코코아 제품에서의 아크릴아미드의 감소 방법,아크릴아미드의 수준이 감소된 코코아 제품 및 시판 물품

코코아 제품에서의 아크릴아미드의 감소 방법, 아크릴아미드의 수준이 감소된 코코아 제품 및 시판 물품{METHOD FOR REDUCTION OF ACRYLAMIDE IN COCOA PRODUCTS, COCOA PRODUCTS HAVING REDUCED LEVELS OF ACRYLAMIDE, AND ARTICLE OF COMMERCE}

본 발명은 코코아 제품에서의 아크릴아미드의 감소, 특히 초콜렛 및 초콜렛 제품에서의 아크릴아미드의 감소에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시판 물품에 관한 것이다.

"신의 음식"으로 알려진 초콜렛은 세계적으로 가장 사치스러운 식품 중 하나이다. 초콜렛은 3000년에 걸쳐 인류가 즐겨왔지만, 연구자들은 단지 최근에야 초콜렛 및 기타 볶은 코코아 빈(cocoa bean) 제품이 아크릴아미드를 함유한다는 것을 발견하였다.

2002년 4월에 스웨덴 국립 식품청(Swedish National Food Administration) 및 스톡홀름 대학(Stockholm University)의 연구자들은 발암 가능 화학 물질인 아크릴아미드가 가열 가공 처리된 다수 유형의 식품 및 음료에서 형성된다는 연구 결과(findings)를 발표하였다. 그 후, 볶은 코코아 빈 제품, 예를 들어 초콜렛이 아 크릴아미드를 함유한다는 것이 발견되었다. 아크릴아미드는 쥐에 있어서 식품 내의 다른 발암 물질의 발암 잠재력과 유사한 발암 잠재력을 가지지만, 사람에 대해서는 식품 및 음료 내에서의 상대적인 잠재력이 알려져 있지 않다. 제한된 사람 모집단 데이터만이 아크릴아미드에 대하여 입수가능하며, 이는 직업적 노출로부터의 암 위험성에 대한 어떠한 증거도 제공하지 않는다. (FAO/WHO Consultation on the Health Implications of Acrylamide in Food: Summary Report; Geneva, Switzerland, 25-27 June 2002.)

만약 있다면 어떠한 건강 효과가 코코아 제품에서 보통 발견되는 수준의 아크릴아미드의 사람에 의한 섭취로부터 생길 수 있는 지를 평가하기 위하여 추가의 연구가 필요하지만, 많은 소비자들이 염려를 언급하여 왔다. 따라서, 본 발명의 목적은 볶은 코코아 빈 중 아크릴아미드의 수준을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 아크릴아미드의 수준이 감소된 볶은 코코아 빈을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 볶은 코코아 제품의 아크릴아미드의 수준이 감소되었거나 낮음을 소비자에게 전하는 시판 물품을 제공하는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 일 태양에 있어서 볶은 코코아 빈 중 아크릴아미드의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 방법은 코코아 빈에 아스파라긴 감소 효소를 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다른 태양에 있어서 코코아 빈 중의 아스파라긴의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 방법은 코코아 빈에 아스파라긴 감소 효소를 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다른 태양에 있어서 아크릴아미드의 수준이 감소된 볶은 코코아 빈을 제공한다.

본 발명은 다른 태양에 있어서 아스파라긴의 수준이 감소된 코코아 빈을 제 공한다.

본 발명은 또다른 태양에 있어서 볶은 코코아 빈을 함유하는 제품의 아크릴아미드의 수준이 감소되었거나 낮음을 소비자에게 전하는 시판 물품을 제공한다.

본 발명은 또다른 태양에 있어서 코코아 빈을 함유하는 제품의 아스파라긴의 수준이 감소되었거나 낮음을 소비자에게 전하는 시판 물품을 제공한다.

본 명세서에 인용된 모든 문헌은 관련 부분에서 본 명세서에 참고로 포함되며, 임의의 문헌의 인용은 본 발명에 관련한 종래 기술로 인정되는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 달리 표시하지 않는 한 모든 백분율(%)은 중량을 기준으로 한다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명자들은 실질적으로 모든 살아있는 시스템에서 발견되는 자연 발생 아미노산인 아스파라긴이 가열시 아크릴아미드를 형성할 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 아스파라긴이 더욱 풍부한 재료는 가열시 더 높은 수준의 아크릴아미드를 포함하는 경향이 있는데, 이는 아스파라긴 함유 재료가 환원당의 존재 하에 가열될 경우 특히 그러하다.

이론에 구애됨이 없이, 도 1에 도시된 반응 기전을 통하여 아크릴아미드가 형성되는 것으로 여겨진다. 자유 아스파라긴의 알파-아미노기가 카르보닐 공급원과 반응하여 쉬프(Schiff) 염기를 형성하는 것으로 여겨진다. 가열 하에서는 쉬프 염기 부가물은 데카르복실화하여, (1) 가수분해되어 베타-알라닌 아미드(가열 하에 서는 더 분해되어 아크릴아미드를 형성할 수 있음)를 형성하거나 (2) 분해되어 아크릴아미드 및 상응하는 이민을 형성할 수 있는 생성물을 형성한다. (본 발명자들은 원으로 표시한(circled) 전구체 원자가 아크릴아미드 중 탄소 및 질소를 포함한다는 것을 밝혀 내었음.)

따라서, 볶은 코코아 빈에서의 아크릴아미드의 형성을, 코코아 빈을 최종적으로 볶기 전에 코코아 빈 중 아스파라긴을 제거하거나 이를 다른 물질로 전환시킴으로써 감소시킬 수 있다. 감소된 수준의 아스파라긴을 함유하는 이러한 빈을 최종적으로 볶을 경우, 아크릴아미드의 형성량은 감소된다.

코코아 빈을 최종적으로 볶기 이전에 아스파라긴의 측쇄 상의 아미드기를 가수분해하는 효소를 첨가하면 볶은 코코아 빈에 존재하는 아크릴아미드의 수준이 감소된다. 이론에 구애됨이 없이, 이러한 효소의 첨가는 아스파라긴의 측쇄를 분해시킴으로써 아스파라긴이 아크릴아미드를 형성하는 것을 방지한다. 이렇게 함으로써 아미드 결합은 가수분해되며 아스파라긴은 아스파르트산으로 전환된다. 이러한 반응 기전은 도 2에 도시되어 있다.

본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 효소는 아스파라기나제를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 그러나, 자유 아스파라긴의 아미드기를 가수분해하여 아크릴아미드의 형성을 방지할 수 있는 임의의 효소는 본 발명의 범주 이내이다.

효소를 사용할 경우의 이점은 많다. 이러한 이점은 (a) 이들이 천연의 비독성 물질이며; (b) 이들이 일반적으로 원하지 않는 부반응(side reaction)을 야기함 이 없이 주어진 반응을 촉매하며; (c) 이들이 매우 온화한 온도 및 pH 조건 하에서 활성을 가지며; (d) 이들이 낮은 농도에서 활성을 가지며; (e) 반응 속도가 온도, pH, 및 효소의 이용량의 조정에 의해 조절될 수 있으며; (f) 이들이 반응이 원하는 정도로 행해진 후 불활성화될 수 있음을 포함한다. (Food Chemistry, 4th Ed., Owen R. Fennema, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 427, 433.)

A. 볶은 코코아 빈에서의 아크릴아미드의 감소 방법

본 발명은 일 태양에 있어서 볶은 코코아 빈 중 아크릴아미드를 감소시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 본 방법은 코코아 빈 중 아스파라긴의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 방법은 코코아 빈에 아스파라긴 감소 효소를 첨가하는 단계를 포함한다. 바람직한 효소는 아스파라기나제이다.

바람직한 실시 형태에 있어서 본 발명은 볶은 코코아 빈 중 아크릴아미드의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 이 방법은

(1) 아스파라긴을 함유하는 코코아 빈을 제공하는 단계;

(2) 선택적으로 코코아 빈을 저온에서 건조시키는 단계;

(3) 선택적으로 코코아 빈을 볶는 단계;

(4) 코코아 빈을 키질하여(winnowing) 빻은 코코아 빈(nibs)을 형성하는 단계;

(5) 선택적으로 빻은 코코아 빈을 볶는 단계;

(6) 선택적으로 빻은 코코아 빈을 미분화하여 코코아 리커(liquor)를 형성하 는 단계;

(7) 선택적으로 코코아 리커를 볶는 단계;

(8) 선택적으로 코코아 리커를 압착하여 코코아 케이크 및 코코아 버터를 형성하는 단계;

(9) 선택적으로 코코아 케이크를 미분화하여 코코아 분말을 제조하는 단계;

(10) 선택적으로 상기 단계 1-9 중 어느 하나의 단계 이전, 상기 단계 동안, 또는 상기 단계 후에 베이스(base)를 첨가하는 단계; 및

(11) 상기 단계 1-6 중 어느 하나의 단계 이전, 상기 단계 동안, 또는 상기 단계 후에 효소를 첨가하는 단계를 포함한다.

1. 아스파라긴을 함유하는 코코아 빈의 제공

코코아 빈의 공급원인 카카오 나무는 열대 및 아열대 기후에서 자란다. 일단 따면, 코코아 빈을 덮고 있는 점액(mucilage)은 제거된다. 코코아 빈은 수확 후 수일 동안 발효되고 나서 건조된다. 다양한 유형의 빈의 혼합물을 포함한 임의의 적합한 건조 코코아 빈이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "코코아 빈" 또는 "빈"은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 임의의 적합한 형태의 코코아 빈을 포함한다. 적합한 코코아 빈은 문헌[Bernard W. Minifie, Chocolate, Cocoa, and Confectionery, AVI Publishing Co./Van Nostrand Reinhold, New York, New York, 1989](이하, 문헌["Chocolate, Cocoa, and Confectionery"])에 기술되어 있는 것을 포함한다.

2. 저온에서의 코코아 빈의 선택적 건조

코코아 빈은 저온에서 임의의 적합한 방법으로 선택적으로 건조될 수 있다. 적합한 건조 방법은 당업계에 공지된 것, 예를 들어 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 개시되어 있는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 저온에서의 건조는 빈을 건조시키기에는 충분히 낮지만 빈을 볶기에 충분히 높은 것은 아닌 온도에서 건조시키는 것을 의미한다.

3. 선택적으로 코코아 빈을 볶기

코코아 빈을 선택적으로 볶을 수도 있다. 볶는 단계를 포함하는 임의의 적합한 공정이 이용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "볶기"는 코코아임을 나타내는 풍미를 생성하기 위한 코코아 빈의 임의의 적합한 열처리를 포함한다. 적합한 볶음 기술은 당업계에 공지된 것, 예를 들어 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 기술되어 있는 것을 포함한다. 다른 실시 형태에 있어서, 코코아 빈을 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 저온에서 볶는다.

4. 건조 코코아 빈을 키질하여 빻은 코코아 빈을 형성하기

그리고 나서, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 건조된 코코아 빈을 키질하여 빻은 코코아 빈을 형성한다. 빻은 코코아 빈의 크기는 임의의 원하는 크기의 것일 수 있다. 그러나, 빻은 코코아 빈 전반에 걸친 효소 이동을 용이하게 하기 위하여 보다 작은 크기의 빻은 코코아 빈이 바람직한데, 이는 표면적 증가 및 이동 거리 감소에 기인한다.

5. 빻은 코코아 빈을 선택적으로 볶기

그리고 나서, 빻은 코코아 빈을 임의의 적합한 방법으로 선택적으로 볶을 수 있다. 적합한 볶음 기술은 당업계에 공지된 것, 예를 들어 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 개시되어 있는 것을 포함한다.

6. 선택적으로 빻은 코코아 빈을 미분화하여 코코아 리커를 형성하기

그리고 나서, 빻은 코코아 빈을 임의의 적합한 방법, 예를 들어 당업계에 공지된 것으로 미분화하여 코코아 리커를 형성할 수 있다. 적합한 미분화 기술은 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 개시되어 있는 것을 포함한다.

7. 선택적으로 코코아 리커를 볶기

코코아 리커를 선택적으로 볶을 수 있다. 코코아 리커를 형성하기 전에 코코아 빈을 단지 약간 볶아서 수분 수준이 비교적 높을 경우, 효소를 첨가하여 반응하게 할 수 있다. 그리고 나서, 코코아 리커는 더 볶아져 풍미를 발하게 된다.

8. 코코아 리커의 코코아 케이크 및 코코아 버터로의 선택적 압착

코코아 리커를 코코아 케이크 및 코코아 버터로 선택적으로 압착할 수 있다. 적합한 압착 방법은 당업계에 공지된 것, 예를 들어 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 개시되어 있는 것을 포함한다.

9. 선택적으로 코코아 케이크를 미분화하여 코코아 분말을 제조하기

코코아 케이크는 임의의 적합한 방법으로 선택적으로 미분화할 수 있다. 적합한 미분화 방법은 당업계에 공지된 것, 예를 들어 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]에 개시되어 있는 것을 포함한다.

10. 선택적으로 상기 단계 1-9 중 어느 하나의 단계 이전, 상기 단계 동안, 또는 상기 단계 후에 베이스(base)를 첨가하기

베이스는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 코코아 빈 가공 처리 동안 선택적으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chocolate, Cocoa, and Confectionery]을 참고한다.

11. 아스파라긴 감소 효소를 상기 단계 1-6 중 어느 하나의 단계 이전, 상기 단계 동안, 또는 상기 단계 후에 첨가하기

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아스파라긴 감소 효소"는 코코아 빈 중 아스파라긴의 수준을 감소시킬 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서 아스파라긴 감소 효소는 자유 아스파라긴의 아미드기를 가수분해시킬 수 있는 효소이다.

본 발명에서 사용하기에 바람직한 효소는 아스파라기나제이다. 바람직한 아스파라기나제 공급원은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)의 카탈로그 #A2925이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아스파라긴 감소 효소" 및 "효소"라는 용어는 하나 이상의 효소를 포함하는데, 예를 들어 2종 이상의 효소의 혼합물이 본 용어에 포함된다. 예를 들어, 아스파라긴 감소 기능성을 가지는 디아미다아제(deamidase)가 이 용어에 포함된다.

효소는 임의의 적합한 형태로 코코아 빈에 첨가될 수 있다. 예를 들어 효소는 분말로, 또는 용액의 형태로 첨가될 수 있다. 또한, 효소는 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 직접적으로(예를 들어 코코아 빈 상에 뿌려지거나 부어지거나 분무되거나, 코코아 빈을 효소 용액에 침지시킬 수 있음) 또는 간접적으로 코코아 빈에 첨가될 수도 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 효소를 코코아 빈에 " 첨가"하는 것은 아스파라긴 및 효소를 합치는 임의의 방법을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.

일 실시 형태에 있어서 효소는 빻은 코코아 빈에 첨가된다. 이 실시 형태에 있어서, 효소는 바람직하게는 용액의 형태로 존재하며 빻은 코코아 빈의 침지 또는 분무, 또는 그 조합을 통하여 적용된다.

효소는 최종 볶음의 완료 전의 본 방법의 임의의 적합한 단계에서 첨가되어 볶은 코코아 빈을 형성할 수도 있다. 또한, 효소는 본 방법의 하나보다 많은 단계 동안 첨가될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 효소는 발효 이전 또는 발효 동안 빈에 첨가된다. 다른 실시 형태에 있어서, 효소 용액이 건조 빈 내로 스며들게 한다.

효소는 중량 또는 부피 기준이라기보다는 활성의 단위로 시판된다. 따라서, 원하는 수준의 아크릴아미드 감소를 성취하는 데에 요구되는 효소의 유효량은 사용되는 특정 효소 제품의 활성에 따라 달라진다.

효소의 첨가량은 아스파라긴 감소 수준과, 그에 따른 요망되는 아크릴아미드 감소 수준에 따라 달라질 수 있다. 효소의 첨가량은 또한 코코아 빈에 존재하는 아스파라긴의 양에 따라 달라질 수 있는데, 일반적으로 아스파라긴이 많은 코코아 빈일수록 동일한 백분율의 아크릴아미드 감소의 성취를 위해 효소 수준 증가 또는 반응 시간 증가를 필요로 한다. 효소의 첨가량은 또한 사용되는 특정 효소(예를 들어, 특정 효소의 효소 활성) 및 처리되는 특정 유형의 코코아 빈에 따라 달라질 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 특정 유형의 코코아, 특정 효소, 효소의 비활 성(specific activity) 및 원하는 결과에 기초하여 효소의 유효량을 결정할 수 있다.

코코아 빈에 효소를 첨가하는 바람직한 방법은 분무, 침지, 뿌리기 및 주 배쓰(dominant bath)를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 효소 용액은 모든 빈 표면에의 균일한 적용을 생성하기 위하여 빈을 온화하게 교반시키면서 효소 용액을 빈에 분무함으로써 적용된다.

다른 실시 형태에 있어서, 코코아 빈을 효소 용액에 침지시켜 이 빈을 수화시킨다. 용액의 사용량은 빈의 원하는 최종 수분 함량에 따라 달라진다. 효소 용액은 모든 액체가 빈에 의해 흡수되게 하는 양으로, 또는 코코아 빈에 의한 용액 흡수 후 잉여 용액이 남도록 하는 양으로 사용될 수 있다. 또다른 실시 형태에 있어서, 코코아 빈을 용액에서 수화시키고 나서 효소 분말을 수화된 코코아 빈 상에 뿌린다. 용액으로부터 미립자를 분리하는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 체질(screening)로 빈을 용액으로부터 제거할 수 있다.

또다른 실시 형태에 있어서, 효소는 주 배쓰에 의해 빈에 첨가된다. 계속하여, 빈으로부터 추출되는 용해성 물질이 효소 함유 용액과 평형을 이루거나 거의 평형을 이룰 때까지 여러 빈 배치(batch)를 효소 함유 용액에 침지시킨다. 일 실시 형태에 있어서, 주 배쓰 내의 효소는 아스파라긴을 아스파르트산으로 전환시키며, 그럼으로써 빈 배치의 후속의 첨가시 추가의 아스파라긴 추출에 대한 구동력을 생성한다. 효소에 의해 계속하여 반응하고 전환되는 아스파라긴을 제외한 추가의 용해성 코코아 성분이 추출되지 않도록, 추출가능한 재료는 빈과 평형을 이룰 수 있다. 아스파라긴으로부터 형성되는 아스파르트산은 빈 내로 다시 스며들며 평형을 이룬다. 추가의 물 및/또는 효소 함유 용액은 매 빈 배치에 뒤이어 다시 첨가되어 이전의 빈 배치 내로 들어간 용액을 벌충하는데, 이는 주 배쓰의 일정한 부피를 유지한다.

일 실시 형태에 있어서, 아스파라긴의 적어도 일부는 코코아 빈으로부터 추출되며, 생성된 추출물은 효소로 처리되며, 이어서 추출물의 적어도 일부는 코코아 빈의 적어도 일부 내로 다시 첨가되는데, 예를 들어 효소는 추출물에 첨가될 수 있거나, 추출물이 고정화된 효소의 베드(bed) 또는 컬럼(기재, 바람직하게는 불활성 기재, 예를 들어 컬럼 중의 비드 또는 플라스틱 조각에 흡착되거나 화학적으로 결합된 효소)을 통하여 펌핑될 수 있다.

효소가 아스파라긴과 반응하는 데에 필요한 시간량은 원하는 아스파라긴(및 그에 따른 아크릴아미드)의 감소 수준, 특정 코코아 빈의 특징(예를 들어, 화학적 조성, 존재하는 아스파라긴의 양, 입자 크기)과, 첨가되는 특정 효소를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 인자에 따라 좌우될 것이다. 바람직하게는, 효소는 충분한 양의 시간 동안 반응하게 하여 아스파라긴의 수준이 약 10% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 더 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상 감소된 코코아 빈을 생성한다. 일반적으로, 효소를 더욱 오랫동안 반응시킬수록 아스파라긴 감소 수준이 더욱 커지며 따라서 볶은 코코아 빈 중 아크릴아미드 감소 수준이 더욱 커진다. 충분한 시간 동안 효소가 반응하게 하는 단계는 임의의 적합한 방식으로 실시할 수 있는데, 예를 들어 이는 효 소를 코코아 빈에 첨가하는 단계, 효소를 코코아 빈과 혼합하는 단계, 코코아 빈에 의한 효소 용액의 흡수 단계, 또는 그의 조합과 동시에 실시될 수 있다.

당 업계에 공지된 바와 같이 pH 및 온도는 효소 활성에 영향을 주는 인자이다. 당업계의 숙련자라면 상기 및 기타 파라미터(예를 들어 물의 함량)의 최적 조건을 손쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한 특정 효소의 최적 pH 및 온도 조건은 일반적으로 문헌 및/또는 효소 공급자로부터 입수가능하다.

효소를 원하는 정도로 반응시킨 후 이를 선택적으로 불활성화시키거나 코코아 빈으로부터 제거할 수 있다. 섭취하기에 안전한 효소(예를 들어 보통의 식품에서 발견되며 자연적으로 발생함)를 사용할 경우 효소를 불활성화시키지 않거나 제거하지 않도록 선택할 수 있다. 대안적으로는, 효소는 효소를 불활성화시키는 임의의 적합한 수단에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 효소는 열의 사용, pH 조정, 프로테아제를 이용한 처리, 또는 그의 조합을 통하여 불활성화될 수 있다. 또한, 효소는 추출을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 임의의 적합한 수단에 의해 코코아 빈으로부터 제거될 수 있다. 효소를 불활성화시키거나, 제거하거나, 불활성화 및 제거의 조합에 처하게 할 수 있다.

효소의 불활성화는 가열을 통하여 일어날 수도 있어서, 선택적인 불활성화 단계 및 코코아 빈의 볶음 단계는 동시에 실시될 수도 있다. 가열 가공 처리는 효소를 변성 및 불활성화시켜 볶은 코코아 빈이 계속적인 효소 활성에 처해질 수 없게 한다. 또한, 효소가 반응하게 하는 시간의 적어도 일부는 볶음 단계 동안 실시될 수 있다.

효소의 불활성화는 가열을 통하여 일어날 수도 있어서, 선택적인 불활성화 단계 및 코코아 빈의 볶음 단계는 동시에 실시될 수도 있다. 가열 가공 처리는 효소를 변성 및 불활성화시켜 볶은 코코아 빈이 계속적인 효소 활성에 처해질 수 없게 한다. 또한 효소가 반응하게 하는 시간의 적어도 일부는 볶음 단계 동안 실시될 수 있다.

12. 볶은 코코아 빈을 함유하는 제품

볶은 코코아 빈은 그대로 사용될 수 있거나 다양한 볶은 코코아 제품, 예를 들어 초콜렛 캔디, 캔디 바, 코팅, 액체 농축물, 즉석 또는 분말 코코아, 코코아 음료(예를 들어, 즉시 제공될 수 있는(ready to serve) 핫(hot) 코코아 및 냉 코코아, 판매 코코아, 시판되는 가정용 코코아), 믹스, 당과류(예를 들어, 캔디), 디저트(예를 들어, 케이크, 아이스크림, 무쓰, 카스타드), 페이스트리(예를 들어, 대니쉬(danish), 도너츠), 소스 및 수프(예를 들어, 칠리(chili))의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 볶은 코코아 빈을 함유하는 볶은 코코아 빈 제품은 아크릴아미드 수준이 약 10% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 더 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상 감소될 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 다크 코코아 분말은 약 350 ppb 미만, 바람직하게는 약 250 ppb 미만, 더 바람직하게는 약 100 ppb 미만의 아크릴아미드를 함유한다.

B. 본 방법을 실행하기 위한 수단

본 발명은 임의의 적합한 수단으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 배치(batch)식, 반배치(semi-batch)식, 또는 연속식으로 실행할 수 있다.

C. 시판 물품

다른 태양에 있어서, 본 발명은 시판 물품을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, 시판 물품은

(a) 아크릴아미드의 수준이 감소된 볶은 코코아 빈을 함유하는 제품;

(b) 제품을 담기 위한 용기; 및

(c) 용기와 결부된 메시지를 포함한다.

용기와 결부된 메시지는 소비자에게 본 제품에서 아크릴아미드의 수준이 감소되었음을 알려준다. 일 실시 형태에 있어서, 메시지는 소비자에게 본 제품이 아스파라긴의 수준이 감소되거나 낮은 코코아 빈으로 제조됨을 알려 준다. 메시지는 용기에 직접 또는 간접적으로 부착된 인쇄물일 수 있거나, 용기 부근에 직접 또는 간접적으로 부착된 인쇄물일 수 있거나, 대안적으로는 용기와 결부된 인쇄된 메시지, 전자 메시지 또는 방송 메시지일 수 있다. 적합한 메시지는 아크릴아미드의 "감소된" 또는 "낮은" 수준을 알려 주는 메시지, 명시된 양보다 적은 양의 아크릴아미드가 존재함을 알려 주는 메시지, 및 볶은 코코아 빈, 볶은 코코아 빈을 함유하는 제품, 및/또는 시판 물품이 제안되거나 의무적인 수준(예를 들어, 규제 역치 또는 신호 수준)을 충족시키거나 그를 능가함을 알려 주는 메시지를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

볶은 코코아 빈을 함유하는 제품을 분배하거나, 제시하거나, 전시하거나 보관할 수 있는 임의의 용기가 적합하다. 적합한 용기는 백, 깡통, 박스, 사발, 플레이트, 통 및 캔을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

분석 방법

본 발명의 요소의 특성화에 사용되는 파라미터는 특정 분석 방법으로 정량화된다. 이러한 방법을 하기와 같이 상세하게 설명한다.

1. 아크릴아미드

식제품에서의 아크릴아미드(AA)의 측정 방법

요약

식제품에 1- ¹³ C-아크릴아미드( ¹³ C-AA)를 타고(spike) 이를 고온수로 추출한다. 수성 상청액을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고 에틸 아세테이트 추출물을 합하고 농축시키고 AA 및 ¹³ C-AA의 특이적 검출을 위한 선택된 이온 모니터링으로 LC/MS로 분석한다.

샘플의 추출

1. 샘플 6.00 ± 0.01 g을 재어 125-mL의 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣는다. 주의: 샘플을 식품 가공기에 넣고 30초 동안 펄스를 발생시켜 입자 크기가 약 3.2 mm(1/8인치) 이하가 되도록 한다. 샘플이 너무 작아서 식품 가공기에서 효과적으로 갈아서 부술 수 없을 경우, 샘플을 새로운 플라스틱 백(예를 들어, 월-팩(Whirl-Pak™ 또는 등가물)에 넣고 입자 크기가 3.2 mm(1/8인치) 이하가 될 때까지 고무 방망이(mallet)로 미분쇄한다.

2. 조정가능한 1000-μL 피펫(보정함)으로 탈이온화 증류수 중 100 ng/μL ¹³ C-AA 120 μL를 샘플 상에 직접 첨가한다(ISTD 2).

3. 분배기를 사용하여 40 mL의 탈이온화 증류수를 플라스크에 첨가하고 호일로 덮는다.

4. 65℃ 수조에 30분 동안 넣어둔다.

5. 분배기로 10 mL의 에틸렌 다이클로라이드를 플라스크에 첨가하고, 테크마 티슈마이저(Tekmar Tissumizer™) (SDT-1810) 또는 울트라-터랙스(Ultra-Turrax)(등록상표)(T18 Basic)로 30초 동안, 또는 균일해질 때까지 균질화한다. 탐침자를 탈이온화 증류수로 플라스크 내로 헹구어낸다.

6. 25 g의 균질화물을 30 ml(8-드램) 바이알에 넣는다.

7. 튜브의 뚜껑을 단단하게 닫고 2500-5200 RPM에서 30분 동안 원심분리한다.

8. 8 g의 상청액을 고체 입자를 피하도록 조심하면서 다른 30 ml(8-드램) 바이알로 옮긴다.

9. 10 mL의 에틸 아세테이트를 분배기로 첨가하고, 뚜껑을 닫고 10초 동안 와동시킨다.

10. 모든 에멀젼을 분쇄시키는데, 1회 또는 2회 소용돌이치게 하거나 진탕시키고 이어서 층이 분리되게 함으로써 돕는다.

11. 어떠한 액체(물)도 계면으로부터 옮김이 없이 상층(에틸 아세테이트)을 가능한 한 많이 섬광 바이알로 옮긴다. 5-mL의 에틸 아세테이트 부분으로 2회 더 추출하고 동일한 섬광 바이알에 첨가한다. 이어서 대략 2 g의 무수 황산나트륨을 첨가한다.

12. 60-65℃ 수조에서 온화한 질소 스트림으로 추출물을 약 1 mL로 농축시킨다. 추출물을 피어스(Pierce) 리액티-바이알(REACTI-VIAL™) 또는 등가의 원추형 유리 바이알로 옮기고 추출물을 대략 100-200 μL의 최종 부피로 더 농축시킨다. 이 추출물을 원추형 슬리브관이 있는 자동 시료 주입 바이알에 넣는다.

표준물의 제조

원액 및 내부 표준물

중간 표준물

보정 표준물

균질화기 세정 절차

매 샘플들 사이에서 본 세정 절차를 사용한다.

1. 고온의 수도물로 1-L 삼각 플라스크를 충전시키고(

2. 분배 요소 탐침자를 물 내로 가능한 한 멀리 삽입한다.

3. 이 용액을 약 10-15초 동안 균질화한다.

4. 세정 용액을 삼각 플라스크로부터 비우고; 플라스크를 고온의 수도물로 헹구고 재충전시킨다.

5. 약 10-15초 동안 다시 균질화한다.

6. 플라스크를 비우고 고온의 수도물로 재충전시키며, 약 10-15초 동안 다시 균질화한다.

7. 물이 투명하지 않고 미립자가 있으면 필요한 만큼 여러번 고온의 청결한 수도물을 계속하여 균질화하여 이 상태를 성취한다.

8. 수도물이 투명하고 미립자가 없으면, 탐침자를 탈이온화 증류수로 헹군 다.

LC/MS에 의한 분석

샘플을 마이크로매스(Micromass) LCZ 질량 분광계에 연결된 워터스(Waters) 2690 LC를 사용하여 분석한다.

데이터 분석

에틸 아세테이트 중 5종의 표준물 시리즈에 있어서 반응 비(AA 피크의 면적/ ¹³ C-AA 피크의 면적)를 상응하는 농도 비에 대하여 도시한다. 모든 표준물은 4.5 g/mL의 ¹³ C-AA와, 농도 범위가 0 내지 5 g/mL인 AA를 포함한다. 선형 회귀에 의해 추출물 중 농도를 측정한 반응 비로부터 결정하는 보정 곡선을 생성한다. 추출 절차 중 단계 2의 샘플에 더해진 정확하게 알려진 ¹³ C-AA의 수준(명목상 2 ppm)을 이 농도 비에 곱할 경우 ppm 단위의 AA의 수준이 생성된다.

LC/MS에 있어서의 샘플 계산:

y 축 상에서의 반응 비(면적 m/z 72 / 면적 m/z 73) 대 x 축 상에서의 농도 비([AA] / [13C-AA])를 도시하여 보정 곡선을 생성한다. 본 예에 있어서 상기 선의 방정식은 y = 0.899x + 0.0123이다.

4.0분에서의 AA 피크의 측정 면적(m/z 72): 100,000

4.0분에서의 13C-AA 피크의 측정 면적(m/z 73): 500,000

반응 비 R _r = 0.200. 보정 곡선의 기울기 및 절편으로부터 농도 비 R _c 를 계산한다: R _c = (0.200 - 0.0123) / 0.899 = 0.209

샘플 중 13C-AA의 스파이크 수준(2 ppm)이 주어지면 AA의 측정 수준은 0.209 x 2 ppm = 0.418 ppm이다.품질 보증/품질 제어(QA/QC)

1. 표준물 및/또는 샘플의 제조에 사용되는 모든 밸런스는 적정 중량의 세트로 매주 그의 보정을 체크하여야 한다. 밸런스는 측정할 샘플/표준물 중량 범위를 포함하는 3개 이상의 중량으로 체크하여야 한다.

2. 6개의 지점에서의 보정 곡선이 매일 수행되어야 한다.

3. 실제 참조 물질(working reference material, WRM)을 각각의 샘플 세트로 분석하여야 한다. 이 물질의 농도는 2σ의 이동 평균 이내이어야 한다. 그렇지 않을 경우 이 기구는 재보정하여야 하며 WRM을 재계산하여야한다.

2. 아스파라긴

식품 및 음료 제품 중의 아스파라긴 및 아스파르트산의 측정

원리

중량을 잰 양의 샘플을 5% HCl과 혼합시키고 30분 동안 가열하고, 이어서 균질화한다. 균질물의 일부를 원심분리하고 이어서 상청액의 일부를 희석시키고 FMOC 시약(9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트)으로 처리하는데, 상기 시약은 아스 파라긴 및 아스파르트산과 반응하여 고도로 형광성인 유도체를 형성한다. 이어서 역상 HPLC를 사용하여 다른 샘플 매트릭스 성분으로부터 FMOC-아스파라긴을 분해해 낸다. 측정은 260 나노미터(nm)에서 여기시킬 경우의 313 nm에서의 형광 방출에 의한 것이다. 공지된 농도의 표준물을 분석하여 정량화한다.

선형성

4종의 표준물(50 - 600 ppm)의 실제 보정 곡선은 0.998 또는 그보다 우수한 상관 관계를 준다. 2000 ppm까지 취해진 곡선도 0.998의 상관 관계를 준다.

정확도

감자 제품:

감자 전분에 4가지 수준(40, 200, 400 및 600 ppm)의 아스파라긴 및 아스파르트산 둘 모두를 탄다. 아스파라긴의 회수율은 100%이며(4% 미만의 상대 표준 편차) 아스파르트산의 회수율은 110%이다(4% 미만의 상대 표준 편차).

참고 문헌

1. Herbert, P.; Santos, L; Alves, A. Journal of Food Science (2001), 66(9), 1319-1325.

2. Heems, Dany; Luck, Geneviewe; Fraudeau, Chrisophe; Verette, Eric. Journal of Chromatography, A (1998), 798 (1 + 2), 9-17.

시스템 반복성

감자 칩의 실제 참조 물질에 대해 5일에 걸쳐 이중으로 실행한다. 결과는 하기와 같다:

하기는 화학물질 및 장비를 제안한 것이지만, 등가의 재료의 치환이 허용가능하다.

화학물질

장비

전달용 피펫, 폴리에틸렌 (삼코(Samco) #222)

부피 플라스크(25, 100, 250, 1000 ml)

부피 피펫(10 ml)

눈금이 매겨진 실린더(100-1000 ml)

HPLC 저장기(500 ml, 1 또는 2 리터)

비이커

자성 교반기/교반 막대

분석용 (4-지점) 밸런스

섬광 바이알

원심분리용 튜브, 뚜껑이 있는 나사 뚜껑(100x16 mm)

크림프형(crimp) 뚜껑이 있는 자동 시료 주입기용 바이알(8x30 mm, 1 ml)

안전성: 본 방법은 배기함(fume hood)의 사용을 필요로 하며 화학물질에의 노출을 수반한다. 문헌[Safe Practices for Fume Hood Use and Chemical Spills]을 개관하기 바람.

컬럼

페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 100 x 4.6 mm C-18(2) 3 마이크론 # 00D-4251-EO

시약의 제조

희석제 (pH 8.3-8.5; 1000 ml).

1. 3.0 g의 붕산나트륨, 3.0 g의 붕산, 및 8.0 g의 중탄산나트륨을 중량을 재어 중량을 잰 건조 비이커에 넣는다.

2. 빈 800 ml 비이커를 자성 교반기 상에 놓는다. 약 500 ml의 밀리-큐™ 물 및 교반 막대를 부가한다. 물을 튀게 함이 없이 격렬하게 교반시킨다.

3. 단계 1로부터의 시약을 물로 정량적으로 옮기고 시약이 완전히 용해될 때 까지 교반시킨다.

4. 단계 3으로부터의 용액을 1-리터 부피 플라스크에 정량적으로 옮기고 밀리-큐™ 물로 소정 부피로 희석시키고 잘 혼합한다. 6개월까지는 안정하다.

염화칼슘 용액(100 g).

1. 40 g의 염화칼슘 이수화물을 중량을 재어 중량을 잰 250 ml 비이커 내로 넣는다.

2. 60 g의 밀리-큐™ 물을 첨가한다. 잘 혼합한다. 뚜껑을 닫은 유리병에서 주변 조건에서 보관한다. 1년까지는 안정하다.

추출 용매(80:20의 펜탄: 에틸 아세테이트; 500 ml)

안전성: 펜탄 및 에틸 아세테이트는 휘발성이며 가연성이다. 배기함에서 하기 작업을 수행한다.

1. 400 ml의 펜탄을 500 ml HPLC 저장 병으로 옮긴다.

2. 100 ml의 에틸 아세테이트를 첨가한다. 잘 혼합한다. 배기함 내에서/하에서 뚜껑을 닫은 채 보관한다.

이동 상 (60:5:35의 완충제:메탄올:아세토니트릴, pH 3.2, 2 L)

1. 1.35 g의 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 3.65 g의 시트르산, 및 1.60 g의 시트르산나트륨을 중량을 재어 중량을 잰 건조 비이커 내로 넣는다.

2. 빈 800 ml 비이커를 자성 교반기 상에 놓는다. 약 500 ml의 밀리-큐™ 물 및 교반 막대를 부가한다. 물을 튀게 함이 없이 격렬하게 교반시킨다.

3. 단계 1로부터의 시약을 물로 정량적으로 옮기고 시약이 완전히 용해될 때 까지 교반시킨다.

4. 단계 3으로부터의 용액을 1 리터 눈금이 매겨진 실린더에 정량적으로 옮기고 밀리-큐™ 물로 1000 ml로 희석시키고 잘 혼합한다.

5. 2-L HPLC 이동 상 저장기로 옮긴다.

6. 200 ml의 밀리-큐™ 물, 100 ml의 메탄올 및 700 ml의 아세토니트릴을 첨가한다. 후자의 두 용매를 격렬하게 교반시키면서 서서히 첨가한다. 이 작업은 배기함에서 수행하고 개인 보호 장비를 착용한다. 특정의 상세한 사항에 대해서는 관련된 물질 안전성 데이터 시트(Material Safety Data Sheets, MSDS)를 참조.

7. 이동상을 교반시키면서 진공 흡기에 의해 탈기시킨다.

FMOC 시약 용액(아세톤 중)

1. 0.10 g의 FMOC 시약을 중량을 재어 중량을 잰 100 ml 부피 플라스크 내로 넣는다.

2. 아세톤을 첨가하여 용해시키고 아세톤으로 소정 부피로 희석시킨다. 잘 혼합한다. 이 작업은 배기함에서 수행한다. 화학물질에 대한 MSDS에서 명기한 PPE를 착용한다.

3. 6개월 이하 동안 냉장 보관한다.

샘플 추출용의 산 용액(5% HCl)

1. 100 ml의 밀리-큐™ 물을 200 ml의 부피 플라스크 내로 첨가한다.

2. 4 ml의 1N HCl을 부피 플라스크에 첨가한다.

밀리-큐™ 물로 소정 부피가 되게 한다.

내부 표준물(아미노아이소부티르산)의 제조

ISTD A - 내부 표준 원액 A

1. 0.5 g의 아미노아이소부티르산을 중량을 재어 중량을 잰 250 ml 부피 플라스크 내로 넣는다.

2. 25 ml의 1.0 N HCl 및 약 100 ml의 밀리-큐™ 물을 첨가한다. 용해될 때까지 소용돌이가 생기게 하여 혼합시킨다.

밀리-큐™ 물로 소정 부피로 희석시키고 잘 혼합한다. 6개월 이하 동안 냉장 보관한다.

ISTD B - 실제 내부 표준 용액 B(본 용액은 보정용 표준물에 첨가함)

1. 1 ml의 내부 표준 원액 A를 100 ml의 부피 플라스크 내로 피펫으로 옮긴다.

2. 밀리-큐™ 물로 소정 부피로 희석시킨다. 1개월 동안 안정하다.

보정용 표준물(들)의 제조

보정용 원액.

중량을 잰 50 ml의 부피 플라스크 내로 0.100 g(+/- 0.001 g)의 아스파라긴 및 0.100 g(+/- 0.001 g)의 아스파르트산을 중량을 재어 넣는다. 25 mL의 밀리-큐™ 물 및 1 mL의 1 N HCl을 첨가한다. 용해될 때까지 음파조에 두고, 이어서 밀리-큐™ H2O로 소정 부피가 되게 한다. 용액은 6개월의 냉장 동안 양호하다.

실제 표준물.

하기의 실제의 보정용 표준물을 제조한다.

용액은 1개월의 냉장 동안 양호하다.

샘플의 제조

1. 샘플 1 g을 중량을 재어 125 ml의 삼각 플라스크 내로 넣는다.

2. 48.0 ml의 5% HCl 용액을 각각의 샘플에 첨가한다.

3. 2 ml의 ISTD A를 각각의 샘플에 첨가한다.

4. 각각의 플라스크를 알루미늄 호일로 덮고 60℃ 수조에 30분 동안 둔다.

5. 10 mL의 다이클로로에탄을 각각의 샘플에 첨가한다.

6. 샘플을 60초 동안 균질화한다.

7. 샘플의 일부를 30 ml의 원심분리용 튜브에 붓는다.

8. 5 ℃에서 10000 rpm에서 32분 동안 원심분리한다. 상청액을 "샘플 - 희석" 단계 1에서 사용한다.

표준물 및 샘플의 제조

세가지의 마이크로랩(등록상표) 방법을 실행하여 샘플/표준물을 희석시키고 내부 표준물을 첨가하고 FMOC 유도체를 형성한다. 이는 이하에 요약되어 있다.

마이크로랩(등록상표) 로봇을 사용한 샘플 및 표준물의 제조

단계 1: 표준물 - ISTD 첨가 및 희석 단계

1. 각각의 표준물에 있어서 2개의 튜브 세트를 준비한다. 하나의 튜브 세트에 대략 2 mL의 표준물을 넣고, 이 충전 튜브를 마이크로랩(등록상표)의 최좌측 위치에 둔다.

2. 마이크로랩(등록상표)의 최우측 랙 위치에 빈 튜브가 있는 랙을 둔다.

3. 20 ml 유리(섬광) 바이알을 실제 내부 표준 용액 B로 충전시키고 마이크로랩(등록상표) 워크스페이스(workspace)에 둔다.

4. 방법 ADDISTD를 선택한다. (200 ul의 ISTD B, 50 ul의 표준 용액을, 밀리-큐™ 물로 총 부피가 4000 ul가 되게 하여 혼합한다).

5. 본 방법을 행한다.

6. 튜브 세트를 좌측 위치로부터 옮겨 폐기를 위하여 옆에 둔다.

7. 실제 내부 표준 용액을 마이크로랩(등록상표) 워크스페이스로부터 옮겨 냉장시킨다.

단계 3을 위하여 우측 옆에 튜브를 둔다.

단계 2: 샘플 - 희석 단계(ISTD를 샘플 제조 동안 미리 첨가함)

1. 각각의 샘플에 대해 2개의 튜브 세트를 준비한다. 하나의 튜브 세트에 대략 2 mL의 샘플을 넣고, 이 충전 튜브를 마이크로랩(등록상표)의 최좌측 위치에 둔다.

2. 마이크로랩(등록상표)의 최우측 랙 위치에 빈 튜브가 있는 랙을 둔다.

3. 방법 TRANSDIL을 선택한다. (샘플의 번호, 샘플의 양으로 50 ul, 그리고 밀리-큐™ 물을 이용한 최종 희석량으로 4000 ul를 설정한다.)

4. 본 방법을 행한다.

5. 튜브 세트를 좌측 위치로부터 옮겨 폐기를 위하여 옆에 둔다.

단계 3을 위하여 우측 옆에 튜브를 둔다.

단계 3: FMOC 시약의 첨가 - 형광성 유도체의 제조

1. 100 x 16 mm의 나사 뚜껑 튜브 랙을 준비한다.

2. 마이크로랩(등록상표)의 최우측 랙 위치에 랙을 둔다.

3. 상기 희석 단계로부터의 표준물 및 샘플 튜브를 마이크로랩(등록상표)의 최좌측 랙 위치에 둔다.

4. 분취량(22 mL)의 FMOC 시약 용액을 유리 섬광 바이알로 옮긴다. 대략 100 μL의 40% 염화칼슘 용액을 첨가하고, 잘 혼합한다. (염화칼슘을 첨가하여 마이크로랩(등록상표)에 의한 검출에 필요한 "하전된" FMOC 시약을 제조한다.)

5. 바이알을 마이크로랩(등록상표) 워크스페이스에 둔다.

6. 방법 ADDFMOC를 선택한다.

7. 물로부터 희석제로(pH 8.3-8.5) 주사기 1 및 2를 스위치한다.

8. 희석제(pH 8.3-8.5)를 사용하여 주사기 1 및 2에 대해 5회 이상의 세척을 수행한다.

9. 방법 ADDFMOC를 행한다. (450 ul의 FMOC 용액, 250 ul의 상기 ADDISTD로부터의 샘플을 희석제 용액으로 1300 ul의 최종 부피로 혼합한다).

10. 튜브 세트를 샘플(SAMPLE) 랙 위치로부터 옮겨 옆에 둔다.

11. FMOC 시약 용액을 마이크로랩(등록상표) 워크스페이스로부터 옮기고 냉장한다.

13. 튜브 세트를 최우측 위치로 옮켜 배기함에 둔다. 10분 이상 동안, 또는 용액이 맑아질 때까지(그러나 20분 이하) 정치한다.

14. 2 ml의 추출 용액을 각각의 튜브에 첨가한다. 뚜껑을 덮고 고속에서 2분 동안 와동시켜 미반응 FMOC 시약을 추출한다.

15. 55x16 mm 튜브의 다른 튜브 세트를 준비한다. 1 ml의 이동상 용액을 각각의 튜브에 첨가한다.

16. 1.0 mL의 수성(하부) 층을 원심분리 튜브로부터 55x16 mm 튜브로 옮긴다.

17. 상부(유기) 층을 버린다.

18. 샘플을 자동 시료 주입 바이알로 옮기고 밀봉한다.

크로마토그래피

작동 조건

켐 스테이션(Chem Station) 소프트웨어를 구비한 HP 1100

검출기: 워터스 474 주사 형광 검출기

모드: 정상

신호: 0.0000

파장: Ex 260

Em 313

이득(Gain): 10

Atten: 1

응답: FST

컬럼: 페노멕스 루나(Phenomex Luna) C18 (2) 100 x 4.6 mm 3 u

LC 방법

유량: 1.000 ml/분

정조성(Isocratic) 실행(시약의 제조 - 이동 상 참조)

주입 부피: 10.0 ul

온도 설정: 제어하지 않음

계산

샘플 용액을 면적 계산법을 사용하여 공지된 양의 표준물 곡선에 대하여 계산한다:

y = mx + b

y(아스파라긴/ISTD의 비) = m(기울기) x (아스파라긴의 농도) + b (y-절편)

(y - b)/m = x

아스파라긴의 ppm = (아스파라긴의 면적/ISTD의 면적 - 절편)/기울기

예:

아스파라긴의 ppm = (215.45436/551.828 - -0.0165)/0.0023 = 176.93 ppm

[ppm = ug/mL]

샘플 제조 단계에 있어서의 희석/균질화에 대한 보정.

[ppm = ug/mL]

예:

실행 용인성 기준:

실제 참조 물질의 점검 샘플의 정확도는 아스파라긴에 있어서 공지된 결과의 10% 이내이어야 한다.

보정 곡선의 선형도(r ² )는 0.995 이상이어야 한다.

LC 분석의 샘플 크로마토그램

도 3은 LC 분석의 샘플 크로마토그램을 도시한다.

3. 아크릴아미드의 감소 %

아크릴아미드의 감소 % = [(대조 샘플 중 아크릴아미드의 수준 - 효소 처리 샘플 중 아크릴아미드의 수준) / 대조 샘플 중 아크릴아미드의 수준] x 100.

대조 샘플은 효소를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 효소 처리 샘플과 정확하게 동일한 방식으로 제조한다.

4. 아스파라긴의 감소 %

아스파라긴의 감소 % = [(대조 샘플 중 아스파라긴의 수준 - 효소 처리 샘플 중 아스파라긴의 수준) / 대조 샘플 중 아스파라긴의 수준] x 100.

대조 샘플은 효소를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 효소 처리 샘플과 정확하게 동일한 방식으로 제조한다.

[실시예]

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

유효량의 아스파라기나제를 코트디부아르(Ivory Coast) 코코아 빈에 용액의 형태로 첨가하고 충분한 시간 동안 반응시켜 생성되는 볶은 코코아 빈에서 아크릴 아미드가 10%보다 많이 감소되도록 한다. 이어서 효소 처리 코코아 빈을 볶고, 미분화하고, 당업계에 공지된 바와 같이 압착하여 코코아 리커를 형성한다. 30% 과산화수소 용액 2부를 코트디부아르 코코아 리커 100부에 첨가하고 교반시키면서 100℃로 1시간 동안 가열한다. 이 시간 동안, 물이 증발되며, 생성된 리커는 바람직한 연한 색을 가진다.

실시예 2

밀크 초콜렛은 실시예 1의 코트디부아르 코코아 리커를 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 밀크 초콜렛에서 아크릴아미드 수준은 10%보다 많이 감소된 다.

실시예 3

유효량의 아스파라기나제를 가나(Ghana) 코코아 빈에 용액의 형태로 첨가하고 충분한 시간 동안 반응시켜 생성되는 볶은 코코아 빈에서 아크릴 아미드가 10%보다 많이 감소되도록 한다. 이어서 당업계에 공지된 바와 같이, 처리된 코코아 빈을 볶고 미분화하여 빻은 코코아 빈을 형성한다. 빻은 가나 코코아 빈을 30%의 과산화수소에 30분 동안 침지시키고 물로 수회 헹구고 이어서 오븐에서 65℃에서 건조시킨다. 당업계에 공지된 바와 같이, 빻은 코코아 빈을 미분화하여 코코아 리커를 형성한다. 이어서 다크 초콜렛을 가나 코코아 리커를 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 이 다크 초콜렛에서 아크릴아미드 수준은 10%보다 많이 감소된다.

실시예 4

실시예 3의 가나 코코아 리커를 통상적인 방법을 이용하여 코코아 버터 및 코코아 케이크로 압착한다. 코코아 케이크를 미분화하여 코코아 분말을 형성한다. 코코아 분말에서 아크릴아미드 수준은 10%보다 많이 감소된다.

실시예 5

당업계에 공지된 바와 같이, 실시예 2의 밀크 초콜렛을 사용하여 초콜렛 캔디 바를 제조한다. 캔디 바를 소비자에게의 소매용으로 포장한다. 캔디 바의 라벨에 "무 아크릴아미드 초콜렛"이라고 적는다.

실시예 6

실시예 4의 코코아 분말을 유통용으로 포장한다. 코코아 분말의 판매 안내 책자 및 제품 설명 시트에는 코코아 분말에서 아크릴아미드가 10%보다 많이 감소되었음을 명시한다.

본 발명의 특정 실시 형태가 예시되고 설명되었지만, 다양한 다른 변경과 수정이 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 당업계의 숙련자들에게 명백하게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 범주 내에 있는 이러한 모든 변경과 수정을 첨부된 청구의 범위에 포함하고자 한다.

도 1은 아크릴아미드가 아스파라긴 및 카르보닐 공급원(예를 들어 글루코스)으로부터 형성되는 제안된 반응 기전을 도시한다. R ₁ 및 R ₂ 는 H, CH ₃ , CH ₂ OH, CH ₂ (CH ₂ ) _n CH ₃ , 또는 환원당을 구성하는 임의의 다른 성분일 수 있으며; n은 10 미만의 임의의 정수일 수 있다.

도 2는 아스파라기나제를 아스파라긴과 반응시켜 아크릴아미드의 형성을 방지하는 제안된 반응 기전을 도시한다.

도 3은 아스파라긴 및 아스파르트산의 LC 분석에 있어서의 샘플 크로마토그램을 도시한다. x-축은 체류 시간을 나타내며 y-축은 반응을 나타낸다.