铁是一种动物和人类营养必需的微量元素。它是血红蛋白中血红 素的组分，并且是肌红蛋白、细胞色素和几种酶类的组分。铁的主要 作用是参与氧的运输、储存和利用。铁不足是贫血高发的主要原因， 尤其在儿童、青少年和妇女更为常见。对足量铁的需求贯穿于人类的 一生中。
不过，人体不产生铁，完全依赖于外源铁如营养和添加剂的供 给。一般来说，推荐的每天铁吸收允许量大约是每天10mg。不过， 需要量还依赖于年龄和性别。儿童、过了绝经期的妇女和怀孕及哺乳 的母亲对铁有更高的需求。
因此，铁缺乏基本上是营养问题，这不仅仅是发展中国家普遍的 问题。该问题容易通过天然提供适量铁的消费食品解决，但在不发达 社会中经常是不可能的。另外，一般在发达国家消费的许多食品也含 铁不足。
为提供铁源，许多食品和饮料添加铁。一般来说，添加时所用的 铁源是可溶的铁盐，如硫酸亚铁、乳酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸 亚铁、柠檬酸铁、柠檬酸胆碱铁和柠檬酸铁铵。尤其是硫酸亚铁因其 良好的生物利用度，应用更为普遍。不幸的是，铁添加物特别是硫酸 亚铁添加物，具有有害的影响。尤其是，由于能与多酚和脂类相互作 用并促进破坏性自由基反应，铁经常引起脱色和丧失味道。这种情况 特别在高温以及氧和光线的存在下出现。
例如，把可溶性铁源加到巧克力奶粉中，当用水或奶重新溶解 时，引起该饮料变成暗灰色。一般认为，这是因为铁与铁敏感的成分 如多酚相互作用引起的。而且，把可溶性铁源加到奶、谷物和其他含 脂肪的产品中，最常见的是含高水平的不饱和脂肪酸的产品，由于脂 质氧化引起味道的改变。脂质氧化不仅影响食品和饮料的味觉感受特 性，而且还令人讨厌地影响这些产品的营养质量。在热处理如巴氏灭 菌法或灭菌法中，也能加强这些相互作用。此外，某些铁盐体系的pH 可能不和其他成分兼容，或者可能影响味道。另外，从技术观点来看， 可溶性铁盐能引起处理设备的腐蚀。
不幸的是，不溶或轻微可溶的铁源，例如元素铁、焦磷酸铁，生 物利用度不够。因此，尽管它们可能微弱或不引起脱色和丧失味道的 问题，但它们很难被人体吸收。
为了解决这些问题，已经出现几种囊化或复合可溶铁源的方法， 这些方法降低它们的反应性但仍保留其生物利用度。不过，这些方法 没有完全取得成功。
在美国3,992,555号专利中，描述了囊化铁源的一个实施例，在 该专利中，用一种可食用能代谢的脂肪包被铁，该脂肪的熔点大约为 38-121℃。氢化并精制的植物油，尤其是来自完全氢化棉子油的提取 单酸甘油酯，据描述适用该方法。尽管这种铁的囊化方法导致了其生 物利用度降低大约20％，假如所用的铁源具有足够良好生物利用度， 据述该方法是可以接受的。不过，主要问题是，如果食品必须经过任 何形式的粗级处理，就会毁坏所述的包囊。结果，该囊化铁不能用于 需要提纯或进行其它形式粗级处理的产品中。
铁复合体的一个早期实施例在美国专利505,986号中有描述。该 复合物是一种铁白蛋白制备物。所述的白蛋白是完整但热凝结的形 式。该复合物作为沉淀物重新获得。不过，当这些铁白蛋白复合物被 用于饮料时，确实发生了脱色和氧化。例如，用铁白蛋白复合物增强 的巧克力饮料变成灰色。
在美国3,969,540号专利中，描述了铁复合物的最近实施例，在 该专利中，以亚铁形式的铁与水解酪蛋白或水解肝粉复合。也提到了 作为可能配体的各种其他水解蛋白。所述的复合物作为不可溶的沉淀 物收集。令人遗憾的是，在该复合物中的铁不可能具有可接受的生物 利用度。
在美国4,172,072号专利中，进一步描述了铁复合物的实施例， 在该专利中，铁与基本上完全水解的胶原复合。也提到了作为可能配 体的各种其他水解蛋白。不过，据述该复合物在酸性条件下稳定；由 于在食道中是酸性的，该复合物中的铁不可能具有可接受的生物利用 度。此外，该复合物不足以防止脱色和脂质氧化。
在美国4,216,144号专利中，进一步描述了实施例，在该专利中， 亚铁形式的铁与水解蛋白尤其是大豆蛋白复合。在该复合物中，铁生 物利用度据称比硫酸亚铁更好。不过，当把该大豆水解物亚铁复合物 用于饮料时，确实发生了脱色和氧化。例如，用大豆水解物亚铁复合 物增强的巧克力饮料变成灰色。
在日本2-083333和2-083400号专利申请书中，描述了铁复合物 的其他实施例。在这些申请书中，酪蛋白化的亚铁复合物被用于治疗 贫血。不过，这些复合物不适用于强化食品和饮料，因为它们不够稳 定。此外，这些复合物是凝结物的形式，难以分散。
因此，本发明的目的是提供一种铁强化体系，该体系相对稳定但 其中的铁具有相对的生物利用度。
本发明概述
因此，在一方面，本发明提供一种铁-蛋白水解复合物，该复合 物包括与分子量范围大约为500-10 000的部分水解卵清蛋白螯合的 亚铁离子。
令人惊奇地发现，来自以亚铁形式的铁与部分水解的卵清蛋白形 成的复合物非常稳定。事实上，所述的复合物足够稳定，适用于含脂 类和多酚的甑馏(retorted)提纯产品中。不过，尽管具有稳定性， 复合物中的铁基本上与明显良好的硫酸亚铁相同的生物利用度。
优选地，部分水解卵清蛋白拥有的分子量范围大约为2 000- 6 000。
在另一方面，本发明提供一种铁-蛋白水解复合物，该复合物包 括与用微生物蛋白酶部分水解的卵清蛋白螯合的亚铁离子。
优选地，所述的微生物蛋白酶是一种从米曲霉(Aspergillus oryzae)中获得的，含有内肽酶和外肽酶的真菌蛋白酶。
在另一方面，本发明提供一种铁-蛋白水解复合物，该复合物包 括与部分水解的卵清蛋白螯合的亚铁离子。所述的复合物含有干重大 约为1％-2％或大约为4.5％-10％的亚铁离子。
优选地，该复合物在中性的pH中稳定，但在低于3的pH中解离。
仍是另一方面，本发明提供一种含脂和稳定的铁强化体系的无菌 液体饮料，所述的铁强化体系包括一种与部分水解的卵清蛋白螯合的 亚铁离子的铁-蛋白水解复合物。所述的饮料可以是含巧克力的饮 料。
仍是另一方面，本发明提供一种含多酚和稳定的铁强化体系的无 菌液体饮料，所述的铁强化体系包括一种与部分水解卵清蛋白螯合的 亚铁离子的铁-蛋白水解复合物。所述的饮料可以是茶饮料。
所述的饮料可以甑馏提纯法或超高温度巴氏灭菌法灭菌。
本发明也提供一种含脂和稳定的铁强化体系的饮料粉末，所述的 铁强化体系包括一种与部分水解的卵清蛋白螯合的亚铁离子的铁-蛋 白水解复合物。所述的饮料粉末可以含有巧克力。
在进一步方面，本发明提供一种制备铁强化体系的方法，该方法 包括：
优选地在酸性条件下，用微生物蛋白酶优选的是酸性真菌蛋白 酶，酶水解卵清蛋白，以提供部分水解的卵清蛋白；
在酸性条件下，把亚铁源加到部分水解的卵清蛋白中；然后
提高pH到6.5-7.5，形成一种作为铁强化体系的水解卵清蛋白亚 铁复合物。
部分水解的卵清蛋白在加入亚铁源之前，可以实行进一步的水 解。优选的真菌蛋白酶是从米曲霉中获得，并且含有内肽酶和外肽 酶。
所述的方法也包括如下步骤，把水解卵清蛋白亚铁复合物干燥成 粉末。
优选实施方案详述
现在本发明的实施方案仅以举例的方式描述。
本发明基于如下的发现，部分水解的卵清蛋白能与亚铁离子形成 牢固的复合物，而以生物可利用的方式提供铁。所得到的铁复合物， 降低了引起诸如脂质氧化、颜色破坏和维生素C降解等有害影响的可 能性。这使该铁复合物成为一种理想的载体，用于强化食品和饮料； 尤其是用于期望改善营养状态的食品和饮料。
可用在铁复合物中的铁源，可以是任何食品级的亚铁盐，如硫酸 亚铁、氯化亚铁、硝酸亚铁、柠檬酸亚铁、乳酸亚铁或富马酸亚铁， 或其混合物。不过，优选的铁源是硫酸亚铁。所述的铁源优选地以亚 铁溶液的形式提供。
通过制备部分水解的卵清蛋白，在酸性条件下加入铁源，然后调 至中性，制备所述的铁复合物。
部分水解的卵清蛋白应该这样，其蛋白级分的分子量范围大约为 500-10000；优选的大约2000-6000。已经发现，从完整的卵清蛋白 或完全水解的卵清蛋白制备的铁复合物并不足够牢固。不过，从部分 水解的卵清蛋白制备的铁复合物极为稳定。
作为常规的一步或多步方法，进行卵清蛋白的水解。不过，当水 解程序包括在酸性培养基中用酸性蛋白酶的酶水解步骤时，获得最好 的结果。合适的酸性蛋白酶可从商业途径得到。特别合适的酸性蛋白 酶，可以通过如米曲霉等真菌的控制发酵获得。这些蛋白酶含有内肽 酶和外肽酶。上述酸性蛋白酶的一个实例是VALIDASE FP-60(可从 Valley Research，Inc.，South Bend，Indiana获得)。
可以用合适的食品级无机或有机酸，使所述的培养基变酸。可使 用的这些酸的实例是磷酸、盐酸、硫酸、乳酸、苹果酸、富马酸、葡 萄糖酸、琥珀酸、抗坏血酸或柠檬酸。最优选的酸是磷酸。选择pH 以发挥所述酶的最佳特性。所选的pH是使该酶最适地起作用。这种 信息可以从供应商或通过简单的试验获得。
用酸性蛋白酶水解后获得的水解蛋白，可以以上述形式应用。不 过，所述的水解蛋白如果需要，可以进一步水解。对于任何需要进一 步酶水解步骤来说，可用任一种合适的酶。实例包括但不局限于， ALCALASE、FLAVORZYME和NEUTRASE(Novo Nordisk A/S，Novo Alle， Denmark)和PROZYNE以及PANCREATIN(Amano International Enzyme Co.Inc.，Troy，VA)。所述的酶可以是酸性蛋白酶、碱性 蛋白酶或中性蛋白酶。特别适合的是碱性蛋白酶。
把铁源加到部分水解的卵清蛋白之前，该部分水解的卵清蛋白应 该是酸性的pH，大约3.0-5.5。如果有必要，该pH可加入上面所述 的合适的食品级无机或有机酸调节。最优选的酸是磷酸。
然后把亚铁溶液与部分水解的卵清蛋白混合。优选地缓慢加入， 把亚铁溶液加入到部分水解的卵清蛋白中，优选地在搅拌的情况下进 行该过程。选择加入亚铁溶液的量，以提供需要的亚铁负载量。不过， 令人惊奇的发现，在该复合物中与亚铁的结合与所结合的亚铁量相 关。当所述的复合物含有干重大约为1％-2％或大约为4.5％-10％的铁离 子时，获得最合适的结合。当然，可以使用超过10％的亚铁负载量， 但是其结合和随后的所述复合物的稳定性，可能轻微降低。
把铁源加入到部分水解的卵清蛋白后，所述的溶液应该变为中 性，以促进亚铁复合物的形成。不过，该混合物不许成为碱性，以避 免沉淀和过氧化物离子的形成。推荐的pH范围大约是6.5-7.5。
如果有必要，加入一种碱，中和该混合物的pH。任何食品级的碱 可用于中和作用，这些碱包括但不局限于，氢氧化钠、氢氧化钾、氢 氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。优选的 是氢氧化铵。
所有步骤优选地在搅拌下进行。
获得的复合物可以作为液体形式得到。不过，更优选地把所述的 复合物干燥成粉末。干燥方法可以是冷冻干燥或喷雾干燥。可以使用 任何合适的方法，把该复合物喷雾或冷冻干燥成粉末。合适的方法在 本领域众所周知。
使用时，所述的复合物被包括在制成所需食品或饮料的成分中， 并且这些成分用常规方式处理。尽管所述的铁的生物利用度可能比硫 酸亚铁的生物利用度轻微降低，但发现它仍然在可接受的范围之内。 在多数的情况下，生物利用度的差异并不明显。而且，已经发现该复 合物非常稳定，当用于食品和饮料时，没有导致增加脱色或丧失味道 的情况出现。再者，也发现该复合物没有增加如腐败等处理过程的问 题。
所述的复合物特别适用于液体形式的食品和饮料中，例如婴儿配 方浓缩液和即喝型饮料，如巧克力和麦芽奶饮料。这些食品或饮料作 为其处理过程的一部分，通常经过甑馏或其他方法灭菌，因此，该复 合物抵抗粗级处理的能力大为改善。不过，该复合物可用于其他类型 的食品或饮料中，如粉末化的饮料、婴儿配方食品和婴儿谷物。
所述的复合物也可以包括通常含有脂类和维生素的宠物食品 中。
可以看出，含有所述复合物的产品与未强化的食品相比较，具有 相似的味觉感受特性和颜色。这表现了优点，产品可以强化，而不引 起不利于消费者感受的明显变化。此外，还发现维生素C不被复合物 降解。因此，所述的复合物可以用于需要营养平衡的产品中。
现在描述本发明的具体实施例，进一步说明本发明。
实施例1
把量为1000g的冷冻卵清加到发酵罐(BiostatM)中，在室 温下溶化。搅拌下，用85％H3PO4缓慢调节pH至3.0。然后加热该溶 液到42℃。加入量为2.5g的一种酸性蛋白酶(可从Valley Research，Inc.，South Bend，Indiana获得VALIDASE FP-60)， 然后在pH 3.0-3.3，低/适中速度搅拌下，使该溶液反应16小时。 该酸性蛋白酶可从米曲霉中获得，它含有内肽酶和外肽酶。
反应16小时后，加入氢氧化铵(28％)，提高pH至7.4。在搅拌 下，加入量为2.5g的碱性蛋白酶(从Novo Nordisk A7S获得的 ALCALASE 2.4L)，并把该溶液的温度提高到50℃。这种蛋白酶从 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中得到，主要含内肽酶。 在低/适中速度搅拌下反应3小时后，把该溶液冷却到室温。在搅拌 下，加入在50ml水中的量为5.0g的FeSO4.7H2O，接着加入量为43.5 g的85％H3PO4。然后搅拌下，用28％NH4OH调pH至6.7。然后把该 溶液加热到90℃，稳定10分钟。然后把该溶液冷却到室温。
收获所述的液状铁复合物。
实施例2
重复实施例1的过程。然后搅拌下，加入量为90g的M.D.5麦 芽糖糊精到液状铁复合物中。用自动旋转圆盘喷雾干燥机，喷雾干燥 该混合物(Tin＝145℃，Tout＝80℃)。
收获所述的粉末状铁复合物。
实施例3
把量为1000g的冷冻卵清加到发酵罐(BiostatM)中，在室 温下融化。搅拌下，用85％H3PO4缓慢调节pH至3.0。然后加热该溶 液到42℃。加入量为2.5g的一种酸性蛋白酶(可从Valley Research，Inc.，South Bend，Indiana获得VALIDASE FP-60)， 然后在pH 3.0-3.3，低/适中速度搅拌下，使该溶液反应4小时。
反应后，把该溶液冷却到室温。在搅拌下，加入在50ml水中的 量为5.0g的FeSO4.7H2O。然后搅拌下，用28％NH4OH调pH至6.7。 然后把该溶液加热到60℃，10分钟。然后把该溶液冷却到室温。
搅拌下，加入量为90g的M.D.5麦芽糖糊精到该溶液中。用自 动旋转圆盘喷雾干燥机，喷雾干燥该混合物(Tin＝145℃，Tout＝80℃)。
收获所述的粉末状铁复合物。
实施例4
除了卵清进行水解6小时外，重复实施例1的过程。收获所述的 粉末状铁复合物。
实施例5
通过重新溶解巧克力奶粉末(QUIK，Nestlé USA，Inc)至8.5％ 重量比的浓度，制备4种巧克力奶饮料。每种饮料含有12.5ppm的 添加铁，这些铁是实施例1-4之一不同铁复合物的形式。
把所述的饮料放入密封的125ml玻璃罐中，大约121℃(250°F) 高压5分钟。把这些罐冷却到室温，然后储存6个月。
经1、2、3、4、5和6个月后，评价这些饮料的物理稳定性、颜 色和口感。口感通过10人的口感测试组评价。评价认为，所有饮料 没有脱色，沉淀或凝结，具有良好的味道。
实施例6
通过重新溶解巧克力奶粉末(QUIK，Nestlé USA，Inc)至8.5％ 重量比的浓度，制备4种巧克力奶饮料。每种饮料含有12.5ppm的 添加铁，这些铁是实施例1-4之一不同铁复合物的形式。
把所述的饮料预先加热到大约80℃(175°F)，注入蒸汽加热到 大约140℃(285°F)，在该温度下保持5秒，然后冷却到大约80℃ (175°F)。接着把这些饮料在大约17/3.5MPa(2500/500psi) 下匀浆，冷却到16℃(60°F)，注入到250ml的Tetra Brik Aseptic 包装袋(Tetra Pak Inc.，Chicago IL)中
经1天、2周、1和2个月后，评价这些饮料的物理稳定性、颜 色和口感。口感通过10人的口感测试组评价。评价认为，所有饮料 没有脱色，沉淀或凝结，具有良好的味道。
实施例7
通过重新溶解巧克力奶粉末(QUIK，Nestlé USA，Inc)至8.5％ 重量比的浓度，制备4种巧克力奶饮料。每种饮料含有12.5ppm的 添加铁，这些铁是实施例1-4之一不同铁复合物的形式。
把所述的饮料预先加热到大约80℃(175°F)，注入蒸汽加热到 大约148℃(298°F)，在该温度下保持5秒，然后冷却到大约80℃ (175°F)。接着把这些饮料在大约17/3.5MPa(2500/500psi) 下匀浆，冷却到16℃(60°F)，注入到250ml的Tetra Brik Aseptic 包装袋(Tetra Pak Inc.，Chicago IL)中
经1、2、3、4、5和6个月后，评价这些饮料的物理稳定性、颜 色和口感。口感通过10人的口感测试组评价。评价认为，所有饮料 没有脱色，沉淀或凝结，具有良好的味道。
实施例8
通过重新溶解巧克力奶粉末(QUIK，Nestlé USA，Inc)3份和重 新溶解麦芽粉末(MILO，Nestlé Australia Ltd)3份，共制备6 种饮料。每种饮料包含在180ml开水中的22.0g粉末。把实施例 2-4之一的铁复合物加入到巧克力饮料和麦芽饮料中。在巧克力饮料 中铁的最终浓度为15.0ppm，而在麦芽饮料中铁的最终浓度为25.0 ppm。
短暂地搅拌所述的饮料，在室温下放置15分钟。15分钟后，通 过10人的口感测试组评价饮料。当这些样品与未加入铁的对照样品 相比较时，没有发现颜色变化或丧失味道。
实施例9
用180ml开水重新溶解55g含香蕉粉的婴儿谷物(Nestlé USA， Inc)，制备3种婴儿谷物膳食。把实施例2-4之一的铁复合物加入 到每种膳食中，每100g谷物粉末为7.5mg铁。
短暂地搅拌所述的饮料，在室温下放置15分钟。15分钟后，通 过10人的口感测试组评价饮料。当这些样品与未加入铁的对照样品 相比较时，没有发现颜色变化或丧失味道。
实施例10    
所述的复合物的生物利用度按如下方法测定：
动物：所用的动物是刚断奶的雄性Sprague-Dawley大鼠，鼠龄 为3周(IFFA-CREDO，L’Arbresle，法国)。
食物：对照食物是ICN低铁食物(Soccochim SA，Lausanne，瑞 士)，其铁含量为3mg/kg。该食物基于酪蛋白，除铁外，提供作为 生长大鼠的营养需求。
试验食物是：
食物A：用FeSO4.7H2O添加的对照食物，以提供10mg/kg的铁。
食物B：用FeSO4.7H2O添加的对照食物，以提供20mg/kg的铁。
食物1：用实施例4的复合物添加的对照食物，以提供10mg/kg 的铁。
食物2：用实施例4的复合物添加的对照食物，以提供20mg/kg 的铁。
食物3：以10mg/kg添加实施例2的复合物的对照食物，提供10 mg/kg的铁。
食物4：以20mg/kg添加实施例2的复合物的对照食物，提供10 mg/kg的铁。
分析方法
1)用异氟烷醚麻醉大鼠，然后从眼眶静脉丛抽取200μL的血液 样品，进行血红蛋白的分析。通过氰化正铁血红蛋白法(Hb MPR3试 剂盒，Boehringer Mannhein GmbH，德国)，使用自动测定仪(Hemocue， Baumann-Medical SA，Wetzikon，瑞士)测定样品中血液血红蛋白 的水平。在所有血红蛋白的测定中，测量具有一系列范围的血红蛋白 水平的商用质量对照血液样品(Dia-HT Kontrollblut，Dia MED， Cressier，瑞士)。
2)根据血红蛋白水平，应用斜率比值计算与七元硫酸亚铁相比 较的铁生物利用度。多元回归方程说明所加入的铁量与血红蛋白水平 的关系。该方程给出每种食物零剂量时截取的一条直线。然后以2个 斜率的比值，计算相对于七元硫酸亚铁的铁源生物利用度。把该比值 乘以100，得到生物利用度的相对值。
步骤：把大鼠单个养在配有不锈钢栅的聚碳酸酯笼中。允许这些 动物自由喝蒸馏水。为使大鼠贫血，给大鼠随机喂对照食物24天。 每天补充新鲜食物。用钢栅盖住食物，而降低大鼠对食物的糟蹋。
24天后，测定血红蛋白和体重。具有血红蛋白水平为4.5-5.8 mg/dl的70只大鼠，被随机分为每组10只，共7组，各组间具有大 约相等平均值的血红蛋白和体重。1组动物喂以1种试验食物14天。 在0天开始，以20g/天给所述的大鼠，随机喂所述的食物。允许这 些大鼠自由喝蒸馏水。每天测定个体食物消耗量。14天后，把大鼠称 重并测定血红蛋白。
结果
平均食物消耗和铁吸收并不受铁源类型的影响。不过，接受未加 铁食物的大鼠比接受加铁食物的大鼠吃得较少。摄食20mg/kg加铁 食物的大鼠比接受10mg/kg铁食物的大鼠，消耗略为较多的食物。
大鼠的体重增加并不受铁源类型的影响。不过，接受未加铁食物 的大鼠比接受加铁食物的大鼠，体重较轻。摄食20mg/kg加铁食物 的大鼠比接受10mg/kg铁食物的大鼠，体重略为增加。
实验期开始和结束时的血液血红蛋白水平，在下表显示。
             平均血红蛋白值；(标准差)   食物   加铁量   (mg/kg)   初始血红蛋白     (g/dl)     最终血红蛋白        (g/dl)     差值    (g/dl)   对照     0     5.12(0.42)       4.88(0.43)     -0.24     (0.20)    A     10     5.12(0.41)       8.66(0.81)     3.54     (0.65)    B     20     5.12(0.40)       11.53(0.86)     6.41     (0.82)    1     10     5.12(0.40)       7.90(0.54)     2.78     (0.41)    2     20     5.13(0.39)       11.15(0.57)     5.92     (0.54)    3     10     5.13(0.37)       8.36(0.47)     3.23     (0.34)    4     20     5.12(0.38)       11.51(0.79)     6.39     (0.65) 相对生物利用度见如下：     食物   相对生物    利用度     1，2      90     3，4      98     A，B      100
所有铁-蛋白复合物的生物利用度，与硫酸亚铁的生物利用度值 相似。相对生物利用度值低于91％被认为明显低于参照组。因此，根 据统计学的观点，实施例2铁复合物的相对生物利用度值，与硫酸亚 铁的生物利用度值相似。不过，从实用观点考虑，所有复合物均具有 非常良好的生物利用度。