糖基化乳及其用途 |
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| 申请号 | CN200880013641.3 | 申请日 | 2008-04-24 | 公开(公告)号 | CN101754688A | 公开(公告)日 | 2010-06-23 |
| 申请人 | 索姆那瑟蒂克有限公司; | 发明人 | R·B·埃利奥特; | ||||
| 摘要 | 一种包含对人或其他 哺乳动物 具有 催眠 作用的多肽的“睡眠乳”，使用来自于β 酪蛋白 A1等位基因纯合的母 牛 的 乳蛋白 。对乳或蛋白进行糖基化增强工艺实质上可增加所得多肽如β酪啡肽-7在摄入、肠道内 水 解 和经肠道壁吸收后的 半衰期 。可通过在 碳 水化合物如 抗坏血酸 的存在下在改良的UHT工艺中通过对A1乳进行糖基化来制备睡眠乳。通过测量糖基化产品来评估所得产品的催眠作用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种在引入哺乳动物(包括人)身体后具有催眠作用的制备产品，其特征在于，该产品包含至少一种糖基化催眠肽或该糖基化催眠肽的前体；该糖基化肽的催眠作用与非糖基化形式的催眠肽或非糖基化形式的催眠肽的前体相比被充分地延长。 |
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| 说明书全文 | 糖基化乳及其用途技术领域[0002] 定义 [0004] “AGE”是高级糖基化终产物(Advanced Glycation End-product)的缩写。例如，多肽或蛋白糖基化中的第一步是形成希夫碱，即葡萄糖分子(或类似物)的醛基与肽链上的赖氨酸分子的氨基结合形成在葡萄糖的碳原子和赖氨酸的氮原子之间具有双键的亚胺或希夫碱。“阿马多尔(Amadori)产物”是本方案中形成AGE的第二阶段，通过重排完成，其中邻近碳氮双键的羟基的氢原子转移与氮结合，留下酮。最后一步(不可逆步骤)是阿马多尔产物的氧化。 [0007] “UHT”是超高温处理(Ultra-High Temperature treatment)的缩写，一种通常在约140℃仅几秒的巴氏杀菌，已知用于延长密封容器中由常规巴氏杀菌获得的乳的保存质量。 [0008] 解决的技术问题 [0009] 人们有时或在某些情况下常需要催眠剂，但人们对于摄入任何相对强安眠药片都比较谨慎，特别是在常规基础上可形成依赖性，或饮酒其副作用可撤消任何的瞬即效应。然而，2005年在新西兰，仅4百万人中就开出了551426份安眠药片处方。显然需要一种“天然的”催眠剂或至少一种可选方案。 背景技术[0010] 几个世纪之前就已知饮用约100-250ml量的热牛奶可引发睡意或睡眠。就2008年4月在″Google″中搜索(睡眠“热牛奶”)获得的结果来看：许多网站简单地否定了该作用。更多网站接受“无稽之谈”。某些试图以多种方式对其进行解释，包括心理学，色氨酸的作用等等。然而这种作用的生理学或药理学机制，即使有，也还未直接建立。什么(如果有的话)可能是牛奶中的活性成分呢？ [0011] 对于人，提出L-色氨酸作为催眠成分，但为此作用所需要的量(约1g)将需要饮用约2.5升的牛奶。 [0012] 对于某些人3-5mg的褪黑素可具有催眠作用，但为此作用所需要的量将需要饮用约25升。 [0013] 钙可以是镇静剂，但在片剂中观察不到该作用。 [0014] 没有证据证明乳糖具有催眠作用。 [0015] 本发明的理论基础如下。应注意的是该理论仅作为指导，在实践中可发现本发明是有效的，尽管作为不是要描述的内容的机制或有效原理之后表现出是正确的。 [0017] 本发明人的理论假定(至少在开始)在以合理量如100-250ml热牛奶消费时，在热处理的A1牛乳中发现的酪蛋白糖基化体类型是有效的催眠物质或变成有效的催眠物质，然后被肠道酶水解成肽类，再以糖基化肽被消费者身体所吸收。尤其是，目前据信主要由糖基化肽β酪啡肽-7负责催眠活动，尽管其他糖基化肽或其他物质直接或间接参与。而且，该理论提出糖基化能较未糖基化肽增强催眠作用，假设通过延迟活性肽从体内排除，而糖基化不直接掩饰催眠作用。明显地，该理论的一个试验是进行类似处理以比较A1型乳和A2型乳(在人肠道消化期间其不会被转化成β酪啡肽-7)的效力。试验显示出其他糖基化肽参与了。 [0018] 在 文 献 ″ Enzymatic digestion and mass spectrometry in the study ofadvanced glycation end products/peptides″in J Am Soc Mass Spectrom.2004Apr；15(4)：496-509，Lapolla A，Fedele D，Reitano R，Arico NC，Seraglia R，Traldi P，Marotta E，and Tonani R.of Dipartimento di Scienze Mediche eChirurgiche，Cattedra di Malattie del Metabolismo，Universita degli Studi diPadova，Padova，Italy.中可得到糖基化赋予肽对肽酶的抗性(通常)的证据。该文献报导了为鉴别源自糖基化HSA酶促消化的特定糖基化肽的目的，以胰蛋白酶和内蛋白酶Lys-C的酶促消化对人血清白蛋白(HSA)和非酶促糖基化HSA所进行的广泛研究。这些肽可被认为是高级糖基化终产物/肽的一级近似物。通过体内糖基化蛋白的酶促消化制备这些对糖尿病和肾病受试者的全身水平很重要的化合物。它们与患者病理状态相关并被调用以负责组织修饰。通过蛋白组学技术MALDI/MS((基质辅助激光解吸附/电离/飞行时间)质谱))和LC/ESI/MSn(液相色谱电喷射电离质谱联用)分析由两种酶获得的消化混合物，并发现了明显的区别。首先，糖基化HSA的消化产物通常不如从非糖基化HSA所观察的丰富，说明前者对酶促消化具有更低的倾向性。双重带电离子的MS/MS实验、与蛋白数据库的比对以及用于鉴别最易被糖基化的赖氨酸NH2基的分子模型鉴别了由两种酶促消化获得的消化混合物中的某些糖基化肽。 残基233K、276K、378K、545K和525K似乎是优先的糖基化位点，与通过分子模型计算的部分溶剂可及表面值相符。 [0019] 通过Medline(PUBMED) 链接 可从 上 述文 献(PMED：15047055)中获 得 相关文章作为引用文献，如″Advanced glycation end products/peptides：an in vivoinvestigation. ″ [Ann N Y Acad Sci.2005]PMID：16037247( 相 同 作 者 )，和 ″ Therole of mass spectrometry in the study of non-enzymatic protein glycation indiabetes：An update″[Mass Spectrom Rev.2006]PMTD：16625652。 [0020] 发明人不知道有利用肽尤其是吗啡的糖基化以增强其对受体的作用或延迟其降解的现有文献。另一方面，Longobardo L，et al；Bioorg Med ChemLett.2000 Jun5；10(ll)：1185-8检测牛β酪啡肽-7和含有β同型苯丙氨酸取代3位上的苯丙氨酸的β酪啡肽5两种类似物对它们的mu阿片类受体的亲和力。与天然肽相比，对修饰的β-CM-7修饰可将mu受体亲和力增强5倍，对修饰的β-CM-5可增强2倍。Kreil G et al，Life Sci.1983；33Suppl 1：137-40认为参与β酪啡肽降解的内源酶与二肽基肽酶IV相同或相似。他们发现2位上的脯氨酸残基被D-丙氨酸所取代的β酪啡肽(β-CM)类似物似乎可完全抵抗血浆中的酶攻击。因此修饰的肽变得持久。 [0021] 发明目的 [0022] 本发明的目的是提供一种安全且方便的催眠剂，或至少为公众提供一种可用的选择。 发明内容[0024] 优选地，产品包含至少一种糖基化催眠肽或其前体；该肽被吸收时的催眠作用与非糖基化形式的催眠肽或其前体相比被充分地延长。(发明人以“充分地延长”表示源于某些类型的经热处理并因此而被相对广泛地糖基化的乳的修饰(糖基化)β酪啡肽-7在循环中具有数小时而不是数分钟的半衰期。) [0025] 在另一方面，本发明提供了制备的可食用的催眠饮料或食物产品，其中，该饮料或产品包含至少一种糖基化蛋白，该至少一种糖基化蛋白在被人摄入后且被肠道酶水解后能释放至少一种可被吸收到人循环中的糖基化的催眠肽。 [0026] 优选地，所述催眠组合物实质包含糖基化的β酪蛋白A1。 [0027] 优选地，成人口服100-250ml剂量的乳基催眠组合物即有效。 [0028] 优选地，组合物在温热后饮用。 [0029] 优选地，所选的糖基化蛋白包含糖基化的牛A1/A1β酪蛋白。 [0030] 优选地，所述糖基化的催眠肽是糖基化的牛β酪啡肽-7。 [0031] 在相关方面，所述产品含有取自包括至少一头奶牛的奶牛群的乳，事先对所述至少一头奶牛进行选择以使该至少一头奶牛基本上是A1β-酪蛋白基因纯合的；所述乳在制备期间被加工使得组合物内的蛋白至少部分地糖基化，以便在被哺乳动物或人消费时，释放有效量的糖基化催眠肽并吸收至循环中。 [0032] 可选地，如本节之前所描述的产品衍生自取自包括至少一头奶牛的奶牛群的乳，事先对所述至少一头奶牛进行选择以使该至少一头奶牛基本上是A1β-酪蛋白基因纯合的；所述乳衍生物含有糖基化的牛A1/A1β-酪蛋白或其部分且能够在消化后释放有效量的糖基化催眠肽至循环中。 [0033] 在第二大方面，本发明提供了一种制备本节之前所述的催眠产品的方法，其中，该方法包括(a)获取A1型牛乳，(b)加入促糖基化的碳水化合物物质，(c)在高温灭菌处理期间或之后进行糖基化，和(d)包装产品。 [0034] 优选地，所述方法进一步包括步骤(e)检测产品以测定糖基化的量和(f)根据所预期的催眠作用标识产品。 [0035] 可选地，检测后的产品包含已知量的糖基化β-酪蛋白。 [0036] 在另一方面，通过在室温或更高温度下将由“UHT”形式的巴氏杀菌制备得乳长期储存约1-6个月，可简单地促进糖基化。 [0037] 在相关方面，所述方法包括以下步骤：检测产品以确定实时的糖基化程度，然后按糖基化检测结果所示，用等价产品(equivalent product)来稀释产品以达到统一的催眠作用，所述等价产品以相同方式使用A2/A2乳制得，由此除了根据检测结果改变产品中的A1β酪蛋白比例之外，每个产品包装具有统一量的糖基化且在产品所有成分的方面是统一的。 [0038] 优选地，促糖基化的物质选自能诱导糖基化反应的物质；碳水化合物包括果糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和抗坏血酸的范围。 [0039] 在第三大方面，本发明提供了基于如本节之前所述的糖基化A1/A1乳的药物组合物，其中，肽β酪啡肽-7的糖基化形式是从糖基化A1/A1乳中提取的并与适宜的防腐剂、赋形剂等一起包装作为适宜口服、口腔内给药或肠胃外给药的肽；产品提供了具有催眠作用的糖基化肽。 [0040] 优选的从糖基化β-酪蛋白A1中提取催眠糖基化肽的方法包括选自以下范围的酶促水解：外肽酶促水解，内肽酶促水解(包括胃蛋白酶促水解，胰蛋白酶促水解，和胰凝乳蛋白酶促水解)，或其组合。 [0041] 在第四大方面，本发明提供了制备特定的与在哺乳动物(包括人)消化道中从A1β-酪蛋白类中释放的肽类似的促进睡眠或引发睡眠的肽的明确方向。 具体实施方式[0042] 通过实施例的方式具体地阐述本发明，但其不以任何方式限制发明的范围或程度。 [0043] 整篇说明书中，除非原文另有要求，词语“含有”和变体应理解成表示包含所列整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其他的整数或步骤或整数或步骤的组。 [0044] 实施例1 [0045] 本发明尤其涉及一种基于特定种类的乳的催眠剂，其含有糖基化终产物，该糖基化终产物摄入后优选地通过内源肠道酶可转化成催眠糖基化肽。还涉及含有从特定种类的乳中获取的糖基化肽的相对长效的催眠剂。 [0046] 至今已知，为此目的有效种类的牛乳仅是来自于A1基因纯合(homozygous)的母牛，所述A1基因用于控制乳蛋白β-酪蛋白序列。这种母牛广布于大多数乳畜群中；例如荷斯坦(Holstein)或弗里斯兰(Friesian)品种主要产A1/A1型乳而泽西(Jersey)品种主要产A1/A2或A2/A2。(A1和A2基因的其他等位基因是已知的，但认为其或者不重要或者在牛中很少出现)。根据本专利，A1和A2型乳的混合物可有效地使用，但催眠作用被稀释并比较难以预测。有公知的基于DNA(基因型)的显型技术用于根据与A2基因和其他的区别来选择A1基因纯合的母牛，当对这种母牛使用A/A1公牛时会忠实地繁殖。 [0047] 牛乳含有约3.4-4.5％蛋白，其中约80％是酪蛋白。约31％的酪蛋白(每100ml约1g)是β-酪蛋白且主要是A1或A2变体。在肠道消化期间A1型β-酪蛋白水解但A2型β-酪蛋白不水解之后，每摩尔A1(或B)型酪蛋白产生约1摩尔的肽β-酪啡肽-7，在67位具有组氨酸残基。该肽可作为人催眠剂。β-酪啡肽-7被归类为“阿片类(opioid)”，已知对大鼠、鸡和蟑螂具有镇定和抗焦虑作用。 [0048] 继续考虑在背景部分讨论的可能的催眠成分，一杯乳中存在足够的β-酪啡肽-7前体以对人消费者具有催眠作用。正常β-酪啡肽-7在循环中的半衰期大约是几分钟。被身体转化成其他化学物质(大概是由于血浆、肝或肾的酶切)。 [0049] 假定β-酪啡肽-7是活性成分，发明人构想出售A1酪蛋白含量高的各种乳从而实现以“天然方式”引发睡意或睡眠。来自精选A1-A1母牛(一头或多头，如一群或一组母牛)的乳可提供两倍于普通零售乳品的β-酪啡肽-7，其中大部分保留酪蛋白是A2-酪蛋白，以及少量的其他形式酪蛋白。 [0050] 而且，存在β-酪啡肽-7的半衰期短的问题。发明人注意到来自于经热处理从而相对广泛地被糖基化的特定类型乳的修饰(糖基化)β-酪啡肽-7具有数小时而不是数分钟的半衰期。 [0051] 因此，如下所述制造和销售一定量的糖基化的且其他方面是天然存在的β-酪啡肽-7前体作为有效催眠乳基饮料比为相同目的而合成肽链上具有取代的β-酪啡肽-7更容易。本发明提供了主要具有A1型β-酪蛋白的精选乳，将所述A1型β-酪蛋白进行处理以产生有效量的糖基化β-酪啡肽-7。通常，具有增加AGE含量或提高产品中糖基化β-酪蛋白比例的作用的对乳的处理包括： [0052] 1、在巴氏杀菌期间或优选在之前，在UHT形式的巴氏杀菌期间和/或之后，长时间对乳进行加热，(或提高改良的巴氏杀菌或UHT加工)， [0053] 2、将灭菌乳在室温或更高温度下长时间保存， [0054] 3、销售之前或之后，与储存结合添加抗坏血酸，或果糖、半乳糖或葡萄糖(在其他糖中)。据说果糖(也称之为左旋糖)和半乳糖作为糖基化剂的活性大约是葡萄糖的10倍，但葡萄糖是常见可供的。乳中可用的糖基化增强物质的范围包括抗坏血酸。 [0056] 5、检测制得的产品以确定其中糖基化物质的含量。FAST指数是检测早期的糖基化产品的实例检测方法，对羧甲基赖氨酸的分析是一种适宜于AGE产品的检测。制得的产品应优选包含至少统一量的催眠成分，尽管已知在储存期间该量趋于上升，计算货架期时应考虑这种影响。 [0057] 在过去偶然也会发生乳或乳产品的致糖基化处理。根据FAST指数方法检测时，简单在4摄氏度储存的巴氏杀菌全脂乳(非定义的A1/A2状态)表现出AGE相关化合物的上升：24小时，10；48小时，10.7；72小时，17.4；1周，22.6。此外，在按照推荐条件简单储存一段时间的UHT乳中注意到了美拉德反应的特征褐变。 [0058] 因此发明人构想，为了制备有效的催眠或睡眠药水，为鼓励睡眠的目的而销售通过在特定碳水化合物的存在下加热并经过“UHT”工艺而糖基化的来自于A1-A1母牛的乳，因为糖基化工艺使得随后被吸收的β-酪啡肽-7对在人体内被转化成失活形式具有相对抗性。进一步储藏对效力的影响通常是增加糖基化的量。商业生产的物质的效力可以按检测所确定的其中含有的糖基化蛋白或糖基化β-酪蛋白的量表示。 [0059] 该乳可以类似于UHT乳那样在单剂量硬纸盒中销售，如果纸盒适合于在微波炉中或浸在热水中(仍密封)加热则它可以手持，以便乳饮料可以在消费前被温热。温热的益处可能纯粹是心理上的如形成去睡觉的仪式的一部分。 [0060] 当然已知糖基化食品可能有害，特别是对糖尿病，尽管糖基化物质的总量很小。因此老人或糖尿病人或正接受透析的人应谨慎使用本发明。优选催眠产品以声明的推荐剂量销售并警示消费本产品后一段时间内不能进行危险活动如驾驶或操作机械。 [0061] 实施例2 [0062] 提供了一种非限制的示例性制备方法如下： [0063] 1.将取自主要或优选都具有A1/A1β-酪蛋白显型的母牛的牛乳倾倒至加工罐中。 [0064] 2.加入1-2克/升(0.1-0.2％)的柠檬酸钠，作为稳定剂。 [0065] 3.搅拌直至柠檬酸盐溶解。 [0066] 4.加入1克/升抗坏血酸(0.1％)作为糖基化促进剂， [0067] 5.搅拌并加热约20分钟以达到45摄氏度 [0068] 6.在45摄氏度保持30分钟 [0069] 7.采用标准工业均质技术进行均质 [0070] 8.在141℃进行UHT处理4秒 [0071] 9.以UHT加工液无菌罐装包装并将其密封。 [0072] 10.推荐消费者在饮用前温热。 [0073] 发明人预期许多糖基化反应都发生在上述工艺期间和随后，尤其当组合物还是热的时候，尽管可以在室温储存期间或甚至在冷藏期间继续糖基化。制备工艺的质量保证/质量控制的一方面是通过监测pH，表1中显示了一组可接受的pH结果。 [0074] 表1 [0075]阶段 温度 pH 所接受的原料乳 16C 6.82 添加柠檬酸盐之后15.8℃ 6.74 添加抗坏血酸之后15℃ 6.64 均质之后 6.73 UHT处理之后 17.2℃ 6.42 [0076] 其他形式的质量控制包括测量制备时期的糖基化程度。只要所有的乳获自都具有A1/A1表型的母牛，就可能参与制得产品的催眠作用。在运输至市场期间参与进一步的糖基化可能是合适的。本发明制备的“睡眠乳”与其他形式的乳的比较如下表2，其显示出由本领域技术人员公知的几个检测所得的结果，(a)糠氨酸(furosine)mg/ml(早期糖基化产物的测量)；(b)FAST指数(后期糖基化/阿马多尔产物的测量)，和(c)CML ng/ml(羧甲基赖氨酸检测-AGE的代表标记)。应该注意的是这些检测不能特异性鉴别β-酪啡肽-7前体。如果采用纯的A1/A1乳，AGE相关检测和催眠作用之间的相关性会更特定。根据发明人的理论，来自于A2/A2母牛的乳按上述进行加工会具有很小的催眠作用。 [0077] 表2 [0078]样品 糠氨酸mg/ml FAST指数 CMLng/ml 原料乳 4.4 - - 巴氏杀菌乳 9.5 10 2.9 含抗坏血酸的巴氏- 19.3 - 杀菌乳(1g/升) UHT乳 20.5 17.5 - “睡眠乳”(本发 22 22.5 5.91 明) [0079] 发明人知道糖基化工艺是相对复杂的，制备“睡眠乳”成本未考虑糖基化的所有方面。不过本说明书展示了原则。 [0080] 变体 [0081] 1.具有等价功能(糖基化吗啡)要素的饮料，尽管不是乳制备的。神经胶质吗啡(gliadomorphin)在催眠作用方面可能是与β-酪啡肽-7等效的。已知的具有主张催眠作用的饮料是称为″Horlicks″(TM)(由Glaxo SmithKline制备)的产品，其通常在乳中包含发芽大麦和经热干燥的小麦。发芽释放的葡萄糖可与大麦和小麦蛋白结合以产生糖基化的产品。在消化中，这些糖基化蛋白会释放神经胶质吗啡或糖基化的神经胶质吗啡。这种神经胶质吗啡是否具有有效的催眠作用仍待研究。 [0082] 2.为了优选在检测AGE相关成分之后将本发明所述产品的催眠作用降至标准量，将获自A2/A2显型母牛的一些乳用于产品制备中，以使产品的一般特性(如口感和营养)保持一致且调整催眠作用。A2/A2母牛的β-酪蛋白无助于活性β-酪啡肽-7。 [0083] 3.方法中所提的糖基化促进剂可选自能诱导糖基化反应的碳水化合物和抗坏血酸的范围；碳水化合物包括果糖、半乳糖和葡萄糖。 [0084] 4.基础乳产品的衍生物，如来自于在加工期间通常在进行糖基化加工之前脂肪和/或糖被去除或至少部分被去除的A1乳衍生物。可添加风味剂。这些增加基于观察到许多改良形式的“全脂乳”在销售中具有不同量的消费者吸引力。 [0085] 5.变体，如只含糖基化β-酪蛋白、或只含一种或多种糖基化合成肽的产品。上述提及的Longobardo和Kreil文献中提出如果如任一文献中描述的取代β-酪啡肽-7也是糖基化的，它们的作用将会增强。这种肽可从天然源中精制，通过常规修饰的微生物制备，或由氨基酸合成，制备环境中发现是方便的，然后被糖基化，然后以稳定和可接受形式如灭菌饮料或用于口服、口腔内给药或肠胃外给药的药物产品进行销售。这种产品至少对牛乳过敏的人有用。如果7-氨基酸肽难以自身糖基化，制备会针对更大的肽，其序列和构型提 |
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