益生细菌在食物产品中的应用往往与健康作用有关，参见例如 A.C.Ouwehand等，Int.Dairy Journal 8(1998)749-758。具体的说，益 生细菌的应用与例如涉及以下方面的健康作用有关：肠道良好状态如 IBS(肠易激综合征)、IBD(炎性肠病)、乳糖消化不良的降低、腹泻的 临床症状、免疫刺激、抗肿瘤活性和矿物质摄取的增强。通常认为， 益生细菌的一些健康作用与其在黏膜部位的免疫调节和抗炎性质有 关。这些健康作用很可能由益生细菌对回肠和空肠中的黏膜免疫系统 的作用所引发。益生细菌的所述调节作用已证明能有益地影响例如针 对感染、过敏性疾病和炎性肠病的抗性。
本领域公知，需要在可食用产品如食物产品中加入某些细菌，以 在可食用产品的消费之际提供健康益处。例如WO 94/00019描述了为 健康目的向焙烤产品中加入合宜的活乳酸细菌。
传统上是将益生细菌以活微生物形式来应用，因为人们认为细菌 必须处于活的状态下才能提供有益的健康作用。
但是，仅使用活的益生细菌有这样的缺点，即它们的应用局限于 其产品特性适合活细菌的可食用产品和由适合活细菌的加工技术所 生产的可食用产品。这意味着包含活细菌的可食用产品的制备费用 高，储藏活益生细菌和包含其的食物的方法复杂，因此进一步增加了 可食用产品的成本。
此外，在可食用产品中使用活益生细菌的一个问题是，产品的配 方往往需要作适应性改动，以确保益生细菌的活菌性质能得以保持。 例如，可食用产品的低或高pH值可能不适宜，高矿物质含量可能不 可以接受和/或产品可能需要尽可能低的水活度。这限制了可食用产品 的配方灵活性，因此是不合宜的。
在可食用产品中使用活益生细菌的另一个可能问题是，产品往往 需要在相对较低的温度下储藏，以确保它们不被细菌所发酵。如果发 酵过程继续下去，这会因为所谓的后酸化而导致产品要么变得很酸， 要么具有令人不快的感官特性，如物理结构差和/或味道差。
已有人提出，益生细菌并不需要处于活的状态才能赋予其消费者 它们的一些益生作用。例如A.C.Ouwehand等，Int.Dairy Journal 8 (1998)749-758论述了含活细菌和非活细菌的发酵乳制品的健康作用。
WO 2004/069156公开了包含失活的益生细菌的配方。细菌通过 辐射处理进行失活处理。由相同发明人Rachmilewitz等在 Gastroenterology 2004；126：520-528发表的文章“Toll-like receptors 9 signalling mediates the anti-inflammatory effects of probiotics in murine experimental colitis”公开了发明人所认为的关于失活和剩余益生作用 的理论。
Rachmilewitz的资料表明，如果在某种条件下使活益生微生物变 成非活微生物，则可使活益生微生物的一些重要免疫调节和抗炎性质 得以保持在非活微生物中。这些资料提示，当将微生物用常规方法如 巴氏灭菌(pasteurization)或杀菌(sterilization)处理变成非活微生物时， 它们的结构完整性受到损害，这会导致非活微生物在接近肠道的部位 快速碎裂。与此对比，Rachmilewitz的用γ射线辐射处理得到的非活 微生物，据称在接近肠道的部位能保持其完整性，这使得特定的微生 物模式(microbial pattern)——在Rachmilewitz的这个情况下是未甲基 化的DNA，能与黏膜免疫系统上的Toll样受体发生相互作用。这种 相互作用据描述然后导致所述的免疫调节和抗炎作用。
WO 01/95741描述了非活乳酸杆菌属(Lactobacillus)细菌在食物 产品中的应用。用单个加工步骤使乳酸杆菌属细菌变成非活细菌，防 止食物产品因细菌的存在进一步被发酵。
尽管本领域提出某些非活细菌可提供至少一些有用的健康益处， 但至今为止都是用单个加工步骤来使细菌变成非活细菌。
这种单个加工步骤的使用可能会有以下一个或多个缺点：
—单个加工步骤可能难以控制，因此并不总是有可能确保细菌 群体被变成非活细菌，同时保持其结构完整性；
—可能要在整个食物产品上或一批这种产品上应用不同的加工 条件，使得处理效率低下或无规律；
—苛刻的单个步骤加工条件对食物产品本身可能有害；
—所用的条件可能会限制食物配方或加工条件的灵活性，因为 单个加工步骤需要达到足以使细菌变成非活细菌的苛刻条件；
—在辐射用作单个加工步骤的情况中，消费者可接受性通常较 低，或者它可能不会在不同地区得到广泛允许或接受。
本发明试图解决一个或多个上述问题。
具体的说，本发明试图提供方便有效的方法，用以提供包含能提 供健康益处的非活细菌的可食用产品。特别是，本发明试图提供可用 来制备多种包含前述类型的细菌的可食用产品的方法。
发明概述
出人意料地发现，当在细菌上使用至少两种处理时——每种处理 就其本身而言并不足以使细菌变成非活细菌——该细菌因组合处理 而变成非活细菌，但仍能够给消费该细菌的人们提供健康益处。
因此，本发明的第一个方面提供制备包含能给其消费者提供健康 益处的非活细菌的可食用产品的方法，其中所述方法包括使活细菌经 历至少两种亚致死处理，获得能提供健康益处的非活细菌。
优选可食用产品是食物或饮料产品。优选健康益处是益生作用。
还优选能提供所述健康益处的细菌是非致病细菌。还优选能提供 所述健康益处的细菌在可食用产品中实质上结构完整。还优选细菌保 持着能被免疫系统的模式识别受体识别的保守微生物模式，优选所述 保守微生物模式包含DNA和/或细胞壁组分。
还优选细菌选自乳酸杆菌属或双歧杆菌属(Bifidobacterium)。
优选地，每份可食用产品含有的细菌为106-1011个。
根据本发明的一个实施方案，可食用产品的制造商可进行第一亚 致死处理，可食用产品的消费者在消费该产品前可进行第二亚致死处 理。
本发明提供了几个优点，包括细菌能被变成非活细菌，同时保持 实质上结构完整和保持其调节免疫功能和炎性反应的能力。这使细菌 的健康益处得到最大的保持。根据本发明，还可获得以下一个或多个 优点：
—可按需和/或由不同的操作者在可食用产品制备过程的不同时 间进行两个亚致死处理，例如一个处理由可食用产品制造商进行，另 一个处理由产品消费者进行；
—采用至少两个亚致死处理，提供可食用产品制备上的灵活性， 因为不必要采用单个苛刻的处理。这使得可以根据可食用产品的类型 选择不同的步骤，而这种步骤往往可从常规加工技术选择。此外，这 可给可食用产品提供更好的感官和营养特性；
—由于可将不同的亚致死处理进行组合使用，使细菌变成非活 细菌，因此不必要仅依靠通常消费者接受性低的处理如辐射。
因此，本发明的第二个方面提供可按本发明第一个方面获得的可 食用产品。
优选地，可食用产品是食物或饮料产品。
本文所用的“益生细菌”是指当以足够的量给予消费者时能赋予 消费者健康益处的细菌。
本文所用的术语“健康益处”是指提高或维持个体的至少一个方 面的健康。
本文所用的术语“非活细菌”是指在任何已知条件下不能够进行 复制的细菌的群体。但是应认识到，由于群体中正常的生物变异，群 体的一小部分(即5％或以下)可能仍是活的，因此能够在原本被定义为 非活群体的细菌群体中在合适的生长条件下进行复制。细菌群体的活 菌百分数可借助本领域公知的细菌计数方法来测定(参见实施例)。这 些方法优选采用受试细菌的最优生长条件(生长培养基、温度等)。
本文所用的术语“活细菌”是指在复制可能进行的合适条件下能 够进行复制的细菌的群体。但是应认识到，由于群体中正常的生物变 异，群体的一小部分(即5％或以下)可能仍是非活的，因此不能够在原 本被定义为活群体的细菌群体中在这些条件下进行复制。
本文所用的术语“接触”是指通过任何合适的手段使细菌和可食 用产品或其至少一种配料相互间发生直接接触。
本文所用的术语“亚致死处理”是指这样的处理，在该处理下细 菌的群体受到损害，但作为一个群体尚不完全失去其复制能力，使得 该能力至少部分上得到保持或者能在该类型的细菌的合适生长条件 下得到恢复。
本发明的两种或多种亚致死处理的组合导致细菌群体的至少 95％变成非活。优选地，上述亚致死处理的组合导致细菌群体变成非 活。
本文所用的术语“合适的生长条件”是指给定细菌株会发生复制 的条件，它是pH、培养基和温度的组合，在这一组合下，活体形式 的所述菌株的稀释液(比如每克约106个细菌)通常会在正常的生长期 内生长至每克至少108个细菌的密度。
本文所用的术语“致病细菌”是指能够在具有免疫能力的宿主中 引起感染或者能够在合适条件下使得这种宿主中毒的细菌。
本文所用的术语“非致病细菌”是指不能够在具有免疫能力的宿 主中引起感染或者不能够在合适条件下使得这种宿主中毒的细菌。
本文所用的术语“实质上结构完整”是指非活细菌的完整性仍足 以避免或延迟在肠道远端中的碎裂，从而使得非活细菌(的保守结构) 能够与免疫系统特别是黏膜免疫系统发生相互作用。
本文所用的术语“每份”是指特定的可食用产品特别是食物或饮 料产品的、被预定用来或被包装用来在单次就餐中消费的数量。因此， 产品也可包装成多份部分(multiple serving portion)。
术语“包含”是指并不局限于任何其后所陈述的要素(element)， 而是还涵括具有或大或小的功能重要性的未指明要素。换句话说，所 列举的步骤、要素或选项并不需要穷举。当使用到“包括”或“具有” 这样的词语时，它们的意思与以上定义的“包含”相当。
除了在操作和比较实施例中以外，或者除非另有明确指明，本说 明书中所有说明材料数量或反应条件、材料物理特性和/或用途的数 字，都应理解为被词语“约”所修饰。所有的量都基于相关产品的总 重量以重量计，除非另有指明。
所有百分比都基于组合物的总重量以重量计，除非另有规定。
有关本发明上述的和其它的特征和优点的更完整的说明，请参考 以下对本发明优选实施方案的描述。这些优选实施方案适用于本发明 的所有方面，适当时可应用于每个方面，除非上下文另作要求。
发明详述
亚致死处理
根据本发明，在可食用产品的制备过程中使能给其消费者提供健 康益处的细菌经历至少两种亚致死处理，每种亚致死处理就其本身而 言并不足以使细菌变成非活细菌。这些处理可在将细菌掺入到可食用 产品中之前进行，例如对细菌或者细菌和一种或多种食物配料的混合 物进行处理。同样，可以在制备过程的不同阶段使细菌经历亚致死处 理，例如首先对细菌进行处理，然后对含有处理过的细菌的可食用产 品进行处理。
任何合适的亚致死处理都可按本发明进行使用。“Basic aspects of food preservation by hurdle technolo gy”，Leistner.，L.Int Journal of Food Microbiology 55(2000)181-186和“Combined methods for food preservation”，Leistner.，L1999，Handbook of Food Preservation，Shafiur Rahman.，M.(编辑)Marcel Dekker，New York，457-485公开了可以使 用的合适的亚致死处理，这两篇参考文献通过引用结合到本文中。
通常，本发明方法采用至少两种亚致死处理，其中至少一种亚致 死处理当作为对活细菌的单个处理来应用时，能使所述活细菌的复制 能力减少至少5％。因此，本发明方法优选包括使活细菌经历至少两 种亚致死处理，其中至少一种亚致死处理能够使(原始)活细菌的复制 能力减少至少5％，优选至少10％。细菌群体的复制能力适于通过上 文提到的细菌计数方法来测定。
本发明人出人意料地发现，通过使细菌经历一种几乎不会(或者 不会)影响其复制能力的亚致死处理和另一种会使(原始)活细菌的复 制能力减少至少5％(例如小于5-50％)的亚致死处理，可以有效地使该 细菌变成非活细菌。具体的说，发现将就其本身而言几乎不会影响细 菌的复制能力的低pH与另一种能够使复制能力减少至少5％的亚致死 处理进行组合使用，可使细菌变成非活细菌。优选地，这些亚致死处 理至少部分上同时进行。
根据一个特别优选的实施方案，本发明方法采用至少两种亚致死 处理，每种处理就其本身而言能够使(原始)活细菌的复制能力减少至 少5％，优选至少10％。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法采用两种或多种亚致死 处理，每种处理就其本身而言能使活细菌的复制能力减少不超过60％， 优选不超过50％。在另一个优选的实施方案中，本发明方法采用两种 或多种亚致死处理，其中每种亚致死处理所观察到的复制能力减少百 分数之和不超过60％，更优选不超过50％。符合这个要求的方法的一 个实例是这样的方法，它采用一种其本身能造成复制能力减少例如 10％的亚致死处理和另一种其本身能造成复制能力减少例如5％的亚 致死处理。虽然这两种亚致死处理的复制能力减少百分数之和只是 15％，但根据本发明，所述处理的组合能造成复制能力的总减少百分 数为例如95％或更高。
根据本发明的另一个优选实施方案，本发明方法包括：
a)使能提供所述健康益处的活细菌经历至少两种亚致死处理，然 后将因此所产生的非活细菌与可食用产品或其至少一种配料接触，或 者
b)使能提供所述健康益处的活细菌与可食用产品接触，然后使 包含活细菌的可食用产品经历至少两种亚致死处理，或者
c)使能提供所述健康益处的活细菌与可食用产品的至少一种配 料接触，然后使活细菌和所述配料的混合物经历至少两种亚致死处 理。
优选两个或多个亚致死处理步骤的每一个独立选自：
(i)施加压力
(ii)调节pH
(iii)调节渗透压
(iv)加热
(v)均质化
(vi)冷冻-解冻循环
(vii)喷雾干燥
(viii)添加一种或多种具有杀细菌作用的物质。
(ix)施加脉冲电场
执行各亚致死步骤的每一个的备选合适条件是本领域技术人员 公知的。优选亚致死处理独立选自以下：
(i)在-30℃-25℃下施加150Mpa-400Mpa的压力20-60秒钟，
(ii)将pH调节到pH3-5、优选pH4-5或者pH8-9的范围，
(iii)加入适量的碱金属盐或碱土金属盐调节渗透压，
(iv)加热到比细菌的最佳生长温度超出10℃-25℃、优选10 ℃-15℃的温度保持1-5分钟，
(v)在比细菌的最佳生长温度超出10℃-15℃的温度下和在 20-30巴的压力下均质化1-5分钟，
(vi)进行冷冻步骤然后是解冻步骤，持续5-25个循环，
(vii)加入适量的一种或多种具有杀细菌作用的物质，所述物质选 自山梨酸钠、溶菌酶和乳链菌肽，
(viii)在10℃-15℃的温度下以15-100kV/cm施加脉冲长度为 1-10μs的脉冲电场。
还有一种亚致死处理可以是使用辐射，条件是辐射处理得到控制 而获得亚致死结果。亚致死辐射处理的合适条件包括用137Cs辐射源 在0.1-1兆拉德下以8Gy/min的剂量率进行辐射过夜。但是，优选本 发明的亚致死处理不包括超过一次的亚致死辐射处理。
有益细菌
任何能给其消费者提供健康益处的细菌都可以按本发明进行使 用。这些有益作用优选包括免疫调节特性和抗炎特性。
根据本发明，优选健康益处是益生作用，因此优选细菌是益生细 菌。还优选细菌是非致病细菌。
按本发明进行使用的益生细菌可以是任何常规的益生细菌。优选 益生细菌选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属 (Propionibacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属 (Streptococcus)、乳酸球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、足 球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属 (Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、酒球菌属(Oenococcus)和乳酸 杆菌属(Lactobacillus)，其中最优选乳酸杆菌属和双歧杆菌属。
可以使用的益生细菌的合适类型包括：纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(B. animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、分叉双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双 歧杆菌(B.infantis)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、 屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大 肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳 杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、发 酵乳杆菌(L.fermentum)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L. helveticus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、乳酸乳球菌(L.lactis)、类干酪 乳杆菌(L.paracasei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、路氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳 杆菌(L.salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Lactococcus cremoris、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌 (Leuconostoc lactis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球 菌(P.cerevisiae)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)、薛氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)。
按本发明合适的具体益生菌株是：Lactobacillus casei shirota、 Lactobacillus casei immunitas、干酪乳杆菌DN-114001、鼠李糖乳杆菌 GG(ATCC53103)、路氏乳杆菌ATCC55730/SD2112、植物乳杆菌 HN001、植物乳杆菌299v(DSM9843)、约氏乳杆菌La1(I-1225 CNCM)、植物乳杆菌WCFS1、瑞士乳杆菌CP53、乳双歧杆菌HN019、 动物双歧杆菌DN-173010、动物双歧杆菌Bb12、婴儿双歧杆菌35624、 干酪乳杆菌431、嗜酸乳杆菌NCFM、路氏乳杆菌ING1、唾液乳杆菌 UCC118、Propionibacterium freudenreichii JS、Escherichia coli Nissle 1917。
应认识到，任何上述细菌都可以是经过遗传修饰的细菌，或者它 们可以是工业过程中常用的食品级细菌。
优选，能(给其消费者)提供健康益处的非活细菌在可食用产品中 的数量为每份106-1011个，更优选每份107-1010个，最优选每份或每 100克产品108-1010个。各种产品的每份大小在表1中给出。
根据一个实施方案，按本发明使用的细菌可以是从另一个食品加 工操作的废液流回收的细菌。
可以通过任何合适的手段使细菌与可食用产品或其一种或多种 配料接触，例如将细菌单独或与另一配料一起(例如作为溶液)，与可 食用产品或其一种或多种配料混合或者作为包衣涂覆到可食用产品 或其一种或多种配料。例如，在制备焙烤产品的过程中，可将非活细 菌添加到面团中，然后在炉子中焙烤面团制成终产品。在另一个实例 中，可将非活细菌添加到冰预混合料(ice-premix)中，然后(任选)进行 热处理和冷冻，以生产出冷冻甜点。或者，特别是在细菌与可食用产 品或其配料接触前已被变成非活细菌的情况中，可通过合适的包装使 细菌与产品/配料接触。这可以例如这样实现：使非活细菌存在于产品 包装的一部分上(例如吸管或容器盖)，使得产品从包装中出来时产品/ 配料接触到非活细菌。
细菌的有益作用
本发明的非活细菌的完整性足以避免或延迟在肠道远端中的碎 裂，从而使得其所谓的保守微生物模式例如细胞壁组分(如脂多糖、脂 磷壁酸、肽聚糖和非甲基化DNA)能够与(黏膜)免疫系统的所谓模式识 别受体(如Toll样受体和Nod受体)发生相互作用。这些相互作用可导 致免疫功能得到有益调节，而这又可导致例如对感染的抗性增加，炎 性反应和过敏得到抑制或自身免疫疾病得到减轻或预防。关于Toll样 受体的作用的说明在Pasare.，C等，Adv Exp Med Boil.2005；560：11-8 这篇参考文献中给出。
可食用产品
本发明的可食用产品可以是任何可食用产品，包括食物和饮料产 品以及食物补充物(预定作为补充物与其它食物一起来食用，而不是作 为食物产品本身来消费)。食物补充物的实例有维生素、矿物质补充物 等等。根据本发明，优选可食用产品是食物或饮料产品。
根据本发明可制备出不同类型的食物产品，例如用于体重控制计 划(weight control programme)的膳食替代品(meal replacer)和其它产品、 炖品(stew)、面条、冰淇淋、沙司、调味品(dressing)、调味料(seasoning)、 涂抹料(spread)如人造黄油、小吃、谷物(包括谷物产品如粥)、饮料(包 括含水果和/或蔬菜的饮料)、甜味或风味花饰(sweet or savoury decoration)、面包和面包产品、饼干和其它焙烤产品、糖果、方条状 产品(bar product)、巧克力、口香糖和乳制品。根据本发明可制备出不 同类型的饮料，例如汤、即饮饮料和粉末饮料。饮料可以是基于蛋白 质的饮料，如基于乳品或大豆的饮料产品，或者可以是不基于蛋白质 的软饮料。
表1示出多种可按本发明进行制备的产品及其典型食用份量。
表1
  产品 典型食用份量 人造黄油和其它涂抹料 15g 冰淇淋和其它冷冻糖食产品 150g 调味品和调味液(dip) 30g 方条状产品和小吃，包括膳食替代产品 75g 膳食替代饮料 330ml 饮料一客产品(beverage shot product)，包括基于水 果和蔬菜的一客饮料产品 100ml 饮料(非膳食替代饮料或一客饮料产品) 200ml 饼干 20g 酸奶酪和其它基于乳品或大豆的甜品 150g
根据一个用pH调节作为一种亚致死处理的实施方案，本发明特 别适用于制备具有这样的pH的可食用产品：能提供健康益处的细菌 在该pH下通常是不稳定的。具体的说，本发明可优选用于制备pH为 4或以下、例如3.8-2.0、更优选3.5-2.5、最优选3.3-2.8的可食用产品。 这种产品的实例是饮料，例如一些软饮料如可乐类型的软饮料，或者 水果/蔬菜汁或基于水果/蔬菜的饮料如柠檬汁或橙汁。
因此，本发明的另一个方面涉及由本发明方法制备的、pH为4 或以下的可食用产品。
或者，本发明可优选用于制备pH为5.0或以上、例如5.0-10.0、 更优选5.1-8.0、最优选5.2-7.0的食物产品。这种产品的实例是例如沙 司、奶、人造奶油、焙烤食品、膳食替代品、冰淇淋等。
可食用产品可包含发酵来源。例如，本发明的食物产品可以是在 按本发明添加细菌之前已经过发酵，如盐腌蔬菜或各种各样的土产食 品(indigenous food)。
人造黄油和其它涂抹料
人造黄油通常是水包油型或油包水型乳液，同时包括实质上不含 脂肪的涂抹料。通常，这些产品在使用温度下(例如2-10℃)可以涂抹， 但不可倒出。脂肪水平的变动范围可以很大，例如全脂肪人造黄油含 有60-90wt％的脂肪，中脂肪人造黄油含有30-60wt％的脂肪，低脂肪 人造黄油含有10-30wt％的脂肪，极低脂肪或无脂肪人造黄油含有 0-10wt％的脂肪。
人造奶油或其它涂抹料中的脂肪可以是任何可食用脂肪，常用的 是大豆油、菜籽油、葵花籽油和棕榈油。脂肪可以原样使用，或者以 修饰形式例如氢化、酯化、精炼等形式使用。其它合适的油是本领域 公知的，可按需选择。
人造黄油或涂抹料的pH可优选为5.0-6.5。
人造黄油以外的涂抹料的实例是干酪涂抹料、糖果涂抹料、酸奶 酪涂抹料等。
涂抹料的任选的其它配料可以是乳化剂、着色剂、维生素、防腐 剂、树胶、增稠剂等。产品的其余部分通常是水。
人造黄油或其它涂抹料的典型平均份量大小是15克。
冷冻糖食产品
出于本发明的目的，术语冷冻糖食产品包括含乳冷冻糖食，如冰 淇淋、冷冻酸奶酪、冰糕(sherbet)、清凉果汁饮料(sorbet)、牛冻奶(ice milk)和冷冻蛋奶甜羹(custard)、水冰(water-ice)、格兰尼它冰糕(granita) 和冷冻果泥。
优选地，冷冻糖食中的固形物(例如糖、脂肪、调味料(flavouring) 等)水平超过3wt％，更优选10-70wt，例如40-70wt％。
冰淇淋通常会包含2-20wt％的脂肪、0-20wt％的甜味剂、2-20 wt％的脱脂乳成分和任选的成分如乳化剂、稳定剂、防腐剂、调味配 料、维生素、矿物质等，其余的是水。通常，冰淇淋会进行充气至例 如20-400％、更通常40-200％的膨胀度，且进行冷冻至-2～-200℃、 更通常-10～-30℃的温度。冰淇淋包含的钙通常为约20wt％的水平。
冷冻糖食材料的典型平均份量大小是150克。
调味品(dressing)和调味液(dip)
通常，调味品(包括蛋黄酱(mayonnaise))或调味液是水包油型乳 液。乳液的油相通常占产品的0-80wt％。取决于调味品或调味液的类 型，脂肪水平通常为10-80％。低脂肪或无脂肪调味品可例如含有0、 5、10、15％(重量)的甘油三酯水平。
调味品和调味液通常是低pH产品，优选pH为2-6。
调味品或调味液可任选含有其它配料，如乳化剂(例如蛋黄)、稳 定剂、酸化剂、生物聚合物、疏松剂、香料(flavour)、着色剂等。组 合物的其余部分是水，水可优选以0.1-99，9wt％、更通常20-99wt％、 最优选50-98wt％的水平存在。
调味品或调味液的典型平均份量大小是30克。
小吃和方条状产品，包括膳食替代性小吃和方条状产品
这些产品往往包含可食用材料构成的基质(matrix)，细菌可掺入到 其中。例如，所述基质可以是基于脂肪(例如巧克力层(couverture)或巧 克力)，或者可以是基于焙烤产品(面包、面团、小甜饼(cookie)等)，或 者可以是基于成团颗粒(大米、粮食、坚果、葡萄干、水果颗粒)。
还有另外其它的配料可加入到产品，如调味材料、维生素、矿物 质等。
膳食替代性饮料和其它饮料(包括饮料一客装产品)
可优选将非活细菌包括在饮料中，例如汤、水果和/或蔬菜汁、软 饮料、奶基饮料和大豆基饮料等。根据本发明优选饮料是茶基饮料和 膳食替代性饮料。这些产品在下文中将作更详细描述。显然的是，类 似的水平和组成适用于根据本发明的其它饮料。
出于本发明的目的，术语茶基产品指含有茶叶或代茶草药组合物 (herbal composition)的产品，例如袋泡茶、片茶(leaf tea)、袋泡草药茶 (herbal tea bag)、草药浸剂(herbal infusion)、茶粉、草药茶粉、冰茶、 冰草药茶、充碳酸气冰茶、充碳酸气草药浸剂等。
通常，本发明的一些茶基产品在临消费前可能需要一制备步骤， 例如将袋泡茶、片茶、袋泡草药茶或草药浸剂进行泡茶，或者将茶粉 或草药茶粉进行溶解。对于这些产品，优选对产品中的非活细菌水平 进行调整，使得每份待消费终产品具有上述所需的细菌水平。
对于冰茶、冰草药茶、充碳酸气冰茶、充碳酸气草药浸剂，典型 的份量大小将是200ml。饮料一客产品是这样的饮料，它们具有浓缩 水平的至少一种活性配料，使得它们以较小的体积就能带来该活性配 料的全部好处，因此它们单份数量通常比其它类型的饮料要少，典型 的每份大小是100ml。
膳食替代性饮料通常基于液体基料，该基料可例如通过树胶或纤 维进行增稠，且可加入矿物质和维生素的混合料(cocktail)。可将饮料 调味成所需的味道，例如水果或巧克力风味。典型的每份大小可以是 330ml。
对于要进行提取来获得终产品的产品来说，通常目标是确保每份 产品包含上述的所需数量。在此意义上，应认识到，待提取茶基产品 中存在的非活细菌通常只有一部分会最终被提取到茶饮料终产品中。 为补偿这一结果，通常需要在待提取产品中掺入的细菌量为提取物中 需要有的细菌量的大约2倍。
对于片茶或袋泡茶，通常是用1-5克茶叶来制备200ml的单一份 量。
如果使用袋泡茶，可优选将乳酸杆菌属细菌掺入到茶叶成分中。 但是应认识到，对于一些应用来说，优选做法可以是使非活细菌与茶 叶分开，例如将非活细菌掺入到袋泡茶的单独隔室中，或者将它施加 到袋泡茶包装纸上。
饼干
本发明的饼干按照需要可以是任何类型的饼干。本发明的非活细 菌可以作为饼干本身的一部分包括在内，或者作为饼干的花饰、包衣 或馅料。饼干的典型份量大小是20g。
酸奶酪和其它奶基或大豆基甜点
本发明的酸奶酪和其它奶基或大豆基甜点按照需要可以是任何 类型的酸奶酪和其它奶基或大豆基甜点。这些产品可以由本发明非活 细菌之外的其它细菌进行发酵。或者，它们可至少部分上由本发明的 有益细菌在其被变成非活细菌之前进行发酵。这些甜点的典型份量大 小是150g。
现将用以下实施例对本发明作进一步的说明。落入本发明范围内 的更多实施例对本领域技术人员是显而易见的。
实施例
实施例1
将路氏乳杆菌SD2112在按以下程序制备的“特殊MRS(Special MRS)”中进行培养。用浓HCl将MRS(Merck，德国)培养基酸化至 pH3.0，以使蛋白质沉淀。将此溶液在5℃下储藏过夜后，5000rpm 下离心10分钟。用0.2μm瓶顶(bottletop)过滤器过滤上清液，将 pH调节到MRS的原始值(pH5.7±0.2)。用连接到无菌瓶的0.1μm瓶 顶过滤器将此溶液进行过滤除菌，(使用前)在5℃下储藏。
给10ml特殊MRS接种上0.5％的路氏乳杆菌SD2112培养物， 该培养物是在脱脂奶中培养成完全生长的培养物后用无菌10％甘油稀 释至6％甘油终体积于-80℃下进行储藏。将路氏乳杆菌SD2112在 37℃下预培养过夜。最终培养在含有250ml特殊MRS的300ml烧 瓶中进行。将烧瓶接种上5ml的预培养物，37℃下温育24小时。
培养后，将培养基在几个50ml无菌Falcon管中离心(5000rpm， 5分钟)，将各管沉淀物集中在一个管中，用蛋白胨生理盐(PPS，Tritium， 荷兰，0.1％蛋白胨，0.85％NaCl)溶液洗涤两次。随后将沉淀物重悬于5 ml PPS中。此细胞浓缩物用于更进一步的处理。
向灭过菌的5ml玻璃管充入2.7ml PPS(或者在进行pH处理的 情况下充入2.7ml乙酸溶液)。乙酸溶液(HAc，pH3)是通过将13μl乙 酸(100％)加入到40ml脱矿质水中来制备。用浓HCl将此溶液的pH 调节至pH3，用0.2μm过滤器进行过滤除菌。此溶液中未离解酸的 含量为0.3g/l。
向PPS(或HAc)中加入0.3ml细胞浓缩物。将样品混合，进行表 1所示的不同处理。
表1
  步骤1 步骤2 步骤3 1 65min RT(1) - - 2 65min HAc(pH3) - - 3 60min RT 5min60℃(2) - 4 55min RT 10min乳链菌肽(3) - 5 35min RT 30min100℃(2) - 6 60min HAc(pH3) 5min60℃ - 7 50min RT 5min60℃ 10min乳链菌肽
(1)RT＝室温
(2)经历过热处理的样品在融化的冰中冷却2分钟后再作进一步的处 理。
(3)从新鲜制备的乳链菌肽储备溶液(100ppm)取30μl乳链菌肽加入， 该储备溶液是将250mg乳链菌肽(Sigma，德国，2.5％，猪)溶于50ml PPS中进行制备。溶液用0.2μm过滤器除菌，5℃下储藏。
所有样品除100℃样品外，在处理后直接在PPS中稀释至10-8 稀释度，100℃样品稀释至10-3稀释度。对于100℃样品之外的所有 样品，将10-5-10-8稀释液放入平皿中(100℃样品为10-1-10-3稀释液)， 将50℃的MRS琼脂加入到平板中(倾注法)。琼脂凝结后，将平板在 37℃下厌氧温育至少2天。
所有处理的10-3稀释液(PPS中)用于流式细胞术测量。这些10-3 样品每个取1ml加入到4ml无菌塑料管中的5μl碘化丙锭(PI)中，混 合并温育5分钟，然后进行流式细胞术测量。PI只会进入渗漏的细胞， 因此是益生细菌发生损伤的量度标准。平板培养的结果、每ml活细 胞的数量(菌落形成单位)和渗漏细胞的百分数在表2中给出。
表2
  样品 活菌计数(CFU/ml) PI染色 1 未处理 3.0·109 0.5 2 30min100℃ ～103 97 3 对照60℃ 2.6·109 0.9
  4 对照pH3 2.8·109 0.6 5 对照1ppm乳链菌肽 0.9·109 40 6 pH3+60℃ 1.3·108 40 7 60℃+1ppm乳链菌肽 <1·104 58
从这些结果得出结论，只有经历过两种亚致死处理的细胞才能够 吸收大量的碘化丙锭。此外，结果显示，即使两种亚致死处理的每一 种本身对活细菌的生存力只有有限的影响，但它们的组合却能使活细 菌变成非活细菌。
实施例2
可使选定的益生细菌株(例如路氏乳杆菌SD2112、鼠李糖乳杆菌 HNOO1、植物乳杆菌WCFS1、德氏乳杆菌LMG6891、Lcasei immunitas、乳双歧杆菌Bb-12)暴露于两种或多种不同的亚致死处理， 这些处理组合在一起能使细菌变成非活细菌，而又不会失去其全部益 生特性。
可使浓度为106-108cfu/ml的活益生细菌：
1)保持未处理(阳性对照)，或者
2)在100℃下温育30分钟(阴性对照)，或者
3)暴露于以下亚致死处理组合：
3.1加热到超过最佳生长温度15℃的温度保持5分钟，然后立 即加入0.1-1ppm溶菌酶、0.9mM-5mM山梨酸钠或0.05-1ppm乳链 菌肽中的至少一种，或者
3.2加热到超过最佳生长温度15℃的温度保持5分钟，然后立 即在5℃下施加150Mpa-400Mpa的压力保持20-60秒钟，或者
3.3.加热到超过最佳生长温度15℃的温度保持5分钟，然后立 即在10℃下以5-100kV/cm施加脉冲长度为1-10μs的脉冲电场，或 者
3.4加入0.1-1ppm溶菌酶、0.9mM-5mM山梨酸钠或0.05-1ppm 乳链菌肽中的至少一种，然后立即在5℃下施加150Mpa-400Mpa 的压力保持20-60秒钟，或者
3.5加入0.1-1ppm溶菌酶、0.9mM-5mM山梨酸钠或0.05-1ppm 乳链菌肽中的至少一种，然后立即在10℃下以15-100kV/cm施加脉 冲长度为1-10μs的脉冲电场。
在进行了上述的两亚致死处理步骤组合3.1-3.5的任何一个及对 照处理1和2后，可将益生细菌在合适的稀释培养基中进行系列稀释， 然后接种在选择性琼脂培养基上37℃厌氧培养24小时，对益生细菌 进行计数，以评估菌落形成单位的残余数量，从而核实使益生细菌变 成非活细菌的效率。其它等分试样可用来例如通过琼脂糖凝聚电泳或 本领域技术人员公知的其它合适方法评估DNA的完整性，和/或等分 试样可用来比较不同益生细菌制品的免疫调节活性。
评估免疫调节活性的一个实例是将得自人志愿者血液的外周血 单核细胞(PBMC)与不同益生细菌制品的系列稀释液一起，或者与 0.1-10μg/mL的从各种益生细菌制品分离的DNA一起，温育不同的时 间(24-48小时)。可将由这些制品与刚分离的人PBMC的相互作用引 发的信号转导事件，评估为各种激酶的激活，NFκB的转位，或通过 所产生的下游作用如细胞因子产生进行评估。
尽管应承认，不同益生细菌株对不同的亚致死处理组合的敏感性 可能不同，但一般导则是热处理过的益生细菌(上述处理2)和按本发明 处理过的益生细菌(上述处理3.1-3.5)被变成非活细菌。此外，未处理 过的益生细菌(处理1)和按本发明处理过的益生细菌(上述处理3.1-3.5) 保持至少一些对人PBMC活性的调节作用。这表明经历过本发明亚致 死处理(上述处理3.1-3.5)的益生细菌当随食物产品给予时，可发挥有 益的益生作用，而又不会带来任何因使用活益生细菌而引起的问题。 但是，当细菌通过致死处理如常规的热处理(处理2)变成非活细菌，情 况却不是如上所述的情况。
实施例3
优选将按以上实施例2处理3.1-3.5所述制备的益生细菌株制品， 后添加(post-added)到基于水果和蔬菜提取物或基于大豆蛋白质的浓 缩饮料(一种所谓的“一客饮料(shot)”产品)中，以给该一客饮料产 品增添益生益处，而又不会因益生细菌的后酸化作用改变产品的感官 和口味特性。