唾液酸化的碳水化合物

本发明涉及碳水化合物在人和动物的免疫调节、免疫抑制和感染 的治疗中的应用，和涉及包含这些碳水化合物的食品、饮食和药物组 合物。

致病生物以及细胞破坏物质与哺乳动物细胞表面的粘附是细胞感 染或破坏的第一步骤和必要的前提条件。病原体和细胞之间的相互作 用通过配体-受体关系形成。在这些配体-受体关系或相互作用中，糖 苷结构起重要作用。

影响这种配体-受体关系的可能性在于分别阻断细胞两表面之一 的或者细胞两表面的各自的受体或配体。

使用特殊试验系统，可表明多种碳水化合物的混合物减少或者甚 至彻底防止如微生物与细胞表面的粘附，参见Kunz，C、Rudloff，S，Acta Paediatr.，1993，82，903-912。其它物质如作为选择蛋白(内皮细胞和 淋巴细胞上的粘着蛋白质)的碳水化合物配体的路易斯结构在例如炎性 进行期间的滚动、归巢和侵入的范围内调节淋巴细胞与内皮的相互作 用(Albelda S.M.，Smith C.W.，Ward P.A.，FASEB J.，1994，8，504- 512)。唾液酸基团一方面在上述病原体-细胞相互作用中发挥重要作 用，另一方面在细胞间相互作用中发挥重要的作用。这些单糖发挥它 们的作用，特别是作为寡糖和糖缀合物如糖脂和糖蛋白的组分(Traving 和Schauer，Structure，function and metabolism of sialic acids，Cell.Mol. Life Sci.，54卷，1998)。发现唾液酸有最多40种不同的衍生形式，至 今已经在人、动物和一些病毒、细菌和真菌中被发现。

除了羧基负电荷的化学物理效应之外，唾液酸的主要功能是它们 特异地参与分子和细胞识别过程(Kelm S.& Schauer R.(1997)，Sialic acids in molecular and cellular interactions，Int.Rev.Cytol.，175，137- 240)。一部分唾液酸稳定酶和其它蛋白质、自动识别/非自动识别免疫 系统、掩蔽细胞和蛋白质。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(P.R. Crocker等人(1998)Siglecs-a family of sialic acid-binding lectins， Glycobiol.，8，Glycoforum 2 v-vi.)构成特定类别的唾液酸特异性凝集 素。这些分子具有免疫球蛋白样结构域，代表凝集素样受体，和以结 合唾液酸作为必要特征。

在细胞间相互作用中，配体或受体的结构对于这些相互作用的作 用机制通常是必不可少的。配体与受体的结合过程是可能产生导致其 它信号级联触发的第一事件，同时在唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集 素的情况中，可以表明这些物质参与信号转导机制。因此，酪氨酸， 其作为存在于Siglec-2(CD22)中的例子，可能经历磷酸化，其反过来， 通过另外的中间步骤导致B细胞活化的减少。

特异性蛋白质与碳水化合物结构的结合机制对于细菌与上皮表面 的粘附也是很重要的。因为粘附表示首次感染的第一步，抑制这些结 合过程是避免感染的重要目标。

特异性识别α2-3的细菌凝集素(粘附素)经历唾液酸结合性免疫球 蛋白样凝集素所经历的相同机制。

此外，所谓的受体和配体群簇在结合强度中起重要作用。在这种 情况中的重要的标准是结合活性配体的多价。在分子中结合越多的配 体结构，配体和受体或两个或更多细胞之间的相互作用越显著。这特 别适用于这样的相互作用中，其中分子或细胞的交联调节生物过程的 功能。因此必须强调的是，多价配体导致受体交联，由此可引发另一 个信号效应。

本发明的目的是提供在碳水化合物的帮助下，在人和动物中实现 免疫调节、免疫抑制和治疗感染的方法。

这些目的通过权利要求书的教导得以解决。

根据本发明，具有至少一个以下通式II的碳水化合物单元的以下 通式I的唾液酸化的碳水化合物在人和动物的免疫调节、免疫抑制和感 染的预防及治疗中的应用：

其中，

Sia表示以α2-3键结合的唾液酸或唾液酸衍生物，

Gal表示半乳糖单糖单元，

HexNac表示N-乙酰化的半乳糖胺单糖单元或N-乙酰化的葡糖胺 单糖单元(GalNAc或GlcNAc)，

Hex表示半乳糖单糖单元或葡萄糖单糖单元(Gal或Glc)，

C表示HexNac或Hex，或不存在C，

N表示1到50，

V表示OH、碳水化合物残基或载体T上的连结点，前提是如果 V表示OH，则n表示1，如果V表示碳水化合物残基或载体T，则n 表示各自直接与这些碳水化合物残基或载体结合的式II碳水化合物单 元数，

X表示唾液酸或唾液酸衍生物，磷酸酯基，硫酸酯基或羧基，或 包括磷酸酯基、硫酸酯基或羧基的单糖，其中第二唾液酸或唾液酸衍 生物或几个唾液酸或唾液酸衍生物可以以α2-8键与唾液酸或唾液酸衍 生物结合，并且只存在一个残基X。

令人惊讶的是，已经发现本发明使用的碳水化合物优于最初提到 的寡糖序列，是高效的抑制剂或受体类似物。这些碳水化合物在以下 称为“本发明的碳水化合物”。

本发明的碳水化合物的特征是必须带有至少一个通式II的碳水化 合物单元[Siaα2-3-Gal-HexNac(X)-Hex(X)-C-]-，在这种情况中，残基 Sia、Gal HexNac、Hex、X和C具有与通式I中表示的相同含义。

因此，通式II的碳水化合物单元构成了通式I的本发明的碳水化合 物的一部分。如果通式I中的残基V表示OH，则通式I的碳水化合物由 通式II的碳水化合物单元和这种残基V组成。

在唾液酸化的碳水化合物中，优选的键合方式如下：α1-2、α1-3、 α1-4、α1-6、α2-3、α2-6、α2-8、β1-2、β1-3、β1-4和α1-6。在碳水 化合物或多糖中，可发生一个及数个提及的键合。在X也表示多糖的 范围内，优选的是带有电荷的α-糖苷基团的β-结合基本结构(I，II)。

残基V还可表示碳水化合物残基或载体T上的连接点。在后一种 情况中，严格来说，V不表示残基，而只不过是连接点。通过这个连 接点，通式II的碳水化合物单元结合到载体上或固定于其上。载体的 种类不是特别关键的，因此可使用许多载体中的任何一个。可将最多 50个通式II的碳水化合物单元结合于这种载体上，每个碳水化合物单 元通过连接点V与这种载体T结合或连接。因此，在本发明范围内使用 的指数n表示通式II的碳水化合物单元数，而不是指例如一连串的n个 这些碳水化合物单元组分。

其中认为n表示1-50，因此，这意味着n表示1到50的整数， 因此可表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。

载体T特别是肽、蛋白质、聚合物或生物高分子，与肽或蛋白质 连接的键具体是N-糖苷键或O-糖苷键。聚羟基丁酸可用作生物高分 子。适当的聚合物是如聚丙烯酰胺。

残基V还可表示碳水化合物残基。其优选是单糖残基、寡糖残基 或多糖残基。其例子可以是以下：乳寡糖、储备碳水化合物(特别是淀 粉)和骨架碳水化合物如果胶、纤维素和半乳甘露聚糖。虽然这些碳水 化合物也可称为生物高分子，但对于更好地术语区分来说，它们不属 于上述的用于本发明目的的生物高分子。

代表残基V的碳水化合物残基也可是与通式II的碳水化合物单元 同样组成的一种或多种(甚至是脂肪族的)碳水化合物残基，但这些碳 水化合物残基的连接是不同的。

重要的是通式II的碳水化合物单元具有至少两个负电荷，存在于 至少3个和特别是4个中性单糖(Gal、HexNac、Hex和C)的核上。这些 负电荷中的一个作为半乳糖上的α2-3结合唾液酸位于核(其也可称为核 心)的非还原性末端上。第二电荷也作为唾液酸存在于接近末端的位 置，然而，其可被其它的带电基团即磷酸酯、硫酸酯或羧基取代。这 些磷酸酯、硫酸酯和羧基可直接位于单糖HexNac和Hex上，或可与另 一个单糖结合。因此，换句话说，该其它单糖表示这些带电基团与通 式II的碳水化合物单元的单糖HexNac或Hex之间的桥。

如果残基V是相当于通式II的碳水化合物单元的碳水化合物残 基，只要涉及了其组成，则优选这些残基V以每3或4个中性单糖存在 两个负电荷而被使用。

在通式II的碳水化合物单元中，只存在一个残基X。换句话说， 其为带有上述类型的残基X的单糖HexNac或单糖Hex。

如果在本发明中提及单糖用于说明通式I和II，那么，严格来说， 不得不使用术语“单糖单元”，因为这些单糖不是以单独的形式存在， 而是与其它的单糖或基团结合。然而，为了简明的目的，将只使用术 语单糖或具体的单糖名称(如半乳糖、葡萄糖、己糖胺等)。

命名为Sia的单糖单元优选为乙酰神经氨酸(NeuAc)或N-羟乙酰神 经氨酸(NeuGc)。例如，残基Sia和X的唾液酸的O-酰基衍生物为O-乙 酰衍生物。

如果残基X表示唾液酸或O-酰基衍生物，那么其优选NeuAc、 NeuGc及其衍生物，如以α2-3结合或α2-6结合的O-乙酰唾液酸。

如以上所说明的，可在残基X上存在以α2-8结合的第二唾液酸或 几个唾液酸。

为了生成连接，尽管α2-3键结合的Neu5Ac(通式I和II中的Siaα2-3 残基)绝对必须存在于本发明使用的碳水化合物中以作为必需的识别序 列，但是第二和第三Neu5Ac作为带电荷基团只在为增加亲合力时才是 必要的。结合的种类并不重要。这个第二Neu5Ac(残基X)也可被另一 个带有负电荷的基团(磷酸酯、硫酸酯、羧基以及羧酸酯的形式)取代。

对于在本发明的碳水化合物的帮助下用于人和动物的免疫调节、 免疫抑制和治疗感染，通式II的碳水化合物单元具有实质性的重要作 用。因此，可结合这些通式II的碳水化合物单元的载体T的种类具有次 要的重要性。因此，载体T可以是任何期望的种类。优选地，其为碳 水化合物、肽、蛋白质、聚合物或生物高分子，与肽或蛋白质连接的 键优选是N-糖苷键或O-糖苷键。更优选地，载体T由亲脂性化合物组 成，包括一种或多种代表其头基的通式II的碳水化合物单元。优选的 亲脂性化合物是糖脂类和神经节苷脂类。

作为通式I的碳水化合物，使用二唾液酸-乳-N-四糖(DS-LNT)、 二唾液酸-乳-N-新-四糖(DS-LNnT)、多糖缩氨酸(GMP)和神经节苷脂 GD1a、GT1b和GT1c。GMP优选来源于动物乳如绵羊、山羊、水牛、骆 驼，和特别是牛乳。

本发明使用的碳水化合物可以是它们游离的碳水化合物(V表示 H2O)或与碳水化合物残基或载体T结合的碳水化合物，其可以被加入 到不同的食品、饮食和药物组合物中。所有这些组合物可以以液体或 固体形式存在。本文使用的术语“食品”不仅包括实际的食品组合物， 而且包括食品添加剂、食品补充剂、饮料，和包括婴儿和幼儿食品的 食品组合物。术语“婴儿和幼儿食品”具体指所有人工制备的食品， 但不包括人乳，具体用于人的婴儿。“人工地”是指那些婴儿食品 由植物或动物原料生产而不是来自人。这些食品组合物可以以任何期 望的方式施用给人或动物。其还包括作为探针食品施用到胃中。

本发明的碳水化合物可以例如为混合物或作为添加剂加入到以下 产品中，虽然这些列举不是结论性的：乳和乳制品、婴儿和幼儿食品、 巧克力棒、酸奶饮料、奶酪、香肠和肉制品、合成代谢食品、探针食 品、和孕妇用产品。

本发明的碳水化合物还可以药物组合物的形式单独施用或与一种 或几种另外的活性剂一起施用。这些组合物可以例如制成片剂/香袋 (sachet)。对于这种药物制剂，可使用通常的佐剂、载体、助剂、 稀释剂、润湿剂、增稠剂、调味剂、甜味剂等。

药物组合物可以以任何通常的方法给予患者(即，人和动物)。然 而，为了方便，它们应为适合于口、舌、鼻、肠、支气管、阴道、局 部(皮肤和粘膜)和经口给予的组合物，并制成适合给药的制剂类型。

包含至少一种本发明使用的碳水化合物的食品、饮食组合物和药 物组合物可与其它物品一起使用，用于预防和治疗胃肠道感染如李斯 特菌病、血液系统、呼吸道、泌尿生殖道、以及鼻咽的感染，和用于 保护内皮、上皮和粘膜。因此，它们可局部施用于皮肤或可在粘膜上 使用。这些粘膜包括鼻、肠、支气管和阴道的粘膜。因此，本发明使 用的碳水化合物可例如加入到漱口药中。所有的年龄组，从新生婴儿 到年长的人，可作为本发明使用的碳水化合物的目标人群。特殊的应 用范围是保护和治疗孕妇、病人、虚弱和年长的人、用于那些对于预 防例如李斯特菌病具有特别重要性的人群。

由于它们的防粘性质，因此，本发明的碳水化合物可用于减少或 预防感染。另一方面，它们还可用于通过调节细胞间相互作用来达到 影响免疫学应答的目的。这不仅适用于调节细胞间相互作用，优选在 真核细胞(如淋巴细胞和内皮细胞等)之间，而且用于调节病原体(如细 菌、孢子、病毒、类病毒、朊病毒、真菌、单细胞的和多细胞寄生虫、 毒素和重金属阳离子)与真核细胞优选哺乳动物细胞的粘附。

本发明使用的碳水化合物为已知化合物，如DS-LNT、DS-LNnT 和神经节苷脂GD1a、GT1b和GT1c。它们为已知的和/或根据适当的已知 方法以化学的或酶促的方法或以这两种技术组合的方式进行制备。

本发明使用的二唾液酸-乳-N-四糖(DS-LNT)和二唾液酸-乳-N-新- 四糖(DS-LNnT)为通式I的化合物，其中HexNac＝GlcNac、Hex＝半乳 糖和C＝葡萄糖。另外，存在两种唾液酸(Siaα2-3NeuAc、X＝α2- 6NeuAc)。还可使用其衍生物，优选那些其中非末端唾液酸已经被羟 乙酰神经氨酸、硫酸酯基团、磷酸酯基团或羧基或羧酸酯基团代替。 也可连接另外的唾液酸。1型的乳糖胺单元可被Gal(α1-3)GalNAc单元 代替。

本发明另外使用的神经节苷脂GD1a、和GT1b，其单糖序列与 DS-LNT很相似。然而，第二或第三唾液酸的结合发生在位于葡萄糖(连 接到神经酰胺)上的半乳糖上。

本发明使用的通式I的碳水化合物以优选每天一次，每公斤体重 至少1 mg的通式I的碳水化合物，特别是一个通式II的碳水化合物单元 的量给予患者。

示例性的饮食和药物为以下所列的，其包含至少一个本发明的碳 水化合物。这些为以下的本发明的碳水化合物：二唾液酸-乳-N-四糖 (DS-LNT)及其衍生物(参见上面)、DS-LNTn及其衍生物、和GD1a、GT1b 和GT1c。为了简化起见，这些碳水化合物在实施例中只称为“本发明 的碳水化合物”。这个称谓表示每个上述的本发明的碳水化合物及其 混合物。

实施例1：

为制备香袋，在所有情况下，将100mg或仅5mg干燥的本发明的 碳水化合物与990mg的麦芽糖糊精混和，然后用香袋包装。这些香袋 每天在进餐过程中给予三次。

实施例2：

将小球产品形式的已知药用食品(即MilupaHN 25，平衡膳食)(包 含18.8g的蛋白质、8.6g的脂肪、62.8g的碳水化合物、3.3g的矿物质 和维生素)与本发明的碳水化合物在本发明本身已知的组合物中混 合，使得在100g的成品小球产品中含有50mg的本发明的碳水化合物。

对于液体药用食品组合物，将100ml的已知药用食品MilupaHN 25液体(2.3g的蛋白质、1.6g的脂肪、8.5g的碳水化合物、37g的矿物 质和维生素)与7mg的本发明的碳水化合物混合。

实施例3：

孕妇用产品

泡腾片(最终重4.15g)(Milupa的Neovin)通过本身已知的方法混 合200到500mg的本发明的碳水化合物进行制备。每天一片，溶于150ml 水中并服下。

实施例4：

用于老年人和虚弱的人的产品

包含22.5g的蛋白质、7.7g的脂肪、60.8g的碳水化合物、5.4g的 矿物质和维生素的粉末状平衡药用食品(Milupa的Dilsana)通过本身已 知的方法进行制备：向每100g粉末中混入100mg到1000mg的本发明 的碳水化合物。每天将最多3×50g食品溶于150ml水中并服下。

实施例5：

茶

将以通常方法制备的100g速溶茶粉末与2g的本发明的碳水化合 物混和。把3.8g的茶粉末溶于100ml热水中，每天服用三次。

实施例6：

包含11.8g的蛋白质、56.9g的碳水化合物、24.9g的脂肪、2.5g 的矿物质和维生素的蛋白质适合型的婴儿乳制剂(Milupa的Aptamil) 通过通常的方法制备成小球产品，每100g的婴儿乳制剂与100mg到 1000mg的本发明的碳水化合物混和。