담즙산염자극 리파아제의 변이체, 이를 코딩하는 데옥시리보핵산 분자, 및 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물

담즙산염자극 리파아제의 변이체, 이를 코딩하는 데옥시리보핵산 분자, 및 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물{Variants of Bile Salt-Stimulated Lipase, DNA Molecules encoding them and Transgenic Non-Human Mammals}

식이성 지질의 가수 분해

식이성 지질은 중요한 에너지원이다. 에너지가 풍부한 트리아실글리세롤은 이러한 지질의 95% 이상을 차지한다. 특정 지질, 예를 들면 특정 지방산 및 지용성 비타민은 필수 식이 성분이다. 위장관 흡수 전에, 트리아실글리세롤 및 소수 성분, 즉 에스테르화 지용성 비타민 및 콜레스테롤, 및 디아실포스파티딜글리세롤은 소수성이 덜한 흡수 가능한 산물을 제공하기 위해 에스테르 결합의 가수 분해가 필요하다. 이들 반응은 리파제라 불리는 특정 군의 효소에 의해 촉매된다.

사람에 있어서, 관련 필수 리파아제는 위 리파아제, 췌장 콜리파아제 의존성 리파아제(트리- 및 디아실글리세롤의 가수 분해), 췌장 포스포리파아제 A2(디아실포스파티딜글리세롤의 가수 분해) 및 카르복실산 에스테르 히드롤라제(CEH)(콜레스테릴- 및 지용성 비타민 에스테르 및 트리-, 디-, 및 모노아실글리세롤의 가수 분해)로 사료된다. 젖을 먹는 신생아에서, 담즙산염 자극 리파아제(BSSL)는 상기 언급한 여러 지질의 가수 분해에 필수 역할을 담당한다. 담즙산염과 함께, 지질 소화의 생성물은 혼합된 미셀 또는 박막 소포(unilamellar vesicle)를 형성(Hernell 등, 1990)함으로써 흡수가 발생한다.

담즙산염 자극 리파아제

담즙산염 자극 리파아제(BSSL)은 제한된 수의 종, 즉 사람, 고릴라, 고양이 및 개에서 젖의 한 구성 성분이다(Hernell 등, 1989; Hamosh 등, 1986). 상부 소장 부위에서 담즙과 혼합시, BSSL은 제1 담즙산염에 의해 특히 활성화된다(Hernell 등, 1975). 총 유단백질의 약 1%에 해당하는 BSSL(Blackberg & Hernell, 1981)은 젖과 함께 위를 통과시 분해되지 않으며, 십이지장 내용물에서는 담즙산염에 의해, 트립신 및 키모트립신과 같은 췌장 프로테아제에 의해 불활성화되는 것으로부터 보호된다.

BSSL을 완전히 불활성화시키는 사람 젖의 열처리(62.5℃에서 30분간 저온 살균) (Bjorksten 등, 1980)는 지방 흡수율을 미숙아에서 약 1/3 감소시킨다 (Williamson 등, 1978; Atkinson 등, 1981). 따라서, 유사한 지방 조성을 갖는 유아식의 이용율에 비해, 신선한 사람 젖의 트리아실글리세롤의 이용율이 더 높은 것은 BSSL에 기인한다(Hernell 등, 1991; Chapell 등, 1986).

BSSL은 비특이성 리파아제(EC 3.1.1.1)로서, 트리아실글리세롤 뿐만 아니라디- 및 모노아실글리세롤, 콜레스테릴 에스테르 및 지용성 비타민 에스테르를 가수분해시킨다(Blackerg & Hernell, 1983). 즉, 활성후의 BSSL은 위 리파아제(EC 3.1.1.3), 콜리파아제 의존성 췌장 리파아제(EC 3.1.1.3) 및 BSSL의 상승 작용이 있어야 사람 젖의 트리아실글리세롤의 이용에 가장 효율적이긴 하지만, 그 자체만으로도 사람 젖 대부분을 가수 분해할 수 있는 능력이 있다(Bernback 등, 1990).

최근의 연구는 젖 효소가 신생아의 장쇄 다불포화 지방산 이용에 특이 중요함을 암시한다(Hernell 등, 1993). 이러한 지방산은 신경 발달을 위한 에이코사노이드의 중요한 전구체이다. 신생아, 특히 미숙아는 전구체로부터 상기 지방산을 합성하는 능력이 제한되어 있다. 따라서, 이들은 생후 일정 기간 후 부터 필수적인 것으로서 사료된다.

여러 연구소의 최근 연구에서, 젖 리파아제 및 췌장 카르복실 에스테르 히드롤라제(CEH)(EC 3.1.1.1) 양 효소로부터의 cDNA 구조가 결정되었고(Baba 등, 1991; Hui 등, 1991; Nilsson 등, 1990; Reue 등, 1991), 젖 효소 및 췌장 효소가 동일한 유전자의 산물이라는 결론이 내려졌다. 또한, BSSL/CEH 유전자(서열 확인 번호 1)의 cDNA 서열 및 연역된 아미노산 서열이 국제 공개 제WO 91/15234호(Oklahoma Medical Research Foundation) 및 국제 공개 제91/18923호(Aktiebolaget Astra)에 기재되어 있다.

BSSL은 단쇄 당단백질이다. 연역된 단백질(서열 확인 번호 3)은 722개의 아미노산 잔기를 포함하고, 고도로 글리코실화 되어 있다(Abouakil 등, 1989). 단백질의 N 말단 절반 부위는 아세틸 콜린에스테라제 및 몇몇 기타 에스테라제에 현저한 상동성을 보인다(Nillson 등, 1990).

잠정적인 활성 부위의 세린 잔기는 세린-194에 위치한다. 이 세린 주위의 서열은 세린 히드롤라제의 공통 활성 부위 서열과 일치한다. 단일의 잠정적 N-글리코실화 부위는 단지 활성 부위 세린의 7개의 N 말단 잔기에 위치한다(Nilesson 등, 1990).

상기 BSSL 서열은 그의 C 말단부에 각각 11개의 아미노산으로 이루어진 프롤린이 풍부한 반복 부분을 16개 포함한다. 반복 부분의 수의 변화는 각 종으로부터의 대응하는 효소간의 분자 크기 및 아미노산 조성의 차이에 대한 중요한 근거로 보인다(Han 등, 1987; Fontaine, 등 1991; Kyger 등, 1989). 이러한 반복 부분은 단백질의 15-20%의 탄수화물 대부분을 갖는다(Baba 등, 1991; Abouakil 등, 1989).

BSSL과 전형적인 에스테라제 간의 특이한 구조적 차이는 폴리펩티드 사슬의 C 말단부, 즉 11개의 아미노산 잔기로 이루어지는 16개의 프롤린-풍부 반복 부분이다. 소 및 래트로부터 얻은 대응하는 췌장 효소는 각각 단지 3 및 4개의 반복 단위를 갖는다(Han 등, 1987; Kyger 등, 1989). 따라서, C 말단부 또는 적어도 그의 일부가 리파아제 활성, 즉 에멀션화된 장쇄 트리아실글리세롤에 대한 활성에 필수 불가결하다는 가정이 가능하다.

지질 흡수 불량

지질 흡수 불량, 즉 영양 불량의 일반적 원인은 췌장 콜리파아제 의존성 리파아제 및(또는) 담즙산염의 감소된 관강내(intraluminal) 수준이다. 상기 리파아제 결핍증의 전형적인 예는 환자의 80%가 수명 단축의 원인이 되는 일반적인 유전성 장애인 낭포성 섬유증, 및 종종 만성 알코올 중독으로 인한 만성 췌장염이 걸린 환자이다.

췌장 리파아제의 결핍증 환자의 현재의 치료는 돼지의 췌장 효소의 조(粗)제제를 매우 다량 경구 투여하는 것이다. 그러나, 콜리파아제 의존성 췌장 리파아제는 위에서의 낮은 pH에 의해 불활성화된다. 이러한 효과는 다량의 효소의 사용에 의해 완전히 극복될 수 없다. 즉, 투여되는 많은 투여량은 대부분의 환자에 부적합하며, 더욱이 제제는 불순하고, 입에 맞지 않는다.

위의 산 부위는 통과하고, 비교적 알칼리성 환경인 공장(空腸)에서만 효소를 방출시키는 특정 정제가 제형화되어 있다. 그러나, 췌장 장애가 있는 많은 환자들은 비정상으로 산성인 공장을 갖고 있어, 이러한 경우에 상기 정제는 효소를 방출시킬 수 없을 것이다.

더욱이, 시판되는 제제가 사람이 아닌 동물로부터 얻은 것이기 때문에, 환자에 유해한 영향을 주거나 치료 효과의 감소를 초래하는 면역 반응의 위험이 있다. 또한, 본 제제의 단점은 콜리파아제 의존성 리파아제 이외의 다른 지방 분해 활성성분의 포함을 설명하고 있지 않다는 점이다. 사실상, 이들 중 대부분은 매우 낮은 수준의 BSSL/CEH 활성을 포함한다. 이는 보충 치료에도 불구하고 낭포성 섬유증의 많은 환자들이 지용성 비타민 및 필수 지방산의 결핍증에 걸리는 이유 중 하나일 수 있다.

즉, 1종 또는 수종의 췌장 지방 분해 효소가 결핍된 환자에 경구 투여 될 수있으며, 사람 리파아제로부터 유도된 성질 및 구조를 갖고, 넓은 기질 특이성을 갖는 제품의 필요성이 크게 대두된다. 본 발명의 사용으로부터 얻을 수 있는 제품은 그 자체 또는 다른 리파아제를 함유하는 제제와 조합하여 상기 요구를 충족시킨다.

본 발명은 담즙산염 자극 리파아제[Bile Salt-Stimulated Lipase(BSSL); EC 3.1.1.1]의 변이체인 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 및 상기 DNA 분자로 이루어지는 부생성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 BSSL 변이체의 제조, 및 이 BSSL 변이체를 발현할 수 있는 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물의 제조에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 형질 전환 동물, 및 상기 형질전환된 동물 유래의 젖을 포함하는 유아식에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물, 및 약제 제조를 위한 상기 폴리펩티드 및 DNA 분자의 용도에 관한 것이다.

제1도

A. 여러 BSSL 변이체의 발현에 사용된 BPV계 벡터의 지도.

B. 분석된 여러 BSSL 변이체의 개략도. FL은 전장 BSSL을 나타낸다. 활성 부위는 원으로 표시하였으며, N-연결 탄수화물이 존재할 수 있는 부위는 삼각형으로 표시하였다. 반복부를 담고 있는 영역은 빗금친 구역으로 나타내었으며, 보존된 C-말단은 검게 칠한 구역으로 표시하였다.

제2도

BSSL 변이체를 발현하는 세포주에서 얻은 DNA의 서던 블롯 분석. 전장 BSSL (FL), 변이체 A (A), 변이체 B (B), 변이체 C (C) 및 변이체 N (N)을 발현하는 세포주로부터 수득한 DNA를 분석하였다. 수득한 세포 DNA 각 5 ㎍ (좌측)과 정제된 세균 벡터 DNA 1 ng (우측)을 BamHI으로 절단시켰다. DNA 시료를 아가로스 겔 상에서 분리하고, GeneScreen Plus 막으로 이동시키고, ³² P-표지된 사람 BSSL cDNA와 혼성화시켰다.

제3도

재조합 BSSL 변이체를 발현하는 단리된 세포주로부터 얻어진 RNA의 노던 블롯 분석. 전장 BSSL (FL), 변이체 A (A), 변이체 B (B), 변이체 C (C) 및 변이체 N (N)을 생산하는 세포주로부터 수득한 전체 RNA 10 ㎍을 분석하였다. BSSL과 관련 없는 단백질을 코딩하는 것을 제외하고는 제1도에 나타낸 벡터와 동일한 BPV 벡터를 내재한 C127 세포주로부터 얻은 RNA를 음성 대조물 (-) (위쪽 패널)로 사용하였다. 필터를 ³² P-표지된 BSSL cDNA와 혼성화시켰다. 그 다음 필터를 쥐의 β-악틴 cDNA 탐침과 재혼성화시켰다. β-악틴 mRNA 신호 (아래쪽 패널)는 각 레인에 투입된 RNA의 양에 대한 내부 대조용으로 사용되었다.

제4도

전장 및 돌연변이된 형태의 사람 BSSL로 형질 감염된 C127 세포에서 BSSL 활성의 발현. C127 세포를 다음의 여러 BSSL 구조체로 형질 감염시켰다: 전장 BSSL (FL), 변이체 A (A), 변이체 B (B), 변이체 C (C) 및 변이체 N (N). 초기 성장 기간 후에 개별 클론을 선택하여 컨플루언시(confluency)가 있을 때까지 성장시켰다. 선택된 클론의 수 (n)는 도면에 표시하였다. 조절된 배지에서 리파아제 활성을 측정하였다. 측정치는 방출된 유리 지방산 μmol x 분 ^-1 x 조절된 배지 ml ^-1 로 표시하였다.

제5도

A. 전장 재조합 BSSL 및 돌연변이 재조합 BSSL의 웨스턴 블롯. 겔에 걸어 준 리파아제 활성의 양은 방출된 지방산 μmol x 분 ^-1 로 나타낼 때 다음과 같다: 전장 0.2 (1번 레인), 변이체 N 0.16 (2번 레인), 변이체 C 0.6 (3번 레인), 변이체 B 0.8 (4번 레인) 및 천연 BSSL 0.1 (5번 레인). 사용된 항혈청은 사람의 젖에서 정제한 BSSL에 대해 토끼에서 유도한 것이었다. 크기 마커 (사전 염색된 SDS-PAGE 표준 물질, 저분자량 범위, BioRad사 제품)의 위치는 좌측에 표시하였다.

B. N-글리코시다아제 F로 처리한 변이체 B의 웨스턴 블롯. 변이체 B를 실험 방법에 기재된 바와 같이 N-글리코시다아제 F로 절단하였다. 1번 레인은 처리하지 않은 변이체 B를, 2번 레인은 처리한 변이체 B를 보여준다.

제6도

전장 및 돌연변이 BSSL의 담즙산염 의존성. 다양한 농도의 소듐 콜레이트 (실선) 또는 소듐 데옥시콜레이트 (점선)의 존재 하에 조절된 배지에서, 전장 재조합 BSSL (*), 변이체 A (□), 변이체 B (▲), 변이체 C (■), 변이체 N (●) 및 정제된 사람 젖 BSSL (○)로부터 리파아제 활성을 측정하였다. A 변이체에 대해서는 조절된 배지를 실험 방법에서 설명한 것과 같이 블루 세파로오스 (Blue Sepharose) 상에서 농축시켰다. 각 효소원의 양은, 다른 것에 비해서 최대 활성이 1/10 밖에 되지 않는 변이체 A를 제외하고는 동일한 수준의 최대 활성이 얻어지도록 선택하였다. 대조 실험 결과, 생장 배지가 천연 BSSL의 활성 수준 또는 담즙산염 의존성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (데이타 기재 않음).

제7도

A. pGEMEX를 사용하여 여러 가지 대장균 균주에서 생산된 BSSL의 노던 블롯. 세균은 실험 방법에 기재된 바와 같이 IPTG로 유도하였다. 실험 조건은 제2도의 설명에 기재된 바와 같다. 1번 레인: BL21(DE3)pLysS 균주, 유도 않음; 2번 레인: BL21(DE3)pLysS 균주, 유도함; 3번 레인: JM109(DE3) 균주, 유도 않음; 4번 레인: JM109(DE3) 균주, 유도함.

B. 정제 젖 BSSL에 대한 항체를 사용하여 행한, 여러 가지 대장균 균주에서 pGEMEX를 사용한 재조합 BSSL의 발현을 보여주는 8-18% SDS-PAGE의 웨스턴 블롯. 세균은 IPTG로 유도하였으며, 용균액으로부터 세포질 및 주변세포질 단백질을 실험 방법에 기재된 바와 같이 수득하였다. 2-5번 레인 (주변세포질 제제) 및 7-10 레인 (세포질 제제)에 걸어 준 세균 단백질의 양은 동일한 배양액 부피를 나타내므로 염색 강도가 생산 농도에 비례한다. 1번 레인: 파마시아 (Pharmacia)사의 분자량 마커; 2번 및 8번 레인: JM109(DE3) 균주, 유도함; 3번 및 7번 레인: JM109(DE3) 균주, 유도 않음; 4번 및 10번 레인: BL21(DE3)pLysS 균주, 유도함; 5번 및 9번 레인: BL21(DE3)pLysS 균주, 유도 않음; 6번 레인: 정제된 천연 젖 BSSL 25 ng.

제8도

정제된 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 SDS-PAGE. 전장 재조합 BSSL (FL) 및 BSSL 변이체 N, B 및 C를 기재된 바와 같이 정제하였다. 1.5 ㎍을 사용한 변이체 B를 제외하고는 각각을 3 ㎍씩 전개시켰다. 정제된 천연 젖 BSSL (NAT) 5 ㎍을 전개시켰다. 크기 마커의 위치는 좌측에 표시하였다.

제9도

소듐 콜레이트에 의한 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 활성화에 대한 소듐 데옥시콜레이트의 영향. 재조합 전장 BSSL (●), 재조합 BSSL 변이체 B (○), C (■) 및 N (▲)의 정제된 제제 및 정제된 천연 젖 BSSL (□)에서 데옥시콜레이트의 부재 (좌측 패널) 및 5 mM (중앙 패널) 또는 10 mM (우측 패널) 존재하에 소듐 콜레이트의 농도를 달리 하면서 리파아제 활성을 측정하였다.

제10도

여러 pH에서 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 안정성. 천연 BSSL, 재조합 전장 BSSL 및 BSSL 변이체를 pH가 2-8인 여러 가지 완충액 중, 37℃에서 배양하였다. 모든 완충액은 1 mg/ml의 소혈청 알부민을 함유하였다. 30분 후, 소량을 수거하여 리파아제 활성을 검사하였다. 기호의 설명은 제9도에서와 같다.

제11도

재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 열안정성. 정제된 재조합 전장 BSSL, BSSL 변이체 및 천연 젖 BSSL을 pH 7.5의 50 mM 트리스-염산 완충액 중, 표시된 온도에서 배양하였다. 1조의 시료에 소혈청 알부민 (BSA)을 최종 농도 1 mg/ml로 첨가하였다. 30 분 후, 시료를 수거하여 리파아제 활성을 조사하였다. 활성은 0 분에서의 각 시료의 활성에 대한 백분율로 나타내었다. 기호의 설명은 제9도에서와 같다.

제12도

트립신에 의한 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 불활성화에 대한 담즙산염의 영향. 25℃, 10 mM 소듐 콜레이트의 부재 (점선) 및 존재 (실선) 하에서, pH 7.4의 1.0 M 트리스-염산 60 ㎕에 정제된 재조합 전장 BSSL, BSSL 변이체 및 천연 젖 BSSL (1-4 ㎍을 함유한 15 ㎕)을 10 ㎍의 트립신 (TPCK-트립신, 뵈링거-만하임(Boehringer-Manheim)사)과 함께 가하였다. 표시된 시간에 소량을 수거하여 리파아제 활성을 조사하였다. 측정치는 트립신이 없는 대조 배양에서 얻어진 값에 대한 백분율로 표시하였다. 기호의 설명은 제9도에서와 같다.

제13도

플라스미드 pS317의 제조 방법. 상세한 사항은 3.1 절 참조.

제14도

플라스미드 pS312의 개략적 구조.

제15도

플라스미드 pS317의 개략적 구조.

제16도

3.1절에 기재된 바와 같은, WAP 유전자의 첫번째 엑손 내로의 사람 BSSL 변이체 게놈 구조의 물리적 도입을 나타내는 물리적 지도.

제17도

A. 형질전환된 동물의 동정에 사용된 PCR-프라이머의 위치를 보여주는 개략도. 5'-프라이머는 WAP 서열 내에 존재하여, WAP과 BSSL 변이체의 접합 지점의 상류 -148 bp 위치에서 시작된다. 3'-프라이머는 첫번째 BSSL 변이체 인트론 내에 위치하여, 접합 지점의 400 bp 하류에서 끝난다.

B. 사용된 PCR 프라이머의 서열.

C. 잠재적 파운더(founder) 동물의 PCR 분석의 대표적인 결과를 보여주는 아가로오스 겔. M: 분자량 마커. 1번 레인: 플라스미드 pS317로부터 생성된 대조용 PCR 생성물. 2-13번 레인: 잠재적 파운더 동물로부터의 DNA 제제로 행한 PCR 반응 생성물.

제18도

pS317로 형질전환된 생쥐 암컷에서 분리한 각종 조직으로부터 수득한 RNA의 노던 블롯 분석. 젖이 분비된 후 제4일에 조직을 분리하였다. 각 조직에서 10 ㎍의 전체 RNA를 아가로오스-포름알데히드 분리로 분석하고, 막으로 이동한 다음 ³² P-표지된 사람 BSSL cDNA와 혼성화시켰다. 각 레인의 내용물은, Mg: 유선; Li: 간; Ki: 신장; Sp: 비장; He: 심장; Lu: 폐; Sg: 침샘; Br: 뇌. RNA의 크기를 좌측에 뉴클레오티드의 수로 나타내었다.

제19도

pS317 형질전환된 생쥐 및 전장 cDNA 벡터 pS314로 형질전환된 생쥐 및 대조용 동물에서 얻은 젖의 웨스턴 블롯. SDS-PAGE로 시료를 분리하고, Immobilon 필터로 이동시킨 다음 천연 사람 BSSL에 대항하여 유도된 항혈청으로 면역블롯하였다. 1번 레인: 분자량 마커; 2번, 3번 및 4번 레인: pS317 파운더 F0 #91의 F1 딸 세 마리 (F1 30, 31 및 33)의 젖 2 ㎕; 5번 레인: pS314 파운더 #90의 젖 2 ㎕; 6번, 7번 및 8번 레인: 세 마리의 비 BSSL 형질전환된 동물의 젖 2 ㎕; 9번 레인: 정제된 쥐 BSSL; 10번 레인: 정제된 사람 천연 BSSL.

발명적 개념의 간단한 설명

본 발명에 따른 재조합 BSSL 변이체는 촉매 활성을 보유하나, 전장(全長)의 BSSL보다 더 적은 글리코실화 부위를 포함하여, 잠재적으로 탄수화물 이종성이 감소되도록 제조될 수 있다. 이와 같이 감소된 복잡성은 정제 및 재조합 단백질의 특성화를 용이하게 함으로써, BSSL 활성을 갖는 폴리펩티드를 보다 효율적인 비용으로 제조할 수 있다.

또 다른 태양에서, 글리코실화의 감소는 숙주에 대한 요구성을 저감시켜 수종의 숙주 세포에서 더 높은 생산이 가능해진다. 또한, BSSL 변이체에서의 글리코실화의 감소로 인하여, 하등 진핵 생물에서의 효율적인 생산이 가능해지고, 면역학적 반응을 발생시킬 수 있는 이상적(異常的)인 글리코실화의 잠재적 위험을 줄인다. 또한, 크기의 감소 및 글리코실화가 덜 복잡해지는 것은 매우 복잡하고 거대한 탄수화물 잔기를 갖는 단백질의 경우 보다 숙주 범위가 확대됨을 암시한다.

크기는 작지만, 마찬가지로 활성인 BSSL 변이체의 치료적 사용은 보충에 필요한 물질의 중량이 감소됨을 의미한다. O-글리코실화된 반복 단위의 대부분 또는 전부가 결여된 재조합 BSSL 변이체의 또다른 잇점은 수용 개체에서의 면역 반응 위험성의 감소에 있다. 이는 O 연결 당이 그것이 생성되는 세포에 따라 매우 이질적일 수 있다는 사실에 근거한다.

천연 BSSL은 장점막에 결합되어 흡수된다고 과학 문헌에 암시되어 있다. 흡수가 감소된 선택된 BSSL 변이체는 식이성 지질 기질에 대해 장기간 활성이어서, 보다 효율적인 관강내 소화를 유도한다. 이러한 변이체의 예는 글리코실화가 감소된 분자이다.

상기한 바와 같이, BSSL은 신생아의 신경 발달에 매우 중요한 장쇄 다중불포화 지방산(Hernell, 1993) 및 비타민 A의 이용에 극히 중요함이 제시되었다. 이러한 측면에서 보다 효과적인, 본 발명에 따른 BSSL 변이체는 공지된 방법에 의해 선택될 수 있다. 절단되거나 단축된 효소는 입체 형태 면에서 상이한 것으로 보이며, 이는 상이한 지질 기질에 대한 특이성에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 개시

한 태양에서, 본 발명은 서열 확인 번호 3에서 잔기 536-722로서 기재된 아미노산 서열의 일부로 이루어지는, 아미노산이 722개 미만의 BSSL 변이체인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

용어 '아미노산 서열의 일부'는 수 개의 아미노산의 서열 또는 이러한 서열의 수 개가 연결된 것 뿐만 아니라 단지 하나의 아미노산을 포함하는 것으로서 해석된다.

용어 'BSSL 변이체'는 BSSL 활성을 갖고, 서열표에서 서열 확인 번호 3으로서 기재된 사람 BSSL의 아미노산 서열의 일부를 포함하는 폴리펩티드로서 해석된다.

용어 'BSSL 활성을 갖는 폴리펩티드'는 적어도 하기의 성질, 즉

(a) 경구 투여에 적합하고,

(b) 특정 담즙산염에 의해 활성화되고,

(c) 소장의 내용물에서 비특이성 리파아제로서 작용하고, 즉 이들의 화학적 구조 및 물리적 상태(에멀션화, 미셀, 용해 상태)와는 비교적 무관하게 지질을 가수 분해할 수 있는 성질, 및 임의로 하기의 성질, 즉

(d) 상이한 사슬 길이 및 상이한 불포화도를 갖는 트리아실글리세롤을 가수 분해시키는 능력,

(e) 디아실글리세롤, 모노아실글리세롤, 콜레스테릴에스테르, 리소포스파티 딜아실글리세롤, 및 레티닐 및 기타 지용성 비타민 에스테르를 가수 분해시키는 능력,

(f) 트리아실글리세롤에서의 sn -1(3) 에스테르 결합 뿐만 아니라 sn -2 에스 테르 결합을 가수 분해시키는 능력,

(g) 제1 담즙산염 뿐만 아니라 제2 담즙산염과 반응할 수 있는 능력,

(h) 최적 활성을 위한 담즙산염에 대한 의존성,

(i) 위 내용물이 상당한 정도로 촉매 효율에 영향을 주지 않는 점에서의 안 정성,

(j) 담즙산염이 존재하는 경우, 췌장 프로테아제, 예를 들면 트립신에 의한 불활성화에 대한 안정성,

(k) 헤파린 및 헤파린 유도체, 예를 들면 헤파린 술페이트에 대한 결합 능 력,

(l) 지질-물 중간상에 대한 결합 능력,

(m) 동결 건조가 가능할 정도의 안정성,

(n) 사람 젖, 또는 유제품에서와 같은 식품 구성 성분과의 혼합시의 안정 성

중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드로서 해석된다.

또다른 태양에서, 본 발명은 상기 BSSL 변이체가 그의 C 말단 위치에 페닐알라닌 잔기를 갖거나, 그의 C 말단부에 서열 Gln-Met-Pro을 포함하고, 또는 달리 그의 C 말단부에 서열 확인 번호 3에서 잔기 712-722로서 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 상기한 바에 따른 핵산 분자에 관한 것이다.

본 명세서에서, 용어 'C 말단 위치'는 마지막 C 말단 잔기의 위치를 나타내고, 반면 용어 'C 말단부'는 BSSL 변이체의 C 말단을 구성하는 약 50개의 아미노산 잔기를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 BSSL 변이체가 16개 미만의 반복 단위를 포함하는 상기한 바에 따른 핵산 분자에 관한 것이다. 본 명세서에서, 용어 '반복 단위'는 서열표에서 서열 확인 번호 1에 기재된 각각 33개의 뉴클레오티드의 반복 단위 중 하나를 나타낸다.

또한, 본 발명은 서열표에서 서열 확인 번호 5, 6 또는 9로서 기재된 아미노산 서열과의 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산 분자, 및 서열 확인 번호 7로서 기재된 아미노산 서열과의 상동성이 90% 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 중 위치 187에서 아스파라긴 잔기를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제외한 핵산 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열표에서 서열 확인 번호 5, 6, 7 또는 9로서 기재된 폴리펩티드 및 상기한 바에 따른 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 바에 따른 핵산 분자를 포함하는 하이브리드 유전자, 상기 하이브리드 유전자를 포함하는 복제 가능한 발현 벡터, 및 상기 하이브리드 유전자를 함유하는 세포에 관한 것이다. 이 세포는 원핵 세포, 단세포 진핵 생물 또는 다세포 생물체, 예를 들면 포유 동물로부터 유래된 세포일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 '하이브리드 유전자'는 한편으로는 상기 언급한 바와 같은 BSSL 변이체, 다른 한편으로는 하이브리드 유전자 산물의 발현을 매개할 수 있는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 하이브리드 유전자 산물의 발현을 매개할 수 있는 '유전자'는 표적 조직에서 하이브리드 유전자의 발현을 매개하고 표직 조직으로 그 발현을 표적화할 수 있는 전체 유전자 및 그 하위 서열을 의미한다. 통상적으로, 상기 하위 서열은 최소한, 1개 이상의 프로모터 부위, 전사 개시 부위, 3' 및 5' 비코딩 부위 및 구조 서열을 함유하는 것이다.

바람직하게는, 상기 하이브리드 유전자는 시험관내에서 상기 BSSL 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 발현을 매개할 수 있는 상기 유전자내로 당업계에 공지된 기술을 사용하여 삽입함으로써 형성된다. 별법으로, 상기 BSSL 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 생체내에서 상동성 재조합에 의해 삽입될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 '복제 가능한'은 벡터가 도입되어지는 소정의 유형의 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있음을 의미한다.

핵산 서열의 바로 앞의 상류 서열에는, 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 제공될 수 있으며, 이로 인해 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 발현되는 BSSL 변이체의 분비를 보장한다. 신호 서열은 본래 핵산 서열과 연관된 것이거나, 또다른 기원으로부터의 서열일 수 있다.

벡터는 재조합 DNA 방법을 편리하게 수행할 수 있는 임의의 벡터일 수 있고, 종종 벡터의 선택은 벡터가 도입되는 숙주 세포에 달려있다. 즉, 벡터는 독립적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외에 존재하고, 염색체의 복제와는 독립적으로 복제하는 벡터일 수 있으며, 이러한 벡터의 예로는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 또는 바이러스를 들 수 있다. 또한, 벡터는 숙주 세포에 도입시, 숙주 세포 게놈 중에 통합되고, 벡터가 통합되는 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 세균 발현 벡터 및 효모 발현 벡터이다. 본 발명의 벡터는 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 모든 핵산 서열을 포함하고 있을 수 있다.

또다른 태양에서, 본 발명은 (i) 상기 핵산 분자를 특정 숙주 세포 또는 생물체에서 복제 가능한 하이브리드 유전자내에 삽입하고, (ii) 얻어진 재조합 하이브리드 유전자를 숙주 세포 또는 생물체에 도입하고, (iii) 얻어진 세포를 배양 배지내 또는 배양 배지 상에서 동정 및 성장시키거나, 또는 생물체를 동정 및 복제하여 폴리펩티드를 발현시키고, (iv) 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

세포를 성장시키기 위해 사용하는 배지는 본 목적에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 벡터는 상기 기재한 임의의 벡터일 수 있고, 적합한 숙주 세포는 상기 리스트된 세포 형태일 수 있다. 벡터를 작제하고, 벡터를 숙주 세포에 도입시키기 위해 사용되는 방법은 재조합 DNA 분야에서 상기 목적을 위해 공지된 임의의 방법일 수 있다. 세포에 의해 발현되는 재조합 사람 BSSL 변이체는 세포 유형 및 벡터 조성에 따라, 분비, 즉 세포막을 통해 방출될 수 있다.

BSSL 변이체가 재조합 숙주에 의해 세포내에서 생성되는 경우, 즉 세포에 의해 분비되지 않는 경우, 기계적 수단, 예를 들면 초음파 분쇄 또는 균질화에 의하거나, 효소 또는 화학적 수단에 의한 세포 파괴 및 이어지는 정제 공정으로 이루어지는 표준 방법에 의해 이를 회수할 수 있다.

분비시키기 위해서, BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열은 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 전방에 위치시킬 수 있으며, 이 신호 펩티드로 인하여 세포로부터 BSSL 변이체의 분비를 보장하여 발현된 BSSL 변이체의 적어도 상당 부분이 세포 배지 중으로 분비되고 회수될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 핵산을 하이브리드 유전자의 발현을 매개할 수 있는 유전자 내로 삽입함으로써 제조되고, 하이브리드 유전자를 함유하는 숙주 세포 또는 생물체에서 발현 가능한 하이브리드 유전자를 포함하여, 하이브리드 유전자가 발현될 때 재조합 폴리펩티드가 생성되도록 하는 발현 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 BSSL 변이체를 생산하는 한 가능한 방법은 BSSL 변이체를 그의 젖으로 분비할 수 있는, 사람을 제외한 형질전환된(transgenic) 포유 동물을 사용하는 것이다. 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물의 사용은 합리적인 비용으로 다량의 재조합 BSSL 변이체를 얻을 수 있다는 잇점, 및 특히 형질전환된 포유 동물이 소인 경우 재조합 BSSL 변이체가 예를 들면, 유아식의 통상적인 구성 성분인 젖 성분으로 생성되기 때문에 젖 기재 제품에 재조합 BSSL 변이체를 영양 보충물로서 사용하고자 할 경우 광범위한 정제가 필요치 않다는 잇점을 갖는다.

더욱이, 사람을 제외한 포유 동물과 같은 고등 생물체에서의 생산은 통상적으로 예를 들면 상기 언급한 바와 같은 번역후 프로세싱 및 적당한 접힘(folding)에 있어서 포유 동물 단백질의 정확한 프로세싱을 유도한다. 또한, 상당히 순수한 BSSL 변이체가 상당량 수득될 수 있다.

따라서, 상기 언급한 발현 시스템은 하이브리드 유전자를 함유하는 포유 동물의 성숙한 암컷의 유선(乳線)에서 발현될 수 있는 하이브리드 유전자를 형성하기 위해서, 사람을 제외한 포유 동물의 유단백질을 코딩하는 유전자내에 삽입된 BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 포유 동물 발현 시스템일 수 있다.

발현 조직으로서의 유선 및 유단백질을 코딩하는 유전자는 일반적으로 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물에서 이종 단백질의 생성에 사용하기에 특히 적합한 것으로 고려되는데, 이는 유단백질이 본래 유선에서 높은 발현 수준으로 생성되기 때문이다. 또한, 젖은 용이하게 수거되고, 대량으로 얻을 수 있다. 본 출원에 있어서, 재조합 BSSL 변이체의 제조에서 발현 조절 및 생성 위치(유선)의 측면에서 유단백질 유전자의 사용은 유단백질 유전자의 천연 생성 조건과 유사한 조건하에서 제조된다는 잇점이 있다.

형질전환된 포유 동물에서 사용시, 상기 언급한 하이브리드 유전자는 바람직하게는 하이브리드 유전자 산물이 정확하게 유선으로 분비될 수 있도록, 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 신호 펩티드는 전형적으로 당해의 유단백질 유전자에서 통상적으로 발견되는 것 또는 BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열과 연관된 것일 수 있다. 그러나, 하이브리드 유전자 산물의 유선으로의 분비를 매개할 수 있는 다른 신호 서열도 적합하다. 물론, 하이브리드 유전자의 다양한 요소는 유전자 생성물의 정확한 발현 및 프로세싱을 가능케하는 방식으로 융합되어야 한다. 즉, 통상적으로 선택되는 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 N 말단부에 정확하게 융합되어야 한다. 하이브리드 유전자에서, BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열은 통상적으로 그의 정지 코돈을 포함하지만, 그 자신의 메세시의 절단 및 폴리아데닐화 부위는 포함하지 않는다. BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 하류에, 유단백질 유전자의 mRNA 프로세싱 서열이 통상적으로 보유된다.

다수의 인자가 특정 하이브리드 유전자의 실제 발현 수준에 영향을 주는 것으로 사료된다. 상기 언급한 바와 같이, 프로모터 및 다른 조절 서열의 능력, 포유 동물의 게놈에서의 발현 시스템의 통합 부위, 유단백질을 코딩하는 유전자에서 BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 통합 부위, 전사후 조절에 영향을 주는 요소 및 기타 유사한 요소가 얻어지는 발현 수준에 매우 중요할 수 있다. 하이브리드 유전자의 발현 수준에 영향을 주는 다양한 요소의 지식에 기초하여, 당업자는 본 발명의 목적에 유용한 발현 시스템을 고안하는 방법을 알 수 있다.

사용되는 유단백질 유전자는 발현 시스템이 삽입되는 것과 동일한 종 또는 다른 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 이와 관련하여, 유전자 발현을 유선으로 표적화(target)하는 조절 요소는 종 경계를 넘어 기능적인 것으로 확인되어 있는데, 이는 공통 조상 때문일 수 있다(Hennighausen 등, 1990).

본 발명의 발현 시스템의 구성에 사용되는 유단백질을 코딩하는 적합한 유전자 또는 그의 유효 하위 서열의 예는, 통상적으로 각종 포유 동물원으로 부터의 유청 단백질, 예를 들면 바람직하게는 쥐 기원의 유청 산성 단백질(WAP) 유전자, 및 바람직하게는 양 기원의 β-락토글로블린 유전자에서 발견될 수 있다. 또한, 다양한 기원으로부터의 카제인 유전자, 예를 들면 소의 αS1-카제인 및 토끼의 β-카제인은 BSSL 변이체의 형질 전환 생산에 적합함을 알 수 있다. 현재 바람직한 유전자는 쥐의 WAP 유전자인데, 이 유전자는 상이한 형질전환된 동물의 젖에서 다수의 외래 사람 단백질을 높은 수준으로 발현하게 할 수 있음이 밝혀졌다(Hennighausen 등, 1990).

본 발명의 발현 시스템과 바람직하게 결합될 수 있는 또다른 서열은 다량 발현을 매개할 수 있는 소위 발현 안정화 서열이다. 상기 안정화 서열이 유단백질 유전자의 인접 부분 및 상류에서 발견되는 유력한 징후가 있다.

또한, 본 발명에는 (a) 상기 발현 시스템을 사람을 제외한 포유 동물의 수정란 또는 배(胚)세포 내로 도입하여 상기 발현 시스템을 포유 동물의 생식선 내로 포함시키고, (b) 얻어진 도입된 수정란 또는 배를 성숙된 암컷 포유 동물로 발생시키는 것으로 이루어지는, BSSL 변이체를 발현시킬 수 있는 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물을 제조하는 방법을 포함한다.

포유 동물의 생식선으로의 발현 시스템의 도입은 임의의 적합한 기술, 예를 들면, "생쥐 배의 조작법(Manipulating the Mouse Embryo"; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986)"에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 발현 시스템의 수백개의 분자를 수정란, 예를 들면 수정된 단세포란 또는 그의 전핵(pro-nucleus), 또는 선택되는 포유 동물의 배아에 직접 주입할 수 있고, 이어서 미세 주사된 난은 가임신된 양육모의 난관으로 이동되어 발생시킨다.

또한, BSSL 변이체를 발현시킬 수 있는 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물의 제조 방법은 상기 포유 동물이 포유 동물 자체로부터는 BSSL을 실질적으로 발현시킬 수 없는 것인 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 (a) 포유 동물의 BSSL이 실질적으로 발현되지 않도록 포유 동물의 BSSL 발현 능력을 제거하고, 상기 발현 시스템을 포유 동물의 생식선에 도입하여 BSSL 변이체가 포유 동물에서 발현되도록 하고(하거나), (b) 포유 동물의 BSSL 유전자 또는 그의 일부를 상기 언급한 발현 시스템으로 대체하는 것으로 이루어진다.

포유 동물의 BSSL 발현 능력은 BSSL의 발현을 담당하는 DNA 서열에 돌연 변이를 도입함으로써 제거할 수 있다. 이러한 돌연 변이는 DNA 서열이 프레임을 벗어나도록 만드는 돌연 변이, 정지 코돈의 도입, 또는 DNA 서열의 1개의 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.

포유 동물의 BSSL 유전자 또는 그의 일부는 상동성 재조합의 주지된 원리를 사용함으로써, 상기 언급한 발현 시스템 또는 BSSL 변이체를 코딩하는 DNA 서열로 대체될 수 있다.

또다른 중요한 태양에서, 본 발명은 상기 DNA 서열을 그의 게놈 중에 함유하는, 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물에 관한 것이다. 상기 DNA 서열은 바람직하게는 포유 동물의 생식선 및 포유 동물의 유단백질 유전자에 존재할 수 있다. 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물은 바람직하게는 생쥐, 래트, 양, 돼지 및 소로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물의 후대 개체 및 상기 사람을 제외한 형질전환된 포유 동물로부터 얻은 젖을 포함한다.

본 발명은 상기 젖으로 이루어지는 유아식, 및 상기 BSSL 변이체로 이루어지는 유아식에 관한 것이다. 유아식은 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 무기질, 비타민 등과 같은 임의의 필요한 첨가제를 함유할 수 있다.

또다른 태양에서, 본 발명은 상기 BSSL 변이체로 이루어지는 제약 조성물 및 치료시 사용을 위한 상기 BSSL 변이체에 관한 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은 췌장 외분비 기능 부전증에 관련한 병리학적 증상, 낭포성 섬유증, 만성 췌장염, 지방 흡수 불량, 지용성 비타민의 흡수 불량, 생리적 이유로 인한 지방의 흡수 불량 치료용 약제를 제조하기 위한 BSSL 변이체의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 미숙아에서, 식이성 지질의 이용을 개선시키는 약제를 제조하기 위한 BSSL의 용도에 관한 것이다.

<실시예>

1. 진핵 및 원핵 세포에서의 재조합 BSSL의 발현

1.1. 실험적 방법
1.1.1. 재조합 플라스미드

pUC19에 클로닝된 2.3 kb의 사람 BSSL cDNA를 포함하는 플라스미드 pS146(Nilsson 등, 1990)를 HindIII 및 SalI로 절단하여, BSSL cDNA를 소의 유두종 바이러스(BPV) 발현 벡터, pS147에 도입시켰다(제1도). 이 벡터는 쥐의 메탈로티오네인 1(mMT-1) 인헨서 및 프로모터 요소 조절하의 사람 BSSL cDNA를 포함한다(Pavlakis & Hamer, 1983). mRNA 프로세싱 신호는 토끼 β-글로빈 유전자의 엑손 II, 인트론 II, 엑손 III 및 하류 요소의 일부를 포함하는 게놈 단편에 의해 제공된다. 이 전사 단위는 전 BPV 게놈을 포함하는 벡터에 클로닝하였다. 전사는 BPV 및 BSSL 전사 단위에 대해 단일 방향이었다. 또한, 대장균(E.coli)에서 벡터의 증식을 위해, 벡터는 pBR322 유도체인 pML2d를 포함한다(Sarver 등, 1982).

발현 벡터 pS147은 하베이 육종(Harvey Sarcoma) 바이러스 5'-긴 말단부 및 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화 신호에 구동되는 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 벡터와 함께 형질 감염시켰다(Lusky & Botchan, 1984).

대장균에서 BSSL의 발현을 위해, 상기 BSSL cDNA를 플라스미드 pT7-7(Ausubel 등, 1992)으로부터의 NdeI-BamHI 단편으로서 플라스미드 pGEMEX-1(Progega, Madison, WI, USA)(Studier & Moffat, 1986)내에 서브클로닝하였다. 이러한 클로닝 방법에 의해, T7 유전자 10을 코딩하는 서열이 시작 코돈을 상류에 위치시킨 성숙 단백질을 코딩하는 BSSL 유전자로 대체되었다. 최종 발현 벡터인 pGEMEX/BSSL을 특정 BSSL 내부 프라이머를 사용하는 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다.

1.1.2. 돌연 변이 유발

뉴클레오티드 번호 1을 개시 코돈 ATG에서의 A에 부여하였다. 아미노산의 번호 매김은, 신호 펩티드의 첫번째 메티오닌이 -23이고, 성숙 단백질의 첫번째 아미노산 잔기인 알라닌에 번호 1을 부여하였다.

결실 변이체 A(서열 확인 번호 4)의 작제를 위해, 두 PCR 프라이머인 PCR-1 및 PCR-2 (표 1)을 합성하였다. 상이한 플라스미드로의 클로닝을 위해 HindIII, SalI 및 BamHI 자리를 만들었다. BclI 자리를 아미노산 서열을 변화시키는 것 없이 BSSL 서열에서 발생시켰다. 이는 다른 변이종을 얻기 위한 합성된 DNA의 첨가를 용이하게 하기 위해 수행되었다. 프라이머 PCR-2는 두개의 합성 정지 코돈을 포함한다. 얻어진 PCR 단편을 서열 분석을 위해 BamHI 및 HindIII로 분해하여 pUC18에 클로닝하였다. 이 플라스미드를 pS157로 명명하였다. 정확한 PCR 단편을 β-글로빈 유전자 앞에 있는 유일한 Asp700 자리(BSSL cDNA에서 위치 1405번) 및 SalI 자리에서 BSSL 서열에 융합시킴으로써 BPV 발현 벡터에 삽입시켜 pS257을 얻었다.

B 변이체 작제(서열 확인 번호 5)를 올리고뉴클레오티드 번호 3, 4, 7 및 8(표1)을 사용하여 수행하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 전장의 단백질에서 712번 라이신 내지 722번 페닐알라닌에 해당하는 C 말단 아미노산 서열을 코딩한다. 이 단편을 535번 글루타민에 융합시켰다. 번역 정지 코돈을 마지막 페닐알라닌 바로 뒤에 삽입하였다. 이 단편은 pS157로 도입시킬 수 있는 5' 말단에 BclI 자리 및 3' 말단에 SalI 자리를 포함한다. 얻어진 플라스미드를 Asp700 및 SalI으로 절단시키고, 313 bp의 단편을 상기한 발현 벡터 내에 도입하였다. 얻어지는 플라스미드를 pS258로 명명하였다.

표1

BSSL 변이체의 작제를 위해 사용된 합성 올리고뉴클레오티드.

제한효소 자리의 뉴클레오티드는 밑줄을 그었다. 번역 정지 신호는 볼드체로 나타내었다. 변이체 N에서 변경된 코돈은 PCR-3에서 볼드체 및 *로 나타내었다.

C 변이체(서열 확인 번호 6)을 코딩하는 유전자를 작제하기 위해서, 올리고뉴클레오티드 1 내지 6(표 1)을 사용하였다. 어닐링된 DNA 단편은 535번 글루타민과 712번 라이신 내지 722번 페닐알라닌 사이에 삽입되는, 공통 서열(Nilsson 등, 1990)과 일치하는 11개의 아미노산을 코딩하는 두개의 반복 단위를 포함한다. 또한, 이 단편은 5' 말단에 BclI 자리 및 3' 말단에 SalI 자리를 포함하여, 상기한 바와 동일한 클로닝 전략을 세울 수 있다. 얻어지는 플라스미드를 pS259로서 명명하였다.

변이체 N(비-N 글리코실화 변이체, 서열 확인 번호 7)의 작제를 위해서, 두개의 PCR 프라이머(표 1에서 PCR-3 및 PCR-4)를 합성하였다. EcoRI 및 BamHI 자리를 서열 분석을 위해 360 bp의 PCR 산물의 pUC19로의 클로닝을 위해 만들었다. 187번 아스파라긴에서의 잠재적인 N 연결 글리코실화 자리를 글루타민으로 변경시켰다. 변형된 서열을 BalI-HindIII 단편으로서 단리하고, mMT-1 프로모터 및 BSSL cDNA의 5' 말단을 포함하는 SacI 및 BalI 단편과 함께, SacI 및 HindIII으로 절단된 pUC19로 클로닝하였다. 약 1.2 kb의 SacI-DraIII 단편을 이 플라스미드로부터 단리하고, 각각 발현 벡터내에 있는 mMT-1 요소 및 BSSL cDNA 서열에 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 pS299로 명명하였다.

1.1.3. 포유 동물 세포 배양 및 형질 감염

벡터를 칼슘-인산염 침전법(Graham Van der Eb, 1973)에 따라, 쥐 세포주 C127(ATTC CRL 1616)에 공동 형질 감염시켰다.

C127 세포를 10% 태아 송아지 혈청으로 보충한 햄즈(Ham's) F12-둘베코 변형이글 배지(DMEM)(1:1)에서 배양하였다. 네오마이신 내성 세포 클론을 G418 1.5 mg x ml ^-1 으로 선택한 후, 10 내지 15일 후, 내성 세포 클론을 마스터 플레이트로부터 단리하여 분석을 위해 계대 배양하였다.

1.1.4. 세균 균주 및 배양 조건

발현 실험을 위해서, 벡터 pGEMEX/BSSL을 대장균 균주 JM109(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS으로 형질 전환시켰다. 발현 실험을 스튜디어(Studier) 등의 문헌(1986)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 세균을 수확한 후, 세포를 원심 분리(5,000 xg, 4℃, 10 분)하여 펠렛화하였다. 주변세포질(periplasm) 분획과 세포질 분획의 제조를 위해, 펠렛을 펠렛 1 g당 20 mM 트리스-Cl/20% 수크로오스 4 ㎖, pH 8.0, 0.1 M EDTA 200 ㎕, 및 라이소자임 40 ㎕(물중 15 mg/㎖)에 재현탁하였다. 이 현탁액을 40분동안 얼음상에서 배양하였다. 펠렛 1 g당 0.5 M MgCl ₂ 160 ㎕을 첨가하고, 이어서, 현탁액을 12,000 xg에서 20분간 원심 분리하였다. 얻어진 상징액은 주변세포질 단백질을 함유하며, 펠렛은 세포질 분획을 나타낸다. 또한, 가용성 단백질의 제조를 위해서, 세포를 40 mM 트리스-Cl, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드, pH 8.2 중에 현탁시키고, 냉동-해동, 및 초음파 분쇄를 수회하여 분해시켰다. 세포 분해물을 원심 분리하였다(30,000 xg, 25℃, 30분).

1.1.5. 핵산 분석

RNA 및 DNA를 단리된 포유 동물의 세포주 또는 대장균 세포로부터 제조하였다(Ausubel 등, 1992). RNA 또는 DNA를 아가로스 겔 상에서 분획화하고, 진스크린 플러스(GeneScreen Plus(New England Nuclear)) 상에서 블롯팅하고 공급사의 지시에 따라 하이브리드화시켰다.

1.1.6. 천연 효소의 제조

담즙산염 자극 리파아제를 상기 기재한 방법(Blackberg Hernell, 1981)에 따라 사람 젖으로부터 정제하였다. 정제된 제제는 SDS-PAGE에 의해 판단시 균질하고, 기질로서 장쇄 트리아실글리세롤로 분석시 100 방출된 지방산 μmol x min ^-1 (분 ^-1 ) 및 mg ^-1 의 비(比)활성을 가졌다.

1.1.7. 효소 분석

기질로서 아라비아검으로 유화시킨 트리올레인을 사용하여 문헌(Blackberg & Hernell, 1981)에 기재된 바에 따라 효소 분석을 수행하였다. 활성화 담즙산염으로서 10 mM 소듐 콜레이트를 사용하여 반응시켰다. 담즙산염 의존성이 시험될 때, 담즙산염(소듐 콜레이트 또는 소듐 데옥시콜레이트, Sigma Chem. Co.)을 제3도에 기재된 농도로 첨가하였다.

1.1.8. 웨스턴 블로팅

블롯팅 실험에서 현저한 반응을 얻기 위해서, 조정된 배지를 블루 세파로스(Blue Sepharose)(Pharmacia LKB Biotechology) 상에서 크로마토그래피하여 농축하였다. 각 배지를 블루 세파로스(겔 1 ㎖ 당 배지 약 10 ㎖)와 혼합하였다. 겔을 0.1 M KCl을 함유하는 pH 7.4의 0.5 M 트리스-Cl 완충액(겔 1 ㎖ 당 약 10 ㎖)으로 세척하였다. 효소 활성물을 동일한 완충액에서 1.5 M KCl로 용출시켰다. 이 방법에 의해, 3 내지 5배의 정제 및 25 내지 30배의 농축물을 수득하였다. SDS-PAGE를 기본적으로 라에믈리(Laemmli)의 문헌(1970)에 따라 10% 폴리아크릴아미드겔 상에서 수행하였다. 니트로셀룰로오스 막으로의 이동 및 폴리클로날 토끼 항혈청으로 배양한 후, 순수한 BSSL의 검출은 알칼리성 포스파타제와 결합된 항토끼 IgG 및 바이오-래드사(Bio-Rad)의 현상 장치를 사용하여 수행되었다.

1.1.9. N-글리코시다제 F 처리

2.5 방출된 지방산 μmol x min ^-1 의 BSSL 활성을 포함하는 변이체 B 10 ㎕에, 1 M의 β-메르캅토에탄올 1 ㎕ 및 10%(w/v) SDS 0.5 ㎕을 첨가하였다. 5분동안 비등시킨 후, pH 8.0의 0.1 M Na-인산염 완충액 10 ㎕, 7.5%(w/v) 노니뎃(Nonidet) P 40 4 ㎕, 및 N-글리코시다제 F(Boehringer Mannheim) 5 ㎕(1U)를 첨가하였다. 대조용으로서, 변이체 B의 동일한 양을 글리코시다제를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 동일하게 처리하였다. 37℃에서 일야 반응한 후, 시료를 SDS-PAGE 상에 걸은 후, 폴리클로날 토끼 BSSL 항혈청을 사용하여 블롯팅하였다.

1.2. 결과

1.2.1. BSSL 변이체의 작제

전장 BSSL에 대한 BSSL 변이체의 변형을 표 2 및 제1도에 도시하였다. 이들 변이체의 발생을 위해 사용된 전략은 1.1절에 기재되어 있다. 변이체 A(서열 확인 번호 4)의 경우, 정지 코돈을 535번 위치에서의 글루타민 뒤에 도입함으로써 전장의 단백질중 마지막 187개의 아미노산을 제거하였다. 변이체 B(서열 확인 번호 5)의 경우, 11개의 C 말단 아미노산을 코딩하는 영역 및 원래의 번역 정지 코돈을 535번 글루타민에 융합시켰다. 따라서, 이러한 변이체는 모든 반복 단위가 결여된다. 변이체 C(서열 확인 번호 6)의 경우, 공통 서열(Nilsson 등, 1990)에 동일한 서열을 갖는 두개의 반복 단위를 포함하는 단편을 535번 글루타민과 712번 라이신 내지 722번 페닐알라닌 서열의 사이에 삽입시켰다.

활성 자리 194번 세린에 인접하여 위치한, 단지 추정적인 N 연결 탄수화물 구조의 중요성을 분석하기 위해서, 변이체를 작제하였다. 변이체 N(서열 확인 번호 7)을 187번 아스파라긴에서의 잠정적인 N-글리코실화 자리를 글루타민으로 변화시킴으로써 얻었다.

표 2

사람 BSSL의 아미노산 서열에 대한 BSSL 변이체의 아미노산 서열

1.2.2.

포유 동물 세포주에서 재조합 DNA의 특성화

DNA 시료를 상이한 BSSL 변이체를 코딩하는 발현 벡터로 형질 감염된 세포주로부터 제조하였다. 제조된 DNA를 BamHI로 절단하고, 아가로스 겔상에서 분획화하고, 혼성화를 위해 막에 이동시켰다. 사용된 탐침은 ³² P으로 표지된 BSSL cDNA이었다. 혼성화 결과는 재조합 유전자 존재를 확인시켜 주며, 또한 벡터 카피 수는 상이한 세포주에서 거의 동일하였다(제2도). 혼성화 단편의 위치는 다양한 BSSL 서열의 상이한 길이를 반영하며, 예상된 크기와 일치하였다. 또한, 위치들은 형질 감염 실험에서 사용한 세균 기원의 DNA에 유사하였는데, 이는 벡터 DNA의 주요 재배열이 세포주에 발생하지 않음을 나타낸다(제2도). 변이체 A로 나타내는 DNA 시료에서의 상부 혼성화 신호는 아마도 부분 절단으로 인한 것으로 보인다.

1.2.3. 포유 동물 세포에서 전장 및 돌연 변이 BSSL에 대한 mRNA의 발현

상이한 재조합 BSSL 유전자의 발현을 분석하기 위해서, RNA를 단리된 세포주로부터 제조하였다. 노던 블롯 실험 및 ³² P으로 표지된 BSSL cDNA와의 혼성화는 재조합 mRNA가 BSSL 벡터를 함유하는 모든 세포주에서 검출됨을 보여준다(제3도). 혼성화는 BSSL cDNA를 제외한 동일한 벡터를 포함하는 세포주로부터 유래된 대조용 시료에서 발견되지 않았다(제3도).

혼성화 mRNA의 상이한 길이는 cDNA의 변형과 일치하였다. 상이한 시료에서 재조합 BSSL mRNA 변이체의 정상(定常) 상태 수준은 변이체 A를 제외하고는 거의 동일하였다(제3도). 변이체 A mRNA의 축적이 감소된 이유는 알려진 바 없지만, 두 군의 세포주 및 단리된 클론에서 관찰된다. 상이한 시료에서 동일량의 RNA의 존재는 쥐의 β-액틴 탐침과의 혼성화에 의해 확인되었다(제3도, 아래 패널)

1.2.4. 포유 동물 세포에서 전장 및 변이종 BSSL의 제조

전장 BSSL으로 형질 감염된 C127 세포 및 상이한 돌연 변이 형태의 각 클론으로부터의 배지를 모아서 BSSL의 활성을 분석하였다(제4도). 전장 분자 및 변이체 N, B 및 C의 경우, 가장 높은 발현을 보이는 클론에서의 활성은 0.7 내지 2.3의 방출된 지방산μmol x min ^-1 x 배지㎖ ^-1 의 범위였다. 이것은 7-23 ㎍ x 배지㎖ ^-1 의 발현 수준에 해당하는 것으로, 천연 젖 BSSL의 비활성에 상당하는 비활성이다. 변이체 A의 경우, 모든 분석된 클론은 0.05 방출된 지방산μmol x min ^-1 x 배지㎖ ^-1 미만의 활성을 갖는다. 고활성 클론의 블루-세파로스 상에서의 농축 및 동결 건조는 비록 낮은 수준이지만 활성 효소가 실제로 발현됨을 보인다. 변이체 A로 얻어지는 저활성이 부분적으로 더 낮은 비활성 때문일 가능성을 배제할 수 없었다.

상이한 형질 감염 실험의 클론으로부터의 웨스턴 블롯을 제5A도에 도시하였다. BSSL 변이체의 겉보기 M _T 는 예상한 대로 였다. 그러나, 전장 BSSL 및 변이체 B 및 C의 경우, 이중 밴드가 얻어졌다. 이중 밴드가 나타나지 않는 변이체 N은 단일 N 글리코실화 자리가 결여된 것에 반하여, 상기 세가지 모두는 단일 N 글리코실화 자리가 보존되어 있기 때문에, 이중밴드는 N 글리코실화의 차이로 부터 생긴다는 설명이 가능하다. 따라서, 변이체 B를 N 글리코시다제 F로 절단하였다. 제5B도에 도시한 바와 같이, 하부 밴드의 세기는 증가하지만, 단지 미량의 상부 밴드만 남게 되는 것은 발현된 변이체의 단지 일부가 N 글리코실화됨을 암시한다.

BSSL의 특징 중 하나는 제1 담즙산염, 에를 들면 콜레이트에 의한 특이 활성이다(Hernell, 1975). BSSL의 모든 상이한 재조합 형태는 콜레이트 활성에 대한 동일한 농도 의존성을 보인다(제6도). 최대 활성은 사용된 분석 시스템에서 약 10 mM에서 얻어진다. 콜레이트가 데옥시콜레이트(제2 담즙산염)으로 교체되는 경우, 상기와 같은 활성은 발생하지 않았다. 즉, 재조합된 전장의 BSSL 및 상이한 변이체도 담즙산염 활성에 관해 동일한 특이성을 보였다.

1.2.5. 대장균에서 전장의 BSSL 발현 및 생화학적 특성 분석

두 대장균 균주 JM109(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS(Studier 등, 1986)을 T7 프로모터의 조절하에 사람 BSSL cDNA을 포함하는 발현 벡터 pGEMEX/BSSL로 형질 전환시켰다. 양 균주로부터의 형질 전환체를 동정하고, 배양하고, 약 90분간 IPTG로 유도하였다(Studier 등, 1986). ³² P로 표지된 탐침으로서 BSSL cDNA를 사용하는 노던 블롯에 의한 전체 mRNA의 분석은 발현이 양 균주에서 효과적으로 유도되며, 전사가 긴밀하게 조절됨을 설명해준다(제7A도). 재조합 BSSL mRNA의 겉보기 크기, 약 2.4 kb는 예상된 길이와 일치한다. 단백질 시료의 SDS-PAGE 분리 및 항BSSL 항체를 사용한 면역 검출은 전장 BSSL이 대장균에서 효과적으로 생성될 수 있음을 보여주었다(제7B도). JM109(DE3)에서 보다 BL21(DE3)pLysS 균주에서 보다 많은 단백질이 주변세포질로 분비되었다(제7B도).

IPTG 유도된 대장균 배양액은 배양액 1 ㎖ 당 0.5-4 ㎍의 가용성의 활성인 BSSL 단백질을 포함하였다. 웨스턴 블로팅은 20 내지 60%의 반응성 물질이 불용성 펠렛 중에 있음을 보여준다. 유도되지 않은 세균은 어떠한 현저한 BSSL 활성을 포함하지 않았다.

배양된 세균으로부터의 리파아제 활성은 천연 젖 BSSL와 동일한 담즙산염 의존성을 보였다.

2. 재조합 전장형 및 변이형의 담즙산염 자극 리파아제의 정제 및 특성화

2.1. 실험 방법

2.1.1. 효소 및 효소 변이체

재조합 전장의 BSSL 및 BSSL 변이체 B, C 및 N을 상기와 같이 작제하고, 발현시켰다. 천연 효소에 비하여, 변이체 B(서열 확인 번호 5)는 모두 16개의 특이하고, O-글리코실화된, 프롤린이 풍부한 C-말단 반복 부위(아미노산 536-711)가 결핍되어 있으나, 대부분의 C-말단 단편(아미노산 712-722)이 글루타민-535에 융합되어 있다. 변이체 C(서열 확인 번호 6)는 동일한 C-말단 단편과 글루타민-535 및 리신-712 간의 11개 잔기로 이루어진 2개의 반복 부위를 포함한다. 변이체 N(비-N-글리코실화 변이체, 서열 확인 번호 7)에서는 N-결합된 당만을 담당하는 아스파라긴-187이 글루타민 잔기로 교체되었다. 천연 BSSL은 문헌[Blackberg Hernell, 1981]에 기재된 바와 같이 사람 젖에서 정제하였다.
2.1.2. 효소 분석

리파아제 활성을 기질로서 아라비아검 중에 유화시킨 트리올레인을 사용하여 문헌[Blackberg Hernell, 1981]에 기재된 바와 같이 분석하였다. 활성화 담즙산염으로 소듐 콜레이트(10 mM)를 사용하였다. 분석의 다양한 변형을 도면에서 설명한다.
2.1.3. 면역흡착제의 제조

정제한 젖 BSSL(5 mg)을 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 CNBr을 사용하여 세파로오스에 결합시켰다. 정제된 젖 BSSL에 대하여 토끼에서 만들어진 폴리클로날 항혈청 40 ml를 컬럼 상에 통과시켰다. 특정 항체를 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.5로 용출하였다. pH를 즉시 고상 트리스로 약 8로 조정하였다. 친화성 정제한 항체 6 mg을 그의 염을 제거하고 냉동 건조시킨 후, 상기한 바와 같이 세파로오스에 결합시켰다.
2.1.4. 정제 방법

재조합 발현 BSSL 또는 BSSL 변이체 5-25 ㎍을 함유하는 조정 배양 배지는 고정 겔의 ml 당 블루 세파로오스(스웨덴왕국 소재 파마시아(Pharmacia) 제품) 10 ml의 혼합한 것이었다. 30 분간 완전 혼합한 후, 겔을 0.05 M 트리스-Cl, pH 7.0 및 0.05 M KCl로 헹구고, 리파아제 활성을 0.05 M 트리스-Cl, pH 7.0 및 1.5 M KCl로 용출하였다. 활성 최대값들을 모으고, 5 mM 소듐 베로날, pH 7.4 및 0.05 M NaCl에 대하여 투석하였다. 투석물을 헤파린-세파로오스 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 5 mM의 소듐 베로날 완충액, pH 7.4 중 구배 0.05 내지 1.0 M NaCl로 희석하였다. 리파아제 활성을 함유하는 분획물을 모으고, 면역흡착(immunosorbent) 컬럼에 가하였다. 0.05 M 트리스-Cl, pH 7.5 및 0.15 M NaCl로 헹군 후, 결합한 리파아제를 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.5로 용출하였다. 분획물의 pH를 즉시 고체 트리스로 약 8로 조정하였다.
2.1.5. 전기영동법

필수적으로 라에믈리(Laemmli)의 방법(1970)에 따라 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 행하였다. 단백질을 코마시에 (Commassie) 브릴리언트 블루로 염색하였다.
2.1.6. N-말단 서열 분석

정규 사이클 프로그램 및 제조업자로부터 얻은 화합물을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈 인크(Applied Biosystems Inc.)사의 477A 펄스 액상 시퀀서 및 온-라인 페닐티오히단토인 120A 분석기 상에서 아미노산 서열 분석을 행하였다. 서열 결정된 표준 단백질(β-락토글로불린)로부터 산출한 초기 및 반복 수율은 각각 47 % 및 97 %였다.

2.2 결과
2.2.1. 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 정제

농축 단계로서 조정 배지의 블루 세파로오스 상의 크로마토그래피를 주로 사용하였다. 이어서, 헤파린-세파로오스 상의 크로마토그래피로 주로 배양 배지 중에 존재하는 대부분의 알부민을 제거함으로써 초기 정제하였다. 또한 이 단계는 재조합 BSSL 분자 모두가 헤파린 결합을 보유하고 있는 것으로 나타내었다. 면역흡착 후, 모든 BSSL 변이체는 SDS-PAGE로 판단하였을 때 90 % 이상의 순도인 것으로 나타났다(제8도). 전장의 효소 뿐 아니라 변이체 B 및 C는 이중선으로서 이동하였다. 상이한 변이체의 겉보기 M _T 를 하기 표 3에 나타내었다. N-말단 서열 분석 결과 모든 변이체에서 8회 실험 동안 단일 서열, 즉 Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-

Tyr-Thr-이 나타났다.
2.2.2. 리파아제 활성

표 3에서, 상이한 제제의 겉보기 분자량을 나타내었다. 제제의 비활성 범위는 75 내지 120 μmol의 방출 지방산/분/단백질(mg)였다. 따라서, 전장의 BSSL과 BSSL 변이체 간에는 활성에 있어서 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다.

제제 모두는 유화된 장쇄 트리아실글리세롤에 대한 활성을 위해 제1담즙산염(소듐 콜레이트)를 절대적으로 필요로 하는 것으로 나타났다(제9A도). 소듐 데옥소콜레이트는 임의의 변이체를 활성으로 만들었다(데이타 나타내지 않음). 그러나, 데옥시콜레이트는 다른 담즙산염과 혼합시켰을 때, 두가지 효과를 나타내었다(제9B도 및 9C도). 먼저, 데옥시콜레이트는 활성화에 필요한 콜레이트의 농도를 저하시켰으며, 다음으로는 높은 담즙산염 농도에서의 효소 활성을 억제시켰다.

표 3

재조합 전장의 BSSL 및 BSSL 변이체의 겉보기 M _T

2.2.3. 재조합 BSSL 및 BSSL 변이체의 안정성

재조합 BSSL 및 BSSL 변이체는 천연 젖 BSSL과 동일한 pH 안정성을 나타내었다(제10도). 모든 경우에 불활성화는 약 2.5-3의 pH에서 발생하였다. pH 3 초과시 단백질 농도가 충분히 높으면 모든 변이체는 완전 안정하였다. 이는 소 혈청 알부민 또는 난알부민을 첨가하여 달성하였다(데이타 나타내지 않음). 시험된 모든 pH에서 희석 시료는 덜 안정하였으나, 한계값은 동일하게 유지되었다(데이타 나타내지 않음). 제11도는 천연 젖 효소에 비교한 재조합 효소의 열안전성을 나타내었다. 37-40 ℃의 온도에서, 활성이 감소되기 시작하였다. 변이체 (B, C, N)은 전장의 재조합 효소 및 젖 효소보다 다소 덜 안정한 것으로 보였다. 그러나, 소혈청 알부민을 첨가하여 단백질 농도를 증가시키는 경우, 모든 변이체도 40 ℃에서 안정하였다(제11도).

천연 젖 BSSL 및 모든 재조합 변이체는 모두 트립신에 민감하였다. 시간 의존성 불활성화를 관찰하였다(제12도). 그러나, 담즙산염, 즉 콜레이트가 완충액에 함유되는 경우, 리파아제 변이체는 보호되며, 리파아제 활성도 유지되었다(제12도).

따라서, 다수 시험관내 특성, 즉 담즙산염 활성화, 헤파린 결합, pH- 및 열 안정성, 및 프로테아제에 의한 불활성화에 대한 담즙산염 보호에 있어서, 상이한 BSSL 변이체와 천연 젖 BSSL을 비교했을 때 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다.

3. 형질 전환 동물에서의 발현
3.1. 발현 벡터의 작제

형질 전환 동물로부터 젖중 재조합 사람 BSSL 변이체를 생산하기 위한 발현 벡터를 작제하기 위하여, 다음 방법을 사용하였다(제13도).

사람 BSSL 유전자의 상이한 부분을 함유하는 3개의 플라스미드(pS309, pS310 및 pS311)는 문헌: Lidberg et al. (1992)에 기술된 방법을 이용하여 수득하였다. 플라스미드 pS309는 5' 비전사 영역으로부터 제4 인트론의 일부까지의 BSSL 유전자를 포괄하는 SphI 단편을 함유하였다. 플라스미드 pS310은 제1 인트론의 일부에서 제6 인트론의 일부까지의 BSSL 변이체 유전자의 서열을 포괄하는 SacI 단편을 함유한다. 최종적으로, 플라스미드 pS311은 제5 인트론의 주요 부분 및 엑손 11에서 결실된 인트론/엑손 구조물의 나머지 BSSL 유전자를 포괄하는 BamHI 단편을 함유한다. 결실된 서열은 231 bp로 이는 BSSL 변이체를 코딩하는 서열로 BSSL 변이체는 전장 BSSL 보다 정확하게 77개의 아미노산 또는 7개의 반복부가 더 적다. 생성된 BSSL 변이체("변이체 T")의 뉴클레오티드 서열은 서열 확인 번호 8로 서열표에 나타낸다. 변이체 T의 아미노산 서열은 서열 확인 번호 9로 서열 목록에 나타낸다.

사람 BSSL 유전자의 엑손 11에서의 고도로 반복적인 서열 때문에, 상기 서열을 플라스미드 중으로 클로닝하여 세균에서 성장시키는 경우, 상대적으로 높은 빈도의 재배열이 예상될 수 있다. 상기 추정을 기초로 하여, 절단된 엑손 11을 함유하는 목적하는 BSSL 변이체 중 하나를 확인하고 분리하여 서열 분석하였다.

HindIII 및 SacI 부위에서 플라스미드 pUC19 중으로 클로닝된 사람 BSSL cDNA의 일부를 함유하는, 다른 플라스미드 pS283을 게놈성 서열의 융합용으로 사용하였다. 플라스미드 pS283을 또한 사용하여 BSSL의 5' 비번역 리더 서열에 위치한, 적합한 제한 효소 부위, KpnI를 수득하였다.

플라스미드 pS283을 NcoI 및 SacI로 분해하고 약 2.7 kb의 단편을 전기영동법으로 분리하였다. 플라스미드 pS309를 NcoI 및 BspEI로 절단하고 BSSL 유전자의 5'-부분을 함유하는 약 2.3 kb의 단편을 분리하였다. 플라스미드 pS310을 BspEI 및 SacI로 절단하고 BSSL 유전자의 중간 영역의 일부를 함유하는 약 2.7 kb의 단편을 분리하였다. 이들 3개의 단편을 결합시키고 수용성 대장균 균주 TG2 중으로 형질 전환시키고, 형질 전환체를 앰피실린 선택법으로 분리하였다.

수많은 형질 전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 목적하는 작제물을 함유하는 플라스미드인 pS312(제14도)로 명명된 플라스미드를 다음 실험에 사용하였다.

추가적인 클로닝을 용이하게 하기 위해 정지 코돈의 하류에 위치한 BamHI 부위를 SalI 부위로 전환시킨 pS311의 변형체를 수득하기 위하여, 다음 방법을 사용하였다: 플라스미드 pS311을 부분적인 BamHI 절단에 의해 선형화하였다. 상기 선형화된 단편을 분리하고 BamHI를 SalI 자리(5'-GATCGTCGAC-3')로 전환시켜, BamHI 부위를 파괴시키는 합성 DNA 링커를 삽입하였다. 합성 링커의 삽입이 가능한 잠재적 위치가 2개 있기 때문에 생성된 플라스미드를 제한 효소 절단법으로 분석하였다. 엑손 11의 하류의 목적하는 위치에 삽입된 링커를 갖는 플라스미드를 분리하고 pS313으로 명명하였다.

사람 BSSL 변이체 게놈성 서열을 함유하는 최종 발현 벡터 작제물을 수득하기 위하여, 수유 기간중 유선 세포에서 단계 및 조직 특이적 발현을 매개하도록 고안된 기존의 발현 벡터, pS314를 사용하였다. 플라스미드 pS314는 NotI 단편으로 클로닝된 쥐의 유청 산성 단백질(WAP) 유전자 유래의 게놈성 단편을 함유하였다(Campbell et al., 1984). 상기 게놈성 단편은 4개의 쥐 WAP 엑손 모두 및 인트론 서열 모두인 대략 4.5 kb의 상류 조절 서열(URS) 및 최종 엑손의 하류 서열 약 3 kb를 갖는다. 유일한 KpnI 부위는 제1 엑손내 천연 WAP 번역 개시 코돈의 24 bp 상류에 위치한다. 다른 유일한 제한 효소 부위는 엑손 3내에 위치하는 SalI 부위이다.

사람 BSSL 변이체 게놈성 서열을 상기 부위, KpnI과 SalI 사이에, 다음 방법으로 삽입하였다: 첫번째로, pS314를 KpnI 및 SalI로 절단하고 절단된 플라스미드를 나타내는 단편은 전기영동적으로 단리하였다. 두번째로, pS312를 KnpI 및 BamHI 로 절단하고 사람 BSSL 유전자의 5'-부분을 나타내는 대략 4.7 kb 단편을 분리하였다. 세번째로, pS313을 BamHI 및 SalI로 절단하고 사람 BSSL 유전자의 3'-부분을 단리하였다. 이들 3개의 단편을 연결하여, 수용성 대장균 중으로 형질 전환시켜 형질 전환체를 앰피실린 선택후 단리하였다.

수개의 형질 전환체로부터 플라스미드를 제조하고 제한 효소 맵핑 및 서열 분석으로 주의깊게 분석하였다. 목적하는 발현 벡터를 나타내는 플라스미드 하나를 정하고 pS317로 명명하였다(제15도).

원핵성 플라스미드 서열을 제거하기 위하여, pS317을 NotI로 절단하였다. 사람 BSSL 변이체 게놈성 단편이 연결된 쥐의 WAP 서열로 이루어진 재조합 벡터 요소를 아가로스 전기영동법으로 단리하였다. 상기 분리된 단편을 이를 쥐의 배중으로 주입하기 전에 전기용출법을 이용하여 더 정제하였다.

형질전환된 쥐로부터 젖에서의 사람 BSSL 변이체 발현용 재조합 유전자를 제16도에 나타낸다.

3.2. 형질전환된 동물의 생성

NotI 단편을 3.1절에 따라서 플라스미드 pS317로부터 단리하였다. 상기 DNA 단편은 사람 BSSL 변이체를 코딩하는 게놈 서열에 연결된 쥐의 WAP 프로모터를 포함하였다. 임신한 말의 혈청 고나도트로핀 5 IU으로 과배란을 촉진시킨 공여 쥐로부터 수득한 350개의 C57B1/6JxCBA/2J-f ₂ 배아의 전핵에 상기 분리된 단편을 3 ng/㎕의 농도로 주입하였다. C57B1/6JxCBA/2J-f ₁ 동물은 다음 기관으로부터 구입하였다: Bomholtgard Breeding and Research Centre LTD, Ry, Denmark. 난관으로부터 배아를 수거한 후, 이들을 M2 배지 중에서 히알루로니다제로 처리하여 구세포로부터 분리하였다(Hogan et al., 1986). 세척후, 상기 배아를 배지 M16(Hogan et al., 1986)으로 옮겨 5% CO ₂ -대기가 있는 배양기에 보관하였다. 주입(injection)은 나리시기 수력 미세조작기 노마르스키 광학기(Nomarski optics)가 장착되어 있는 니콘 역전 현미경을 사용하여 경질 파라핀유하의 M2 미세 액적(microdrop)중에서 수행하였다. 주입 후, 267개의 건강하게 보이는 배아를 2.5% 아버틴 0.37 ml을 복강내로 공급한 12 마리의 가임신된 C57B1/6JxCBA/2J-f ₁ 수용체중으로 이식하였다. 형질 전환 유전자를 통합시킨 생쥐를 동물 출생후 3주 경과된 후 수득한 꼬리 생검 표본으로부터의 DNA의 PCR 분석으로 확인하였다. 써던 블롯 분석에 의해 양성 결과를 확인하였다.

젖 수거를 위하여, 암컷 수유 동물에게 옥시토신 2 IU를 복강내로 주사하고 10분후 2.5 % 아버틴 0.40 ml를 복강내로 주사하여 마취시킨다. 젖 수거 기구를 실리콘으로된 관을 통해 유두에 부착하고 유선을 부드럽게 맛사지하여 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 젖을 수거하였다. 젖의 양은 수유일에 따라 변화되며, 생쥐 및 수집 당 0.1 내지 0.5 ml 사이였다.

3.3. 형질 전환 생쥐에서의 BSSL 변이체의 발현

형질전환된 생쥐를 절단한 꼬리 시료로부터 제조한 DNA 분석으로 확인하였다. 조직 시료를 프로테이나제 K와 함께 배양하고 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 분리된 DNA를 프라이머와의 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하는데, 프라이머는 발현 벡터 단편을 나타내는 이종성 도입 DNA가 존재하는 경우 특정 단편을 증폭시켰다. 또한, 동물을 DNA 혼성화 실험으로 분석하여 PCR 데이타를 확인하고 가능한 재배열, 통합된 벡터원의 구조에 대해 시험한 다음 통합된 벡터원의 카피수에 관한 정보를 수득하였다.

한 세트의 실험에서, 31 마리의 생쥐를 2 가지 방법으로 분석한 결과는 1마리의 생쥐가 pS317로부터 유래된 이종성 DNA 벡터 요소를 포함하는 것으로 입증되었다. PCR 분석 및 혼성화 실험의 결과는 동일하였다(제17도). 전체적으로, 65 마리의 시험된 동물중 10 마리는 pS317로 형질전환된 것으로 밝혀졌다.

벡터 DNA 요소를 포함하는 것으로 확인된 생쥐(파운더(founder) 동물)를 교배시키고 F1 후손을 동일한 방법으로 형질 전환 유전자에 대해 분석하였다.

수유 중의 pS317 형질전환된 암컷의 여러 조직으로부터 분리한 RNA를 아가로스 포름알데히드 겔 전기영동법으로 분리하고, 막에 블롯팅한 다음, 탐침으로서 ³² P-표지된 BSSL cDNA로 혼성화시켰다. 수득한 결과는 발현이 수유 기간중에 유선으로 제한됨을 나타내었다(제18도).

수유를 유발시키기 위하여 옥시토신으로 처리한 마취된 창립 동물로부터 젖 시료를 수거하여 재조합 사람 BSSL 변이체의 존재에 대해 분석하였다. 이는 SDS-PAGE를 수행하여, 니트로셀룰로오즈 막으로 옮겨 천연의 사람 BSSL에 대해 생성된 폴리클로날 항체와 반응시켜 이루어졌다. 수득한 결과는 형질전환된 생쥐로부터의 젖에서 재조합 사람 BSSL 변이체의 발현을 증명하였다. 제19도는 형질전환된 생쥐로부터의 젖에서 재조합 사람 BSSL 변이체의 존재를 증명하였다. 여러가지 pS317 형질전환된 생쥐로부터 유래된 젖 시료의 SDS-PAGE 분리 및 면역블로팅은 pS314로 형질전환된 생쥐의 젖으로부터 유래된 전장의 재조합 BSSL과 비교하여 명백히 감소된 분자량을 갖는 재조합 BSSL 변이체의 효율적인 생산을 나타낸다. 플라스미드 pS314는 게놈성 변이체 대신 전장의 사람 BSSL cDNA를 함유한다는 것 이외에는 pS317과 유사하다. 모든 쥐의 젖 시료에서 명백한 이중 밴드는 쥐의 BSSL을 나타내고, 따라서 항혈청의 교차 반응성을 나타낸다. 상기 결론은 또한 이중 밴드가 제19도의 9번 레인 (이는 정제된 쥐의 BSSL을 함유함)에서 명백함을 확인함으로써 지지되었다.

형질전환된 동물의 안정한 주(line)가 생성된다.

유사한 방법으로, 토끼, 소 또는 양과 같이 사람 BSSL 변이체를 발현할 수 있는 다른 형질전환된 동물을 제조할 수 있다.

기탁물

하기 플라스미드는 부다페스트 조약에 따라서 DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 기탁되어있다.

본 발명에 따른 재조합 BSSL 변이체는 촉매 활성을 보유하나, 전장(全長)의 BSSL보다 더 적은 글리코실화 부위를 포함하여, 잠재적으로 탄수화물 이종성이 감소되도록 제조될 수 있다. 이와 같이 감소된 복잡성은 정제 및 재조합 단백질의특성화를 용이하게 함으로써, BSSL 활성을 갖는 폴리펩티드를 보다 효율적인 비용으로 제조할 수 있다.

참조 문헌

서 열 표

(1) 일반적 정보

(i) 출원인

(A) 성명 : 악티에볼라게트 아스트라(AB ASTRA)

(B) 거리 주소 : 크바른베르가가탄

(C) 도시 : 쇠더텔예

(E) 국가 : 스웨덴

(F) 우편 번호(ZIP) : 에스-151 85

(G) 전화 번호 : +46-8-553 260 00

(H) 팩스 번호 : +46-8-553 288 20

(I) 텔렉스 번호 : 19237 아스트라 에스

(ii) 발명의 명칭 : 신규 폴리펩티드

(iii) 서열수 : 9

(iv) 컴퓨터 판독형

(A) 매체 형태 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성

(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : 페턴트인 릴리스(PatentIN Release) # 1.0,

버전 # 1.25(EPO)

(vi) 선행 출원 데이타 :

(A) 출원 번호 : SE 9300686-4

(B) 출원일 : 1993. 3. 1.

(vi) 선행 출원 데이타 :

(A) 출원 번호 : SE 9300722-7

(B) 출원일 : 1993. 3. 4.

(2) 서열 확인 번호 1에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 2428 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수 : 이중 가닥

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : cDNA 내지 mRNA

(iii) 가상 서열 : 아님

(iii) 안티센스 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : CDS

(B) 위치 : 82..2319

(D) 기타 정보 : /생성물= '담즙산염 자극성 리파아제'

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 엑손

(B) 위치 : 985..1173

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 엑손

(B) 위치 : 1174..1377

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 엑손

(B) 위치 : 1378..1575

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 엑손

(B) 위치 : 1576..2415

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 펩티드

(B) 위치 : 151..2316

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 폴리A-신호

(B) 위치 : 2397..2402

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-부위

(B) 위치 : 1756..2283

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 5'UTR

(B) 위치 : 1..81

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1756..1788

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1789..1821

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1822..1854

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1855..1887

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1888..1920

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1921..1953

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1954..1986

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1987..2019

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2020..2052

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2053..2085

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2086..2118

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2119..2151

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2152..2184

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2185..2217

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2218..2250

(ix) 특징

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2251..2283

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 1 :

(2) 서열 확인 번호 2에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 745 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 2 :

(2) 서열 확인 번호 3에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 722 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(iii) 가정 배열 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(2) 서열 확인 번호 4에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 535 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(iii) 가정 배열 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(xi) 특징

(A) 이름/기호 : 펩티드

(B) 위치 : 1..535

(D) 기타 정보 : /표지= 변이체-A

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 4

(2) 서열 확인 번호 5에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 546 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(iii) 가정 배열 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(xi) 특징

(A) 이름/기호 : 펩티드

(B) 위치 : 1..546

(D) 기타 정보 : /표지= 변이체-B

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 5

(2) 서열 확인 번호 6에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 568 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(iii) 가정 배열 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(xi) 특징

(A) 이름/기호 : 펩티드

(B) 위치 : 1..568

(D) 기타 정보 : /표지= 변이체-C

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 6

(2) 서열 확인 번호 7에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 722 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(iii) 가정 배열 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(xi) 특징

(A) 이름/기호 : 펩티드

(B) 위치 : 1..722

(D) 기타 정보 : /표지= 변이체-N

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 7

(2) 서열 확인 번호 8에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 2184 염기쌍

(B) 유형 : 핵산

(C) 가닥수: 이중 가닥

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)

(iii) 가정 배열 : 아님

(iii) 안티센스 : 아님

(vi) 기원 :

(A) 생물명 : 호모 사피엔스

(F) 조직 종류 : 유선

(xi) 특징

(A) 이름/기호 : CDS

(B) 위치 : 82..2088

(D) 기타 정보 : /표지= 변이체-T

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : mat-펩티드

(B) 위치 : 151..2085

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1756..2052

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1756..1788

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1789..1821

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1822..1854

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1855..1887

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1888..1920

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1921..1953

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1954..1986

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 1987..2019

(ix) 특징 :

(A) 이름/기호 : 반복-단위

(B) 위치 : 2020..2052

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 8

(2) 서열 확인 번호 9에 대한 정보 :

(i) 서열 특징 :

(A) 길이 : 668 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(D) 위상 : 선형

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 기재 : 서열 확인 번호 9