LaborLux S，Leica x10物镜，温度-18℃)。收集冰 晶的图像(大约400个单独的冰晶)并且通过影像摄像机(三洋CCD) 传送到图像储存和分析系统(LEICA Q520MC)。
通过绘画出周边然后将整个晶体加亮来人工突出储藏冰晶的图 像。然后使用图像分析软件测定加亮冰晶的图像，所说的软件计算完 成最长直线(长)、最短直线(宽)、长宽比所需要的像素数目。将每 批冰淇淋各个冰晶的数据输入电子制表软件，在其中进行数据组的分 析，以发现平均和标准的偏差。
使用Housfield H10KM通用试验机、Housfield 100N负荷电池 和10cm圆柱形不锈钢探针进行冰淇淋的硬度测定。在设定为-18℃ 的Prolan温度控制室中通过16小时的保温用486ml冰淇淋块制备冰 淇淋样品。
从Prolan温度控制室中取出冰淇淋块并放入Housfield H10KM 通用试验机中。将10cm圆柱形探针以400mm/min的恒速推进冰淇淋 块中，达到20mm的深度。记录推压时的最大力并且表示为冰淇淋的 硬度。如果观察到样品有断裂或脆性裂缝，则在右栏中指示出来。
获得以下结果 冰晶大小参数 原料特性 样品 平均 冰晶长度/μm 平均 冰晶宽度/μm 平均 冰晶成形系数/- 平均 冰晶长宽比/- 硬度 /N 脆性裂 缝观察 比 n 胡萝卜AFP -新鲜 26.79±1.3 19.00±0.9 1.15±0.013 1.43±0.024 40.8 是 胡萝卜AFP -滥处理 33.48±1.3 24.61+0.9 1.13±0.013 1.37±0.020 59.9 是 对照 -新鲜 33.67±1.1 24.79±0.8 1.12±0.008 1.38±0.018 27.3 否 对照 -滥处理 61.77±2.7 46.54±2.0 1.11+0.010 1.37±0.020 32.7 否
可以得出以下结论： a)初始冰晶大小在含胡萝卜AFP的冰淇淋中较小，因此胡萝卜AFP 抑制了再结晶抑制性。 b)胡萝卜AFP冰淇淋的冰晶阻碍了它们再结晶的过程。 c)胡萝卜AFP冰淇淋的冰晶形状与常规冰淇淋可见的冰晶形状没有 显著差别。 d)含胡萝卜AFP的冰淇淋的原料特性与常规冰淇淋相比有所改进。 即，冰淇淋比常规冰淇淋硬但仍比含如鱼AFP的冰淇淋软。其次，含 胡萝卜AFP的冰淇淋观察到有裂缝。
使用毛鹳草属或squarrosus灯心草可以获得同样非常良好的结 果。 实施例IX
本实施例描述从冬黑麦中分离各种蛋白质以及其测试。
将经过30天冷适应的黑麦植物的叶切割成3cm长并且用蒸馏水 彻底洗涤以除去任何细胞内含物。将叶片在纸巾上轻拍干燥并且全部 浸入5mM EDTA、10mM抗坏血酸、2mM己酸、2mM苯甲脒和1mM苯甲基 磺酰氟(PMSF)的提取介质中。然后在布其勒烧瓶中真空浸润60分钟， 之后取出叶子并且完全拍干。然后将它们沿纵向排列在切掉的塑料注 射器管中并且在2000xg下温和离心30分钟。将质外体提取物收集在 注射器下面的eppendorf管中。
使用Amicon超滤器用PM10膜将质外体提取物浓缩7倍。通过 将50微升的浓缩质外体提取物上样到SMART分离系统的大小排阻 Superdex 75 PC 3.2/3.0(分离范围3-70kDa)色谱柱上来进行初始纯 化，所说的系统均来自Pharmacia。缓冲液是pH为9.5的50mM Tris/HCl。分离在50μl/min流速下进行并且收集50μl馏分直到体 积为2.5ml，并且按实施例1的描述进行再结晶的测定。
将活性馏分上样到强阴离子交换MonoQ FPLC柱(Pharmacia)上， 该柱用pH9.5的50mM Tris/HCl平衡过，并且使用直到0.5M NaCl线性梯度的相同缓冲液洗脱蛋白质。用25分钟的时间将洗脱缓冲液 添加到浓度0.5M的NaCl中，保持10分钟并在15分钟内减少到0M。 在1ml/min的流速下进行色谱并收集1ml馏分。将经实施例I测试为 阳性的馏分在7000rps的Centrican PM10离心式浓缩机中浓缩，直 至体积减少为50μl并且第二次上样在S75柱上。满足实施例1测试 的馏分具有一个在大约150mM盐处的峰。
在SDS PAGE上分离该活性馏分(与实施例VII方法相同)。这证 实了32kDa是活性馏分。
冬黑麦的32kDa馏分在用于制备糖食制品的用途中可能是有利 的。