一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法及其筛选方法专利检索- 奶或奶配制品的保存专利检索查询-专利查询网

一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法及其筛选方法
申请号	CN201610311278.X	申请日	2016-05-11	公开(公告)号	CN105994616A	公开(公告)日	2016-10-12
申请人	天津科技大学;			发明人	王硕; 张燕; 杜欣军; 柳海宾; 孙昶;
摘要	本发明涉及一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下：⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到0.5～4mg/mL，然后在25℃‑30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶；⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。本方法为非热杀菌，避免了因热杀菌造成的牛奶风味的损失，最大程度的保留了牛奶的天然风味和营养价值，提高了超高压杀菌效果，缩短了保压时间，同时，该方法处理后的牛奶货架期同超高压单独作用杀菌的牛奶相比，明显延长，另外，也降低了超高压杀菌所需的能耗，节约了能源，降低了生产成本。
权利要求	1.一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：步骤如下： ⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到 0.5～4mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； ⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。 2.根据权利要求1中所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：所述步骤⑴中无菌食品级抑菌物质为无菌食品级ε-聚赖氨酸或山梨酸钾。 3.根据权利要求2中所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：所述无菌处理为：将ε-聚赖氨酸或山梨酸钾先配制成储备液，再经0.22um滤膜除菌。 4.根据权利要求1中所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：所述步骤⑴中牛奶无需进行巴氏杀菌或超高温瞬时杀菌。 5.根据权利要求1中所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：所述步骤⑵中灌装后单个包装的空气的残余量低于1％，所述百分比为空气的残余量占包装的体积百分比。 6.根据权利要求1中所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，其特征在于：所述超高压处理在超高压设备内进行。 7.如权利要求1至6中任一项所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法的筛选方法，其特征在于：步骤如下： ⑴ε-聚赖氨酸或山梨酸钾对牛奶中的致病菌的生长状况的抑制效果测定①用量筒量取50mL脱脂牛奶，置于锥形瓶中； ②向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，山梨酸钾使其终浓度分别达到：0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL轻轻摇晃，混匀； ③向牛奶中接入OD600＝0.5的沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL，轻轻摇晃混合均匀； ④将锥形瓶置于37℃培养箱中恒温培养； ⑤分别在0h、3h、6h、12h取样，对样品进行梯度稀释至计数浓度，取1mL稀释液移入平皿后，将保温至45℃的平板计数培养基注入平皿内，并轻轻摇动平皿使培养基和菌液混合均匀，每个样品做三次平行；琼脂凝固后，平皿倒置于37℃培养箱中培养48h，取出，计数； ⑥计数后，挑取若干菌落，用沙门氏菌引物及反应条件做PCR验证，如没有杂菌，则计数视为有效； ⑵超高压处理牛奶中致病菌的效果测定 ①用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中； 6 ②向脱脂牛奶中接入OD600＝0.5的致病菌菌液，使其菌浓达到10CFU/mL； ③将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温下，分别于200MPa、 300MPa、400MPa、500MPa压力下处理2.5min、5min、10min、15min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行； ④将经过高压处理后的样品，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数；每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效； ⑶超高压协同抑菌物质处理牛奶中致病菌的效果测定 ①用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中； ②向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，加入山梨酸钾使其终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL，轻轻摇晃，混匀； ③向牛奶中接入OD600＝0.5的致病菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL； ④将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温下分别于200MPa、 300MPa、400MPa、500MPa压力下处理5min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行； ⑤将处理后的样品置于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数；每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效； ⑷确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法根据上述步骤⑴、⑵和⑶确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： ①向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到 0.5～4mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； ②将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。
说明书全文	一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法及其筛选方法技术领域 [0001] 本发明属于食品加工技术领域，尤其是一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法及其筛选方法。背景技术 [0002] 在现代液态乳制品生产中，最常见的杀菌方法是使用巴氏杀菌或超高温瞬时杀菌的加热处理方法。加热处理通常会给乳制品带来不利的影响，如会导致牛乳的感官变化；由于蛋白质变性而引起乳制品在保质期内变的不稳定或分布不均匀，产生沉淀，影响产品质量；使一些具有特殊生理活性的成分丧失活力，乳制品营养价值降低。由此可见，使用传统方法加工、保藏的食品已不能完全满足广大消费者对食品感官、风味、营养的需求。 [0003] 超高压是一种食品工业中公认的保存食品原有风味的冷杀菌技术。超高压可以杀死食品中的致病菌，且对食品原有的风味影响很小，因而从整体上改善了食品的质量。近年来高压技术已经被广泛应用于肉类制品、乳制品和蔬菜制品的加工。在超高压下，微生物细胞中的蛋白质、淀粉、DNA和RNA等生物大分子由于受到了外加压力作用，体积减小，维持大分子立体结构的氢键、硫氢键、水化结构等共价键发生变化或破坏，最终使微生物的蛋白质变性、酶失活、淀粉糊化、DNA等遗传物质构相发生改变甚至发生断裂，导致生命活动停止；宏观上可以使微生物的形态受损、细胞膜、细胞壁完整性缺失，产生损伤，这些不利的影响均加速了处理后的细胞的死亡。当各个变化的和超过了细胞的修复能力时细胞便会死亡。 [0004] 随着超高压杀菌技术研究的不断深入人们发现，超高压处理后微生物除了死和存活还存在第三种“受伤”的状态，人们认为微生物的“受伤”状态是介于死亡和正常的中间状态，研究表明，一般食品加工中常见的处理工艺如超高压、高温处理、反复冻融、超声波、辐照等都会导致微生物出现受伤状态。受伤微生物可以在适宜的食品介质中经过一段时间的自我修复过程，转变成为正常的生长状态，繁殖壮大，最终给产品的安全和货架期以及消费者的健康带来隐患。牛奶是一种营养物质较为丰富的食品介质，富含蛋白、脂类、维生素、矿物质，对于濒死或受伤微生物的活力恢复提供了一种良好的营养条件和保护效果，并为致病菌的进一步生长繁殖提供了非常适宜的条件，因此超高压处理液态乳制品的效果一直不够理想，微生物在常温下和低温储存条件下的恢复问题严重阻碍了这一技术在液态乳制品的实际应用。此外，使用超高压加工食品，在连续化生产过程中，超高的压力过会导致压力容器，及加压设备寿命缩短，导致整个生产运行成本增加，这些成本最终都会体现在超高压设备生产出的商品的价格上。因此，寻找提高超高压加工食品设备生产效率，降低生产成本的方法非常迫切。 [0005] ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,简写ε-PL)是一种天然抑菌物质，它是由白色链霉菌发酵合成的一种赖氨酸单体通过ε-酰胺键连接形成的多肽，ε-聚赖氨酸杀菌机理有两种：一它可直接吸附到细胞膜上，通过于细胞发生一系列理化作用，最终导致细胞死亡；二可抑制细菌的呼吸作用，同时作用于细胞膜和蛋白合成系统，通过与核糖体结合而达到抑制蛋白质和酶的合成，从而达到杀菌目的。ε-PL能在人体内分解为赖氨酸，不但没有任何毒副作用，而且可以作为一种赖氨酸的来源。因此ε-PL作为一种天然防腐剂，潜力巨大，逐渐受到国内外科学工作者的青睐。随着人们对ε-PL研究的深入，它作为新型的天然防腐剂已于 2003年10月被FDA批准为安全的食品保鲜剂并在某些领域内展开应用。山梨酸钾(Potassium Sorbate)的结构式为CH3-CH＝CH-CH＝CH-COOK，其分子式为C6H7KO2，相对分子量为150.22，由山梨酸和碳酸钾发生中和反应而制成，除溶解度外，其理化性质与山梨酸基本相同。山梨酸钾性状为白色或类白色颗粒或粉末，无臭味、或微有臭味，在空气中不稳定易吸潮，易发生氧化而变褐色，对光、热稳定性较好，在270℃下加热时才会溶化分解。山梨酸钾易溶于水，1％的水溶液pH值为7～8。山梨酸钾能有效地抑制霉菌、酵母菌及多数好氧细菌的活性，还能防止肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌的生长繁殖，但对厌氧微生物，其抑制生长繁殖的作用比杀菌作用效果突出，从而达到有效地延长食品货架期的目的，同时，山梨酸钾可以保持食品天然的风味不变。 [0006] 目前也有一些将ε-聚赖氨酸和山梨酸钾用于液态奶和其它乳制品中微生物的抑制研究，但是由于液态奶和相关乳制品是一种良好的乳化体系，脂类和蛋白在水介质中形成了高浓度的稳定体系，并且使一些脂溶性和水溶性的营养物质很好的平衡于这一体系中。这类食品对于存在于其中的微生物起到了良好的保护作用，液态奶和相关乳制品中的微生物能够抵抗更强的抑菌处理，并且能够帮助未彻底致死的微生物在适宜条件下迅速恢复。因此，在这类食品中通常需要添加更高浓度的抑菌物质，以达到理想的杀菌效果。然而，高浓度抑菌物质的添加会带来一些潜在的负面作用，如影响食品品质、驯化致病菌抗逆性、抑制正常肠道菌群、以及长期大量食用对人体可能造成的直接危害等。因此，应该尽可能少地在食品中添加抑菌物质，尤其是人工合成的抑菌物质。超高压的协同作用，已被证明能够显著提高抑菌物质的抑菌效果，通过与超高压的协同作用，抑菌物质在较低的浓度下能够达到高浓度的抑菌效果。并且，超高压与抑菌物质的协同应用，往往能够产生超过叠加作用的效果，是一种更具应用潜力的防腐、保鲜技术。然而，目前将超高压与聚赖氨酸或山梨酸钾协同作用，应用于乳制品杀菌处理的技术还未建立。 [0007] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。发明内容 [0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法及其筛选方法，该方法在提高超高压杀菌的效果的同时，降低了杀菌的能量消耗，并提高了乳制品的食用安全性。 [0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： [0010] 一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： [0011] ⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到0.5～4mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； [0012] ⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。 [0013] 而且，所述步骤⑴中无菌食品级抑菌物质为无菌食品级ε-聚赖氨酸或山梨酸钾。 [0014] 而且，所述无菌处理为：将ε-聚赖氨酸或山梨酸钾先配制成储备液，再经0.22um滤膜除菌。 [0015] 而且，所述步骤⑴中牛奶无需进行巴氏杀菌或超高温瞬时杀菌。 [0016] 而且，所述步骤⑵中灌装后单个包装的空气的残余量低于1％，所述百分比为空气的残余量占包装的体积百分比。 [0017] 而且，所述超高压处理在超高压设备内进行。 [0018] 如上所述的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法的筛选方法，步骤如下： [0019] ⑴ε-聚赖氨酸或山梨酸钾对牛奶中的致病菌的生长状况的抑制效果测定[0020] ①用量筒量取50mL脱脂牛奶，置于锥形瓶中； [0021] ②向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，山梨酸钾使其终浓度分别达到：0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL轻轻摇晃，混匀； [0022] ③向牛奶中接入OD600＝0.5的沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL，轻轻摇晃混合均匀； [0023] ④将锥形瓶置于37℃培养箱中恒温培养； [0024] ⑤分别在0h、3h、6h、12h取样，对样品进行梯度稀释至计数浓度，取1mL稀释液移入平皿后，将保温至45℃的平板计数培养基注入平皿内，并轻轻摇动平皿使培养基和菌液混合均匀，每个样品做三次平行；琼脂凝固后，平皿倒置于37℃培养箱中培养48h，取出，计数； [0025] ⑥计数后，挑取若干菌落，用沙门氏菌引物及反应条件做PCR验证，如没有杂菌，则计数视为有效； [0026] ⑵超高压处理牛奶中致病菌的效果测定 [0027] ①用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中； [0028] ②向脱脂牛奶中接入OD600＝0.5的致病菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL； [0029] ③将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温下，分别于200MPa、300MPa、400MPa、500MPa压力下处理2.5min、5min、10min、15min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行； [0030] ④将经过高压处理后的样品，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数；每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效； [0031] ⑶超高压协同抑菌物质处理牛奶中致病菌的效果测定 [0032] ①用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中； [0033] ②向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，加入山梨酸钾使其终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL，轻轻摇晃，混匀； [0034] ③向牛奶中接入OD600＝0.5的致病菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL； [0035] ④将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温下分别于200MPa、300MPa、400MPa、500MPa压力下处理5min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行； [0036] ⑤将处理后的样品置于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数；每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效； [0037] ⑷确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法 [0038] 根据上述步骤⑴、⑵和⑶确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： [0039] ①向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到0.5～4mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； [0040] ②将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。 [0041] 本发明取得的优点和积极效果是： [0042] 1、本方法为非热杀菌，避免了因热杀菌造成的牛奶风味的损失，最大程度的保留了牛奶的天然风味和营养价值，而且效果更好、安全性更高的协同杀菌技术。 [0043] 2、本方法提高了超高压杀菌效果，该方法处理后的牛奶货架期同超高压单独作用杀菌的牛奶相比，明显延长，效果优于超高压或抑菌物质单独处理的效果，具有明显的协同效应。 [0044] 3、本方法显著缩短了保压时间，大幅度降低了超高压杀菌所需的能耗，节约了能源，降低了生产成本。 [0045] 4、本协同杀菌方法在室温下进行，当目标菌为对压力抗性较强的微生物时，可根据待杀菌牛奶的要求适当升温，以保障更好的杀菌效果。 [0046] 5、本方法同样适用于果汁，果乳，酸乳等产品，并且可以提高超高压杀菌效果，缩短保压时间，降低超高压杀菌成本。附图说明 [0047] 图1为本发明中ε-聚赖氨酸和山梨酸钾对牛奶中的致病菌的生长状况的抑制效果测定图； [0048] 图2为本发明中超高压处理时间为2.5min的杀菌效果图； [0049] 图3为本发明中超高压处理5min的杀菌效果图； [0050] 图4为本发明中超高压处理10min的杀菌效果图； [0051] 图5为本发明中超高压处理15min的杀菌效果图； [0052] 图6为本发明中超高压协同0.5mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0053] 图7为本发明中超高压协同1mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0054] 图8为本发明中超高压协同2mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0055] 图9为本发明中超高压协同0.5mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0056] 图10为本发明中超高压协同1mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0057] 图11为本发明中超高压协同2mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0058] 图12为本发明中超高压协同4mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定图； [0059] 图13为本发明中牛奶的微生物指标测定结果图。具体实施方式 [0060] 下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 [0061] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。 [0062] 本发明中所使用的所述的抑菌物质为ε-聚赖氨酸或山梨酸钾，抑菌物质应先配制成储备液，经0.22um滤膜除菌后，再进行使用。 [0063] 实施例1 [0064] 一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： [0065] ⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质ε-聚赖氨酸，使无菌食品级ε-聚赖氨酸在牛奶中的终浓度达到1mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； [0066] ⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min，即得杀菌后牛奶。 [0067] 实施例2 [0068] 一种超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： [0069] ⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质山梨酸钾，使无菌食品级山梨酸钾在牛奶中的终浓度达到2mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； [0070] ⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理10min，即得杀菌后牛奶。 [0071] 对比实施例1 [0072] 在实施实例1基础上，将实施实例1中的抑菌物质溶液替换为等体积无菌去离子水。原料及其余步骤均与实施例1相同。 [0073] 对比实施例2 [0074] 在实施实例1基础上，将等浓度ε-聚赖氨酸储备液加入牛奶中，但不进行超高压处理。 [0075] 对比实施例3 [0076] 在实施实例2基础上，将等浓度山梨酸钾储备液加入牛奶中，但不进行超高压处理。 [0077] 对比实施例4 [0078] 在实施实例1基础上，将实施实例1中的抑菌物质溶液替换为等体积无菌去离子水，并将保压时间延长1倍。 [0079] 相关的检测结果： [0080] 采用GB 47892-2010方法，分别对上述实施例中超高压杀菌后的牛奶(储存0h)中的菌落总数，及在37℃下保存3h、6h、12h后的牛奶中的菌落总数进行测定。结果显示，由上述数据可知，当抑菌物质单独作用于牛奶中时，其抑制微生物生长繁殖的作用微乎其微；500MPa左右超高压单独处理牛奶中的微生物5min可将其完全杀死，但12小时后，牛奶中微生物菌落总数达到2.44log CFU/mL；而使用500MPa超高压与一定浓度的抑菌物质协同处理牛奶中的微生物，在37℃下储存12小时后，菌落总数仍为0CFU/mL，结果如图13所示。 [0081] 由此可见，本发明方法在提高超高压杀菌牛奶的货架期的同时，也降低了超高压杀菌所需的能耗。 [0082] 上述超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法的筛选方法，步骤如下： [0083] 1、ε-聚赖氨酸或山梨酸钾对牛奶中的致病菌的生长状况的抑制效果测定[0084] (1)用量筒量取50mL脱脂牛奶，置于锥形瓶中； [0085] (2)向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸储备液使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，山梨酸钾使其终浓度分别达到：0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL轻轻摇晃，混匀。 [0086] (3)向牛奶中接入OD600＝0.5左右的沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL左右，轻轻摇晃混合均匀。 [0087] (4)将锥形瓶置于37℃培养箱中恒温培养。 [0088] (5)分别在0h、3h、6h、12h取样，对样品进行梯度稀释至计数浓度，取1mL稀释液移入平皿后，将保温至45℃的平板计数培养基注入平皿内，并轻轻摇动平皿使培养基和菌液混合均匀，每个样品做三次平行。琼脂凝固后，平皿倒置于37℃培养箱中培养48h左右，取出，计数。 [0089] (6)计数后，挑取平板计数琼脂上的菌落形态是否一致，并挑取若干菌落，用沙门氏菌引物及反应条件做PCR验证，如没有杂菌，则计数视为有效。 [0090] 结果如图1所示，随着牛奶中聚赖氨酸或山梨酸钾的浓度增加，抑菌效果随之增强，2mg/ml的聚赖氨酸和4mg/ml的山梨酸钾单独作用于牛奶中的微生物，抑菌效果好于其他浓度的抑菌物质，综合不同浓度聚赖氨酸和山梨酸钾，牛奶中聚赖氨酸的浓度为2mg/ml时，可以在牛奶储存12小时后使牛奶中的菌落总数降低1.14logCFU/mL，牛奶中山梨酸钾的浓度为4mg/ml时，可以在牛奶储存12小时后使牛奶中的菌落总数降低0.84logCFU/mL，抑菌效果最好，但是单独加入聚赖氨酸或山梨酸钾不能达到食品级的杀菌要求。 [0091] 2、超高压处理牛奶中致病菌的效果测定 [0092] (1)用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中。 [0093] (2)向脱脂牛奶中接入OD600＝0.5左右的致病菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL左右。 [0094] (3)将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温(25℃)下，分别于200MPa、300MPa、400MPa、500MPa压力下处理2.5min、5min、10min、15min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行。 [0095] (4)将经过高压处理后的样品，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数。每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效。 [0096] 超高压处理时间为2.5min杀菌效果如图2所示，超高压处理时间为2.5min时，200MPa，300MP处理组与对照组菌落总数在各个时间点没有显著差别，400MPa杀菌效果优于 300MPa，500MPa处理2.5min后，在0小时和3小时计数，菌落总数都为0CFU/mL，但是随着培养时间的延长，菌落数随之增加，培养到12小时，牛奶中的菌落总数为4.01logCFU/mL，说明超高压单独作用2.5min不能完全杀死致病菌，只是造成了亚致死，在适宜的条件下，受损伤的致病菌可以通过自身修复恢复增长，并且恢复致病性。 [0097] 超高压处理5min杀菌效果如图3所示，200MPa处理5min的杀菌效果与对照组差别不大，400MPa处理5min，培养至12小时，牛奶中的菌落数为6.17logCFU/mL，与400MPa处理2.5min相比，菌落总数降低了1.18logCFU/Ml，500MPa处理5min，菌落总数在培养至6小时依然为0logCFU/mL，牛奶的无菌状态延长至6小时。 [0098] 超高压处理10min杀菌效果如图4所示，压力为400MPa和500MPa时，菌落总数明显低于200MPa和300MPa，并且明显低于对照组(不经过高压处理)，牛奶的无菌状态最多可延长至6小时。 [0099] 超高压处理15min杀菌效果如图5所示，超高压处理时间延长至15min后，牛奶的无菌状态最多延长至6小时，与超高压处理5min相比，无菌状态的时间没有延长。增加超高压处理压力可以明显提高杀菌效果，延长保压时间不能较大幅度的提高杀菌率。 [0100] 3、超高压协同抑菌物质处理牛奶中致病菌的效果测定 [0101] (1)用量筒，量取50mL脱脂牛奶，将脱脂牛奶装于无菌均质袋中。 [0102] (2)向脱脂牛奶中加入ε-聚赖氨酸储备液使其终浓度分别达到0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，加入山梨酸钾储备液使其终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，4mg/mL，轻轻摇晃，混匀。 [0103] (3)向牛奶中接入OD600＝0.5左右的致病菌菌液，使其菌浓达到106CFU/mL左右。 [0104] (4)将无菌袋真空热封口后置于超高压设备的加压舱中，在室温(25℃)下，分别于200MPa、300MPa、400MPa、500MPa压力下处理5min，处理时间不包括加压和泄压时间，每个样品做3次平行。 [0105] (5)将处理后的样品置于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h、3h、6h、12h取样并用生理盐水进行梯度稀释用平板计数琼脂计数。每次挑取若干菌落用PCR验证，若无杂菌，则数据视为有效。 [0106] 超高压协同0.5mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定如图6所示，对牛奶中致病菌的杀灭效果，与超高压单独处理5min相比，300MPa、400Mpa、500MPa协同处理与相同压力的单独超高压处理相比，菌落总数在3小时、6小时、12小时均有显著降低，可以得出0.5mg/ml的聚赖氨酸与超高压处理有协同作用。 [0107] 超高压协同1mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定如图7所示，对照组为只加入1mg/ml的聚赖氨酸，与0.5mg/ml的聚赖氨酸协同处理相比，1mg/ml聚赖氨酸协同处理在各个时间点菌落总数均有显著降低，而且，1mg/ml聚赖氨酸与500MPa超高压处理5min协同作用，可以在37℃下抑制牛奶中致病菌的恢复增殖，超高压与1mg/ml聚赖氨酸协同处理的杀菌效果高压超高压单独处理与聚赖氨酸单独处理杀菌效果的和。 [0108] 超高压协同2mg/ml聚赖氨酸处理牛奶中致病菌的效果测定如图8所示，从图中可以得出，300MPa、400MPa、500MPa与2mg/ml的聚赖氨酸协同处理，菌落总数与对照组相比有显著降低，500MPa高压处理与2mg/ml聚赖氨酸协同作用，可以使牛奶在37℃下保持12小时的无菌状态，并且300MPa、400MPa高压处理与2mg/ml聚赖氨酸协同和300MPa、400MPa高压处理与1mg/ml聚赖氨酸协同相比，菌落总数在各个时间点均有显著降低，充分说明2mg/ml聚赖氨酸与高压处理有协同作用。 [0109] 超高压协同0.5mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定如图9所示，从图中可以看出，超高压协同0.5mg/ml山梨酸钾与超高压单独作用相比，在各个压力下均可以显著提高杀菌效果，但是从整体来说杀菌效果不如与0.5mg/ml聚赖氨酸协同，可以保证牛奶在6小时内处于无菌状态。 [0110] 超高压协同1mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定如图10所示，从图中可以看出，1mg/ml山梨酸钾协同超高压处理可以在12小时内保证牛奶处于无菌状态，并且各个处理组与对照组相比有显著差异。 [0111] 超高压协同2mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定如图11所示，从图中可以得出，超高压协同2mg/ml山梨酸钾与超高压单独作用相比显著降低了牛奶中致病菌菌落总数，充分说明超高压与2mg/ml山梨酸钾有显著的协同作用，500MPa超高压处理与2mg/ml山梨酸钾协同作用，可以在37℃抑制牛奶中致病菌的增殖，在12小时内保证牛奶中致病菌数为0。 [0112] 超高压协同4mg/ml山梨酸钾处理牛奶中致病菌的效果测定结果如图12所示，从图中可以看出，超高压与4mg/ml山梨酸钾协同作用可以显著抑制牛奶中致病菌的增殖，并且4mg/ml山梨酸钾与500MPa高压处理协同作用，可以在37℃，12小时内抑制牛奶中致病菌的增殖，使牛奶中致病菌的菌落总数维持在0CFU/ml，并且与2mg/ml山梨酸钾协同作用相比， 4mg/ml山梨酸钾与超高压协同作用可以显著降低牛奶中致病菌的菌落总数。 [0113] 4、确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法 [0114] 根据上述步骤确定最终的超高压与抑菌剂协同的牛奶非热杀菌方法，步骤如下： [0115] ⑴向牛奶中加入无菌食品级抑菌物质，使无菌食品级抑菌物质在牛奶中的终浓度达到0.5～4mg/mL，然后在25℃-30℃下对牛奶进行均质，得均质后牛奶； [0116] ⑵将均质后牛奶进行灌装后，直接将牛奶在室温下对其在500±5MPa条件下超高压处理5min～10min，即得杀菌后牛奶。

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