Probiotic microorganism that has been separated from donkey milk |
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申请号 | JP2012509030 | 申请日 | 2010-05-05 | 公开(公告)号 | JP2012525828A | 公开(公告)日 | 2012-10-25 |
申请人 | ユーロラクティス グループ エスエー; | 发明人 | オルランド,ピエランジェロ; コンティ,アメデオ; ナザロ,フィロメナ; | ||||
摘要 | ロバの乳から分離した乳酸菌属のプロバイオティクス乳酸菌、および発酵乳製品のような食品または飲料組成物へのこれらの使用を開示する。 【選択図】なし |
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权利要求 | 特にロバの乳から単離され、寄託番号DSM22098、DSM22099、DSM22100、DSM22102、DSM22101、DSM23558、DSM23559、及びDSM23560でDSMZに寄託された菌株、前記菌株から入手可能である変異株、並びに、ラクトバチルスプランタルムクラスターに属し、DSM22102、DSM22101、DSM23558、DSM23559、およびDSM23560で寄託された菌株から成る群から選択された菌株と少なくとも70%のDNA−DNA相同性および少なくとも99.5%の16S RNA同一性を示す菌株、から成る群から選択された、プロバイオティクス乳酸菌。 請求項1に記載の1つまたは複数のプロバイオティクス乳酸菌種または菌株を含む、組成物。 前記組成物は、食品組成物または飲料組成物である、請求項2に記載の組成物。 少なくとも、 −請求項1に記載の生存可能なプロバイオティクス乳酸菌を食品製品に接種するステップと、 −前記プロバイオティクス乳酸菌が代謝するのに適した条件下に、前記接種した食品製品を置くステップと、 −個体数が、少なくとも10 6 CFU/mL(食品)に到達するまで、前記食品製品を発酵させるステップと、 を含む、食品組成物または飲料組成物の製造プロセス。 少なくとも、 −請求項1に記載のプロバイオティクス乳酸菌を、個体数が少なくとも10 6 CFU/mLに到達するまで発酵させるステップと、 −前記プロバイオティクス乳酸菌を保護するステップと、 −前記保護されたプロバイオティクス乳酸菌と食品製品とを混合させるステップと、 を含む、食品組成物または飲料組成物の製造プロセス。 発酵が定常期に達した時に発酵を停止し、それが、前記プロバイオティクス乳酸菌をそれらが代謝するのに適した条件下に配置した状態で約24時間以内であることが好ましい、請求項4または5に記載のプロセス。 病原微生物による粘膜でのコロニー形成に関連する疾患を治療するための組成物の調製における、請求項1に記載のプロバイオティクス乳酸菌の使用。 前記粘膜が腸の粘膜及び胃の粘膜から成る群から選択される、請求項7に記載の使用。 前記病原微生物は、サルモネラ菌、コレラ菌、大腸菌のような腸管病原性微生物である、請求項7または8に記載の使用。 リステリア、サルモネラ、カンピロバクターまたはクロストリジウムなどの食品の病原体に対して、このような食品病原体の成長の阻害によって発酵食品製品を保護するための、請求項1に記載のプロバイオティクス乳酸菌の使用。 前記細菌を利用している発酵の間に酪酸を製造するための、請求項1に記載のプロバイオティクス乳酸菌の使用。 適した条件下で請求項1に記載のプロバイオティクス乳酸菌を発酵させるステップと、前記微生物によって発酵されている間に製造された前記酪酸を収集するステップとを含む、酪酸を製造するための方法。 |
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说明书全文 | 本発明は、プロバイオティクスとして知られている微生物及び食品産業(ヒトまたは動物の食物)におけるそれの使用方法の分野に関する。 特に、本発明は、ロバの生乳から分離されたプロバイオティクスに関する。 プロバイオティクス微生物、または単にプロバイオティクスは、適切な用量で投与した場合、健康や栄養の面で利益を付与する可能性が高い微生物として定義することができる。 それらは、所謂機能性食品のカテゴリに属する。 プロバイオティクスは、ダノンのActimel(登録商標)もしくはActiva(登録商標)、ヤクルト本社のYakult(登録商標)、またはネスレのLC1(登録商標)のような市販されている商品などの乳製品でよく知られている。 これらの細菌は、例えば、ビフィズス菌、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノサス、またはラクトバチルス・ジョンソニイのような、乳酸菌の異なる属及び種に属する。 一般的に、プロバイオティクスの正確なメカニズムは常に知られてはいないものの、プロバイオティクスが作用することにより、腸内細菌叢のバランスを保つことができるという効果を通じて、健康や栄養の利点を提供することが受け入れられている。 近年、ロバの乳への興味は、乳児栄養の粉ミルク、豆乳、またはその他の人工乳への有効な代替手段として用いることができるため、主にその組成のために、著しく高まってきている。 実際、ロバの乳は、高分子不飽和脂肪酸、そのカルシウム/リン比、及びそのタンパク質含量という組成から、ヒトの母乳に非常に近いと考えられている。 さらに、ロバの乳は、微生物の細胞壁の多糖類を加水分解することができるグリコシダーゼ、リゾチームが豊富である。 幾つかの科学的証拠によって、リゾチームの栄養的、健康的重要性が証明されている。 乳糖の高含有量は、カルシウムの腸管吸収にプラスの効果があり、それがおいしさを担っている。 生後数ヶ月後でも、ロバの乳は、骨の石灰化を強化し、Ig−E介在の重篤な牛乳蛋白アレルギーの子供にとって、重要な栄養サポートを構成しており、従って、効率的な免疫系の形成に役割を果たす。 高齢者の年代では、ロバの乳は、別の心臓血管病とコレステロール低下食生活において、プラスの効果を発揮することができる。 本発明は、新規のプロバイオティクス乳酸菌を提供することを目的とする。 この目的のために、本発明の実施形態は、特にロバの乳から分離し、ブタペスト条約の条件に基づいて、2008年12月8日に「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH社(DSMZ社、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)で、寄託番号DSM22098、DSM22099、DSM22100、DSM22102、及びDSM22101として寄託された菌株、並びに、2010年4月26日に寄託番号DSM23558、DSM23559、及びDSM23560として寄託された菌株、並びに、前述の菌株から得られる変異株、並びに、ラクトバチルスプランタラムのクラスタに属する株(DSM22102、DSM22101、DSM23558、DSM23559、及びDSM23560として寄託された菌株から成る群から選択された菌株と、少なくとも70%のDNA−DNA相同性及び少なくとも99.5%の16S RNA同一性を示す)から成る群から選択された、プロバイオティクス乳酸菌を提供する。そのようなクラスタは、以下、乳酸菌アシニ(asini)と呼ばれる新しい種を画定する。 変異体は、本発明の菌株の遺伝物質の変化を推定する、または他の分子との本発明の菌株の遺伝物質の組換えを推定する遺伝子工学的手法により得られる。 通常、このような変異株を得るために、当業者は、紫外線照射や変異原性化学製品への暴露などの通常の変異誘発の手法を使用することができる。 本発明の別の実施形態は、上記のような一つまたは複数の、本発明のプロバイオティクス乳酸菌の種または系統を含む組成物を提案する。 前述の組成物は、ヒトまたは動物の食用である食品組成物または飲料組成物であり得る。 本発明のさらなる実施態様では、食品組成物又は飲料組成物の製造プロセスを提供する。 前述のプロセスは、少なくとも以下のステップを含み得る。 別の実施形態において、食品組成物または飲料組成物を製造するプロセスは、少なくとも以下のステップを含む。 発酵は、発酵が定常期に到達すると停止し、好ましくは、前述のプロバイオティクス乳酸菌をそれらの代謝に有利な条件下へ配置した状態で約24時間以内である。 本発明の別の実施形態は、病原性微生物による粘膜のコロニー形成に関連する病気を治療するための組成物の調製における、プロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。 粘膜としては、腸粘膜、胃粘膜を含むが、これらに限定されない。 例えば、病原性微生物は腸管病原性微生物であり得る。 例えば、本発明に係る乳酸菌の菌株の阻害活性は、腸管病原性微生物に対するものであり得る(例えば、サルモネラ菌、コレラ菌、大腸菌)。 本発明の別の実施形態は、リステリアやサルモネラ、カンピロバクターやクロストリジウムなどの食品の病原体に対して、このような食品病原体の成長を阻害することにより発酵食品を保護するためのプロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。 本発明の別の実施形態は、このような細菌を利用して発酵させている間に酪酸を製造するために、上記で画定した本発明のプロバイオティクス乳酸菌の使用を提案する。 本発明の別の実施形態は、本発明のプロバイオティクス乳酸菌を好適な条件下で発酵するステップ、および前述の細菌によって発酵する間に製造された酪酸を収集するステップを含む酪酸の製造方法を提供する。 本発明のこれらの及び他の態様、特徴、並びに利点は、添付図面に関連してここで提供される開示を読めば当業者に明らかになるであろう。 詳細な説明は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、単なる例としてのみ与えられる。 過去数十年の間に、ヒトの健康へのプロバイオティクスの役割は、製品の製造と消費の増加だけではなく、市場の要求に顕著な増加を引き起こすことによって、科学と産業レベルの両方での大きな関連性を得た。 生存性の側面のためには、プロバイオティクス株は、胃酸の極端に低いpH及び胆汁酸塩の界面活性効果を克服する能力持っていること、並びに、作用部位、即ち、腸管上皮へ生存可能な生理的状態で到達することが最も重要である。 プロバイオティクス株は、結腸へコロニー形成することが可能であり、積極的に病原性細菌による感染症の結果に影響を与え、免疫系に刺激を与え、好ましくない代謝物の濃度を減少させる。 更に、一部の菌株は、本発明の細菌を含めて、コレステロールとトリアシルグリセロール血漿中濃度の一定の削減を提供することができる。 胃腸(GI)管の通過時には、プロバイオティクス培養物はペプシンの存在と胃の低pH、十二指腸のプロテアーゼが豊富な条件、及び胆汁酸塩の抗菌活性に耐える必要がある。 胃のpHは、食物摂取後に6.0以上にまで増加する可能性があるが、一般的には2.5〜3.5の範囲である。 胃の通過の後、小腸は、GI管における2番目の主要な障壁である。 小腸のpH(すなわち、7.0〜8.5)は、細菌の生存に向けて、より有利であるが、胆汁酸塩の存在が悪影響を与える可能性がある。 伝統的に、GI管通過を生き残るためにプロバイオティクス候補の能力は、例えばチャータリスらの論文、《上部胃腸管における潜在的にプロバイオティクス乳酸菌とビフィドバクテリウム属の種の通過トレランスを決定するためのin vitro手法の開発》J. Appl. Microbiol. 84:759−768(1998)で記載されている模擬GI管液でのインキュベーション中に、生存と生殖細胞の数に関する情報を提供する従来のプレーティング技術を用いて評価する。 従って、このような胃液への耐性、胆汁酸塩への耐性、胆汁酸塩加水分解能、疎水性の評価、抗菌活性、抗生物質感受性など、様々な培養に基づく方法は、プロバイオティック微生物を特徴付けるために使用されることがある。 これらの試験については、下記の実施例の節において十分に説明する。 本発明の実施形態において、プロバイオティクス細菌は、以下の条件のうち少なくとも一つを満たす。 クローン37、38、48、43、41、32、34及び57は、本発明の特定の実施形態を表す。 それらは、2008年12月8日(クローン37、38、48、43、41)及び2010年4月26日(クローン32、34、57)に、以下の受託番号の下にブダペスト条約に準拠して「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH」(DSMZ)に寄託された。 クローン37、38及び38は、ラクトバチルスプランタラムアシニ亜種に属し、クローン43、32、34、57及び41は、乳酸菌アシニ種に属する。 より具体的には、クローン32は乳酸菌アシニSSPブチリクス(butyricus)と呼ばれる亜種に属し、クローン34は、乳酸菌アシニSSPラクティスと呼ばれる亜種に属し、クローン57は、乳酸菌アシニSSPカウダツス(caudatus)と呼ばれる亜種に属している。 前述のプロバイオティクス細菌は、新鮮な培養または、栄養補助食品のような乾燥食品サプリメントとして提供されてもよい。 後者の場合、例えば少なくとも10 8 CFU/g、好ましくは10 9 CFU/gのように高い品質の培養粉末を提供するために、バイオマスは凍結乾燥または噴霧乾燥させることができる。 本発明によると、プロバイオティクス細菌は、ヒトまたは動物が消費するための食品または飲料品を調製する際に使用されてもよい。 食品と飲料は、新鮮な乳製品、発酵乳、ヨーグルトなどの発酵食品を含む。 乳は通常、牛乳を指す。 本発明上では、ロバの乳が好ましい場合があるが、ウマの乳、ヤギの乳、ラクダの乳、ヒツジの乳を含む他の乳も、乳製品を調製するために使用されることがある。 このような発酵乳製品の食品を調製するための方法は当業者の理解の及ぶ範囲内である。 好ましくは、プロバイオティクス細菌は、提供または消費するまで、生存可能な形で維持される。 乳は、未加工または水で再構成できる粉体で使用され得る。 様々な成分を、発酵を改善するため、または消費者に付加的な健康上の利点を提供するために(例えばビタミンやミネラルの添加など)乳に添加してよい。 発酵の後、例えばレンネットを発酵乳に加えることによって、乳をカッテージチーズやクォークに変換することができる。 そのような手順は、当業者に公知である。 別の実施形態において、プロバイオティクス細菌は、該組成物の発酵なしで、食品または飲料組成物の成分として使用される。 言い換えると、前述のプロバイオティクス細菌は、食事や栄養補助食品である。 この場合、プロバイオティクス細菌は生存可能な形態で提供されることが好ましい。 本発明に関するプロバイオティクス乳酸菌はまた、リステリア、またはサルモネラ、カンピロバクター、またはクロストリジウムなどの食品病原体から、そのような食品病原体の成長を阻害することによって、発酵食品のような食品を保護するために使用され得る。 その場合、本明細書に開示されているような、所望のプロバイオティクス細菌を含む組成物は、食品や飲料製品に混合される。 後者の製品は、所望のプロバイオティクス細菌を含む組成とは無関係に発酵されることがある。 いずれの場合でも、発酵が約24時間以上は持続しないことが好ましい。 通常、プロバイオティクス菌株は、この期間内に発酵の定常期に達している。 本発明の実施形態において、発酵が定常期に達した所で発酵は停止され、前述のプロバイオティクス乳酸菌の代謝に有利な条件下に接種した食品を配置した状態で約24時間以内が好ましい。 本発明はまた、病原性微生物による粘膜のコロニー形成に関連する疾患を治療するための組成物の調製におけるプロバイオティクス乳酸菌の使用に関する。 粘膜は、腸の粘膜と胃の粘膜を含むがそれらに限定されない。 例えば、病原性微生物は腸管病原性微生物であり得る。 例えば、本発明に係る乳酸菌の菌株の阻害活性は腸管病原性微生物(例えば、サルモネラ菌、コレラ菌、大腸菌)に対抗し得る。 これは、腸の細胞のような上皮細胞に付着するプロバイオティクス細菌の能力に関連しており、また、現在理解されているように、ある程度、腸からのそのような病原性細菌を除外する能力に関連している。 同様に、これはプロバイオティクス細菌の疎水性と相関し得る。 本発明はまた、そのような細菌を利用した発酵過程での酪酸の製造のための本発明のプロバイオティクス乳酸菌の利用に関し、例えば、このような細菌を接種され、その後ユーザに摂取される食品の発酵、大腸での内部発酵、または適当な条件における適切な培地での発酵であって、前記微生物による発酵の過程で生成した酪酸を収集できるようにしている発酵、である。 好ましい細菌は、DSM23558、DSM22098、DSM22100、及びDSM22099である。 培養に基づく手法(プロバイオティクスの試験、胆汁酸塩加水分解能力、疎水性の評価、抗菌活性、抗生物質感受性、有機酸の生産、インキュベーション中のpHの変化) 有機飼育から得られるロバの生乳は、順次滅菌生理溶液中(NaCl 0.85%)に希釈し、特にラクトバシラス属の分離のために、MRS(Man,de Rogosa and Sharpe)寒天プレートに接種した。 プレートは、異なる温度で48時間(Anaerogen、オキソイド)嫌気的条件でインキュベートした。 乳酸菌の分離株(約150)をランダムに最高希釈のMRS−寒天プレートから選んだ。 分離株はMRS−ブロス培地で継代培養し、MRS−寒天培地上に画線した。 プロバイオティクス性試験 1)胃液への耐性 増殖した後、各コロニーを遠心分離し、滅菌生理溶液中で洗浄し、同じ液で元の容積中に再懸濁した。 胃液耐性の評価は、DeGiulioらによって検定した。 《凍結及び凍結乾燥後の乳酸菌の生存率を向上させるためのアルギン酸塩と低温保護糖の使用》World Journal of Microbiology&Biotechnology 21:739−746(2005)を、多少変更して。 アリコートは、模擬胃液中(ペプシン3g/L、pH2.5)でインキュベートし、180分までインキュベーションの異なる時間に取り出し、プレートした。 陰性対照として、未処理の細胞を用いて接種した。 胃液に対する耐性は、コロニー形成単位(CFU)/mLで評価し、陰性対照と比較した。 2)胃液及び胆汁塩への耐性 胃液耐性のコロニーを、最大3時間、胆汁酸塩0.3%を含むMRSから構成される模擬胆汁中でインキュベートし、それらをDe Giulioら(2005)に従って、MRS寒天培地に接種した。 未処理のコロニーを陰性対照として用いた。 胆汁塩への耐性は、コロニー形成単位(CFU)/mLで評価し、陰性対照と比較した。 結果 ロバの生乳から分離された150の細菌コロニーの内、わずか8(暫定的に、クローン32、クローン34、クローン37、クローン38、クローン41、クローン43、クローン48及びクローン57と名づけた)のみが乳酸菌属に属すると同定され、胃液と胆汁酸塩に耐性を示し、未処理の対照乳酸菌を100%として比較すると、75%のCFU/mLのコロニー形成を示した。 それらの最適生育温度は、約30〜31℃であった。 150のコロニー中わずか8のみが、模擬胃液及び胆汁塩存在条件へ好適な耐性を示した。 これらのコロニーは、次に、以下の活性について試験した:疎水性試験、胆汁酸塩加水分解活性についての培養のスクリーニング、抗菌活性、及び抗生物質感受性。 3)疎水性試験 潜在的に腸上皮に付着するコロニーの能力を、Strusらの疎水性の間接的な方法を用いて評価した。 《カンジダに対するプロバイオティクス特性を持つ膣乳酸菌のイン・ビトロでの活性》Infectious Diseases in obstetrics and Gynaecology, 13(2) :69−75 (2005)及びLjungh et al. 《ヒトの感染症から分離された黄色ブドウ球菌株をautoaggregatingの高い表面疎水性は、塩の凝集試験についての研究。 》Infection and immunity, 47 : 522−526 (1985)。 コロニーは、24時間MRSブロス中で成長させた。 微生物懸濁液は、等量の、前もって調製しておいた異なるモル濃度(20mMから4Mの範囲)の硫酸アンモニウムと混合した。 微生物の集合体が顕微鏡のガラスに目に見えるようにできる最小の硫酸アンモニウム濃度は、塩の凝集試験に反比例する。 等張液を対照として使用した。 結果 −0.1M硫酸アンモニウムでの微生物凝集が目視可能:クローン32、37、43及び57 これらのデータから、クローン32、37、43及び57について、イン・ビトロにおける腸上皮へ接着能力がより強いという仮説を立て得る。 4)胆汁酸塩の加水分解活性のための培養のスクリーニング 胆汁酸塩の加水分解は、哺乳動物の胆汁酸塩の代謝に重要な代謝反応である。 近年、人間や動物のコレステロール代謝に影響を及ぼす胆汁酸塩の加水分解の使用についての関心が増加している。 胆汁酸塩の加水分解や細胞膜へのコレステロールの取り込みは、ヒトにおける血清コレステロール濃度を低下させる可能性を秘めている。 小腸での結合胆汁酸塩の加水分解を介する遊離胆汁酸塩の放出は、糞便中のより多くの胆汁酸塩の排泄という結果になる。 コレステロールが体内から除去される主要な手段は、加水分解胆汁酸塩の形で排泄することである。 ほとんどの結合した胆汁酸塩は、腸肝循環を介して再循環されている。 排泄される胆汁酸塩は、新たな胆汁酸で置き換える必要があり、これは、体内でコレステロールから形成されている。 従って、胆汁酸塩がより多く排泄されると、より多くのコレステロールは、身体内のプールから利用される。 さらに、遊離胆汁酸塩は、結合した胆汁酸塩が行うほどは、小腸からのコレステロールや他の脂質の吸収をサポートしていない。 コロニーの胆汁酸塩の加水分解活性を、Minelliらによって説明された方法によって定性的に評価した。 ≪機能性乳製品の生産のための新規プロバイオティクスラクトバチルスカゼイ株の評価≫Int. Dairy J. ,14:723−726(2004)。 簡単に言うと、株(5μL)の一晩培養した液体培養を、0.5%の結合胆汁酸塩混合物及び0.37g/LのCaCl 2を含むMRS寒天培地上にスポットし、上述のようにインキュベートした。 スポットの周りの沈殿胆汁酸(不透明なハロー)の存在は、胆汁酸塩を加水分解する菌株の能力を示す、正の結果をと見なされた。 結果 胆汁抽出物を加水分解する能力を定性的に評価した。 すべての株は、胆汁抽出物を加水分解することができた。 5)抗菌活性 寒天プレートアッセイ上の阻害ハロー試験は微生物菌株の抗菌活性を調査するために採用された。 サンプルは、以下の細菌について試験した。 : 全ての株は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH社(DSMZ社 ドイツ)から購入した。 各株は、その特定の増殖培地中に37℃で18時間インキュベートした。 :乳酸菌は、Man de Rogosa Sharpe(MRS)ブロス(オキソイド)中で培養し、大腸菌、フェカリス菌、緑膿菌及びセレウス菌は、栄養塩ブロス(オキソイド)中で培養した。 微生物懸濁液(1×10 8 CFU/mL)を、均一にその特定の固体培地プレート上に広げた。 各培養物の50μLを、接種プレート上にそれぞれ配置した。 室温無菌条件下で30分放置後、プレートは、株菌によって37℃で24〜48時間インキュベートした。 プレートに見られるクリアゾーンの直径を正確に測定し、これは、cmで表される抗菌活性である。 滅菌脱イオン水を陰性対照として使用し、標準的な抗菌剤、クロラムフェニコールは、Dall'Agnolらのように陽性として使用した。 ≪いくつかのオトギリソウ属の抗菌活性≫Phytomedicine10:51 1−5 16. (2003)。 結果 a)他の乳酸菌に対する抗菌活性 クローンは、乳酸菌サケイ20494に対する抗菌活性を示さなかった(非常に低い程度でのクローン57を除く)。 この結果は、通常と見なすことができ、それはバクテリオシンのような抗菌性物質のすべての乳酸菌による生産のためであり、これは、病原性細菌に対してだけでなくまた、他の乳酸菌に対する「領土防衛のメカニズム」としてふるまうことができる。 b)病原細菌に対する抗菌活性 結果は以下の表に示す。
Ps緑膿菌に対してクローン37が強い抗菌活性を示すのを観察することは興味深い。 クローン37、38及び48は、毒素原性株の大腸菌DSM8579に対して特定の抗菌活性を示した。 6)抗生物質感受性 コロニーの異なる抗生物質への感受性は、30mg〜40mgの以下の抗生物質を用いて評価した。 抗生物質の粉体の各々は、慎重に秤量し、溶解し、適切な希釈剤で希釈し、MRS培地に添加する前に、滅菌濾過を行った。 プレートは、LAB株を接種し、上述のようにインキュベートした。 抗生物質に対する感受性や抵抗性は阻害ハロー試験によって評価した。 結果 クローンは、テストで使用される抗生物質に対して種々の度合いの感受性を示した。 下記の表に示されているように、クローン32は全ての抗生物質に対して敏感であり、一方、その他のクローンは、ストレプトマイシン及びリンコマイシンに対してある程度の耐性を示した。 7)有機酸の生産 発酵後の有機酸の生産は、紫外線検出器(Beckman社、CA、米国)を搭載したゴールドシステム装置を用いて、濾過上澄み液の高速液体クロマトグラフィー(Vulevic,Rastall&Gibson,2004;Nazzaroら 2009)によって測定した。 サンプルはプレパックAminex HPX−87カラム(300 7.8mm,Bio−Rad,Hercules,CA,USA)上にロードし、0.005mMの硫酸で溶出した。 合計実行時間40分、流速0.6ml/分、注入体積20μL、及び検出波長210nm。 結果 ロバ乳中で培養した、本発明の菌株及びいくつかの参照の菌株によって発酵中に生成される酪酸、クエン酸の量を、以下の表に示す。 データは、絶対面積に関して表現している。 酪酸の生産は、外部から本発明の細菌が接種されている食物を発酵させて作ることができ、そのような食物は、消化器系で酪酸を増加させるために、ユーザによって摂取されている。 酪酸は、大腸での細菌による発酵からも生成される短鎖脂肪酸であり、大腸の上皮細胞のエネルギー需要の60%から70%を満たしている。 さらに、酪酸は大腸、空腸、回腸の上皮の再生を刺激し、大腸内の微生物の増殖を阻害する。 上皮による酪酸の代謝が悪い場合は大腸の潰瘍性炎症を引き起こす可能性がある。 表は、本発明の菌株が、参照の菌株よりも高い酪酸の量を生産することができることを示している。 従って、本発明の菌株は、腸の壁を刺激し、免疫システムを強化することができる。 クエン酸は食品や飲料中の天然防腐剤として使用される。 表は、本発明の菌株が、参照の菌株よりも高いクエン酸の量を生産することができることを示している。 従って、それらによって本発明の菌株を含む組成物の貯蔵特性を向上させることができる。 8)インキュベーション中のpH変化 ロバの乳中の微生物の増殖を試験した。 ロバの乳はEurolactis Farm社から、噴霧乾燥形態で得た。 乳は、滅菌脱イオン水に再懸濁した(率 100グラム+水600ml)。 そのような懸濁42mLに、0.840mLの分離した微生物培養(2%接種、λ600nmでの初期吸光度=1)を接種した。 サンプルは30℃でインキュベートした。 ロバの乳は、ラクトバチルスプランタラム、ラクトバチルスパラプランタラム及びラクトペントサス型菌株により、同じ条件下で接種し、一方、温度37℃がラクトバチルス・ブルガリとラクトバチルス・ラムノサスのために利用された。 菌株のロバ乳中の成長能力及び発酵能力は、微生物細胞の計数(インキュベーション開始から3、6及び24時間後の、MRS培地上の嫌気培養によって測定する)コロニー形成単位(CFU)mL及び結果として得られるpHを測定することのそれぞれによって評価した。 結果 初期pH値は、7.14であった。 図1は、ロバの乳中における本発明のクローン及び参照菌株のインキュベーションの、24時間のpHの減少を示す。 参照Aは、本発明の異なる菌株の群を示す。 参照B〜Fは、L. ブルガリカス、L. ラムノサス、L. パラプランタルム、L. ペントサス、及びL. プランタラムにそれぞれ対応する。 図1は、本発明のクローンと比較して、参照菌株がより酸性−発酵能力が高いことを示している。 商品の嗜好性に、低いpHは悪影響を及ぼす。 従って、本発明のクローンは、そのようなクローンを含む組成物の嗜好性を維持することができる。 表現型と遺伝子型のアプローチ(糖の代謝、DNA指紋、DNA−DNAハイブリダイゼーション、16S RNA配列比較) 9)糖の代謝 分離物は、炭水化物発酵のAPI 50 CHL(BioMerieux社)識別システムを使用して、種レベルまで同定した。 ラクトバチルス属及び関連する生物の同定を目的としたAPI 50 CHL培地は、API 50 CHストリップ上の研究される49の炭水化物の発酵を可能にする既製品の培地である。 試験する微生物の懸濁液を培地中で作り、ストリップの各チューブに接種する。 インキュベーション中、炭水化物は発酵し、pHを低下させる酸となり、インディケータの色の変化によって検出される。 結果は、生化学的プロファイルを形成しており、その識別またはタイピングに使用される。 推定されるプロバイオティクス菌株をAPI 50 CHLストリップ中で接種し、色変化の評価を、37℃でのインキュベーションの24時間と48時間後に行った。 各ストリップは、以下の表に示されるように構成された。 結果は、APIビオメリューソフトウェアを使用して分析した。
遺伝学的アプローチ 以下の方法論を、分子同定に適用した:DNA指紋、DNA−DNAハイブリダイゼーション及び16S RNA配列。 10)DNA指紋法 Ronimusら(1997)による、ランダム増幅多型DNA−PCR(RAPD−PCR)アッセイを、指紋パターンを生成するために使用した。 DNAの増幅は、ゲノムDNAを50〜200ng、1XPCR緩衝液(DNAポリメラーゼキットの構成要素として提供される)、MgCl 2を3mM、dNTPsを250μM、OPR−2プライマー(5'−CACAGCTGCC−3',配列 配列番号1)を0.5μM、または、OPR−13プライマー(5'−GGACGACAAG−3',配列 配列番号2)、及びPlatinum(登録商標)TaqDNAポリメラーゼ(INVITROGEN社)を2.5単位含む、50μLのPCR反応混合物中で行った。 増幅プロファイルは、92℃で2分間の初期変性、94℃で15秒を35サイクル、36℃で15秒間アニーリング(事前に温度勾配増幅で最適化)、及び72℃で2分間伸長から構成した。 7分の最終伸長を72℃で実施した。 PCR産物の10〜20μLを、2100エキスパートソフトウェア(アジレント)を搭載した2100バイオアナライザを使用して、DNA7500マイクロチップ(アジレント)上で電気泳動した。 結果 APIテストに続いて遺伝子型の研究を行った。 DNA指紋法分析(図2)は、クローン37、38及び48が、同じ種に属しているようであることを示す。 図3a〜図3eにおいて、クローン37、38、41、43及び48に関連した電気泳動図が提供されている。 11)16S RNA配列の比較 全RNAを、製造業者の指示に従って、RiboPure−細菌キット(Ambion)で抽出した。 RNAは、RNA−保存溶液(Ambion社)に溶解し、UV−定量はバイオ光度計(登録商標)(エッペンドルフ)で行い、−80℃で保存した。 最終容積20μLの反応混合物中で、ゲノムDNAの混入を除去するように、RNAアリコート(6μg)をRNAseフリーのDNAse I(Ambion社DNA−freeTMキット)で消化した。 DNAse消化後、RNAサンプルの濃度と純度は、製造元の指示に従って、2100エキスパートソフトウェア(登録商標)(アジレント)を装備した2100バイオアナライザ(登録商標)を使用してRNA−6000−ナノ(登録商標)マイクロチップアッセイにより評価した。 試験された全てのサンプルについてRNA完全性数値(RIN)は、7超(0〜10の範囲に対して)であった。 それらを20μLの反応混合物中で逆転写した。 10μLの全容量中、バイオアナライザで評価された3μgの全RNA、2pmolの1517Rフォワードプライマー(前記参照)、2mMのdNTPsを含む混合物は、70℃で2分間インキュベートし、40℃まで急冷却した。 混合物へ、2倍の適した緩衝液(Invitrogen社)、20mMのジチオスレイトール、RNAse阻害剤(Invitrogen社)を20ユニット、及びMoMuLV Superscript@III逆転写酵素(Invitrogen社)を200ユニット含むものを10μL添加した。 該反応混合物(最終容積20μL)を55℃で60分間インキュベートし、70℃で15分間インキュベートし、反応及びRNA分解を停止させた。 16ScDNAの増幅を、1倍の適した緩衝液(Invitrogen社)、200pMのdNTPS、300nMの大腸菌16S RNA配列のアクセッション上に設計された細菌性16S一般プライマー(8フォワード及び1517−リバース)を含む50μLの反応混合液中で、iCycler−iQ5(登録商標)によって行った。 増幅のプロファイルは、94℃で3分間の初期変性、94℃で30秒の25サイクル、57℃30秒間のアニーリング、72度で1分間の伸長、及び72度で7分間の最終伸長から構成した。 1倍のTAE緩衝液中で5V/cmで4時間、5μLのPCR生成物を1%のアガロースゲル(アガロース−1000、Invitrogen社)上で電気泳動を行った。 臭化エチジウム(0.1μg/mL)は、ゲルと泳動バッファの両方に含まれており、PCR生成物は、UV可視化によって検出され、Polapan55フィルム(ポラロイド(登録商標))上に記録した。 各増幅混合物100〜150μLを空気乾燥させ、配列決定のためMWG(Ebersberg−Germany社)に送付した。 配列決定は、プライマー8F、1517 R及び内部プライマー368 Fを用いて行い、第一の配列データを基に設計された。 シーケンスコンティグは、「.scf」シーケンスファイルを利用したDNA−Baser ver2.0ソフトウェアによって行った。 生成された「.fasta」シーケンス(約1400塩基長)は、NBCl−BLAST及び「リボソームデータベースプロジェクト」−RDPデータバンクで整列させた。 結果 リボソーマルRNAを抽出し、レトロ転写した。 得られたcDNAを増幅させ、上記のように配列を決定した。 約1400塩基のシーケンスコンティグを得て、データバンクにおいて比較した。 以下は、リボソームデータベースプロジェクト(RDP)における配列比較をまとめたものである。 99.9%超の16S RNA同一性を示す(菌株型)L. プランタラム、パラプランタラム及びペントサス種の非常に緊密なクラスタに私達のクローンが含まれるという構図が明らかになった。 以下の結果は、これらの種と比較した本発明のクローンの16S RNAの同一性の割合である。 12)DNA−DNA ハイブリダイゼーション 定量的DNA−DNAハイブリダイゼーション及びDNAの相同性割合の計算のために、細菌性細胞培養(各菌株について約250mgの乾燥ペレット)から、ゲノム−DNA−バッファセット及びゲノム−チップ−100/Gカラム(QIAGEN SPA社、ミラノ、イタリア)を使用して、製造元の指示に従って、それを若干変更して、DNAを抽出、精製した。 DNAをTEバッファに溶かし(10mM トリス pH8、1mm EDTA)、また、バイオ光度計(エッペンドルフ、ドイツ)を使用してUV吸収による測定として、50μg/mLの最終濃度(WS)に連続希釈した。 WS DNA濃度は、Quant−iT DNAアッセイキット(Invitorogen社、ミラノ、イタリア)を使用して蛍光測定によって確認し、DNAサイズは、分子量マーカーとしてのDNA(DNAサイズ約32kD)を使用して、0.8%DNA−グレードアガロース(BIO−RAD)電気泳動によって推定した。 WS溶液は、5ng/mLのニシン精子DNAを含む0.1×SSCで2ng/mLの最終濃度に希釈した。 DNAを100℃で10分間変性させ、水−氷槽内で素早く液浸した。 各菌株について50〜100ngのDNAを、弱いバキュームに接続されているドットブロット装置(Bio−Rad社製、米国カリフォルニア州)を使用して正に荷電したナイロンメンブレン(Roche社、ドイツ)上に4連でブロットした。 標準曲線20から200 ngのDNA/相同DNA(DNAプローブ)のスポットは、ドットに含まれていた。 DNAは、3分間のUV露光及び120℃での減圧下での1時間のバッキングにより、ナイロンに架橋した。 膜は分析まで、−20℃で凍結した。 1μgのプローブDNAを、20μLの反応混合物中で、製造元の指示に従ってランダムプライムドDNAラベリングキット(Roche社、ドイツ)を使用して、ジゴキシゲニン−sUTPに一晩標識した。 膜を事前にDIG Easy−Hyb溶液(Roche社)中で40℃で3時間ハイブリダイズし、そして20pg/mLのDig標識されたプローブ(上述のように熱変性させた)を含有するDIG Easy−Hyb溶液中、チューブ−回転ハイブリダイゼーションインキュベータ(GFL)を用いて、40℃で一晩ハイブリダイズした。 ストリンジェント洗浄は、以下のように行った:0.1SDSを含む2倍のSSC溶液中で室温で5分間を2回、0.1倍SDSを含む0.1倍のSSC溶液中で68℃で15分間を2回。 免疫検出は、抗ジゴキシゲニン−AP抗体(アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニンFabフラグメント)、CDP−Star化学発光基質、並びにDIG洗浄およびブロックバッファセットキットを用いて行い、すべての試薬及び相対的な手順についてはRoche社から得た。 化学発光はQuantity−oneソフトウェアを搭載したVersaDOC4000装置(BIO−RAD)を使用して、時間露光直線性の条件で定量した。 DNA−DNA相同性の割合はJahnke(1994)に従って、相同DNAスポットから取得した化学発光値のメディア(調整後のボリューム輝度×mm2)を100%として置くこと及び、相同DNA標準曲線の線形応答を考慮にいれることによって算出した。 複製サンプルのメディアの標準偏差は、メディアの値の5%を超えなかった。 結果 代謝のデータは、プローブとしてdUTP−dioxigeninによって標識されたL. プランタラムDNAを利用することにより、DNA−DNAハイブリダイゼーションによって確認された。 分類学的DNA−DNAは、異なる種については、DNA−DNA相同性が70%以下に制限されることが知られているが、図4が示す通り、クローン37、38、及び48は、それぞれ86、99、99%のL. プランタラム(図4上にL.Pl)とのDNA−DNA相同性を示した。 三つの可能性から区別し、これまでの知見を確認すると、クローン37、38及び48は、L. プランタラム(図5上のPL)、L. パラプランタラム(図5のPPL)及びL. ペントサス(図5のPE)菌株型のDNA内で、クローン37から標識されたDNAのプローブ(図5)にDNA−DNAハイブリタイズされていた。 N−Ctrは陰性対照である。 本発明の好ましい実施形態の前述の説明は、網羅的であることまたは開示された実施形態に本発明を限定することを意図したものではない。 本発明の範囲内での種々の変更が当業者には明らかであり、また本発明の実施から取得してもよい。 DNA−DNAハイブリダイゼーションの実験結果及び16S RNAの分析に基づき、菌株37、38及び48は、L. プランタラム、L. ペントサス及びL. パラプランタラムも存在するが、それらとは異なる固有のクラスタに属する。 菌株37、38と48はL. プランタラムの亜種を表すと考えられ、これは、L. プランタラムアシニと名づけられる。 同様の理由で、菌株41及び43は、明らかに新しい種、乳酸菌アシニに属する。 確かに、菌株41と43は、主にペントサス、タラム及びパラプランタラムという、他の乳酸菌と40〜50%の類似性を示す。 菌株37,38及び48、並びに菌株41及び43は、ラクトバチルス属に属する微生物であり、Lプランタラム、Lパラプランタラム及びLペントサスの厳密なクラスタで99.2パーセントより高い16S RNA相同性を有し、またそのような相同性に比例する指紋と相対的なタンパク質プロファイルを有する。 |