有“上帝的食物”之称的巧克力是世界上最奢侈的食物之一。
尽管人类享用巧克力已有三千多年的历史，但研究人员只是近来 才发现，巧克力和其它烘烤过的可可豆产品含有丙烯酰胺。
2002年4月，瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学的研究人员 宣布了他们的发现：在许多种进行热处理的食物和饮料中产生了丙烯 酰胺，一种可能致癌的化合物。后来，发现了烘烤过的可可豆产品(例 如巧克力)含有丙烯酰胺。丙烯酰胺在老鼠体内具有与食物中其它致 癌物类似的致癌能力，但对于人类，其在食物和饮料中的相对致癌能 力还是未知的。对于丙烯酰胺，只有有限的人口资料，并且这些资料 不能证明职业性接触丙烯酰胺有致癌的危险。(FAO/WHO关于食物中 丙烯酰胺健康问题的鉴定：摘要报告；日内瓦，瑞士，2002年6月25 至27日)
虽然需要进一步研究才能确定人们以通常存在于可可产品中的含 量食用丙烯酰胺可产生怎样的健康影响(若存在的话)，但许多消费 者对此表示关注。因此，本发明的一个目的是提供一种降低烘烤过的 可可豆中丙烯酰胺含量的方法。本发明还有一个目的是提供含减量丙 烯酰胺的烘烤过的可可豆。此外，本发明还有一个目的是提供一种商 业制品，该商业制品告知消费者该烘烤可可产品含有减量或少量的丙 烯酰胺。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种降低烘烤过的可可豆中丙烯酰胺 含量的方法。在一个实施方案中，该方法包括将降低天冬酰胺的酶加 入到可可豆中。
在另一个方面，本发明提供了一种降低可可豆中天冬酰胺含量的 方法。在一个实施方案中，该方法包括将降低天冬酰胺的酶加入到可 可豆中。
在另一个方面，本发明提供了含减量丙烯酰胺的烘烤过的可可豆。
在另一个方面，本发明提供了含减量天冬酰胺的可可豆。
在另一个方面，本发明还提供了一种商业制品，该商业制品告知 消费者该包含烘烤过的可可豆的产品含有减量或少量的丙烯酰胺。
在另一个方面，本发明还提供了一种商业制品，该商业制品告知 消费者该包含可可豆的产品含有减量或少量的天冬酰胺。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用 不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
除非另外指明，本文所用的所有百分比(％)均按重量计。
附图简述
图1.图1列出了所提出的反应机理，根据该机理，丙烯酰胺 形成于天冬酰胺和羰基源(如葡萄糖)。R1和R2可以是H、CH3、CH2OH、 CH2(CH2)nCH3，或任何其它组成还原糖的组分；n可以是小于10的任 何整数。
图2.图2列出了所提出的反应机理，根据该机理，天冬酰胺 酶与天冬酰胺反应以阻止丙烯酰胺的形成。
图3.图3列出了天冬酰胺和天冬氨酸LC分析的样本色谱 图。x轴表示保留时间，而y轴表示响应。
发明详述
申请者已发现，加热时，天冬酰胺(存在于几乎所有生命体系中 的天然存在的氨基酸)可产生丙烯酰胺。因此，当加热时，含天冬酰 胺越多的物质趋于包含越高含量的丙烯酰胺；当在存在还原糖的情况 下加热含天冬酰胺物质时尤其如此。
不受理论的限制，据信通过图1中所列的反应机理可产生丙烯酰 胺。据信，游离天冬酰胺的α-氨基与羰基源反应，形成席夫碱。加热 条件下，该席夫碱加合物脱去羧基形成产物，该产物可以：(1)水解 形成β-丙氨酸酰胺(加热条件下该化合物可进一步降解形成丙烯酰 胺)，或(2)分解形成丙烯酰胺和相应的亚胺。(申请者已发现，环 状前体的原子包含丙烯酰胺中的碳原子和氮原子。)
因此，通过在可可豆的最终烘烤前将该可可豆中的天冬酰胺除去 或转变为别的物质，可减少烘烤过的可可豆中丙烯酰胺的形成。当含 有减量天冬酰胺的上述可可豆进行最终烘烤时，形成的丙烯酰胺量也 减少了。
在可可豆的最终烘烤之前，加入可水解天冬酰胺侧链上酰胺基的 酶，可降低存在于烘烤过的可可豆中的丙烯酰胺含量。不受理论的约 束，据信加入上述酶可使天冬酰胺的侧链降解，从而阻止天冬酰胺形 成丙烯酰胺。在这种情况下，酰胺键被水解，并且天冬酰胺被转变为 天冬氨酸。该反应机理列于图2中。
用于本文方法中的优选酶包括，但不限于，天冬酰胺酶。然而， 任何能够水解游离天冬酰胺的酰胺基以阻止形成丙烯酰胺的酶均在本 发明的范围内。
使用酶的优点有许多。这些优点包括：(a)它们是天然、无毒的 物质；(b)它们通常催化指定的反应，而不会产生无需的副反应；(c) 在非常温和的温度和pH值条件下，它们具有活性；(d)在低浓度下， 它们具有活性；(e)通过调节温度、pH值和所用酶的量，可控制反应 速率；以及(f)在反应进行到所需程度后，它们可被失活。(“Food Chemistry”，第4版，Owen R.Fennema编辑，Marcel Dekker， Inc.，New York，1985年，第427、433页。)
A.降低烘烤过的可可豆中丙烯酰胺的方法
在一个方面，本发明提供了一种降低烘烤过的可可豆中丙烯酰胺 的方法。在一个实施方案中，该方法包括降低可可豆中天冬酰胺的含 量。在另一个方面，该方法包括将降低天冬酰胺的酶加入到可可豆中。 优选的酶是天冬酰胺酶。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种降低烘烤过的可可豆 中丙烯酰胺含量的方法，该方法包括：
(1)提供包含天冬酰胺的可可豆；
(2)非必需地低温干燥该可可豆；
(3)非必需地烘烤该可可豆；
(4)风选该可可豆以形成可可豆碎粒；
(5)非必需地烘烤该可可豆碎粒；
(6)非必需地将该可可豆碎粒碾成可可浆；
(7)非必需地烘烤该可可浆；
(8)非必需地将该可可浆压榨成可可饼和可可油；
(9)非必需地将该可可饼碾成可可粉；
(10)非必需地在以上步骤1至9中任何一步之前、之中或之 后加入碱；
(11)在以上步骤1至6中任何一步之前、之中或之后加入酶。
1.提供包含天冬酰胺的可可豆
产可可豆的可可树生长于热带和亚热带气候。一旦摘下，就将覆 盖在豆上的粘液除去。收获后使豆发酵数天，然后干燥。任何适宜的 干可可豆，包括各种豆的混合物，可依照本发明使用。本文所用术语 “可可豆”或“豆”包括本领域已知的任何适宜形式的可可豆。合适 的可可豆包括描述于Bernard W.Minifie的“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”，AVI Publishing Co./Van Nostrand Reinhold，New York，New York，1989(以下为“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”)的那些。
2.非必需地低温干燥可可豆
可可豆可非必需地在低温下以任何适宜的方法干燥。合适的干燥 方法包括本领域已知的那些，例如公开于“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”中的那些。本文所用低温干燥是指在足以干燥豆的低 温、但又不能太高而烘烤它们的温度下干燥。
3.非必需地烘烤可可豆
可非必需地将可可豆烘烤。可使用包括烘烤的任何适宜方法。本 文所用术语“烘烤”包括对可可豆任何适宜的热处理以产生象征可可 的风味。合适的烘烤技术包括本领域已知的那些，例如描述于 “Chocolate，Cocoa，and Confectionery”中的那些。在另一个实 施方案中，如本领域已知的对可可豆低温烘烤。
4.风选干燥的可可豆以形成可可豆碎粒
如本领域所已知的，然后对干燥的可可豆风选以形成可可豆碎粒。 可可豆碎粒的尺寸可为任何所需尺寸。然而，优选较小尺寸的可可豆 碎粒以有利于酶移动通过所有可可豆碎粒，这是由于增加的表面积和 减少的移动距离。
5.非必需地烘烤可可豆碎粒
然后可非必需地通过任何适宜方法对可可豆碎粒进行烘烤。合适 的烘烤技术包括本领域已知的那些，例如公开于“Chocolate，Cocoa， and Confectionery”中的那些。
6.非必需地将可可豆碎粒碾成可可浆
可通过任何适宜方法，例如本领域已知的那些，将可可豆碎粒碾 碎以形成可可浆。合适的碾碎技术包括公开于”Chocolate，Cocoa，and Confectionery”中的那些。
7.非必需地烘烤可可浆
可非必需地对可可浆进行烘烤。在可可豆在形成可可浆之前只是 稍微烘烤且水分含量相对较高的情况下，可加入酶并容许反应。然后 将可可浆进一步烘烤以产生风味。
8.非必需地将可可浆压榨成可可饼和可可油
可非必需地将可可浆压榨成可可饼和可可油。合适的压榨方法包 括本领域已知的那些，例如公开于“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”中的那些。
9.非必需地将可可饼碾成可可粉
可非必需地通过任何适宜方法将可可饼碾碎。合适的碾碎方法包 括本领域已知的那些，例如公开于“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”中的那些。
10.非必需地在以上步骤1至9中任何一步之前、之中或之后 加入碱
如本领域所已知的，在可可豆加工期间可非必需地加入碱。参见， 例如“Chocolate，Cocoa，and Confectionery”。
11.在以上步骤1至6中任何一步之前、之中或之后加入降低 天冬酰胺的酶
本文所用“降低天冬酰胺的酶”包括任何能够降低可可豆中天冬 酰胺含量的酶。在一个实施方案中，该降低天冬酰胺的酶是能够水解 游离天冬酰胺的酰胺基的酶。可用于本文的优选酶是天冬酰胺酶。天 冬酰胺酶的优选来源是Sigma-Aldrich，目录号#A2925。
本文所用术语“降低天冬酰胺的酶”和“酶”包括一种或多种酶； 例如，该术语包括两种或多种酶的混合物。例如，具有降低天冬酰胺 功能的脱酰氨基酶包括于该术语中。
可将酶以任何适宜的形式加入到可可豆中。例如，可将酶以粉末 或溶液的形式加入。此外，可将酶以任何适宜的方式加入到可可豆中， 如直接加入(例如，淋洒、倾倒或喷射在可可豆上，或者可将可可豆 浸泡在酶溶液中)或间接加入。本文所用的向可可豆中“加入”酶包 括，但不限于，任何将天冬酰胺和酶放在一起的方法。
在一个实施方案中，将酶加入到可可豆碎粒中。在该实施方案中， 酶优选为溶液形式，并通过浸泡或喷射可可豆碎粒或它们的组合施用。
酶可在完成最终烘烤以形成烘烤过的可可豆之前的该方法任何适 宜步骤中加入。此外，酶可在该方法的多个步骤中加入。在一个实施 方案中，将酶在发酵之前或发酵期间加入到可可豆中。在另一个实施 方案中，将干豆浸泡在酶溶液中。
酶是按照活性单位来销售的，而不是按照重量或体积。因此，获 得期望的丙烯酰胺减少量所需酶的有效量将取决于所用具体酶产品的 活性。
酶的加入量可取决于天冬酰胺的减少量，以及由此所期望的丙烯 酰胺的减少量。加入酶的量还取决于存在于可可豆中的天冬酰胺量； 含有较多天冬酰胺的可可豆，通常需要增加酶的量或增加反应时间， 以达到相同的丙烯酰胺减少量。酶的加入量还取决于所用的具体酶(例 如，具体酶的酶活性)和所处理的可可豆具体种类。本领域的技术人 员将能够依据具体的可可种类、具体的酶、酶的具体活性和期望的结 果，决定酶的有效量。
将酶加入到可可豆中的优选方法包括喷射、浸泡、淋洒和主浴。 在一个实施方案中，酶溶液的施用是通过将该溶液喷射在可可豆上并 伴随对豆的温和搅拌，以产生对所有豆表面的均匀施用。
在另一个实施方案中，将可可豆浸泡在酶溶液中以水合这些豆。 所用溶液量取决于这些豆所需的最终水分含量。酶溶液的所用量可使 得所有液体被豆吸收，或者所用量可使得溶液被可可豆吸收后仍有过 量溶液剩余。在另一个实施方案中，可可豆在溶液中水合，然后将酶 粉末喷洒在水合的可可豆上。可通过将颗粒从溶液中分离的任何适宜 方法将豆从溶液中除去，例如通过筛分。
在另一个实施方案中，利用主浴将酶加入到豆中。将几批豆连续 浸泡在包含酶的溶液中，直到从豆中提取出的可溶解物质与溶液达到 平衡或接近平衡。在一个实施方案中，主浴中的酶将天冬酰胺转变成 天冬氨酸时，因此对后来加入的几批豆的另外天冬酰胺提取产生了驱 动力。可提取物质与可可豆达到平衡，使得除天冬酰胺以外的其它可 溶解可可组分不被提取出来，而天冬酰胺继续反应并被酶转化。形成 于天冬酰胺的天冬氨酸浸回到豆中并达到平衡。每批豆处理完后加入 补充的水和/或含酶溶液，以补偿进入上一批豆的溶液；这使得主浴保 持恒容。
在一个实施方案中，将至少一部分天冬酰胺从可可豆中提取出来， 所得提取物用酶处理，然后将至少一部分提取物加回到至少一部分可 可豆中；例如，可将该酶加入到提取物中，或将提取物经由固定酶床 或固定酶柱(在柱中，酶被吸附或化学键合在基质上，优选为惰性基 质，如塑料片或小珠)抽出。
酶与天冬酰胺反应所需的时间取决于以下因素，包括，但不限于， 所期望的天冬酰胺(和因此产生的丙烯酰胺)减少量、具体可可豆的 性质(如化学组成、天冬酰胺的含量、粒度)以及加入的具体酶。优 选使酶反应足够的时间以得到如下的可可豆，其中天冬酰胺的含量已 降低至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还更优选至 少约70％，甚至更优选至少约90％。通常，让酶反应的时间越长，烘 烤过的可可豆中天冬酰胺减少的量越大，因此丙烯酰胺减少的量越大。 给予足够的时间使酶反应的步骤可以任何适宜的方式进行；例如，该 步骤可与将酶加入到可可豆中、将酶与可可豆混合、酶溶液被可可豆 吸收，或它们的组合同时进行。
如本领域所知，pH值和温度是影响酶活性的因素。本领域的技术 人员应易于确定这些和其它参数(如含水量)的最佳条件。此外，具 体酶的最佳pH值和温度条件典型地在文献中和/或酶供应商处获得。
在酶已反应至所需程度后，可非必需地使其失活，或从可可豆中 除去。当使用可安全食用的酶(如天然存在和存在于普通食物中)时， 可选择不使酶失活或将其除去。可供选择地，可使用任何适宜的失活 酶方法使酶失活。例如，通过利用热、pH调节、用蛋白酶处理或它们 的组合，可使酶失活。此外，可通过任何适宜的方法将酶从可可豆中 除去，该方法包括但不限于提取。酶可被失活、除去，或联合进行失 活和除去。
可通过加热使酶失活，从而非必需的失活步骤和烘烤可可豆可同 时进行。热处理可使酶变性和失活，使得烘烤过的可可豆不再具有持 续的酶活性。此外，在烘烤步骤中，给予至少一部分时间使酶进行反 应。
可通过加热使酶失活，从而非必需的失活步骤和烘烤可可豆可同 时进行。热处理可使酶变性和失活，使得烘烤过的可可豆不再具有持 续的酶活性。此外，在烘烤步骤中，给予至少一部分时间使酶进行反 应。
12.包含烘烤过的可可豆的产品
烘烤过的可可豆可按原样使用，或者可被用于制作多种烘烤过的 可可产品，例如巧克力糖、糖块、糖衣、液体浓缩物、速溶或粉状可 可、可可饮料(例如热冷即用型可可、出售的可可、商用和家用可可)、 混合物、糖食(例如糖果)、甜点(例如蛋糕、冰淇淋、慕丝、奶油 冻)、酥皮点心(例如丹麦酥皮饼、油炸圈饼)、沙司和汤(例如胡 辣汤)。
包含本发明烘烤过的可可豆的烘烤过的可可豆产品可具有的丙烯 酰胺减少量为至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约50％，还 更优选至少约70％，甚至更优选至少约90％。
在一个实施方案中，黑可可粉末的丙烯酰胺含量小于约350ppb， 优选小于约250ppb，更优选小于约100ppb。
B.实施所述方法的方式
可以任何适宜的方式来实施本发明。例如，可以分批、半分批或 连续的方式来实施本发明的方法。
C.商业制品
在另一个方面，本发明提供一种商业制品。在一个实施方案中， 该商业制品包括：
(a)包含烘烤过的可可豆的产品，其中所述烘烤过的可可豆具有 减量的丙烯酰胺；
(b)装盛产品的容器；和
(c)与容器有关的提示信息。
附在容器上的提示信息告知消费者该产品具有减量的丙烯酰胺。 在一个实施方案中，提示信息告知消费者由可可豆制成的该产品含有 减量或少量的天冬酰胺。该提示信息可以是直接或间接附在容器上、 直接或间接附在容器附近的印刷物，或可供选择地，可以是与容器有 关的印刷、电子或广播提示信息。合适的提示信息包括，但不限于， 告知“减量”或“少量”丙烯酰胺的提示信息，告知含有小于规定量 丙烯酰胺的提示信息，以及告知该烘烤过的可可豆、包含烘烤过的可 可豆的产品和/或商业制品达到或超过建议量或强制量(如规定的阈值 或正常含量)的提示信息。
可配发、呈现、展示或储存含烘烤过的可可豆产品的任何容器均 是合适的。合适的容器包括，但不限于，袋、罐、盒、碗、盘、盆和 筒。
分析方法
用特定的分析方法量化用于表征本发明成分的参数。这些方法详 细描述如下。
1.丙烯酰胺
测定食品中丙烯酰胺(AA)的方法
概述
将1-13C-丙烯酰胺(13C-AA)掺入到食品中，然后用热水提取。 用乙酸乙酯萃取含水上清液三次，合并乙酸乙酯萃取物，并浓缩，然 后用带有具体检测AA和13C-AA的选择性离子监测的LC/MS分析。
样品的萃取
1.称量6.00±0.01g样品，放于125mL锥形瓶中。注意：将 样品放到食品加工机中，并脉动30秒，使粒度达约3.2mm(1/8英 寸)或更小。如果样品太小以致不能在食品加工机中被有效地粉碎， 则将样品置于一个新塑料袋中(如Whirl-PakTM或等价物)，然后用橡 皮锤粉碎，直至粒度达约3.2mm(1/8英寸)或更小。
2.使用可调节的1000-μL移液管(已校准)将120μL的 100ng/μL13C-AA去离子蒸馏水溶液(ISTD 2)直接加在样品上。
3.使用分配器，将40mL去离子蒸馏水加入到烧瓶中，并以箔 覆盖。
4.在65℃的水浴中放置30分钟。
5.用分配器将10mL 1，2-二氯乙烷加入到烧瓶中，然后用 Tekmar TissumizerTM(SDT-1810)或Ultra-(T18 Basic)匀 化30秒，或直至均匀。用去离子蒸馏水冲洗探头，洗液接至该烧瓶 中。
6.将25g的均匀混合物放置在30ml(8打兰)的小瓶中。
7.盖紧管口，然后以2500至5200转/分的速度离心30分 钟。
8.将8g上清液小心地转移到另一个30ml(8打兰)的小瓶 中，注意不要将固体颗粒转移过去。
9.用分配器加入10ml乙酸乙酯，盖上盖，并涡旋10秒。
10.使所有乳液破乳；这可借助于涡旋或振荡一次或两次，然后 使各层分开。
11.将尽可能多的上层(乙酸乙酯)转移到闪烁管中，而不要转 移界面处的任何液体(水)。每次用5ml乙酸乙酯萃取两次以上，并 加入到同一个闪烁管中。然后，加入约2g无水硫酸钠。
12.在60℃至65℃的水浴中，用和缓的氮气流将该萃取物浓 缩至约1ml。将该萃取物转移到Pierce REACTI-VIALTM或等效的锥形 玻璃瓶中，并进一步浓缩该萃取物，直至最终体积约为100至200 μL。将该萃取物放入到带锥形套管的自动取样瓶中。
标准物的配制
储备液和内标物
  溶液   重量   容量瓶   溶剂  浓度(ppm)   储备液1   0.1000g丙烯酰胺   (AA)   100ml   乙酸乙酯  1000   ISTD1   0.0100g   13C-丙烯酰胺   100ml   乙酸乙酯  100   储备液2   0.1000g丙烯酰胺   (AA)   100ml   去离子蒸馏水  1000   ISTD2   0.0100g   13C-丙烯酰胺   100ml   去离子蒸馏水  100
中间标准物
  溶液 储备液1AA的体积 (μL)   容量瓶   (ml)   溶剂   浓度(ppm)   INT1 100   10   乙酸乙酯   10   INT2 1000   10   乙酸乙酯   100
校正标准
  标准物   体积   INT1   (μL)   体积   INT2   (μL)   ISTD1   的体积   (μL)   容量瓶   (ml)   溶剂   浓度   AA   (ppm)   浓度   ISTD1   (ppm)   0   0   0   450   10   乙酸乙酯   0   4.50   0.25   250   0   450   10   乙酸乙酯   0.250   4.50   0.75   750   0   450   10   乙酸乙酯   0.750   4.50   1.5   0   150   450   10   乙酸乙酯   1.50   4.50   3.0   0   300   450   10   乙酸乙酯   3.00   4.50   5.0   0   500   450   10   乙酸乙酯   5.00   4.50
匀化器清洁方法
在测定每个样品的间隔，用该清洁方法清洁匀化器。
1.将热自来水注入一个1L的锥形瓶中(≈80％满)，然后加 入一滴DawnTM餐具洗涤液(购自Procter&Gamble Co.)或等效物。
2.将分散元件的探头尽可能深地插入到水中。
3.将溶液匀化约10至15秒。
4.将洗涤液从锥形瓶中倒出；用热自来水冲洗并再注入该锥形 瓶。
5.再次匀化约10至15秒。
6.将锥形瓶倒空，再注入热自来水；再次匀化约10至15秒。
7.如果水不澄清且有颗粒物，则继续按需要多次匀化干净的热 自来水，直至达到这个条件。
8.当热自来水澄清且无颗粒物时，用去离子蒸馏水冲洗探头。
用LC/MS分析
使用连接在Micromass LCZ质谱仪上的Waters 2690LC，对样 品进行分析。
  流动相   100％H2O，10mM NH4Ac，pH值调节至4.6w/甲酸   色谱柱   2.0mm×150mm，YMC C18 AQ(购自Waters Corp.)   流速   0.2ml/min   界面   直接(无分层)   进样体积   5μL   MS离子化方式   电喷雾，正离子模式   MS检测方式   选择性离子监测：m/z72(AA)，m/z73(13C-AA)；停留时间：0.5s
数据分析
对于一系列乙酸乙酯中的五个标准样品，将响应比(AA峰的面积 /13C-AA峰的面积)对相应的浓度比作图。所有标准样品包含 4.5μg/ml的13C-AA，并且AA的浓度为0至5μg/ml。线性回归产生 标准曲线，借助该标准曲线，从所测定的响应比中确定萃取物中的浓 度比。当该浓度比乘以在萃取方法的步骤二加入到样品中的精确已知 的13C-AA含量(标称2ppm)时，就可得到AA的ppm含量。
LC/MS的样品计算：
通过将y轴上的响应比(m/z 72的面积/m/z 73的面积)，对 x轴上的浓度比([AA]/[13C-AA])作图，产生标准曲线。对于本实施 例，该线的方程是y＝0.899x+0.0123。
4.0分钟时AA峰(m/z 72)的测定面积：100,000
4.0分钟时13C-AA峰(m/z 73)的测定面积：500,000
响应比Rr＝0.200。从标准曲线的斜率和截距，计算浓度比Rc为： Rc＝(0.200-0.0123)/0.899＝0.209
已知样品中13C-AA的掺入量(2ppm)，则AA的测定含量为 0.209×2ppm＝0.418ppm
质量保证/质量控制(QA/QC)
1.在准备标准物和/或样品时使用的所有天平，必须每周用一系 列标准砝码检查它们的校准。这些天平应使用至少三个覆盖待测样品/ 标准物重量范围的砝码来检查。
2.应每天作出六个点的校准曲线。
3.应使用每一组样品分析工作参考物质(WRM)。该物质浓度的 游动平均值应在2σ之内。如果不在该范围内，则该仪器应重新校准， 并重新计算WRM。
2.天冬酰胺
测定食物和饮料制品中的天冬酰胺和天冬氨酸
原理
将已称过重量的样品与5％HCl混合，并加热30分钟，然后匀 化。将一部分均匀混合物离心，然后将一部分上清液稀释，并用FMOC 试剂(9-芴甲基氯甲酸酯)处理，该试剂与天冬酰胺和天冬氨酸反应 形成强荧光衍生物。然后用反相HPLC将FMOC-天冬酰胺从其它样品 基质组分中分离开来。在260nm处激发，检测313纳米(nm)处的 荧光发射。已知浓度的标准物分析可进行定量。
线性度
四个标准样品(50至600ppm)的工作标准曲线给出的相关性为 0.998或更高。由2000ppm的样品得出的曲线也给出了0.998的相 关性。
精度
马铃薯制品：
马铃著淀粉中掺入四种含量的天冬酰胺和天冬氨酸(40、200、400 和600ppm)。天冬酰胺的回收为100％(相对标准偏差小于4％)， 而天冬氨酸的回收为110％(相对标准偏差小于4％)。
体系可重复性
在五天内一式两份平行测定炸薯片的工作参考物质。结果如下：
        ug/g                           ug/g
        天冬酰胺                       天冬氨酸
平均值  7832.07                        1440.98
STD     625.59                         195.80
％RSTD  7.99                           13.59
以下是建议使用的化学药品和仪器；然而，等效物质的替换是可 接受的。
化学药品
水，HPLC级或Milli-QTM级(Millipore)
乙腈，HPLC级                            Burdick&Jackson#AH015-4
甲醇，HPLC级                            Fisher#A452-4
乙酸乙酯                                Baker#9280-3
戊烷                                    Burdick&Jackson#GC312-4
天冬酰胺一水合物                        EM Science
天冬氨酸                                Sigma#A-8949
氨基异丁酸                              Sigma#A-8379
9-芴基氯甲酸酯(FMOC)                    ICN#150200
硼酸钠                                  EM Science#SX 0355-1
硼酸                                   Fisher#A-73
碳酸氢钠                               ICN#194847
四甲基氯化铵                           Fisher#04640-500
柠檬酸钠                               MCB#SX445
无水柠檬酸                             Baker#0122-01
丙酮                                   Burdick&Jackson#010-4
盐酸，0.1N                             Fisher#SA48-500
二水氯化钙                             Aldrich#22，350-6
装置
移液管，聚乙烯(Samco#222)
容量瓶(25、100、250、1000ml)
定容吸移管(10ml)
量筒(100-1000ml)
HPLC贮液器(500ml、1L或2L)
烧杯
磁力搅拌器/搅拌子
分析天平(4位)
闪烁管
离心管，带盖的螺旋帽(100×16mm)
自动取样瓶(8×30mm，1ml)，卡口盖
安全性：该方法需要使用通风橱，并且涉及接触化学药品。请查 阅关于通风橱使用和化学品溅出的安全规章。
仪器               型号               生产商
                                                 
自动仪                  SPE Hamilton
泵/HPLC注射器      HP 1100            Agilent
检测器             RF10AXL            Shimadzu
数据系统           Chemstation        Agilent
色谱柱
Phenomenex Luna 100×4.6mm C-18(2)3微米#00D-4251-E0
配制试剂
稀释剂(pH 8.3至8.5；1000ml)。
1.称量3.0克硼酸钠、3.0克硼酸和8.0克碳酸氢钠于一个已 去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800ml烧杯。加入约500ml Milli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L的容量瓶中，并用Milli-QTM 水稀释至容积；混合均匀。可稳定放置最多六(6)个月。
氯化钙溶液(100克)。
1.称量40克二水合氯化钙于已去皮重的250ml烧杯中。
2.加入60克Milli-QTM水。混和均匀。在环境条件下保存于有 盖的玻璃瓶中。可稳定放置最多1年。
萃取溶剂(戊烷∶乙酸乙酯80∶20；500ml)
安全性：戊烷和乙酸乙酯是易挥发和易燃的。在通风橱中进行以 下操作。
1.将400ml戊烷转移至500ml HPLC贮液瓶中。
2.加入100ml乙酸乙酯。混和均匀。在通风橱中/下盖上盖保存。
流动相(缓冲剂∶甲醇∶乙腈60∶5∶35，pH 3.2，2L)
1.称量1.35克四甲基氯化铵、3.65克柠檬酸和1.60克柠檬 酸钠于已去皮重的干燥烧杯中。
2.在磁力搅拌器上放置一个空的800ml烧杯。加入约500ml Milli-QTM水和搅拌子。剧烈搅拌水，但不要喷溅出来。
3.将步骤1的试剂定量转移到水中；搅拌直至其完全溶解。
4.将步骤3的溶液定量转移到1L量筒中，并用Milli-QTM水稀 释至1000ml；混合均匀。
5.将其转移至2升的HPLC流动相贮液器中。
6.加入200ml Milli-QTM水、100ml甲醇和700ml乙腈。在剧烈 搅拌下，缓慢地加入后两种溶剂。在通风橱中进行该操作，并穿戴个 人防护装备。具体细节请参见相关的物质安全性数据表(MSDS)。
7.搅拌时，用真空抽吸对流动相进行脱气。
FMOC试剂溶液(丙酮中)
1.称量0.10克FMOC试剂于已去皮重的100ml容量瓶中。
2.加入丙酮溶解，同样用它稀释至容积。混和均匀。在通风橱中 进行该操作。穿戴上化学药品的MSDS中规定的PPE。
3.冷冻保存不超过六(6)个月。
用于样品萃取的酸溶液(5％HCl)
1.将100ml Milli-QTM水加200ml容量瓶中。
2.将4ml 1N的HCl加入容量瓶中。
用Milli-QTM水稀释至容积。
配制内标物(氨基异丁酸)
ISTD A-内标物储备液A
1.称量0.5克氨基异丁酸于已去皮重的250ml容量瓶中。
2.加入25ml 1.0N HCl和约100ml Milli-QTM水。涡旋混合，直 至溶解。
用Milli-QTM水稀释至容积，并混合均匀。冷冻保存不超过六(6) 个月。
ISTD B-工作内标物溶液B(将此溶液加入到校准标准物中) 1.吸移1ml内标物溶液A至100ml容量瓶中。
2.用Milli-QTM水稀释至容积。可稳定保存1个月。
配制校准标准物
储备校准液。
于已去皮重的50ml容量瓶中，称量0.100g(+/-0.001g)天 冬酰胺和0.100g(+/-0.001g)天冬氨酸。加入25ml Milli-QTM水 和1ml 1N的HCl。将其置于声波浴中，直至溶解，然后用Milli-QTMH2O 稀释至容积。冷冻下溶液可保持有效6个月。
工作标准物。
配制以下工作校准标准物：
  标准物#   mL储备液   最终体积(ml)   ppm   1   5   200   50   2   5   100   100   3   1   10   200   4   3   10   600
冷冻下溶液可保持有效一个月。
样品的配制
1.称量1g样品于125ml锥形瓶中。
2.每个样品中加入48.0ml 5％的HCl溶液。
3.每个样品中加入2ml ISTD A。
4.用铝箔将每个烧瓶盖上，并在60C的水浴中放置30分钟。
5.每个样品中加入10ml二氯乙烷。
6.将样品匀化60秒。
7.将一部分样品倒入到30ml离心管中。
8.在5℃下以10000rpm离心32分钟。上清液用于“样品- 稀释”步骤1中。
配制标准物和样品
使用三种方法来稀释样品/标准物、加入内标物、并 形成FMOC衍生物。它们概述如下。
操作                          所用的Microlab方法
稀释                          TRANSDIL
加入内标物                           ADDISTD
形成FMOC衍生物                       ADDFMOC
使用 自动仪配制样品和标准物
步骤1：标准物-加ISTD和稀释步骤
1.对于每个标准物，准备两套管子。在一套管中，放入约2ml标 准物，将这些装有标准物的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.将工作内标物溶液B注入20ml玻璃(闪烁)管中，并放置 在的工作区上。
4.选择方法ADDISTD。(混合200μl ISTD B、50μl标准物溶液， 用Milli-QTM水将总容积稀释至4000μl)。
5.实施该方法。
6.从左边位置上取下管组，弃于一边。
7.从工作区取出工作内标物溶液，并冷冻。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤2：样品-稀释步骤(ISTD已在样品配制过程中加入)
1.对于每个样品，准备两套管子。在一套管子中，放入约2mL样 品，将这些装有样品的管子放置在最左边的位置上。
2.将放有空管子的管架放置在最右边的架位上。
3.选择方法TRANSDIL。(设置样品号，样品量为50μl，并且 用Milli-QTM水稀释的最终稀释量为4000μl。)
4.实施该方法。
5.从左边位置上取下管组，弃于一边。
留下右边的管子用于步骤3。
步骤3：加入FMOC试剂-制备荧光衍生物
1.准备一架100×16mm的螺帽管。
2.将管架放置在最右边的架位上。
3.将得自上面稀释步骤的标准物管和样品管放置于 最左边的架位上。
4.将等分(22ml)的FMOC试剂溶液转移到玻璃闪烁管中。加 入约100μL 40％氯化钙溶液；混合均匀。(加入氯化钙使 FMOC试剂“带电”-这是用测定所必需的)。
5.将闪烁管放置于工作区上。
6.选择方法ADDFMOC。
7.将注射器1和2从水切换到稀释剂(pH 8.3至8.5)。
8.用稀释剂(pH 8.3至8.5)对注射器1和2进行洗涤至少 五(5)个循环。
9.实施方法ADDFMOC。(将450μl FMOC溶液、250μl得自上 面ADDISTD的样品混合，用稀释剂溶液稀释至最终容积为 1300μl)。
10.从样品架位上取下管组，并丢弃。
11.从工作区取出FMOC试剂溶液，并冷冻。
13.从最右边的位置上取下管组，并置于通风橱中。静置至少10 分钟，或直至溶液澄清(但不超过20分钟)。
14.每个管子中加入2ml萃取溶剂。盖上盖，并高速涡旋二(2) 分钟，以萃取出未反应的FMOC试剂。
15.准备另一管架55×16mm的管子。每个管子中加入1ml流动 相溶液。
16.将1.0ml水层(下层)从离心管中转移到55×16mm的管中。
17弃去上层(有机层)。
18.将样品转移到自动取样瓶中，并密封。
色谱法
操作条件
装有Chem Station软件的HP 1100
检测器：Waters 474扫描荧光检测器
型号：Norm
信号：0.0000
波长：激发260
发射313
增益：10
衰减：1
响应：FST
色谱柱：Phenomex Luna C18(2)100×4.6mm 3u
LC方法
流量：1.000ml/min
等度操作(参见试剂配制-流动相)
注射体积：10.0ul
温度设置：不控温
计算
使用面积值，相对于已知量的标准曲线计算样品溶液：
y＝mx+b
y(天冬酰胺/ISTD比率)＝m(斜率)x(天冬酰胺浓度)+b(y轴截距)
(y-b)/m＝x
天冬酰胺(ppm)＝(天冬酰胺面积/ISTD面积-截距)/斜率
实施例：
天冬酰胺(ppm)＝(215.45436/551.828--0.0165)/0.0023＝176.93ppm
[ppm＝ug/mL]
对于样品制备步骤中稀释/均化的校正。

[ppm＝ug/ml]
实施例：

进行合格判断标准：
·工作标准物质对照样品的准确度必须在天冬酰胺已知结果的 10％范围之内。
·校准曲线的线性度(r2)必须为0.995或更大。
样品的LC色谱分析
图3列出了样品的LC色谱图分析。
  停留时间   化合物   4.5分钟   天冬酰胺   6.6分钟   天冬氨酸   11.5分钟   FMOC试剂   20.7分钟   ISTD
3.丙烯酰胺的减少％
丙烯酰胺的减少％＝[(对照样品中丙烯酰胺的含量-酶处理 的样品中丙烯酰胺的含量)/对照样品中丙烯酰胺的含量]×100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相 同。
4.天冬酰胺的减少百分比
天冬酰胺的减少％＝[(对照样品中天冬酰胺的含量-酶处理过 的样品中天冬酰胺的含量)/对照样品中天冬酰胺的含量]×100。
除了没有加入酶，对照样品的配制方法与用酶处理样品的完全相 同。
实施例
以下实施例举例说明本发明，但不旨在对其进行限制。
实施例1
将有效量的天冬酰胺酶加入到溶液形式的象牙海岸可可豆中，并 容许反应足够的时段，使得所得烘烤过的可可豆的丙烯酰胺减少量大 于10％。如本领域所已知的，然后将酶处理过的可可豆烘烤、碾碎， 并压榨成可可浆。将两份30％的过氧化氢溶液加入到100份的象牙 海岸可可浆中，并在搅拌下加热至100℃，时间为1小时。在这段 时间内，水分蒸发且所得可可浆具有所需的浅色。
实施例2
使用实施例1的象牙海岸可可浆通过常规方法制作牛奶巧克力。 该牛奶巧克力的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例3
将有效量的天冬酰胺酶加入到溶液形式的加纳可可豆中，并容许 反应足够的时段，使得所得烘烤过的可可豆的丙烯酰胺减少量大于 10％。如本领域所已知的，然后将处理过的可可豆烘烤并碾成可可豆碎 粒。将加纳可可豆碎粒浸泡在30％的过氧化氢中30分钟，用水漂 洗几次，然后在烘箱内干燥，温度为65℃。如本领域所已知的，将可 可豆碎粒碾成可可浆。然后使用加纳可可浆通过常规方法制作黑巧克 力。该黑巧克力的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例4
利用常规方法将实施例3的加纳可可浆压榨成可可油和可可饼。 将该可可饼碾成可可粉。该可可粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
实施例5
如本领域所已知的，使用实施例2的牛奶巧克力制作巧克力糖 块。将该糖块进行包装以零售给消费者。糖块上的标签写道，“不含 丙烯酰胺的巧克力”。
实施例6
将实施例4的可可粉进行包装以用于商业销售。该可可粉的销售 小册子和产品说明书传单声明该可可粉的丙烯酰胺减少量大于10％。
尽管已说明和描述了本发明的具体实施方案，但对于本领域的技 术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可 作出许多其它的变化和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中 包括本发明范围内的所有这些变化和修改。
参考文献
1.Herbert，P.；Santos，L；Alves，A.Journal of Food Science (2001年)，第66卷(第9期)，第1319至1325页。
2.Heems，Dany；Luck，Geneviewe；Fraudeau，Chrisophe；Verette， Eric.Journal of Chromatography，A(1998年)，第798卷(第1 +2期)，第9至17页。