항염증인자, 그의 분리방법 및 이용

[발명의 명칭]

항염증인자, 그의 분리방법 및 이용

[도면의 간단한 설명]

본 발명 및 많은 부수적인 이점에 대한 보다 완전한 이해는 발명이 첨부되는 도면과 관련하여 고찰될 때 다음의 상세한 설명을 참고로 더욱 잘 이해됨에 따라 쉽게 얻어질 것이다.

제1도는 바람직한 방법의 단계 2에서, DEAE-셀룰로스 컬럼상에서의 이온-교환 크로마토그래피에 의한 MAIF의 분리.

제2도는 바람직한 방법의 단계 3에서, 세파덱스 G-10 분자 시이브 컬럼상에서의 DEAE-셀룰로스 크로마토그래피(제1도)로부터의 MAIF 피이크(두번째)의 분별.

[발명의 상세한 설명]

본 출원은 1982년 6월 3일 출원되고 현재 포기된 US일련번호 384,625의 부분계속출원인 1987년 1월 9일 출원의 US일련번호 001,848의 부분 계속출원이다; 전자는 1983년 10월 27일 출원된 US일련번호 546,162와 1983년 2월 1일 출원되고 현재 포기된 US일련번호 576,001의 계속출원인 1986년 9월 17일 출원의 US일련번호 910,297로 분할되어 있다.

[발명의 배경]

[발명의 분야]

본 발명은 항염증인자(AF), 실질적으로 순수한 형태의 제조방법, 및 염증치료에의 그의 이용방법에 관한 것이다

[배경기술의 설명]

도어랜드 의학 사전에 정의된 바와 같이, 염증은 유해제제 및 손상된 조직을 파괴, 희석 또는 제거하는 작용을 하는, 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유도된 국소 보호 반응이다. 그것은 미소혈관계의 천공, 혈액요소의 세포조직사이의 공간으로의 누출, 및 염증을 일으킨 조직으로의 백혈구의 이동을 특징으로 한다. 육안으로 보이는 수준에서는, 이것은 통상 흉반, 부종, 민감증(통각 과민증), 및 고통의 친숙한 임상적 신호에 의해 이루어진다. 이 복합반응이 이루어지는 동안, 히스타민, 5-히드록시트립트아민, 다양한 화학주성인자, 브래디키닌, 류코트리엔, 및 프로스타글란딘 같은 화학조절제가 국소적으로 방출된다. 식세포가 그 부분으로 이동하며, 세포 리소좀 막이 파열될 것이며 그로써 용해 효소가 방출된다. 이런 모든 사건이 염증 반응에 기여할 것이다.

류머티양 관절염에 걸린 환자의 염증은 아마도 항원(감마 글로불린)과 항체(류머티양 인자) 및 백혈구를 유인하는 화학주성인자의 국소 방출을 유발하는 보체의 조합을 포함한다. 백혈구는 항원-항체와 보체의 복합체에 대해 식작용을 나타내고, 또한 그것들의 리소좀에 함유된 많은 효소를 방출한다. 그러면 이들 리소좀 효소들은 연골 및 다른 조직의 상해를 유발하고 이것은 나아가 염증의 정도를 진행시킨다. 세포-중재 면역반응이 또한 포함될 수 있다. 이 과정중에 또한 프로스타글란딘이 방출된다.

염증에서 생성되는 것으로 보이는 프로스타글란딘은 흉반을 초래하고, 국소혈류를 증가시킨다. 프로스타글란딘의 2가지 중요한 혈관 효과-장기 지연 혈관확장작용 및 노르에피네프린 및 안지오텐신 같은 물질의 혈관수축효과와 역작용을 하는 능력은, 일반적으로 염증의 다른 조절제와 공유되지 않는다.

많은 염증 조절제가 후모세관 및 소맥수집의 혈관 투과도(누출)를 증가시킨다. 또한, 백혈구의 염증부위로의 이동은 염증반응의 중요한 측면이다. 프로스타글란딘이 화학주성 반응에 직접 포함되는 것 같지 않은 반면, 아라키돈산 대사의 또다른 생성물인 류코트리엔이 매우 잠재성이 높은 화학주성 물질이다.

항염증반응은 상기 규정된 바와 같은 염증을 특징으로 하는 어떠한 반응이다.

염증반응이 상이한 질병 및 상해와 관련되는 많은 육체적 불편, 즉, 고통과 기능의 손실을 초래한다는 것은 의학분야에 숙련된 사람들에게는 잘 알려진 것이다. 따라서, 염증 반응을 중화시키는 효과를 나타내는 약리학적 제제를 투여하는 것이 통상적인 의학적 관행이다. 이런 성질을 가지는 제제는 항염증제로서 분류된다. 항염증제는 광범위한 장해의 치료에 사용되며, 동일 약제가 때로 상이한 질병을 치료하기 위해 사용된다. 항염증제를 이용한 치료는 질병이 아니라, 증상, 즉, 염증에 대해 가장 자주 사용된다.

항염증제, 진통제 및 해열제는 때로 화학적으로는 무관하지만, 그래도 특정 치료작용 및 부작용을 공유하는 화합물들의 이종 군이다. 코르티코스테로이드가 항염증 반응의 치료를 위한 화합물 중 가장 광범위하게 사용되는 종류를 나타낸다. 단백질분해 효소는 항염증 효과를 가지는 것으로 주장되는 화합물의 또다른 종류를 나타낸다.

부신피질이 스테로이드를 생성 및 분비하는 것을 직접 또는 간접으로 유도하는 호르몬은 항염증 화합물의 또 다른 종류를 나타낸다. 많은 비-호르몬성 항염증제가 기재되어 있다.

이들 중에서, 가장 광범위하게 사용되는 것은 살리실산 염이다. 아세틸 살리실산, 또는 아스피린이 가장 광범위하게 처방되는 진통-해열 및 항염증제이다.

스테로이드성 및 비-스테로이드성 항염증제의 실례는 Physician's Desk Reference, 1987(pp 207,208. 그러한 제제의 색인,참조)에 나열되어 있다.

천연 및 합성 코르티코스테로이드 제제는 혈압상승, 염 및 물 보유, 및 칼륨 및 칼슘 배설의 증가를 포함한 많은 심각한 부작용을 유발한다.

더욱이, 코르티코스테로이드는 감염의 신호를 차단하고 감염성 미생물의 보급을 증강시킬 수 있다. 이들 호르몬은 임신중의 부인에게 사용하기에는 안전하지 못한 것으로 생각되며, 장기간의 코르티코스테로이드치료는 위 과민증 및/ 또는 소화성 궤양과 관련되어 왔다.

이들 화합물로의 치료는 또한 보다 많은양의 인슐린을 필요로 하는 당뇨증을 악화시킬 수 있으며, 정신이상 장해를 초래할 수 있다. 내인성 코르티코스테로이드의 생성을 간접적으로 증가시키는 호르몬성 항염증제는 동일한 정도의 유해한 부작용을 갖는다.

비-호르몬성 항염증제는 고용량에서 광범위한 바람직하지 못한 부작용을 수반하는, 독성일 수 있는 합성생화학적 화합물이다. 예를들어, 살리실산염은 이 화합물 종류에 의한 중독을 특징으로 하는 위험한 산-염기 평형 방해에 기여한다. 살리실산염은 호흡을 직접 및 간접적으로 자극한다. 독성량의 살리실산염은 혈관운동 강하에 이차적인 순환성 쇼크뿐만 아니라 중추 호흡 마비를 초래한다. 살리실산염의 섭취는 상복부의 고통, 구역질, 및 구토를 유발할 수 있다. 살리실산염-유도 위출혈은 잘 알려져 있다.

살리실산염은 간 상해를 초래할 수 있고, 응고 시간의 지연을 유도할 수 있다. 그러므로, 심각한 간 손상, 저프로트롬빈혈증, 비타민 K 결핍증, 또는 혈우병 환자에게는 실리실산염에 의한 혈소판 지혈의 저해가 혈우병을 유발할 수 있으므로, 아스피린 사용을 금해야 한다. 살리실산염 중독은 흔히 있는 일이고, 심각한 살리실산염 중독의 10,000경우 이상이 년간 미합중국에서 발생하며, 그들 중 약간은 치명적인 것이 되고, 많은 경우 어린이에게서 일어난다.

굳맨과 길맨의 The Pharmacological Basis of Therapeutics, 제7판, 1985, 참조. 따라서, 현재 대다수의 항염증제가 활용되고 있음에도 불구하고, 부작용 및 역반응이 없는 안전하고 효과적인 항염증 생성물이 여전히 요구된다.

예를들어, 우유에서 유도되는 것과 같은 천연 식품이 항염증 효과를 가지는 것으로 얻어질 수 있다면, 그것은 쉽게 투여가능하고 쉽게 활용가능한 안전한 치료 조성물이 될 것이다.

선행 기술 분야에는 다양한 치료효과를 가지는 우유를 제조하는 것이 공지되어 있다. 예를들어, 벡크(Beck)는 충치 저해 효과를 가지는, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항체를 함유하고 있는 우유를 개시한 바 있다(미국 특허 제4,324,782호). 그 우유는 소를 스트렙토코커스 뮤탄스 항원으로 2단계로 면역시킴으로써 얻어지며, 그것으로부터 치료용 우유가 얻어진다.

스톨(Stolle)등은 동물의 흡연과 관련된 혈관 장해 또는 폐 장해 치료방법을 개시하였으며, 그 방법은 초면역 상태로 유지되고 있는 소로부터 취한 우유를 동물에게 투여하는 것으로 이루어진다(미국 특허 제4,636,384호).

벡크는 항염증 인자 생성 상태로 유지된 소로부터 수집한 우유의 항염증적으로 유효한 양을 동물에게 투여하는 것으로 이루어지는, 동물의 염증치료방법을 개시하였다(미국 특허 제4,284,623호). 하인바흐(Heinbach, 미국 특허 제3,128,230호)는 소를 항원 혼합물로 접종시킴에 의한 알파, 베타, 및 감마 성분의 글로불린을 함유하고 있는 우유를 기재한 바 있다. 피터슨 등(미국 특허 제3,376,198호), 홀름(미국출원(공개) 일련번호 제628,987호), 투나 등 (영국 특허 제1,211,876호)및 비오케마 에스. 에이.(영국 특허 제1,442,283호)도 또한 항체-함유 우유를 기재하였었다.

그러나 상기 언급한 참고문헌중 어느것도 소정의 치료 효과를 나타내는 치료용 우유의 성분 또는 성분들의 정체를 개시한 것은 없다. 예컨대, 벡크의 미국 특허 제4,284,623호에서 치료수단으로서 사용된 우유제품은 유동성 전체우유, 지방이 없는 유동성 유장이거나, 또는 전체 우유 분말로 이루어진다.

이들 우유 제품의 각각이 비록 항염증성질을 가지고는 있지만, 실제로 치료상의 유익함을 제공하는 인자 또는 인자들은 아직까지 분리 또는 확인되지 않았다.

[발명의 개요]

본 발명은 분리 및 정제된 항염증 우유생성물이 동물의 항염증 장해를 치료하는데 가장 유용할 것이라는 본 발명자들의 고찰을 토대로 한다.

이것을 염두에 두고, 본 발명자들은 이하 우유 항염증 인자(MAIF)라 부르는, 초면역 소과 동물의 우유로부터의 항염증 인자를 분리하여 부분적으로 정제하고 특성을 확인하였다.

진일보한 연구는 이 우유 생성물이 염증의 임상적 증상을 방지 또는 완하시켰음을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 사전에 특정 다가 항원에 대하여 초면역된 우유-생산 동물의 우유로부터 분리된 항염증 인자가, 상기 분리 및 정제된 항염증 인자가 항염증 효과를 나타내기에 충분한 양생법하에 일정량으로 투여되는 경우, 염증상태에 대하여 효과적이라는 발견이다. 이 발견은 특히, 다가항원 백신 자체가 MAIF를 함유하지 않는다는 사실의 견지에서 놀랄만한 것이다.

초면역된 소과 동물의 우유로부터의 활성인자의 분리는 MAIF가 정상 소과 동물의 우유에 소량 존재한다는 예기치 않았던 발견을 유도하였다. 이 발견은 정상 소과 동물의 우유중의 MAIF의 농도가 우유에 식별 가능한 항염증 성질을 부여하기에는 너무 낮다는 사실에 의하여 가리워져 왔었다. 그러나, 정상 우유의 MAIF는 본 발명의 분리방법에 의하여 농축될 수 있고, 그런 다음 염증 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

[바람직한 구체예의 상세한 설명]

본 발명은 MAIF의 분리 및 정제와 항염증 장해를 치료할 목적의 상기 MAIF의 동물에의 투여를 포함한다.

용어 우유 항염증 인자(MAIF)는 초면역 우유 또는 정상 우유로부터 얻어진 인자를 의미한다. 용어 실질적으로 순수한 MAIF는, 본 발명의 목적에 대해서는, 고분자량 물질(10,000달톤)의 제거 및 이온교환 크로마토그래피에 의해 저분자량이고 음성-전하인 종을 분리한 후, HPLC 크로마토그래피 상에서 단일한 주된 대칭 피이크로서 용출되는 항염증인자를 의미한다. 정상 우유 및 초면역 우유 두 가지 모두 MAIF를 얻기 위해 본원에 기재된 방법에 의하여 가공처리될 수 있다.

용어 초면역 우유는, 본발명의 목적에 대해서는, 초면역 상태로 유지된 우유-생산 동물로부터 얻어진 우유를 말하며, 초면역에 대한 상세한 설명은 아래에서 보다 상세하게 기재하기로 한다.

용어 탈지유는 본 발명의 목적에 대해서, 크림이 제거된 우유를 의미한다.

용어 유장은 본 발명의 목적에 대해서, 크림과 카제인성 물질이 제거된 우유를 의미한다.

용어 정상우유는 본 발명의 목적에 대해서, 종래수단 및 낙농관행에 의해 우유-생산 동물로부터 얻어지는 우유를 의미한다.

용어 우유-생산 동물은 본 발명의 목적에 대해서, 상업적으로 적합한 양의 우유를 생산하는 포유동물을 의미하며, 바람직하게는 소, 양 및 염소이고, 보다 바람직한 것은 보스(Bos)(소과)속의 낙농소, 특히, 홀스타인같은, 고수율의 우유를 제공하는 품종이다.

용어 박테리아 항원은 본 발명의 목적에 대해서, 가열-사멸된 박테리아 세포의 동결건조된 제제를 의미한다.

용어 미소캡슐 형태는 본 발명의 목적에 대해서, 우유-생산 동물에 투여하기 위한 박테리아 항원을 하나 또는 그 이상 캡슐화하는 중합미소입자를 의미한다.

용어 염증은 본 발명의 목적에 대해서, 유해 제제 및 상해된 조직 두가지를 모두 파괴, 희석 또는 제거하는, 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유도된 국소 보호 반응을 의미하며, 그것은 급성형태의 고통, 열, 적열, 종창, 및 기능 손실이라는 고전적인 순서를 특징으로 하고, 조직학적으로는 소동맥, 모세혈관, 및 투과도 및 혈류속도가 증가된 소맥의 확장을 포함하는 사건들의 복합적인 연속, 혈장 단백질을 포함하는 유동액의 삼출, 및 백혈구의 염증 병소로의 이동을 포함한다.

용어 치료는 본 발명의 목적에 대해서, 장해의 증상 및/또는 장해의 병원성 원인이 호전 또는 완전히 제거되는 것을 의미한다.

용어 투여는 본 발명의 목적에 대해서, 예컨대 경구, 비내, 비경구(정맥내, 근육내, 또는 피하), 또는 직장투여와 같이, 환자에게 물질을 사용하여 치료하는 어떠한 방법을 의미한다.

용어 동물은 본 발명의 목적에 대해서, 사람, 농장 동물, 가축 또는 동물원의 동물들을 포함하여 염증이 일어날 수 있는 어떠한 살아있는 동물을 의미한다.

본 발명의 분리 및 정제된 우유 생성물에 의해 치료될 수 있는 염증상태의 실례로는 급성 및 하위급성 활액낭염, 급성 비-특이적 건염, 전신 낭창 홍반, 전신 피부근염, 급성 류마티성 심장염, 천포창, 수포성 피부염, 포진모양의 염증, 중증의 홍반, 다형 박리성 피부염, 간경변, 계절성 반복성 비염, 기관지 천식, 전위 피부염, 혈청병, 각막염, 눈의 홍채염, 확산 유레이티스(diffuse ureitis), 맥락막염, 눈의 신경염, 교감성 안염, 유육종증 증상, 뢰플러 증후군, 베릴륨중독증, 용혈성 빈혈, 유선염, 유양돌기염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 건선성 관절염, 유착 척추염, 급성 통풍성 관절염, 및 대상 포진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상태들이 있다. 나아가, 분리 및 정제된 우유 생성물은 잠재적으로 염증성 제제에 노출되는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 부분적으로는, 소과의 동물같은 우유-생산 동물이 초면역이라는 특정 상태에 처하게 될때, 동물이 초정상수준의 매우 유익한 MAIF를 가지는 우유를 생산할 것이며, 그 MAIF는 사람 및 다른 동물에서 염증 증상을 억제할 뿐만 아니라, 수용체내의 염증성 제제의 존재의 사전 예방제가 된다는 발견을 토대로 한다.

용어 초정상수준은 초면역되지 않은 동물의 우유에서 발견되는 과잉수준을 말한다.

면역 민감성 단독의 유도는, 소가 소질병에 대한 정상면역감작중에 및 환경에의 정상적인 노출중에 다양한 항원에 대하여 민감해진다 하더라도 정상적인 소의 우유는 이런 초정상 수준을 함유하지 않는다는 사실에 의해 알 수 있는 바, 우유의 MAIF의 초정상수준의 발현을 유발하기에는 불충분하다. 특정한 초면역 상태에서만 우유가 소정의 초정상 수준을 가진다.

이런 특별한 상황은 초기면역감작을 실시하고, 이어서 충분히 고용량의 특정 항원으로 주기적인 추가면역을 시행하므로써 이루어질 수 있다.

추가면역의 바람직한 용량은 소과 동물의 1차 면역감작을 유발하기에 필요한 용량의 50%이거나 또는 50% 이상이어야 한다. 그에따라, 소가 정상적으로는 면역상태라 불릴수 있을 때라도, 역치 추가면역 용량은 그 성질이 우유에 나타나지 않는 양보다 낮다. 필수적인 초면역 상태를 이루기 위해서는, 첫번째 연속되는 추가면역 투여후에 초면역 우유를 시험하는 것이 필수적이다. 만약 우유에 유익한 인자가 존재하지 않는다면, 고용량의 추가의 추가면역이 그 성질이 우유에 나타날때까지 투여된다.

초정상수준의 MAIF를 함유하는 초면역 우유의 제조방법은 1987년 7월 2일에 출원되고 공동 계류중에 있는 미국 일련번호 제069,139호와, 1983년 2월 1일 출원된 미국 특허출원 일련번호 제576,001호의 계속인 1986년 9월 17일에 출원되고 공동 계류중에 있는 미국 일련번호 제910,297호(이들은 모두 참고로 본원에 삽입됨)에 개시되어 있다.

요약하면, 초정상수준의 MAIF를 함유하고 있는 초면역 우유를 제조하는 한가지 방법은 다음 단계로 이루어진다 :

(1) 항원 선택 단계; (2) 소과 동물의 1차 면역감작단계; (3) 민감성 유도를 확인하기 위한 혈청 시험 단계; (4) 적절한 용량의 추가면역으로 초면역시키는 단계; 임의로, (5) 항염증성질에 대하여 우유를 시험하는 단계; (6) 초면역 소과 동물로부터 우유를 수집하는 단계; 그리고 (7) 우유를 가공처리하여 MAIF를 분리하는 단계.

단계 1 : 어느 한 항원 또는 항원들의 조합이라도 사용할 수 있다. 항원은 박테리아, 바이러스, 원생동물, 진균, 세포, 또는 우유-생산 동물의 면역계가 반응을 보일 어떠한 다른 물질일 수 있다. 이 단계에서 결정적인 것은 항원(들)이 우유-생산동물에서 면역 및 초면역 상태를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 우유의 MAIF를 정상수준 이상으로 생성할 수 있어야 한다는 것이다. 어떠한 항원이라도 정상이상 수준의 MAIF를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 하나의 바람직한 백신은 아래 실시예 1A에 상세하게 기재되는, 시리즈 100백신으로서 언급되는 다가 박테리아 항원의 혼합물이다.

단계 2 : 항원(들)은 증강을 유발하는 어떠한 방법으로도 투여될 수 있다 .한가지 방법에서, 1×10 ⁶ 내지 1×10 ²⁰ , 바람직하게는 10 ⁸ 내지 10 ¹⁰ , 가장 바람직하게는 2×10 ⁸ 의 가열-사멸된 박테리아로부터 유도된 항원으로 이루어진 백신이 근육내 주사에 의해 투여된다. 그러나, 정맥내 주사, 복강내 주사, 직장 좌제, 또는 경구 투여같은 다른 방법도 사용될 수 있다.

단계 3 : 우유-생산 동물이 항원에 민감하게 되는지의 여부를 측정할 필요가 있다. 민감성을 시험하는 많은 방법이 면역학의 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다(Methods in Immunology and Immunochemistry, William, CA, and Chase, WM, Academic Press, New York, 제1-5권(1975)). 바람직한 방법은 항원으로서 다중 박테리아 종을 포함하고 있는 다가 백신을 사용하여 백신의 도전 전 및 후에 동물의 혈청중의 응집항체의 존재에 대하여 시험하는 것이다. 백신을 이용한 면역감작 후의 우유 항체의 출현은 민감성을 가리킨다; 이 때에 단계 4로 진행하는 것이 가능하다.

단계 4 : 이 단계는 감응된 동물에서 초면역상태의 유도 및 유지를 포함한다. 이 단계는 1차 증강을 이루기 위하여 사용한 것과 동일한 다가 백신을 고정된 시간 간격으로 반복 추가면역 투여하므로써 이루어진다. 2주의 추가면역 간격이 다가 박테리아 항원에 가장 적합하다. 그러나, 동물이 초면역 상태에서 항원에 대하여 면역 내성의 상태로 계대되지 않는 것을 확실히 할 필요가 있다.

바람직한 구체예에서, 소과 동물의 초면역 감작은 아래의 실시예 1B에서 상세하게 기재되는 것처럼 제조된, 미소캡슐화된 백신의 단일 투여에 의해 이루어질 수 있다. 초면역감작의 제어된 방출형태의 이점은 항원에 대한 일정한 노출이 초면역상태로 동물이 유지되는 것을 확실하게 해준다는 것이다.

다른 구체예에서, 상이한 면역감작과정, 예컨대 미소캡슐화된 및 액체항원의 동시투여, 또는 1차 면역감작을 위한 근육내 주사, 및 경구투여 또는 미소캡슐화 수단에 의한 비경구 투여에 의한 추가면역 투여를 조합하는 것이 또한 가능하다. 1차 및 초면역감작의 많은 상이한 조합이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 공지이다.

단계 5 : 항염증 활성수준에 대하여 우유를 시험하는 것이 필요하다. 이것은 초면역 우유 또는 염증시에 유도된 생성물의 어느 하나의 효과를 시험하는 어떠한 연구 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 쥐 발의 화학 약품-유도 염증은 항염증제에 대한 표준 측정이다.

단계 6 : 이 단계는 우유의 수집 및 가공처리를 포함한다. 우유는 종래 방법에 의하여 수집될 수 있다. MAIF를 분리하기 위한 가공처리법은 아래에서 설명한다.

MAIF를 분리, 정제 및 시험하는 가장 간단한 방법은 다음 단계들로 이루어진다 :

1. 초면역우유를 탈지하여 탈지유를 제조하는 단계;

2. 탈지유로부터 카제인을 제거하여 유장을 제조하는 단계;

3. 유장으로부터 한외여과에 의하여 약 10,000달톤보다 큰 분자량을 가지는 고분자를 제거하는 단계;

4. 이온교환수지 컬럼을 사용하여 단계 3으로부터의 생성물을 분별하여 분자량이 약 10,000달톤보다 적은 음성-전하 MAIF종을 분리하는 단계;

5. 분자 시이브 크로마토그래피에 의하여 단계 4로부터 음성-전하종을 분리하는 단계; 그리고

6. 단계 5로부터의 MAIF의 생물학적 측정단계.

우유인자의 항염증작용은 카라기난 용액을 쥐의 발에 주사하므로써 유발되는 부종에 대해 시험된다.

쥐의 발 시험은 항염증제에 대한 표준동물시험이다(Winter, CA, Risley, GA, Nuss, AW, Carrageenin-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs,Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3 : 544(1967)). 각종 다른 시험도 사용될 수 있다[Wetnick, AS, and Sabin, C., The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats, Jap. J. Pharm. 22 : 741(1972)]. 그러나, 쥐의 발 시험이 활용가능한 가장 간단하고 직접적인 시험으로 모든 항염증제에 대해 만족할만한 것으로 밝혀졌다.

이 시험은 쥐의 발시험을 설명하는 정도로 본원에 참고로 삽입된 미국 특허 제4,284, 623호(Beck)에 상세하게 기재되어 있다. 간단히 말하면, 이 시험은 소량의 카라기난을 성인 백색 쥐의 다리끝부분에 주사하는것을 포함한다. 이것은 염증반응을 유도하는 것으로 알려진다. 그 결과의 팽창도는 정량될 수 있다. AF를 함유하고 있는 샘플이 적당한 경로에 의하여, 바람직하게는 복강내 주사에 의하여 쥐에 투여되고, 염증 진행의 봉쇄 또는 호전은 용적측정 또는 중량측정 방법의 어느하나에 의해 정량된다.

요약하면, 우유의 탈지, 카제인 제거, 10,000달톤이상의 고분자 제거, 및 이온교환 및 분자 시이브 크로마토그래피의 수행이라는 방법에 의하여 초면역된 우유로부터 항염증인자를 분리할 수 있다. 항염증인자의 적절한 제제의 생물학적 활성은 본원에 기재된 바와 같은 쥐에 대한 용량-반응 실험을 하므로써 시험될 수 있다.

본 발명은 부분적으로는 MAIF가 분리 및 정제될 수 있고, 사람 및 동물에서 다양한 염증 진행을 치료하는데 효과적이라는 뜻밖의 발견을 토대로 한다. 바람직한 구체예에서, MAIF는 우유-생산 동물을 박테리아 항원백신에 대하여 초면역시킴으로써 제조된다. 동물을 초면역시키기 위하여 사용된 백신은 항염증활성을 가지고 있지 않다. 그러므로, 혼합된 박테리아 항원 백신에 대해 면역된 동물로부터 얻어지는 분리 및 정제된 인자로 치료하는 것이 염증진행과정을 완화 또는 제거하는데 효과적이라는 것은 놀라운 것이다.

이제까지 본 발명을 일반적인 관점에서 기재하였고, 본원에 단지 설명을 목적으로 제공되고, 다른 특별한 언급이 없는한 제한하는 것으로 의도되지 않은 특정 구체예를 참고로 본 발명을 더욱 설명하기로 한다.

[우유의 제조]

[실시예 1A]

S-100 백신의 제조

아메리칸 타입 컬춰 콜랙션으로부터 얻어지는 바와 같은 아래의 표 1에 제시된 박테리아의 스펙트럼을 함유하고 있는 박테리아 배양액을 15ml의 배지로 재구성하여 밤새 37℃에서 배양하였다. 일단 양호한 성장이 이루어지면, 대략 1/2의 박테리아 현탁액을 사용하여 1리터의 브로스를 접종하고, 37℃에서 그 접종액을 배양하였다. 나머지 현탁액은 멸균 글리콜 튜브에 옮겨서 -20℃에서 6달까지 보관하였다.

양호한 성장을 배양액에서 볼 수 있게 된 후, 현탁액을 20분동안 원심분리하여 배지를 제거하므로써 박테리아 세포를 수득하였다. 얻어진 박테리아 펠릿을 멸균 식염수 용액에 재현탁하고 박테리아 샘플을 3회 원심분리하여 세포로부터 배지를 세척해내었다. 3회의 멸균 식염수 세척 후, 원심분리상에서 얻어진 박테리아 펠릿을 소량의 이차 증류수에 재현탁시켰다.

배지가 없는 박테리아 현탁액을 80℃ 수조의 유리 플라스크에 밤새 놓아둠으로써 열-사멸시켰다. 브로스 배양액의 생육성을 소량의 열-사멸된 박테리아를 사용하여 시험하였다. 브로스를 열-사멸된 박테리아로 접종하고 37℃에서 5일동안 배양한후, 매일 성장을 체크하였다. 이것은 박테리아를 백신에 사용하기 위해서는 죽어야 하기 때문이다.

열-사멸된 박테리아를 건조할때까지 동결건조시켰다. 그런다음 건조한 박테리아를 2.2×10 ⁸ 박테리아 세포/ml 식염수(660nm에서 광학밀도는 1.0이다)의 농도로 멸균 식염수 용액과 혼합하였다.

소에게 매일 다가 액체 백신샘을 5ml씩 주사하였다. 주사된 소에 대한 항체(IgG) 역가 수준을 다가 항원에 대한 소과 동물의 항체에 대한 효소-결합 면역측정법을 사용하여 주기적으로 측정하였다.

[실시예 1B]

열-사멸된 박테리아를 상술된 방식으로 제조하였다. 얻어진 다가 항원 샘플(S-100)을 종래의 상-분리 방법에 의해 미소캡슐하여 다가 항원-함유 미소입자 생성물을 제조하였다.

일반적으로, 항원-함유형 매트릭스 물질은 생물학적 적합성의 물질, 바람직하게는 생분해가능한 또는 생물학적으로 서서히 파괴될 수 있는 물질, 바람직하게는 폴리락트산, 폴리글리콜산의 중합체, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리캅토락톤, 코폴리옥살산염, 콜라겐 같은 단백질, 글리세롤의 지방산 에스테르, 및 셀룰로스 에스테르로부터 형성한다.

이들 중합체는 당해 기술 분야에 공지이며, 예컨대 US 3,773,919; US 3,887,699; US 4,118,470; US 4,076,798(이들은 모두 참고로 삽입됨)에 기재되어 있다. 사용한 중합체 매트릭스 물질은 생분해가능한 락티드-글리콜리드 공중합체였다.

열-사멸된 박테리아 항원은 그러한 매트릭스 물질안에, 바람직하게는 1-500미크론 사이의 직경, 바림직하게는 10-250미크론 사이의 직경을 가지는 미소구로서 캡슐화된다. 캡슐화 공정은 종래의 것이며 상분리 방법, 경계면 반응, 및 물리적 방법을 포함한다. 매트릭스와 선별된 항원의 많은 농축물의 많은 조합이, 숙주 몸체에 박테리아 항원의 미소입자로부터의 방출을 최적 속도로 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 조합은 부적절한 실험없이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 측정될 수 있다.

실시예의 미소입자는 직경이 250미크론 이하였다. 그런다음 다가 항원을 22%(16.5mg) 함유하고 있는 대략 750mg의 미소입자를 약 3cc의 비히클(물중에 1중량%의 트윈 20과 2중량%의 카르복시메틸 셀룰로스)에 현탁시켰다.

작은 그룹의 소를 보다큰 떼의 소들로부터 선택하였다. 무작위 선택된 이들 소중 5마리를 대조표준으로서 선택하였다. 4마리의 소에 다가 항원을 함유하고 있는 미소입자를 근육내 주사하였다. 미소 입자 샘플은 2.0mRad의 감마선으로 살균하였다. 항체(IgG) 역가수준은 접종된 소와, 및 대조 소로부터 얻어지는 우유 샘플로부터 주기적으로 측정하였다.

[실시예 2]

초면역된 우유로부터의 MAIF 인자의 분리

단계 1 : 우유 여과액 제조

초면역된 소로부터 취한 20리터의 신선한 우유를 크림분리기(DeLaval Model 102)를 통과시켜 지방을 제거하였다.

그 결과의 16리터의 탈지유를 한외여과시켜 중공섬유 디아필트레이션/농축기(Amicon DL-10L)를 사용하여 고분자량 종(10,000달톤 이상)을 제거하였다. 농축기에는 2개의 10,000달톤 분자량 커트-오프 카트리지(Amicon H ₅ P _10-43 )가 구비되어 있다. 탈지유를 펌프 속도가 80이고 입압(inlet pressure)과 출압(outlet pressure)이 각각 30psi와 25psi인 계량기상에서 처리하였다.

시간당 4리터의 유속으로 카트리지에서 나오는 여과액(＜10,000달톤) 12리터를 보관 및 앞으로의 정제를 위하여 동결 또는 동결건조시켰다.

단계 2 : 이온-교환 크로마토그래피

여과액중의 우유 항염증인자, MAIF를 먼저 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 의하여 분리하였다.

이 과정에서는 5×10cm 유리 컬럼에 팩킹하기 위해 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로 평형화시켜 놓은 DEAE-세파로스 CL-6B겔(Pharmacia)을 사용하였다.

1리터의 여과액(＜10,000)을 컬럼에 적용하여 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로, 시간당 160ml의 유속으로 용출시켰다. 10밀리리터의 분획을 수집하여 광학밀도가 인쇄되어 나오는 기록기(Pharmacia REC-482)가 연결된 LKB 유비코드 4700 흡광계에서 280nm에서 모니터하였다.

양성 및 중성 전하를 가지는 MAIF 이외의 물질은 DEAE-세파로스겔에 결합하지 않았다. 그것들은 통과시켜 흘려버리는 피이크(제1피이크)에서 용출된다. 음성전하를 가지고 있는 MAIF는 겔에 보유된다.

MAIF를 방출시키기 위하여, 멸균 생리식염수, pH 7.0을 사용하여 단계 구배로 컬럼을 용리하였다. 전형적인 프로필을 제1도에 도시한다. 개개의 분획의 생물학적 측정은 제2피이크가 MAIF를 함유하는 것으로 나타났다. 제2피이크 및 그 양옆을 함유하는 분획을 다음 정제에 사용하였다. 회수 연구는 8.8그램의 건조 분말이 이 방법에 의해 얻어졌음을 보여준다.

단계 3 : 겔 여과 크로마토그래피

단계 2로부터 얻어진 제2피이크는 MAIF 및 다른 음성전하 분자를 함유하므로 추가의 정제단계가 필요하였다. 추가의 정제를 완수하기 위하여, 겔 여과 컬럼을 사용하여 분자량을 토대로 다양한 성분을 분리하는 것이 편리하다.

이 방법에서는, 세파텍스 G-10 수지(Pharmacia)를 2.5×80cm 유리컬럼에 팩킹하고 멸균 2차 증류수, pH 7.0으로 평형화하였다. 단계 2로부터의 제2분획 2g을 멸균 2차 증류수에 재용해하여 컬럼의 맨위에 적용하였다. 컬럼을 시간당 30ml의 유속으로 용리하였다. 분획(3.3ml)을 수집하고, 연결된 기록기(Pharmacia REC-482)상에서 인쇄되어 나오는 광학 밀도로 254nm 및 280nm(Pharmacia Duo Optical Unit)에서 모니터하였다.

전형적으로, 제2도에 도시된 바와 같이 용출 프로필에는 3개의 피이크가 있다. 제1 및 제2피이크가 MAIF 활성을 함유하였다. 제1피이크는 활성 MAIF를 함유하는 G-10 컬럼상에서 형성되는 응집체이다. 제2피이크는 MAIF의 비응집 형태를 함유한다. 응집형태(피이크 1) 및 비응집 형태(피이크 2) 두가지 모두 쥐 생물학적 측정에서 생물학적으로 활성이다.

[우유 항 염증인자의 특성확인]

상술한 방법에 의해 제조된 MAIF의 비응집 형태의 분자량은 10,000달톤 이하인 것으로 나타났다. 이것은 유장으로부터 MAIF의 분리하는 제1단계가, 10,000달톤 이상의 분자량 종의 통과는 허용하지 않는 막을 사용하여 한외여과하므로써 이루어진 사실로부터 추론하였다.

MAIF는 음성전하를 갖는다. 이것은 DEAE 셀룰로스 이온교환컬럼에 우유 한외여과물을 적용하므로써 측정하였다. MAIF는 물을 사용해서는 컬럼으로부터 용출되지 않았다. 용출 배지를 염화나트륨(0.9% pH)으로 변화시킴으로써 여러가지 피이크가 용출되었다(제1도).

중성 및 양성 전하 종은 이온 교환수지에 부착하지 않으며, 음성 전하 종은 염 농도를 증가시킴으로써 용출된다. 10,000달톤 분자량 이하의 투과물이 DEAE 컬럼에 적용될 때는 중성염 및 당은 물을 사용하여 용출된다(피이크 1, 제1도). 완충액이 식염수로 변화되었을때 3개의 분명한 피이크가 용출되었다(피이크 2-4). 제2피이크 및 그 주변은 쥐 측정에서 MAIF 생물학적 활성을 함유하였다. 그러므로, MAIF는 음성전하를 가지는 것으로 결론지을 수 있다.

MAIF의 또다른 화학적 특징은 그것이 염제거 과정중에 응집체를 형성한다는 것이다. 이 성질은 10,000달톤 분자량 이하의 투과물이 세파덱스 G-10 컬럼을 통과하고 이차 증류수로 평형화된후 pH 7에서 물로 용출될때 명백해진다(제2도).

3개의 피이크가 G-10 컬럼으로부터 용출된다; 제1피이크는 10,000달톤과 동일한 또는 그것보다 큰 분자량으로 추정되는 보이드 부피를 수반하여 용출되었다. 이것은 10,000달톤보다 큰 분자가 앞서 한외여과에 의하여 이 샘플로부터 제거되었기 때문에 기대하지 않았던 것이다. 제2피이크는 항염증인자에 대해 예견된 위치에서 용출하였다. 제1 및 제2피이크는 두가지가 모두 쥐의 발 측정에서 항염증 생물학적 활성을 나타낸 반면, 제3피이크에는 활성이 없었다. 제1 및 제2피이크가 항염증 생물학적 활성을 가졌음을 발견한 것은 놀라운 일이었다.

G-10 컬럼의 제1피이크로부터 회수된 물질(단계 3)을 동결건조하여 G-100 컬럼에 적용하였다; 단일 피이크가 보이드 부피를 수반하여 용출하였고, 그것은 100,000달톤 또는 그 이상의 분자량으로 추정된다.

단계 3 G-10 컬럼은 상이한 분자량 종을 분리함과 동시에 염을 제거한다. 그러므로, G-10 컬럼통과 및 그로써 염의 제거가 이루어지는 동안 항염증인자가 고분자량 응집체를 형성한 것으로 결론지을 수 있다. 응집정도는 염농도에 따라 변하였다.

응집성질은 항염증인자의 존재에 의한 항염증 생물학적 활성을 가지는 상이한 분자량 종의 광범위 스펙트럼이 형성될 수 있다는 가능성을 시사한다. 이 성질의 발견은 최종 생성물의 응집정도에 의존하는 상이한 생화학적 성질의 광범위 스펙트럼을 가지는 우유 항염증인자의 제조가능성을 시사한다.

예를 들어, 더 길거나 더 짧은 생물학적 반감기를 가지는 제형이 더 크거나 더 작은 분자량 응집체를 사용하므로써, 가공처리중에 염농도에 의해 제어되는 분자량 분배를 수반하여 제조될 수 있다.

본원에 기재된 컬럼 크로마토그래피 방법으로 생물학적 활성을 가지는 가장 작은 분자량종이 얻어지게 되었다(즉, 단계 3 G-10 컬럼으로부터의 피이크 2). 이 관찰은 또한 응집체를 형성하기 위한 다른 방법을 사용하는 것을 시사한다. 예를들어, 물로 희석하는 것은 응집이 일어나는 것을 유발한다. 염, 특히 칼슘과 결합하는 화학적 제제는 응집체의 형성을 유발할 수 있다. 이 발견을 취하므로써, 응집체를 형성하고 MAIF를 분리하는 다른 방법도 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백할 것이다.

[실시예 3]

생물학적 활성 측정

MAIF의 항염증 작용을 쥐의 다리끝부분에 카라기난용액을 주사하므로써 유발된 부종에 대하여 시험하였다. MAIF의 동결건조된 샘플을 적절한 비히클에 용해시켜 실험용 쥐에 복강내 투여하였다. 그런다음 카라기난을 1% 식염수 용액 0.1ml의 양으로 쥐의 2개의 뒷다리 끝부분에 투여하였다. 주사전과 주사후 2.5시간 후의 다리끝부분을 두께 게이지를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 표2 및 3에 예시한다.

대조표준 및 초면역 우유로부터의 MAIF의 비응집체(G-10 컬럼으로부터의 피이크 2)는 1mg과 0.25mg사이의 용량에서 쥐 발 염증을 보다 경감시켰다(표 2). 초면역 우유 및 정상 우유는 두가지가 모두 활성을 나타냈다; 그러나, 초면역 우유가 보다 강력하였다. 이것으로부터 MAIF가 초면역 소의 우유에 보다 큰 농도로 존재한다고 결론지을 수 있다.

DEAE 컬럼으로부터의 제2피이크는 초면역 우유 또는 정상 우유로부터 분리될 때 활성을 나타냈다. 활성은 초면역 우유에 실질적으로 더 많다(표 3).

MAIF의 응집형태인, G-10 컬럼으로부터의 제1피이크는 쥐의 발 시험에서 활성을 나타냈다(표 2). 그러나, 응집형태는 동일 중량을 토대로 하였을때 비응집 형태만큼 강력하지 않다.

이들 연구로부터 MAIF 인자가 우유에 자연적으로 발생한다고 결론지을 수 있다. 소의 초면역감작은 우유중의 MAIF 농도가 더 높아지게 유도한다. MAIF는 다양한 방법에 의해 우유로부터 분리될 수 있는 작고, 음성 저하를 띈 분자이다. MAIF 인자는 우유에 자연적으로는 발생하지 않지만 가공처리중에 형성되는 고분자량 응집체를 형성할 수 있다.

[항염증인자의 화학적 분석]

항염증인자 샘플을 화학적으로 분석하였다. MAIF는 X-선 회절연구에 의하여 측정된 바 결정구조는 아니다. MAIF 제제의 요소분석 결과는 탄수화물 조성물에 부합한다. C, H, O 비율은 약간의 카르비놀기가 카르복실로 산화되어 있는 중합체 또는 올리고머 물질과 일치하였다. 염화이온을 초과하는 약간 과량의 칼슘 당량이 부분적으로는 카르복실산염으로서 설명될 수 있다. 나머지는 나트륨 또는 칼륨염일 수 있다. 그러나, 용융행동, 또는 비-용융 행동까지도 염 형태 및/또는 고분자량 조성물임을 시사하였다. 현재 상태의 순수한 물질은 외관상으로는 칼슘 및 콜로라이드의 염, 아마도 CaCl ₂ 의 가변량을 포함한다.

어떤 제제도 그의 조성물중의 어떠한 펩티드 성분을 방해하는 질소의 충분한 양을 함유하지 않았다. 유사하게, 질소의 부재는 아미노당 및 주성분(들)으로서 다양한 복합지질같은 다른 질소-함유물질의 존재를 불가능하게 할 수 있다.

열분해 질량 스펙트럼은 상당한 흔적량의 18-탄소 지방산을 나타냈다. N 및 P의 흔적량과 함께 취해지는 이런 사실은 인자중의 복합 지질의 존재를 시사한다.

회절 분광기 조사는 카르비놀 및 카르복실산염 기능성과 일치하는 흡수를 나타냈다. 자외선, 가시광선 및 형광 분광기 조사는 회절분석에 의해 가리키는 바를 넘어서는 발색단의 유의량이 없는 것으로 드러났다.

화학적 시험은 카르보닐 기능(알데히드 또는 케톤)이 하위단위 연쇄와 관련되는 올리고머 탄수화물과 양립한다. 올리고머 탄수화물은 또한 약간의 측쇄의 카르복실레이트로의 산화를 함유한다.

MAIF 제제는 실질적으로 순수하지만 완전하지는 않다.

본 발명을 일반적으로 기재하였다. 많은 변형 및 수정이 발명의 사상 또는 범주에 영향을 미치지 않으면서 발명에 첨가될 수 있음이 당해 기술분야에 숙련된 사람들에게 쉽게 이해될 것이다.