콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트{MANUFACTURING METHOD OF FUNCTIONAL YOGURT OF PREVENTING TOOTH DECAY BY USING SOYBEAN MILK AND THE LACTIC ACID BACTERIA, AND YOGURT OF PREVENTING TOOTH DECAY MADE BY THE SAME}
본 발명은 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트에 관한 것이다.
사람의 구강내는 400종류 이상의 세균이 번식하고 있으며, 그 균수는 100억개에 달하고 있다. 또한, 이에 더하여 타액에는 10 8 ∼10 9 CFU/㎖ 수준의 균수가 검출되고 있다. 치아는 미세한 구멍이 다수개 천공되어 있어서 충치를 일으키는 세균이 상기한 구멍으로 들어가 치아를 병들게 하는데 이것이 충치이다. 이러한 충치는 치아에서 가장 흔히 볼 수 있는 대표적인 질환의 하나로 치아우식증이라고도 한다. 구강 내 음식물이 내산성 연쇄상구균과 유산균에 의해 부패되고 산에 의해 치아의 성분이 파괴되는 감염성 세균성 질환이다. 우리나라에서는 영구 치아의 충치 이환율이 약 80%에 이르고, 한 사람이 평균 2-3개의 충치를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 충치를 일으키는 원인은 여러 가지가 복합적으로 작용하고 있는 것으로 밝혀져 있지만 가장 중요한 것은 치태이다. 치태에는 여러 세균이 섞여 있는데, 특히 내산성 연쇄상 구균과 유산균이 많고 그 중에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 주요 충치균으로 알려져 있다. 이같은 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 치아의 표면에 부착하여 성장하면서 음식물 내의 당을 이용하여 산을 생성하여 치아를 부식시키고 동시에 치아 골세포에 침입하여 각종 치조 골 부식과 잇몸병을 발생시키는 데 이 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다. 충치의 발생은 충치 원인균에 의해서 치태가 치면에 형성하는 과정을 제1단계로 하고, 치태내에서 유기산이 생성되는 과정을 제2단계로, 치태내에서 생성된 유기산, 단백질 분해효소 등에 의해서 치아 표면을 구성하는 무기질을 탈회하고 나아가 유기질을 용해하여 가는 제3단계로 이루어진다. 또한 치주질환의 경우, 치면 및 치주 조직에 부착된 치태가 치주질환의 발생과 진행의 주된 원인이 되는 바, 치태내의 세균에 의해서 유해한 대사 산물이나 세균성 효소를 생성하여 그 결과로서 치은염을 유발시켜 발생하고 진전되는 것으로 알려져 있다. 최근에 치주 질환은 단순한 잇몸 조직의 만성 감염에 그치지 않고, 심근경색, 동맥경화를 비롯하여 당뇨병, 조산(早産) 유발 등의 위험인자로서 주목을 받고 있다. 따라서, 충치를 비롯한 치주질환을 치료하기 위하여, 살균제를 투여하거나 항생물질 복용 등의 방법이 행해지고 있다. 그러나 치료를 위한 살균제나 항생물질의 장기 투여는 새로운 항생제에 대해 저항을 가지는 내성균을 키우는 등의 부작용을 유발하고 있다. 또한, 치아는 한번 파괴되면 다시 재생되지 않기 때문에 충치는 치아를 대신하는 재료로 밀봉하여 치료하고 있다. 이러한 충치 치료는 일반적으로 치아에서 충치 부위를 제거하고 인공적인 재료를 사용하여 충치가 제거된 부위를 금 인레이,세라믹 인레이, 아말감 충전, 레진 충전 등의 재료로 메우는 것으로, 마취제로 해당 부위를 국소마취시킨 후 핸드 드릴을 이용하여 고속으로 연마시켜 충치부위를 제거하였다. 그러나 이러한 핸드 드릴을 통한 치료는 치료시 소음과 진동에 의하여 환자에게 고통과 불쾌감을 주게 되므로, 치과 치료를 꺼려서 충치를 더욱 확산시키는 문제점이 있었다. 현재 충치 예방 방법으로는 칫솔질과 적절한 식이 요법을 통해 당분의 섭취를 줄이거나 자일리톨을 이용하여 충치균에 의한 산의 생성을 방지하는 방법이 있다. 종래의 치약 조성물에는 이러한 충치를 비롯한 각종 치아 및 구강관련 질환을 예방할 목적으로 항균 효과가 있는 불소 화합물이나 그 밖의 합성 화학물질에 의존하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스균 등의 활성을 억제하는 치약 조성물을 사용해 왔다. 이 방법은 충치는 예방되지만 불소 침투층이 치아표면에서 깊이 침투하지 못하고 쉽게 소실되는 한계성을 가진다. 결과적으로 이와 같은 방법은 근본적으로 충치 유발균의 사멸이나 골세포 침입 방지의 효과는 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 충치 유발균의 사멸 효과를 나타내는 신규 유산균과 콩물을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 콩물에 한국인으로부터 분리 동정한 충치 유발 세균 활성 억제 작용을 하는 신규한 미생물을 포함하는 혼합유산균 배양액을 2 내지 5 %(v/v) 비율로 접종한 후, 당원을 첨가하고 발효하는 것을 특징으로 하는 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 콩물은 (ⅰ) 대두를 흠집이나 상처가 난 부위를 제거함과 동시에 선별한 후 흐르는 물에 세척하거나 은나노수에 세척하는 재료 선별 및 세척 공정(제 1 공정); (ii) 콩을 물에 3시간 침지시켜 불리고 껍질을 제거하는 공정(제2 공정) (iii) 25℃ NaHCO3 용액에 20분간 침지시키는 공정(제3 공정) (iv) 5분간 열처리 후 콩 중량의 7배의 물을 첨가한 후 마쇄하는 공정(제 4 공정) 및 (v) (iv) 단계의 혼합물을 170 메시로 체로 거르는 공정에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 발효는 35 내지 45℃ 온도에서 5 내지 10 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 콩물과 혼합유산균을 이용한 기능성 두유 요구르트의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 이와 같은 제조 방법에 의하여 제조된 콩물과 유산균을 포함하는 충치 예방 기능성 요구르트를 제공한다.
본 발명에 따른 콩물과 유산균을 이용한 충치 예방 기능성 요구르트의 제조 방법에 의할 경우 충치 예방 세균의 활성을 억제하는 유산균이 포함되어, 요구르트의 풍미를 느끼면서도 충치를 예방할 수 있게 되어, 맛과 풍미가 좋은 기능성 두유 요구르트를 제조할 수 있게 된다.
도 1은 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대한 생존 억제 효율을 비교한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 콩물에 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005을 접종하여 발효시키는 것을 특징으로 한다 본 발명에 의한 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005는 성인의 분변으로부터 분리하였으며, 이들 중 충치를 유발한다고 알려진 세균들에 대한 항균 실험을 통해 충치용 세균의 성장 억제 효과가 있는 균주들을 선발하였고, 선발된 균주들을 16S rRNA의 염기서열 분석, PCR-RAPD 분석, 형태학적, 배양학적 특성분석을 통해 동정하였다. 그 결과 본 발명에서 분리된 유산균이 “비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis)”임을 확인하였으며, 따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을 "비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005"로 명명하여 2010년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다. (기탁 번호 : KCTC 11670BP)
본 발명의 기능성 두유 요구르트의 제조방법에서, 상기 제조된 콩물에 혼합 유산균의 생육을 촉진하기 위해 포도당, 설탕, 과당, 식이섬유 등을 더 첨가할 수 있는데, 각각 0.1 내지 3.0%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 0.1% 이하의 농도로 첨가하면 유산균 발육촉진의 효과가 미미하고 3.0% 이상의 농도로 첨가하면 유산균에 의한 산 생성이 너무 많아져서 제품의 풍미가 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 발효 두유는 플레인 요구르트 타입, 향미 요구르트 타입, 후르츠요구르트 타입, 감미 타입 등 어떤 종류의 제품이어도 좋다. 또한, 본 발명의 발효 두유는 플레인 요구르트 타입, 소프트 요구르트 타입, 드링크 요구르트 타입, 고형 (경질) 요구르트 타입, 후로즌(frozen) 요구르트 타입 등 어떤 형태의 제품이어도 좋다. 또한, 발효 종료 후 발효 두유와 시럽액의 혼합 전 등의 단계에서 발효 두유에 살균 처리를 실시한 사균(死菌) 함유 타입의 제품이어도 좋다.
< 제조예 > 콩물의 제조 100% 국산콩을 준비하고, 흠집이나 상처가 난 부위를 제거하고, 흠집이 없는 콩을 선별한 후 흐르는 물에 세척하였다. 세척한 콩을 물에 3시간 침지시켜 불리고 껍질을 제거한 후, 25℃ NaHCO3 용액에 20분간 침지시켰다. 이후 5분간 가열하고, 다시 콩 중량의 7배의 물을 첨가한 후 곱게 분쇄하였으며, 결과로서의 혼합물을 170 메시로 체로 걸러서 콩물을 제조하였다. 제조된 콩물을 100 ℃에서 1~2시간 가열하여 멸균하고, 20～45 ℃로 식혀 발효원액으로 사용하였다.
< 실시예 1> 분변으로부터 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis) 균주 분리 정상적인 섭식 습관을 갖는 20 - 30 세의 건강한 성인 15명으로부터 분변을 수집하였다. 수집된 인분의 적당량을 생리식염수 100 ㎖에 현탁한 후, 적당량을 취하여 5% 양 혈청이 함유된 BL 아가 배지(Blood-Liver, Nissue)에 도말하였다. 박트론 혐기 챔버(Bactron Anaerobic chamber; Sheldon Manufacturing Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
생존한 균주 중에서 0.5-2.0 mm 의 적갈색 중심 부분을 갖는 밝은 갈색, 유백색 또는 황갈색 형태의 비피도박테리움 속 미생물을 선별하였다. 선별된 3종의 유산균은 fructose-6-phosphate phosphoketlase (F6PPK) 시험을 통해 비피도박테리움속인 것을 확인하고, 이들을 각각 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307 로 명명하였다.
< 실시예 2> 비피도박테리움 아돌레센티스( Bifidobacterium adolescentis )균주의 분리 및 동정 - 16S rRNA 분석 상기 실시예 1을 통해 분리되고 명명된 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307를 동정하기 위하여, 당업계에 공지된 통상의 방법(Matsuki, T., et al., FEMS Microbiology Lett., 167: 113-121, 1998; Mullie, C., et al., FEMS Microbiology Lett., 222: 129-136, 2003; Venema, K., et al., FEMS Microbiology Lett., 224: 143-149, 2003)에 따라 16S rRNA 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 유산균 SPM1005의 5' 영역과 3' 영역 모두 비피도박테리움 아돌레센티스 L2-32(1448bp)와 99 %의 상동성을 나타내었다.(결과 미도시)
< 실시예 3> 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005 의 항균 활성 조사 상기 실시예에서 건강한 20 - 30세 한국인의 분변으로부터 분리, 동정된 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1601 균주 중에서 충치균의 성장 증식 억제효과를 가진 균주를 선발하기 위하여, 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1601 균주를 이용하여 충치를 유발하는 것으로 알려진 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 성장 저해 실험을 실시하였다.
먼저, 본 발명의 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum KCTC1048 균주들을 GAM(General anaerobic medium) (Nissui Pharm. Co. Ltd., Japan) broth 30 ㎖에 접종하여 N 2 (90%), H 2 (5%) 및 CO 2 (5%)로 구성되는 혼합 가스로 채워진 혐기적 시스템(Bactron Anaerobic Chamber, Sheldon Manufacturing Inc.,USA))하에 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다. 또한, 본 실시예에서 충치를 유발하는 세균으로는 스트렙토코쿠스 뮤탄스가 사용되었으며, 이는 경희대학교 구강미생물실로부터 획득되었다. 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스는 BHI(brain-heart infusion) broth 30 ㎖에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 혐기성 조건에서 전배양하였다. 실시예로서는 전배양한 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212, SPM1005, SPM1207, SPM1307-A, SPM1601, SPM1307가 선택되었고, 비교예로서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KCTC1048 균주가 선택되었다. 이들 균주들을 전배양한 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 1:1로 혼합하여 잘 섞은 후 BHI(brain-heart infusion) broth 5ml을 추가하여, 37℃에서 2시간 동안 본 배양하였다. 반면, 대조군(Control)은 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 PBS(살린)를 1:1로 혼합하여 잘 섞은 후 BHI(brain-heart infusion) broth 5ml을 추가하여, 37℃에서 2 시간 동안 본 배양하였다. 본 실시예에서 사용된 대조군, 실시군 및 비교군을 나타내면 다음과 같다.
대조예 1 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 살린 실시예 3-1-1 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM0212 실시예 3-1-2 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1005 실시예 3-1-3 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1207 실시예 3-1-4 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307-A 실시예 3-1-5 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1601 실시예 3-1-6 : 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 비피도박테리움 아돌레센티스 SPM1307 비교예 1 스트렙토코쿠스 뮤탄스 + 락토바실러스 플란타룸 KCTC1048
그 후 대조예 1, 실시예 3-1-1 내지 3-1-6 및 비교예 1의 본 배양액들로부터 균을 수득하였고, 수득된 균을 살린(saline)으로 10 배씩 계열 희석(serial dilution)한 후, 희석된 배양액을 BHI 아가 배지(agar plate)에 도말하여 호기성 조건하에 37℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지 위에 성장한 콜로니의 수를 계수하여 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생존율을 대조군과 비교하여 측정하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 상기 SPM1005 균주는, 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 생장 억제에 현저한 효과를 나타냈다
< 실시예 4> 유산균 배양물 첨가 두유 요구르트의 제조 상기 실시예 3에서 선택된 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 배양물과 상기 제조예에서 제조된 콩물과 혼합하여 두유 요구르트를 제조하였다. 선택된 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) SPM1005 배양물을 전체 콩물에 3 %(v/v) 가 되게 접종한 후 40℃ 에서 8시간 발효하였다. 결과 두유 요구르트를 제조할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11670 20100407 |
