高β－伴大豆球蛋白产品及其用途

本发明涉及高β-伴大豆球蛋白(conglycinin)组合物、肉食类似物、干 酪类似物、饮料和动物饲料，并涉及生产高β-伴大豆球蛋白组合物、干酪 类似物、饮料、肉食类似物和动物饲料的方法。

此处用来阐明发明背景或提供关于实施的其他细节的公开文本及其 他材料均引用作为参考。

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白(BC)占大豆中蛋白质的约70％。曾 经假定食物系统中大豆蛋白质成分的功能性质能通过改变这些蛋白质的 比例来改善。以前曾尝试提高大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白的比例，来提 高豆腐类大豆凝胶的产量和质量，及为营养目的提高含硫氨基酸的含量 (Kitamura，K.，食品科学与技术趋势(Trends Food Science& Technology)4：64-67，(1993)，Murphy，P.等人，食品技术(Food Technology)51：86-88(1997))。

需要饮食中的蛋白质来补偿组织和器官蛋白质的代谢损失，在新组 织中形成并沉积蛋白质，及补充病理状态引起的组织损失。这些需要可 由组成饮食蛋白质的不可缺少的(必需)氨基酸和不是必要的氨基酸来 满足。在本说明书中主要是将饮食蛋白质的营养价值解释为满足每日必 需氨基酸需求的能力(Steinke，F.等人，《人类健康中的新蛋白质食品： 营养预防与治疗》，CRC出版社，1992)。高质量的蛋白质含有高于参 照水平的所有必需氨基酸，并且是高度可消化的，以使氨基酸可被利 用。在本说明书中，蛋清和乳蛋白是评价其他蛋白质的标准，并认为植 物蛋白质具有较低的营养价值。在蛋白质中的浓度低于参照蛋白质水平 的必需氨基酸被称为限制氨基酸，例如，大豆中半胱氨酸和甲硫氨基酸 的总和有限。

大豆球蛋白每单位蛋白质含有比β-伴大豆球蛋白多3-4倍的半胱氨酸 和甲硫氨酸(Fukushima D.，国际食品综述(Food Rev.Int.)7：323- 351，1991)。因此预期大豆球蛋白含量的增加和β-伴大豆球蛋白含量的 降低可导致蛋白质质量提高(Kitamura，K.，食品科学与技术趋势4：64- 67，1993；Kitamura，K.，JARQ 29：1-8，1995)。这与4种低β-伴大豆 球蛋白含量代表系的种子中含硫氨基酸含量的平均值比4种普通品种高约 20％的发现相一致(Ogawa，T.，日本培育杂志(Japan J.Breed.) 39：137-147，1989)。也报道了野生大豆中大豆球蛋白：β-伴大豆球蛋白 比值(1.7-4.9)与总蛋白质的甲硫氨酸或半胱氨酸之间有正相关 (Kwanyuen等人，JAOCS 74：983-987，1997)。没有关于高β-伴大豆 球蛋白大豆的氨基酸组成的报道(大豆球蛋白：β-伴大豆球蛋白比值低于 0.25)。

除蛋白质满足身体对必需氨基酸的每日需求的能力外，饮食蛋白质 也能提供生物活性肽和氨基酸模式，它们能减少心血管疾病、癌症和骨 质疏松症的危险因素。也应在评估蛋白质质量中考虑这些组成因素，特 别是在人们平均消费过量饮食蛋白质的国家，如美国。研究人员 (Sugano等人，PCT号WO89/01495；Sugano，M.，营养学杂志(J. Nutr)120：977-985，1990；Sugano，M.和Kobak，K.，纽约科学院年报 (Annu.NY Acad.Sci.)676：215-222，1993；Wang，M.，营养科学与 维生素学杂志(J.Nutr.Sci.Vitaminol.)41：187-195，1995)鉴定了大豆 蛋白质的一种胃蛋白酶抗性组分(5000-10000分子量)，其代表分离的大 豆蛋白质中约15％的蛋白质。每天食用含有24g或48g胃蛋白酶抗性组分 的食物的人们比食用含有分离的大豆蛋白质或酪蛋白的人们有更少的 LDL-胆固醇和更多的粪便中性和酸性类固醇排泄。对该胃蛋白酶抗性组 分有贡献的大豆蛋白质尚未鉴定。纯化的β-伴大豆球蛋白比纯化的大豆球 蛋白有更高的胃蛋白酶抗性(Astwood，J.和Fuchs，R.，变态反应专题论 文，第六届国际食物变态反应免疫学与临床问题研讨会，Ortolani，C.和 Wuthrich，B.编，Basel，Karger，1996)，因此逻辑上可得出β-伴大豆 球蛋白可能是生物活性组分的主要部分。这种可能性尚未在喂食研究中 得到证明，也未用蛋白质组成改变的大豆制成的蛋白质证明。

在组织培养实验中，β-伴大豆球蛋白的α和α-prime亚基与人及动物 肝细胞的膜成分特异地相互作用(Lovati，M.R.等人，营养学杂志(J. Nutr.)126：2831-2842)。β-伴大豆球蛋白亚基被肝细胞掺入，降解并使 LDL与高亲和力受体的最大结合增强。有人建议，这种机制能负责大豆 蛋白质分离物的降胆固醇性质。然而，尚不清楚显著量的饮食大豆蛋白 质是否能到达肝脏内。Lavarti等人(营养学杂志122：1971-1978， 1992)报道了用大豆球蛋白或β-伴大豆球蛋白饲养高胆固醇血症大鼠2周 的研究。两组均显示总血清胆固醇降低1/3。没有在动物模型或人体中测 定来源于大豆蛋白质组成改变的大豆之大豆蛋白质分离物对于大豆蛋白 质分离物的降胆固醇性质的影响的研究。

由应用乙醇抽提的(除去异黄酮)和非乙醇抽提的大豆蛋白质分离 物的恒河猴试验可以推断，大豆异黄酮是引起降胆固醇作用的大豆蛋白 质分离物的主要成分(Anthony，M.S.，营养学杂志126：43-50， 1996)。然而，在使用仓鼠(Balmir等人，营养学杂志126：3046-3053， 1996)或大鼠(Topping等人，营养学研究(Nutr.Res.)22：513-520， 1980)的其他研究中，对大豆蛋白质进行乙醇抽提对其降脂作用没有任 何影响。乙醇抽提法能提取出一些蛋白质，并能变性并聚集大豆蛋白质 的单一结构，可能影响它们如何在G1区域(tract)中作用。例如， Sugano等人(营养学杂志120：977-985，1990)发现，甲醇抽提完全消除 了高分子量大豆蛋白质肽结合并排泄类固醇的能力。食用分离的大豆异 黄酮(染料木黄酮和大豆黄素)在人体中对血清脂类或脂蛋白没有有利 的影响(Colquhoun等人，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)109：75， 1994；Nestel，P.J.，动脉硬化、血栓形成、血管炎生物学(Arterioscler. Thromb.Vasc.Biol.)17：3392-3398，1997)。

关于多种大豆蛋白质分离物成分在观察到的降胆固醇作用中的相对 作用的混乱，难以用产生组成改变的样品的加工技术解决。一种改进方 法是特异地改变大豆中的目的成分。

心脏病危险的一个关键指征是高血清同型半胱氨酸水平。饮食甲硫 氨酸是同型半胱氨酸的前体，因此大量食用甲硫氨酸能潜在地增加消费 者患心脏病的危险，特别是当他们也食用低水平的叶酸和维生素B6时 (McCully，K.S.，《同型半胱氨酸循环》，Keats Publishing，Inc.，New Canaan，Connecticut，1997)。降低同型半胱氨酸的内皮细胞毒性的另一 个途径是体内一氧化氮(NO)与同型半胱氨酸之间的反应，形成无毒的 S-亚硝基同型半胱氨酸。提高饮食精氨酸水平能增强该途径，因为精氨酸 可被一氧化氮合酶转化为NO。因此，保持同型半胱氨酸健康水平的一种 理想的饮食蛋白质应含有较多的精氨酸和较少的甲硫氨酸(和半胱氨 酸)，如在β-伴大豆球蛋白中所发现的。然而，以前未曾公开富含β-伴大 豆球蛋白的大豆蛋白质分离物用于该目的的应用。

新的蛋白质成分必须有利于食品的味道、结构和外观，以便为人所 接受。这些质量特征取决于蛋白质的结构及它们在其他食物成分(例如 钙离子、其他蛋白质)的存在下如何变化及加工条件(例如温度、 pH)。提高大豆的大豆球蛋白含量通常是为了提高大豆蛋白质成分的食 用功能。以前提高豆腐类大豆凝胶的产量和质量的尝试曾增加某些大豆 球蛋白或大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白之比(Wang，C-C和Chang，S.， 农业食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)43：3029-3034，1995； Yagasaki，K.等人，培育科学(Breeding Sci.)46：11-15，1996；Murphy， P.等人，食品技术51：86-88，110，1997)。几乎没有关于在其他食物模型 系统中，特别是在其他食物系统的典型条件下(例如，低pH、高盐、脂 肪、在低于72℃温度下的凝胶形成)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白性质的 信息。在pH7.0和无盐时，大豆球蛋白的发泡性质优于β-伴大豆球蛋白 (Yu，M.A.，农业食品化学杂志39：1563-1567，1991)。部分水解的大豆 球蛋白在中性pH下形成热诱导的凝胶，它比部分水解的β-伴大豆球蛋白 更类似于干酪凝乳(Kamata等人，Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 36：557-562，1989)。大豆球蛋白在沸腾温度下形成比大豆蛋白质分离物 有更高弹性模量的凝胶(Van Kleef，生物聚合物(Biopolymers)25：31- 59，1986)。在pH7.5-8.0时在大豆球蛋白与β-伴大豆球蛋白之间进行比 较(Shimada，K.和MatSuShita，S.，农业生物化学(Agric.Biol.Chem.) 44：637-641，1980；Utsumi，S.和Kinsella，食品科学杂志50：1278-1282， 1985；Nakamura等人，农业生物化学50：2429-2435，1986)。尽管观察 到β-伴大豆球蛋白具有优于大豆球蛋白的乳化性质，但没有比完整大豆蛋 白质分离物对照更好的乳化性质(Aoki等人，食品科学杂志45：534-546， 1980；Yao等人，JAOCS 67：974-979，1990)。富含β-伴大豆球蛋白和大 豆球蛋白的大豆蛋白质分离物的冻融性质未有报道，但大豆蛋白质冻融 不稳定性的问题已知(Abtahi，S.和Aminlarl，M.，农业食品化学杂志(J. Agric.Food Chem.)45：4768-4772，1997)。

缺乏大豆球蛋白的大豆种质-同胞系品种B2W(2)、B2G(2)和 B2G(1)-由日本Morioka的Tohoku大学校长Norihiko Kaizuma博士 赠与(10/7/96)。这些大豆系的突变用γ照射诱导(Odanaka，H.和N. Kaizuma，日本培育杂志39(增)430-431，1989；Kaizuma等人，日本 培育杂志40(增1)504-505，1990)。这些系缺乏所有的I组亚基，包括 A1aB2、A1bB1b、A2BB1a。丢失的多肽的合成证明由单隐性等位基因控制。 未观察到对生理方面如种子发育和发芽有不利影响。

Nagano，T.，农业食品化学杂志44：3484-3488讨论了高β-伴大豆球 蛋白分离物在pH7时的性质。Lehnhardt，W.F.和Orthoefer，F.T.，欧洲专 利号0072617，1982讨论了酶促水解的β-伴大豆球蛋白组分在85℃时的胶 凝性质和起泡性质。Kinney，A.等人，国际专利号WO 97/47731提出了用 转基因方法改变种子贮存蛋白的概念，但只进行并证明了消除β-伴大豆球 蛋白的尝试。

在设计商业可行的品种时也需考虑蛋白质及其他大豆成分的产量。 在大豆的总蛋白质含量与大豆球蛋白：β-伴大豆球蛋白比之间发现有正相 关，因此含有更多大豆球蛋白的大豆具有更高的蛋白质含量(Shui-Ho Cheng，1984博士论文，IL大学)。

发明概述

本发明涉及与商品大豆蛋白质成分相比具有改进的物理(例如稳定 性和胶凝)及生理(例如降胆固醇和甘油三酯)性质的高β-伴大豆球蛋 白组合物，及生产该高β-伴大豆球蛋白组合物的方法。本发明还涉及改 进的食品加工及食品生产方法。本发明也包括利用高β-伴大豆球蛋白组 合物作为不同食品的方法。

通常，本发明包括一种40％以上的蛋白质为β-伴大豆球蛋白 (BC)而不到10％的蛋白质为大豆球蛋白的组合物(高BC组合物)。 经酸沉淀法从伊利诺斯州生长的高BC大豆中分离的高BC组合物在分离 物中有超过24mg/g蛋白质，优选超过25mg/g蛋白质的半胱氨酸和甲硫氨 酸总和，这符合FAO.WHO对2-5岁儿童的要求。然而，由在波多黎各 生长的高BC大豆制备的高β-伴大豆球蛋白含较多的精氨酸(75mg/g蛋 白质)而含较少的甲硫氨酸(低于11mg/g蛋白质)。

一种生产本发明的高BC组合物的方法，包括除去大豆种子的外 壳，并调节种子适于制片。将经调整的种子制成薄片，并提取油。然 后优选地研磨大豆种子片，加入溶剂使pH为约7.0-10，以溶解蛋白 质。通过离心去除纤维生产提取物并中和该提取物。通过pH4.6左右 的酸化或超滤除去糖及其他低分子量溶质。该提取物在去除低分子量 溶质之前(hb)或在去除之后(ha)加热处理，以制造不同类型的高 BC产品。得到的中和产品是干燥的浆液。进一步设想，由高BC大豆 的新蛋白质组合物引起的有益性质也可用于完整的豆用途(例如快 餐、熟豆、印尼豆豉)，及全脂和脱脂大豆粉，和为面包房、牛奶场 (在用纤维素酶水解纤维成分之后)生产的大豆蛋白质浓缩物(例如 结构改进的)和肉食用途。本发明也包括用高β-伴大豆球蛋白组合物 作为不同食品的方法。

发明详述

为便于理解在本说明书和权利要求书中使用的几个术语，提供下列 定义：

β-伴大豆球蛋白：在此使用时，术语β-伴大豆球蛋白是指一种分子量 为150-220 kDa的三聚体。β-伴大豆球蛋白的三个主要亚基是α-prime (72 kDa)、α(68kDa)和β(52 kDa)。α-prime和α亚基含有两个共 价结合的碳水化合物部分，而β亚基含有一个。Utsumi等人(《食物蛋白 质及其用途》，Damodaran，S.和Paraf，A.编，Marcel Dekker，Inc.，NY， 1997)综述了β-伴大豆球蛋白及另一种主要贮存蛋白——大豆球蛋白的 结构与性质。

1组大豆球蛋白：在此使用时，术语1组大豆球蛋白是指分类为 A1aB1、A2B1a和A1bB2的大豆球蛋白亚基。2组大豆球蛋白是A5A4B3和A3B4 (Nielsen，N.C.等人，植物细胞(Plant Cell)1：313，1989)。“A”是指 酸性亚基，“B”指碱性亚基。1组亚基中的半胱氨酸和甲硫氨酸残基含 量高于2组亚基。

高β-伴大豆球蛋白大豆：在此使用时，高β-伴大豆球蛋白大豆(高 BC大豆)是指用实施例1所述分析方法测定，含有40％以上的蛋白质为β- 伴大豆球蛋白，少于10％的蛋白质为大豆球蛋白的大豆种子。

大豆蛋白质分离物(SPI)：在此使用时，大豆蛋白质分离物是由大 豆制成的喷雾干燥粉末，其在无水基础上含有不低于90％的蛋白质 (N×6.25)。

大豆蛋白质组合物：在此使用时，术语大豆蛋白质组合物是指含有 大豆蛋白质的人或动物的食物成分。实例包括豆粉、脱脂豆粉、喷雾干 燥的豆奶、豆腐、喷雾干燥的豆腐、大豆蛋白质浓缩物、结构改进的大 豆蛋白质浓缩物和水解的大豆蛋白质和大豆蛋白质分离物。

高β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物：在此使用时，高β-伴大豆球蛋 白大豆蛋白质分离物(BC-SPI)是指由高BC大豆种子制成的喷雾干燥的 粉末。用实施例1中的方法测定，BC-SPI中BC的含量大于分离物中蛋白 质的40％，BC-SPI中大豆球蛋白的含量低于分离物中蛋白质的10％。

高β-伴大豆球蛋白组合物：在此使用时，术语高β-伴大豆球蛋白组合 物，或高BC组合物是指成分中β-伴大豆球蛋白超过大豆蛋白质的40％， 而大豆球蛋白低于大豆蛋白质的10％的食物成分。人或动物食物成分的 实例包括豆粉、脱脂豆粉、喷雾干燥的豆奶、豆腐、喷雾干燥的豆腐、 大豆蛋白质浓缩物、结构改进的大豆蛋白质浓缩物和水解的大豆蛋白质 和大豆蛋白质分离物。

低β-伴大豆球蛋白大豆蛋白质分离物：在此使用时，低β-伴大豆球 蛋白大豆蛋白质分离物(低BC-SPI)是指由缺乏β-伴大豆球蛋白的α和 α-prime亚基的大豆制成的喷雾干燥粉末。SPI中有β-伴大豆球蛋白的β- 亚基(总蛋白质的12％)。

BC-SPI-酸-hb：在此使用时，BC-SPI-酸-hb是指经酸沉淀法分离的 高β-伴大豆球蛋白SPI，其在酸沉淀步骤之前接受加热处理。

BC-SPI-酸-ha：在此使用时，BC-SPI-酸-ha是指经酸沉淀法分离的 高β-伴大豆球蛋白SPI，其在酸沉淀步骤之后接受加热处理。

BC-SPI-UF-hb：在此使用时，BC-SPI-UF-hb是指经超滤和渗滤法 分离的高β-伴大豆球蛋白SPI，其在超滤步骤之前接受加热处理。

Cntrl-SPI：在此使用时，对照(Cntrl)大豆蛋白质分离物是指由 大豆混合物(Prospect、HP43和Harovinton)制成的SPI。Cntrl-SPI- 酸-ha是指由这些大豆制成的SPI，其经酸沉淀法分离，在酸沉淀步骤之 后接受加热处理。Cntrl-SPI-酸-hb是指由这些大豆制成的SPI，其经酸 沉淀法分离，在酸沉淀步骤之前接受加热处理。

72C或90C：在此使用时，当上述缩写之后为“72C”时(例如BC- SPI-酸-hb，72C)，则成分生产中的加热处理为72℃15秒钟。当上述 缩写之后为“90C”时，则成分生产中的加热处理为90℃20秒钟。

Hunter L值：在此使用时，术语“Hunter L值”是用Hunter Lab比 色计测定的白度的测定值。

Hunter B值：在此使用时，术语“Hunter B值”是用Hunter Lab比 色计测定的泛黄度的测定值。

氮溶解度指数(NSI)：在此使用时，术语“氮溶解度指数 (NSI)”是用AOCS，1989第4版的官方及暂行方法Ba 11-65对蛋白质 溶解度的测定值。本发明的大豆蛋白组合物在pH7.0-7.4时其氮溶解度指 数大于90％。

部分水解的：在此使用时，术语“部分水解的”意思是大豆蛋白质 被切割为较小的多肽，但主要不是分子量低于1000的氨基酸或肽。

乳化的肉食：在此使用时，术语“乳化的肉食”意思是其中脂肪分 散入液滴并由蛋白质网络稳定，具有柔软结构的产品，如法兰克福香肠 (热狗)和大腊肠(bologna)。

营养食物条：在此使用时，术语“营养食物条”意思是用来增强健 康的食物条。

口感：在此使用时，术语“口感”意思是物质在人口中的感觉如 何。

Com’l SPI：在此使用时，商品SPI(Com’l SPI)是指能从SPI制造 商处购买的SPI。在此使用时，Com’l SPI A、B、C、D和G分别为Supro 760、Supro 974、Supro 670、Supro 500E和Supro 710，购自Protein Technologies International，St.Louis，MO。这些分离物是为不同用途而 生产的。Supro 760被制造商的产品说明书推荐用于巴氏灭菌的、罐头灭 菌甑或UHT加工的饮料和冷冻甜食、调味剂和酸奶。Supro 940因乳化和 充气性质推荐作为卵蛋白替代物。Supro 670是一种部分水解的大豆蛋白 质分离物，推荐用于干饮料混合物、人造干酪和食物条。Supro 500E推 荐用于肉食用途，Supro 710是一种水解的大豆蛋白质分离物，推荐用于 需要冻融稳定性的液体咖啡增白剂、冷冻甜食、调味剂、酸奶和人造干 酪。在此使用时，Com’l SPI E和F分别是ProFam 974和Ardex DHV，其 购自Archer Daniel Medland，Decatur，IL。ProFam 974推荐用于代乳 品、加工的肉食、乳化的肉食和香肠类肉食。

BBI：在此使用时，术语Bowman Birk蛋白质酶抑制剂(BBI)是指 在许多植物种子中发现的相关蛋白质家族，其分子量为7000-8000，可抑 制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。小抑制剂(70-80个氨基酸，含7个二硫键) 是高度热稳定的；例如，在pH6.5和80℃下加热1小时不能引起大的构象 改变(Wu，Y.V.和Sessa，D.J.，农业食品化学杂志42：2136-2138， 1994)。

KTI：在此使用时，术语Kuintz胰蛋白酶抑制剂(KTI)是指一种由 181个氨基酸的单多肽链组成，分子量为21500的蛋白质。它含有两个甲 硫氨酸和4个半胱氨酸残基(Laskowski和Kato，生物化学年述(Annual Review of Biology)49：593-626，1980)。

本发明揭示了高BC组合物的生理及食物功能益处。本发明的高BC 组合物含有高于预期水平的必需氨基酸。本发明的高BC组合物具有改善 的食品加工及产品性质。

评估含脂肪食物中的蛋白质值

含脂肪食品如法兰克福香肠、加工干酪、色拉调料、酱汁和营养饮 料依赖于乳化剂来帮助在匀浆过程中形成极小的脂肪滴，然后稳定液滴 防止聚结(液滴的融合)和防止在贮存中乳状液分层(漂浮于顶层 上)。是特别好的乳化剂之蛋白质具有高度韧性的结构，这使蛋白质在 油-水界面处具有高亲和力和吸收，并通过蛋白质-蛋白质相互作用在液滴 表面形成机械强度高和粘弹性和高度水合的薄膜。在某些产品中，蛋白 质加热或酶促水解后蛋白质稳定的脂肪液滴的受控聚集，对于形成可保 持水分并为食品提供结构的胶体结构是重要的。动物蛋白质如牛奶中的 酪蛋白、蛋黄中的脂蛋白、肉中的肌球蛋白和蛋清中的白蛋白是具有稳 定及胶凝性质的良好乳化剂(Bringe，N.，于《食物蛋白质与脂类》， Domodaran，S.编，Plenum Press，NY，161-181，1997)。本发明的机会在 于用便宜且有益健康的大豆蛋白质成分代替动物蛋白质。

通过测定在脂肪颗粒分解为小液滴的条件下形成的蛋白质稳定脂肪 液滴的直径，能确定新蛋白质来源作为食品乳化剂代替动物蛋白质的潜 力。一种良好的蛋白质乳化剂被快速吸附于新油-水界面上，并稳定液滴 免于聚结，产生具有最小中值颗粒直径的乳剂。较差的乳化蛋白质不能 覆盖所有新油-水界面，并具有不能排斥(阻止聚集)其他蛋白质覆盖液 滴的低水合结构。较差的蛋白质乳化剂导致通过液滴-液滴聚集形成较大 颗粒，大颗粒随离开悬液底部清液层的时间而在空间中上升。大颗粒聚 集物在口中也感觉为白垩或砂质结构。小颗粒在口中不能感觉为单个颗 粒，而产生光滑或奶油样结构(Bringe，N.和Clark，D.，于《21世纪食品 工业科学》，Yalpani，M.编，ATL出版社，51-68，1993)。蛋白质覆盖 的油滴中值直径的测定是在不同条件下蛋白质对蛋白质-蛋白质聚集稳定 性的敏感测定，也与在不含脂肪时蛋白质的稳定性或聚集特性有关。为 了测定新蛋白质成分代替其他成分的能力，人们能在与不同食物有关的 不同条件下制备含这些成分的乳剂，并测定形成的液滴的大小和贮存后 形成的清液的量(Bringe，N.等人，食品科学杂志61：1-6，1996)。本研 究中使用的蛋白质稳定乳剂的中值颗粒直径的相对差异在贮存10天后无 显著改变。

纯化的β-伴大豆球蛋白(BC)的有益的功能性质

在高BC大豆用于检测之前，将纯化的BC的性质与模型食物乳剂中 的大豆球蛋白和商品分离物相比较。在本发明中，我们发现，当在类似 于食品(如营养饮料)中所见水平的离子钠(或钾)或离子钙存在下制 备乳剂时，BC形成比对照和商品大豆蛋白质成分更小的乳剂颗粒(见实 施例2)。BC的良好乳化性质对于使饮料乳剂免于分离(乳状液分层)是 重要的。

本发明的其他方面包括以下发现：当加热处理蛋白质稳定的乳剂或 如实施例2所述冻融乳剂时，BC的性能好于对照和商品大豆蛋白质成分。 这一性质在如冷冻甜食和液体冷冻咖啡增白剂的用途中是有价值的，其 中光滑均匀的产品结构和外观取决于蛋白质对冻融诱导的蛋白质聚集的 稳定性。

本发明的另一实施方案是，如实施例2、表3所述，BC稳定的乳剂的 热诱导的凝胶或粘性形成性质在接近pH5.6时最佳，并且在盐的存在下明 显高于对照和其他大豆蛋白质成分。现在在本发明中能设想并设计由 pH5.4-5.8和低盐浓度(0.2-0.6％NaCl或KCl)的BC稳定的乳剂制备食物 凝胶。在大豆蛋白质成分用作胶凝剂时，胶凝性质处于乳化肉食的pH范 围内。素食性肉食类似产品不限于高盐制剂，与在低盐条件下发现的β-伴 大豆球蛋白的胶凝性质有关。

大豆蛋白质组合物

本发明涉及高β-伴大豆球蛋白组合物、肉食类似物、干酪类似物、 饮料和动物饲料。特定大豆蛋白质组合物的选择部分取决于预期的最终 用途，及大豆的其他成分是否是希望的(例如，纤维、异黄酮、寡糖、 色素、酶)。例如，大豆蛋白粉的常见用途是有机食物条和干酪中的焙 烤食品、喷雾干燥的豆奶和喷雾干燥的豆腐，肉食产品中的结构改进的 大豆蛋白质浓缩物，和饮料及干酪产品中的大豆蛋白质分离物。也为不 同用途而改变组合物中蛋白质的状态。例如，为生产某些乳化的肉食， 变性的大豆蛋白质是希望的，对于饮料而言高度可溶的蛋白质是希望 的，而对于干酪，部分水解的蛋白质是希望的。与蛋白质组合物制造和 在食品中的用途有关的合适的步骤、材料和方法见于Liu，KeShun，《大 豆-化学、技术与应用》(Soybeans-Chemistry，Technology and Utilization)，Chapman&Hall，NY，(1997)；Erickson，D.R.，编，《大 豆加工与应用实践手册》(Practical Handbook of Soybean Processing and Utiization)，AOCS Press，Champaign，IL and United Soybean Board，St.Louis，MO，(1995)；Applewhite，T.H.(编)《世界植物蛋白质 在人类食品和动物饲料中的应用大会论文集》(Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs)，美国油类化学家协会(American Oil Chemists′ Society)，Champaign，IL(1989)；《大豆蛋白质产品——特征、营养方 面和应用》(Soy Protein Products-Characteristics，Nutritional Aspects and Utilization)，大豆蛋白质委员会(Soy Protein Council)， Washington D.C.(1987)；Hua，Y.F.等人，J.A.O.C.S.73：1067-1070 (1996)；此处所述的。

下面公开的方法涉及大豆蛋白质分离物的用途，然而，本领域的技 术人员应当知道在此处所述食品的生产中如何应用其他类型的大豆蛋白 质组合物(如定义中所述)。

BC-SPI

得益于以上申请中BC的性质，本发明研究了一种制备富含BC而缺 乏大豆球蛋白的组合物的经济的方法。使用含有低于10％的大豆球蛋白 和高于40％的BC的高BC大豆(实施例4，表7)，使得能制备BC-SPI而 在加工过程中无需去除大豆球蛋白。本发明的BC-SPI含有50-62％的 BC，而商品SPI含26-29％(实施例4，表6)。本发明的BC-SPI也含有约 3-6％的大豆球蛋白，而商品SPI含40-50％(实施例4，表6)。

如实施例3所述，利用酸沉淀法和超滤与渗滤法的组合(Lawhon， J.，美国专利号4,420,425；Koseoglu，S.和Lusas，E.，于《世界植物蛋白 质在人类食品和动物饲料中的应用大会论文集》，Applewhite，T.编，美国 油类化学家协会，Champaign，IL，528-547(1989))将高BC大豆种子加工 为BC-SPI。低BC种子(无α或α-prime亚基；BC的β-亚基为总蛋白质的 12％)也加工成大豆蛋白质分离物，用于在仓鼠饲养试验中对比。

BC-SPI的溶解度和颜色

当蛋白质间的静电和/或水合排斥大于疏水作用的驱动力时，蛋白质 在水中是可溶的(Kinsella等人，《乳品化学的发展》-4，Fox，P.F.编， Elsevier Applied Science，伦敦，55-95，1989)。当有太多的疏水基团暴 露于水，使水在这些基团周围成为更具结构的(氢键键合)且丢失熵 时，蛋白质分子聚集形成胶态和大胶态颗粒。蛋白质单体聚集的主要驱 动力是水的熵的提高，这在在这些相互作用位点中蛋白质表面的主要疏 水区域缔合且离子基团配对时发生(Bringe，N.A.和Kinsella，J.E.，《食 品蛋白质发展》，第5卷，Hudson，B.J.F.编，Elsevier Applied Science Publishers LTD，Baking，英格兰，159-194，1987)。当加热(70-95 ℃)球状蛋白质(如大豆蛋白质)时，蛋白质逐渐展开，暴露更多的疏 水氨基酸。这种变性导致更大量的聚集(Hayakawa，S.和Nakai，S.，食品 科学杂志50：486-491，1985)。也能用其他处理如高压和醇变性蛋白质。 对于特定处理，变性和聚集的程度取决于影响蛋白质结构(例如净负电 荷和水合)的条件(例如pH)。颗粒大小和可溶性蛋白质的测定作为蛋 白质变性的测定。然而，变性和聚集的蛋白质的溶解度不同。例如，利 用加热和机械作用将强结合的蛋白质分子转化为松散作用的集合物，人 们能部分再溶解在大豆蛋白质浓缩物生产过程中产生的变性和聚集的蛋 白质(Hua，Y.F.等人，JAOCS 73：1067-1070)。

在用低剪切混合法分散粉末(不是工业均化器)并希望乳品饮料为 白色时，高度可溶的和白色的蛋白质组合物对于干饮料混合物用途是有 价值的。

在本发明的一个实施方案中，BC-SPI-UF-hb和BC-SPI-酸-ha的溶解 度、颗粒大小颁和颜色大大好于BC-SPI-酸-hb和商品分离物(实施例 4)。只有BC-SPI-UF-hb具有大于86.5的白度(L)值和低于10的泛黄度 (b)值。只有BC-SPI-酸-ha在水中分散10分钟后具有低于10％的颗粒大 于10微米的颗粒体积。

BC-SPI中少部分大集合物(＞10微米)可降低食品用途中不满意的 砂粒样口感。BC-SPI的这种高度可溶性也与以下所述的良好功能性质 (例如，乳化性质、对冻融过程中蛋白质-蛋白质聚集反应的稳定性)有 关。

接近pH6.7的BC-SPI的稳定性，饮料模型

酪蛋白钠在饮料中对于其形成和稳定小脂肪滴的能力及其对在钙存 在下蛋白质-蛋白质聚集反应、低pH(例如5.5-6.5)、冷冻和高温 (＞75C)的耐受性有价值。在其结构中具有水合的和带负电的区域之酪 蛋白成分中κ-酪蛋白的存在对酪蛋白的稳定性起很大作用(Bringe，N.A. 和Kinsella，J.E.，1991，乳制品研究杂志(J.Dairy Res.)58：195- 209)。少数大豆蛋白质对大豆蛋白质成分的乳化和稳定性质起主要作用 也是可能的。经过对两种蛋白质复合物的表观等电点pH测定(分别为4.8 和6.4)，β-伴大豆球蛋白的净负电荷远低于大豆球蛋白(Thanh，V.H.和 Shibasaki，K.，农业食品化学杂志24：1117，1976；Brooks，J.R.和Morr， C.V.，JAOCS 62：1347，1985)。因此，β-伴大豆球蛋白具有模拟酪蛋白 钠性质的潜能，特别是β-伴大豆球蛋白的α-亚基，其具有β-伴大豆球蛋白 的最低的等电点pH和高度水合的N端区域(Morita，S.等人，生物科学、 生物技术与生物化学60：1870-1871，1996)。

将BC-SPI的性质与商品大豆蛋白质分离物和模型饮料系统中的酪蛋 白钠比较，以确定巴氏灭菌和喷雾干燥的大豆蛋白质成分中β-伴大豆球蛋 白组合物的增加是否有利。BC-SPI的表现等同于或大大好于对照和商品 SPI，这取决于BC-SPI和条件(实施例6)。发现BC-SPI-酸-ha有比对照 和商品SPI更高的，对钙离子诱导的聚集、pH(6.5)诱导的聚集和加热 诱导的聚集的稳定性(实施例6)。根据乳剂颗粒直径确定的BC-SPI-酸- ha对聚集的稳定性，类似于纯化的BC所证明的稳定性(实施例2)。BC- SPI-酸-ha蛋白质的稳定性类似于酪蛋白钠，并且可用于饮料用途如营养 饮料、婴儿乳品和豆奶。因此本发明的一个方面是饮料的研制和BC-SPI 的使用以获得良好结构。

本发明也包括如下发现：如实施例6所述，本发明的BC-SPI具有高 度的冻融稳定性，其好于完全和部分水解的商品SPI。Cntrl-SPI-酸-ha成 分也有良好的冻融稳定性。因此本发明的一个方面是如实施例3C所述用 来制备高度可溶的BC-SPI和Cntrl-SPI组合物的方法。

当形成过程中包括游离钙离子(4mM)时(中值颗粒直径＞100微 米)，BC-SPI-酸-hb的冻融稳定性丧失。用BC-SPI-酸-ha和Cntrl-SPI-酸 -ha制备的乳剂显示更好的稳定性(在4mM钙和70mM NaCl存在下冻融 处理后，乳剂的中值直径为10微米)。因此本发明的一个方面是高度可 溶的BC组合物如BC-SPI-酸-ha达到良好冻融稳定性的应用。

pH5.8的BC-SPI的增稠性质，一种乳化的肉食模型

在生产过程中一般在90-154℃下加热处理商品大豆蛋白质分离物至 多20秒钟，以灭菌该分离物并变性蛋白质。在最大食品加工温度低于天 然大豆蛋白质的变性温度时，加热处理可促进食品中大豆蛋白质分离物 的胶凝。为了在乳化肉食的pH、盐和温度条件下测试BC-SPI胶凝性质的 用途，我们比较了有及无高度变性蛋白质(90℃)时BC-SPI的胶凝性质 与商品分离物和蛋清的胶凝性质。蛋清是一种在大量食品包括肉食如鱼 浆(蟹腿类似物)中使用的出色的胶凝剂。然而，象肉类蛋白质一样， 蛋清较大豆蛋白质昂贵。本发明的一个意外发现是，用BC-SPI制备的乳 剂的粘度比用商品SPI制备的乳剂高1.7-3.0倍，并且最接近于蛋清的表 现(实施例7，表14)。此外，与商品分离物稳定的乳剂相比，在BC- SPI稳定的乳剂中，蛋白质包被的脂肪滴表面之间的蛋白质-蛋白质相互 作用形成的含水结构更易于破裂，这是根据随剪切时间延长粘度有较大 降低而确定的(实施例7，表14)。当在口中发生这种破裂时，它被感 觉为一种更希望的结构，如更光滑、多汁和较嫩。因此，用BC-SPI能优 化在乳化肉食系统条件下大豆蛋白质分离物的胶凝(及有关的脂肪和水 结合)性质。

本发明涉及一种制备含有大豆蛋白质的乳化肉食的方法，其包括： a)预水合本发明的之大豆蛋白质组合物；b)加入磨碎的肉源、盐、磷 酸盐、熟化剂，并形成均匀的肉食糊；c)加入抗坏血酸盐或异抗坏血 酸盐，并研磨未加工的肉食糊；d)共挤出或填塞该混合物于肠衣肉； 和e)热加工该混合物。

在本发明的一个实施方案中，所述方法其进一步包括热加工肉食 糊，方法是通过在60℃下保持30％的相对湿度1小时，然后在71℃下保 持35％的相对湿度2.5小时，然后在82℃下制成混合物，直到肉食温度为 70℃。在本发明的一个实施方案中，所述方法中磨是具有3.0和1.4mm磨 盘的胶体磨。在本发明的一个实施方案中，所述方法中肠衣是22mm纤 维素肠衣。在本发明的一个实施方案中，所述方法中步骤a)的大豆蛋 白质组合物包括在pH7.0-7.4时氮溶解度指数至少90％的组合物；pH7.0- 7.4时NSI低于70％且组合物超过20％的颗粒体积是由直径大于10微米 的颗粒导致的组合物；或其任一组合。

本发明还涉及一种通过上述方法生产的乳化肉食。

本发明还涉及一种制备含有大豆的面糊包裹的肉食之方法，其包 括：a)磨碎肉食；b)用水预水合结构改进的大豆蛋白质浓缩物；c) 混合脂肪和水合的结构改进的大豆蛋白质浓缩物，直到均匀；d)加入 肉食、磷酸钠和盐；e)以配方的约1-6％的量加入未结构改进的大豆蛋 白质组合物和水；和f)用面糊、面食包裹肉食，并烹制，其中，未结构 改进的大豆蛋白质组合物是本发明的大豆蛋白质组合物。在本发明的一 个实施方案中，所述方法中结构改进的大豆蛋白质浓缩物由本发明的大 豆蛋白质组合物制成。在本发明的一个实施方案中，所述方法中未结构 改进的大豆蛋白质组合物在pH7.0-7.4时有至少90％的氮溶解度指数 (NSI)。

变性高BC组合物形成胶体的积极作用的一种解释如下：在约pH7.0 和90℃时以稀释浓度制备高度变性的高BC组合物，此时发生蛋白质变 性而暴露反应性位点，但变性蛋白质的聚集受到限制。当变性蛋白质暴 露于为形成精细胶体/聚集结构而优化的条件时，产生最高粘度(或硬 度，或有关的水和脂肪结合)。当预变性BC-SPI时，对于BC这种胶凝 条件接近pH5.6-6.0，变性BC的胶凝发生较快且发生于较低的温度下 (于或低于天然BC的变性温度)。测试BC-SPI以与高度变性的BC-SPI 对比。用未处理的BC-SPI制备的样品粘度与用高度变性的BC-SPI制备 的样品粘度的差，确定了通过高热处理预变性大豆蛋白质所增加的值。 高度变性的正常SPI所增加的值较低，因为大豆球蛋白与BC形成复合 物，改变了随后的胶体形成反应的性质和数量(例如，最佳胶凝条件转 移为不同pH值，在BC上有较少的未聚集位点可用于胶体形成)。

变性的高BC组合物的良好乳化和胶凝性质需要显著量的剪切，以 分离并水合蛋白质聚集物。某些肉食或肉食类似物的加工包括更少的剪 切。本发明包括如下发现：在低剪切条件下(20秒超声处理而不是60 秒)，高度可溶的BC-SPI-酸-ha稳定较小的脂肪滴，并在加热处理乳剂 后形成比商品大豆蛋白质分离物更高的粘度(实施例7，表15)。因 此，利用更加高度可溶(较少变性)的BC-SPI-酸-ha能优化产品(如面糊 包裹的肉片)中SPI的乳化和结合性质。用Cntrl-SPI-酸-ha成分产生的乳 剂也在加热处理后产生比商品成分更高的粘度，表明如实施例3C所述用来 制备高度可溶性BC-SPI和Cntrl-SPI成分的该方法是本发明的一个方面。

在水相0.5％NaCl时BC-SPI-酸-ha的增稠或胶凝性质，素食性肉及其他酸 性胶体的一种模型

发现在接近pH5.6和低NaCl(水相中0.5％)时，本发明的BC-SPI- 酸-ha具有比商品分离物和对照SPI更高的胶凝性质。对于加热到70℃或 80℃的BC-SPI-酸-ha悬液，这些发现(实施例7)重复了在90℃加热的β- 伴大豆球蛋白具有良好的增稠性质这一发现(实施例2，表3)。因此为 了在pH5.2-5.6时制备素食性肉类似物(例如热狗)及其他酸性胶体(例 如酸奶类似物，烘烤的馅)可考虑利用高度可溶性高BC组合物如BC- SPI-酸-ha的胶凝或增稠性质。

BC大豆和BC-SPI的氨基酸组成

本发明的高BC大豆惊人地富含蛋白质和甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨 酸和精氨酸含量(见实施例7)。这些氨基酸在大豆和大豆粉中(特别是 对于婴幼动物和人类)通常是有限(DeLumer，B.等人，食品技术(Food Technol.)51：67-70，1997)。因此本发明的一个方面包括利用高BC大豆 制造富含必需氨基酸用于动物饲料的(全脂或脱脂的)大豆粉，限制加 强饲养限量所需的合成氨基酸的量。为了实现这些氨基酸水平的益处， 设想需要其他种子改变或与富含色氨酸的蛋白质来源混合，以防止色氨 酸浓度成为限制因素。

用实施例3所述的方法制备的高BC大豆蛋白质组合物在必需氨基酸 组成方面类似于商品大豆蛋白质分离物，或如示富含含硫氨基酸(见实 施例10)。因此高BC组合物对于多种食品结构和生理益处的用途不必受 必需氨基酸的不平衡所限制。可能的解释是，高BC大豆也富含较小的大 豆蛋白质以部分补偿大豆球蛋白的损失，这些蛋白质保留于高BC组合物 中，

BC-SPI的降胆固醇和甘油三酯性质

由包含或不包含BC的α和α-prime亚基的大豆制备大豆蛋白质分离 物。用仓鼠和公开的方法(Terpastra，A.等人，营养学杂志121：944- 947，1991；Potter，S.等人，营养学杂志126：2007-2011；Balmir，F.等 人，营养学杂志126：3046-3053，1996)检测这些BC-SPI和由正常大豆制 备的对照分离物的降胆固醇和甘油三酯性质。

喂食基于BC-SPI的食物6周的仓鼠比喂食Cntrl-SPI、Com’l-SPI A或 酪蛋白钠的仓鼠有明显降低的总胆固醇和甘油三酯浓度(实施例5； P＜0.05)。与酪蛋白钠组相比，BC-SPI饮食的血清胆固醇和甘油三酯的 降低分别为28％和73％。胆固醇的降低主要是由于LDL和VLDL胆固醇 组分的明显降低(P＜0.05)。喂食基于BC-SPI的食物的仓鼠也具有比喂 食低BC-SPI食物的仓鼠更低的总血清胆固醇和甘油三酯浓度。BC-SPI与 低BC-SPI组之间总胆固醇浓度的差异无显著性不同(P＝0.057)。两组甘 油三酯浓度的差异显著不同(P＜0.05)。与其他含大豆分离物食物和酪 蛋白食物相比，在BC-SPI组中食物摄取平均降低16％(P＜0.02)。其他 饮食之间的食物摄取无差异。

本研究的结果提供了关于SPI中负责降胆固醇和甘油三酯性质的活性 组合物的新信息。不需要BC的α和α-prime亚基和更高水平的异黄酮。低 BC-SPI中BC的α和α-prime亚基的缺乏不能使该分离物具有较差的降胆 固醇或甘油三酯性质。低BC-SPI含有比Com’l SPI A或Cntrl-SPI低2.8倍 的异黄酮，但引起相同或更大的胆固醇和甘油三酯降低。据报道大豆球 蛋白的A3亚基在胃蛋白酶胰消化后产生胆汁酸结合蛋白质(Iwami等 人，Tanpakushitsu Kenkyukai kaishi 15：74-80，1994)。然而，BC-SPI 中较少量的A3蛋白质(实施例4，表6)不能限制SPI的降胆固醇和甘油三 酯性质。

与SPI的胰蛋白酶抑制剂活性相关的成分可能在决定SPI的降胆固醇 和甘油三酯性质方面是重要的。食用SPI的仓鼠的总胆固醇和甘油三酯含 量(实施例5，表10)与SPI的胰蛋白酶抑制剂活性(实施例4，表6)之 间的线性回归证明了这一点，其R方值分别为0.98和0.88。该结果的一种 可能的解释是，较低的食物摄取自身即解释了在BC-SPI组中观察到的相 比其他SPI组明显降低的脂类水平，它是通过降低仓鼠消耗的饮食脂肪和 胆固醇的量。降低BC-SPI的食物摄取的机制可能是，由高胰蛋白酶抑制 剂活性引起的消化较差的蛋白质延迟了养分吸收，并导致降低的食物摄 取(Schneeman，B.O.，美国临床营养学杂志(Am.J.Clin.Nutr.)42 (增5)：966-972，1985)。此外，也可以是胰蛋白酶抑制剂通过如在 Zucker大鼠中发现的对胰蛋白酶的直接抑制(McLaughlin CL等人，生 理学行为(Physiol.Behav.)31：487-491，1983)，引起过饱因子缩胆囊素 (CCK)的分泌增加。另外，具有较高胰蛋白酶抑制剂活性的SPI可被胰 蛋白酶消化为较低程度，产生较高浓度的大豆蛋白质片段，它们能与肠 中的胆汁酸和胆固醇物理地相互作用。与胆汁酸的相互作用降低了胆汁 酸和结合胆固醇的吸收，并提高了粪便中胆固醇、胆固醇代谢物、中性 类固醇和胆汁酸的排泄。胆固醇排泄的这种提高可能上调肝中的LDLapo B/E受体活性，而从血液中去除胆固醇，并提高胆固醇向胆汁酸合成途径 的供应(Beynen，A.C.，营养科学与维生素学杂志36(增)：S387-S93， 1990)。然而，对于消耗含大豆分离物食物的所有实验组，总中性固醇 排泄(胆固醇和粪甾醇，主要的肠胆固醇代谢物)均彼此类似，并且比 酪蛋白组的中性固醇排泄高25％(实施例5，表10)。类似地，对于食用 含所有大豆分离物食物的仓鼠，胆汁酸的粪便排泄比酪蛋白饮食组高5 倍，但在不同含大豆分离物的食物之间胆汁酸排泄无差异。另外，在喂 食含大豆分离物的食物的仓鼠中，肝胆固醇浓度比酪蛋白组平均降低 39％，大豆组之间的肝胆固醇降低无显著性差异。在喂食含大豆分离物 食物的仓鼠中，粪便胆汁酸排泄和肝胆固醇浓度均与血清胆固醇水平无 关。

尽管不同大豆蛋白质分离物之间脂类降低表观机制有相似性，但BC- SPI具有明显优于Com’l SPI A的降胆固醇和甘油三酯性质。BC-SPI引起 的比Com’l SPI A更有效的血清胆固醇降低不能用粪便胆汁酸或总中性类 固醇排泄的提高来解释，因为BC-SPI和Com’l SPI A在这些参数上有类似 的提高(相对于酪蛋白)(不显著)。BC-SPI组中胆固醇的粪便浓度相 比Com’l SPI A组提高54％(p＜0.05)，而粪甾醇降低20％，表明在BC- SPI组中胆固醇的分解降低。尚不清楚BC-SPI单独引起的粪便胆固醇代谢 的这种改变是否能完全说明BC-SPI和Com’l SPI A实验组之间血清胆固 醇程度的差异(与酪蛋白组相比分别降低28％和15％)。因此，BC-SPI应 有其他的特殊性质可解释更有效的降胆固醇和甘油三酯性质。

BC-SPI有更高的胰蛋白酶抑制剂活性，因为高BC大豆富含 Bowman Birk抑制剂(BBI)，并且在BC-SPI中保留有更高水平的这种 蛋白酶抑制剂(实施例4，表6和7)。SPI中BBI的含量与血清脂类含量之间 有相关性，因此也可能BBI含量，而不是胰蛋白酶抑制剂活性，是影响血清 脂类水平的主要因素。BBI是一种醇溶性蛋白质，其从大豆中的提取能部分 解释为什么其他人发现醇抽提的大豆蛋白质不能介导对脂类参数的作用 (Kirk等人，营养学杂志128：954-959，1998；Anthony，M.S.等人，营养学 杂志126：43-50，1996)。Sugano等人(营养学杂志120：977-985，1990)提 出的另一种解释是，醇抽提改变了大豆蛋白质的结构，因此未消化的片段不 再与胆汁酸结合，而引起胆固醇的排泄。本发明的一个方面是高BC大豆和 来源于高BC大豆的蛋白质成分的应用，以及BBI与作为营养添加剂的大豆 贮存蛋白一起在保持健康(低)胆固醇和甘油三酯水平中的应用。

在如婴儿乳品等不希望有蛋白质酶抑制的用途中，本发明设想人们 能用大豆加工技术或遗传工程技术除去抑制剂和/或其他抑制剂活性。

本发明还涉及一种用于降低人体中血清胆固醇和甘油三酯的营养产 品，其包含本发明之大豆蛋白质组合物。在本发明的一个实施方案中， 该产品是进一步含有蔗糖、碳酸钙、香料、盐、树胶和维生素的液体饮 料或干饮料混合物。在本发明的一个实施方案中，该产品是进一步含有 盐、磷酸盐和香料的肉食类似物。在本发明的一个实施方案中，该产品 是进一步含有颜料和香料的碎肉。在本发明的一个实施方案中，树胶选 自角叉藻聚糖、黄原胶、瓜尔豆胶和其任一组合。

BC-SPI作为抗癌BBI、抗氧化肽和免疫激活肽的来源

Bowman Birk抑制剂(BBI)可阻止或降低在培养细胞及实验动物 模型中诱导的肿瘤的多种类型的恶性转化(Kennedy，A.，营养学杂志 125：733S-743S，1995)。因此，鉴定含有显著水平的活性BBI、人们可 食用的、基于大豆的食物是有意义的(Miyagi，Y.，营养科学与维生素 学杂志43：575-580，1997；Billings，P.C.，营养与癌症(Nutr.Cancer) 14：85-93，1990)。本发明的高BC组合物中的高BBI含量现在提供了一种 富含BBI材料的经济的来源，用于提高基于大豆的食物中的BBI组分，降低 消费BBI作为添加剂或药物中分离成分的需要。由高BC大豆制备的高BC组 合物如BC-SPI(实施例4)在本发明中设想用于提高BBI的饮食摄取，以 保持健康(非癌)的组织。本发明的一个方面是，利用超滤和渗滤制备 SPI能富集分离物的BBI含量(实施例4，表6)。这与通过在pH9时超滤 制备的对照相反，其中BBI不保留于SPI中(实施例4，表6)。补充甲硫 氨酸和硫酸盐(酯)也能提高培养的大豆子叶中BBI的含量(Biermann， B.J.等人，农业食品化学杂志46：2858-2862，1998)。其他技术的目标是 大豆中BBI的降低(Beach，L.等人，国际专利号WO 95/27068，1995)。

评价大豆蛋白质消化物中肽的有益健康性质的研究表明，β-伴大豆 球蛋白是一种抗氧化剂(Chen等人，农业食品化学杂志44：2619-2623， 1996)和免疫激活肽(Tanaka，M.等人，Nogei Kagaku Zasshi 68：341， 1994)的来源。发现抗氧化剂(LLPH)和免疫激活 (MITLAIPVNKPGR)肽只在β-伴大豆球蛋白中发现。因此，设想本发 明的高BC组合物可为保持健康提供这些有益肽的丰富饮食来源。

用于加工干酪用途的BC-SPI

在本发明的加工干酪用途中，用蛋白酶处理的BC-SPI生产断裂的弹 性加工干酪或易涂抹的干酪。酪蛋白与大豆蛋白质的结构之间有几点不 同。一个主要的不同是，主要的酪蛋白(α-s1-和β-酪蛋白)缺乏半胱氨 酸，而5个大豆球蛋白亚基均含有6-8个半胱氨酸，β-伴大豆球蛋白亚基含 有0或1个半胱氨酸(Utsumi等人，《食品蛋白质及其用途》Damodaran， S.和Paraf，A.编，Marcel Dekker，Inc.，1997)。β-伴大豆球蛋白在此方 面比大豆球蛋白更类似于酪蛋白，因此在缺乏大豆球蛋白的干酪中可能 有较少的由硫基团引起的缺陷(例如基于硫的香料、保水并产生粉状结 构的二硫键连接的蛋白质聚集物)。

酪蛋白与大豆蛋白质之间的另一个主要不同是酪蛋白是磷酸化的。 酪蛋白的磷酸基团有两个作用。在自然干酪中的第一个作用是在加入特 异酶切κ-酪蛋白的凝乳酶后生成在钙的存在下不可溶的酪蛋白。第二个作 用是在用细菌培养物酸化并除去水后(乳清)再溶解或水合酪蛋白。在 较低pH时，钙从磷蛋白质中释放，水合磷酸基团限制了蛋白质-蛋白质相 互作用。在加工干酪中，不必降低pH来溶解酪蛋白，因为可加入多种可 螯合钙离子的磷酸盐。在pH5.1-6.0和高食品生产温度下酪蛋白-酪蛋白相 互作用的限制性质降低了蛋白质稳定的水包油乳剂的水结合，因此降低 了其粘度，并使酪蛋白能流动，这由干酪的熔化和延伸性质所证明。溶 解的酪蛋白也在加工干酪中起乳化剂的关键作用，这防止了烹饪过程中 脂肪的分离。

β-伴大豆球蛋白是一种含有共价结合的碳水化合物的糖蛋白。在干 酪的pH时保持水合的这些碳水化合物限制了BC蛋白质之间的蛋白质-蛋 白质相互作用。用酶如Alacalase(Novo Nordisk)部分水解BC，能进一 步提高BC蛋白质在干酪的pH时的溶解度，蛋白质结构和性质的这种改变 导致由BC-SPI制备的加工干酪类似物的熔化性质改善(干酪蛋白质的 30％)(实施例11)。部分水解也能改善含有正常SPI的加工干酪类似物 的熔化性质(Kim，S.等人，JAOCS 69：755-759)。从高β-伴大豆球蛋白 组合物中去除其他富含半胱氨酸的蛋白质也应能提高加工干酪中水解BC 的性质。

BC-SPI也可用一种称为Flavourzyme(Novo Nordisk)的酶水解。 该产品(干酪蛋白质的30％)与酶凝酪素一起应用可引起加工干酪类似 物结构的最明显改变(实施例11)。这种干酪外观光滑，极易涂抹，质 地光滑，类似于干酪涂抹食品或奶油干酪。这种干酪只有轻微的大豆香 味。这种干酪的良好味道部分是用来制造干酪的高BC组合物中所存在的 少量乙醛的结果。BC-SPI-酸-ha 72C和BC-SPI-酸-ha 90C中硫代巴比妥 酸反应性物质的组合物分别为0.522和0.688mg丙二醛/kg。它们有类似于 或低于我们所测试的商品SPI的值(例如，Com’l SPI E有0.771mg/g的 TBA值)。TBA试验由Ralston Analytical Lacoratories，St.Louis，MO按 Yu，T.C.和Sinhuber，R.O.，JAOAC 44：256-258，1967的方法进行。本发明 的一个方面是如下发现：酶处理的BC-SPI的应用能用来生产具有良好味 道，含有至少占蛋白质30％的大豆蛋白质，和低于48％的水分的可涂抹 干酪产品。

在本发明中，进一步设想BC的部分水解对于生产基于大豆的独特食 物结构是有价值的，因为能特异地对BC蛋白质半切割，形成30kDa片段 (Kawai等人，生物科学、生物技术与生物化学61：794-799，1997)。

用于同型半胱氨酸的低甲硫氨酸、高精氨酸蛋白质

来源于饮食蛋白质的甲硫氨酸作为含硫氨基酸包括同型半胱氨酸生物 合成的主要来源之一。同型半胱氨酸是心血管疾病的主要危险因素。因 此，长期消耗低甲硫氨酸饮食将降低或至少维持同型半胱氨酸的血浆水 平。

另一方面，精氨酸是一氧化氮合酶的天然底物，该酶将精氨酸转化 为胍氨酸和一氧化氮(NO)。同型半胱氨酸的内皮细胞毒性由NO的存 在调节；NO和同型半胱氨酸在生理条件下反应，形成无毒的S-亚硝基- 同型半胱氨酸。此外，NO是一种重要的血管介质，由基础状态的内皮 细胞持续释放。在高胆固醇血症兔模型中，饮食中补充L-精氨酸降低了 粥样斑的形成，改善了内皮依赖的扩张，降低了血小板聚集和单核细胞 对主动脉内皮的粘附。也曾显示，补充L-精氨酸通过一氧化氮途径抑制 了健康年轻成人中的血小板聚集。在高胆固醇血症病人中，补充L-精氨 酸能增强内皮依赖的血管舒张。此外，已知作为血管内皮生长因子 (VEGF)负反馈的一氧化氮具有预防血管生成和转移的额外益处。因 此，由于持续释放的低水平一氧化氮有这些已知的健康益处，在本发明 中含高精氨酸和低甲硫氨酸的大豆蛋白质可用作使同型半胱氨酸解毒的 天然途径，并代表代替当前使用维生素添加物的治疗的一种可行的和有 吸引力的代用方法。本发明的一个实施方案中，所述大豆蛋白质组合物 含硫氨基酸含量低于24mg/g蛋白质，而精氨酸含量大于70mg/g蛋白质。

本发明还涉及一种生产上述大豆蛋白质组合物的方法，该方法包括 在可选择性除去同型半胱氨酸和甲硫氨酸蛋白质而保留高精氨酸和低甲 硫氨酸蛋白质的条件下，超滤大豆蛋白质分离物。

减少癌症和骨质疏松症危险的低硫氨基酸蛋白质成分

甲硫氨酸通过最终促进蛋白质合成和细胞增殖在肿瘤发展中起关键 代谢作用。因此，与动物蛋白质如酪蛋白相比，大豆蛋白质的较低的甲 硫氨酸含量有助于低甲硫氨酸蛋白质(如商品大豆蛋白质分离物)抑制 肿瘤发生(Hawrylewicz，E.和Huang，H.，《饮食蛋白质，它们如何缓 解疾病及促进健康》，Liepa，G.编，Amer.Oil Chem.Soc.，Champaign， IL，123-150页，1992)。本发明的含更少甲硫氨酸的高BC组合物(实施 例12)在高蛋白质食品用途中的应用进一步提高了食用高蛋白质食品的 安全性。

我们饮食中的蛋白质组分也可通过影响食用钙的保持而影响骨骼健 康。对于以动物蛋白质为食的实验对象，较高的尿钙排泄与较高的含硫 氨基酸含量有关(Breslau，N.等人，临床内分泌与代谢杂志(J.Clin. Endocrinol.Metab.)66：140-146，1988)，并与食用较多动物食品的妇 女中较高的髋骨折发生率有关(Abelow，B.等人，Calcif.Tissue Int. 50：14-18，1992)。所涉及的一种机制如下：硫在体内被氧化为硫酸根， 这产生被骨骼缓冲的固定酸载荷，导致骨分解。低甲硫氨酸的高β-伴大 豆球蛋白组合物中含硫氨基酸的低含量有利于预防骨质疏松症、癌症和 心脏病。

功能性食品用途

食品开发人员尚未认识到β-伴大豆球蛋白在功能性食品用途中有上 述生理益处。根据本发明现在可能的新的高β-伴大豆球蛋白组合物能用 来制造具有改善的结构、香味、颜色和营养价值的饮料和肉食和干酪类 似物。

本发明涉及一种生产豆奶的方法，其包括：a)使β-伴大豆球蛋白 含量超过蛋白质的40％、大豆球蛋白含量低于蛋白质的10％之大豆破裂 并脱壳；b)加入约82℃的热水灭活脂氧化酶和β-葡糖苷酶；c)研磨大 豆种子成浆液，过滤除去纤维；和d)巴氏灭菌，冷却并包装过滤的浆 液。在本发明的一个实施方案中，所述方法中所述大豆缺乏至少一种脂 氧化酶。在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括在过滤后离 心浆液以除去脂肪。

本发明还涉及一种生产代乳品或婴儿配方的方法，其包括：a)在 水中约50℃下搅拌本发明之大豆蛋白质组合物，至在配方中的终浓度为 5-50％，达到约18％的固体，以形成溶液；b)加入甜乳清或玉米糖浆 固体、糖、盐、矿物质和香料，并与该溶液混合形成混合物；c)混合 加热至约60-70℃的油，且加入乳化剂，然后将其加入该混合物中；和 d)巴氏灭菌该混合物。在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步 包括在步骤a)之后向蛋白质溶液中加入约0.1％蛋白质重量的蛋白酶， 搅拌该混合物1小时，并巴氏灭菌。在本发明的一个实施方案中，所述 方法中所述蛋白酶是neutrase。在本发明的一个实施方案中，所述方法 所述乳化剂是卵磷脂。

其他改变

本发明包括富含β-伴大豆球蛋白的大豆和β-伴大豆球蛋白蛋白质的 其他改变，其进一步扩展到分离物的生产效率和高BC组合物的有用 性。实例包括下列：1)为提高β-伴大豆球蛋白的产量，减少大豆中非 贮存蛋白含量；2)为减少高β-伴大豆球蛋白组合物生产过程中的臭味 产生，添加单、双、三或四倍脂氧化酶无效性状；3)为减少高β-伴大 豆球蛋白组合物生产过程中的臭味产生，减少大豆中亚油酸含量，例如 通过提高油酸或硬脂酸；4)利用特定亚基或特定亚基反义物的过量表 达改变β-伴大豆球蛋白的α、α’和β-亚基的量，以获得多种益处(例如 降低变应原性，提高溶解度)，或利用定点诱变改变特定亚基的结构； 5)利用不同酶和条件对富含β-伴大豆球蛋白的分离物的部分酶促水 解，以提高蛋白质的溶解度、干酪类似物性质、胶凝和发泡性质；和 6)为提高溶解度和有关功能性质，β-伴大豆球蛋白的酶促磷酸化或脱 酰胺。

在本发明一个实施方案中，本发明所述β-伴大豆球蛋白缺乏α-亚 基，在又一实施方案中，本发明所述β-伴大豆球蛋白缺乏β-亚基，在另 一实施方案中，本发明所述β-伴大豆球蛋白β-缺乏α-prine亚基，在又一 实施方案中，本发明所述β-伴大豆球蛋白缺乏α-prine和β-亚基，在又一 实施方案中，本发明所述β-伴大豆球蛋白缺乏α-和β-亚基。

高β-伴大豆球蛋白、低大豆球蛋白的大豆也可通过遗传工程得到。 β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在大豆中由多个基因家族编码。这些基因 由转录因子和其他调节蛋白质调节。大豆的有效转化使得能向大豆基因 组中导入有义和反义基因。针对大豆球蛋白基因的反义物是降低大豆球 蛋白水平的一种有效途径。适当的1组大豆球蛋白核苷酸序列能从大豆 种子表达标记(EST)数据库中获得，并以反义方向克隆到种子表达盒 中。能用这些构建体产生转基因大豆植物，可对降低的1组大豆球蛋白 表达筛选这些植物。Nielson等人(《植物种子发育的细胞与分子生物 学》，B.Larkins和I.Vasil编，Kuwer Academic Publishers，1997)描述 了1组大豆球蛋白基因序列。能用公开的信息或EST数据库信息分离目 的1组大豆球蛋白基因，并能为了在转基因大豆中共抑制1组而适当截短 这些基因。也能通过共抑制大豆球蛋白基因表达与大豆球蛋白启动子或 有义大豆球蛋白RNA来降低大豆球蛋白水平。能操作控制大豆球蛋白表 达的转录因子及其他调节蛋白质，以得到大豆球蛋白含量较低的大豆。 能用低大豆球蛋白大豆突变体通过基于作图的克隆鉴定转录因子及其他 调节蛋白质。新大豆品种中大豆球蛋白积累的减少可能与低大豆球蛋白 突变体的β-伴大豆球蛋白的同时增加有关。人们也能通过过量表达β-伴 大豆球蛋白基因特异的转录因子或其他具有正作用的调节蛋白质，或通 过反义对β-伴大豆球蛋白表达有负作用的调节蛋白质的RNA介导抑制， 来提高β-伴大豆球蛋白水平(同时降低大豆球蛋白水平)。特定β-伴大 豆球蛋白亚基的较高水平也能通过改造在种子特异性启动子控制下编码 这些亚基的基因来实现。这可特异地增加希望的β-伴大豆球蛋白亚基。 也能在体外工程构建功能性增强的β-伴大豆球蛋白的突变形式，并用转 基因技术将其导入大豆中。

γ射线能用来产生一批大豆突变体。能筛查该群体种子中1组大豆球 蛋白水平的缺乏或降低，或通过遗传作图策略筛查1组大豆球蛋白基因 的物理突变。

能用类似的方法除去高BC大豆中的Kunitz和/或Bowman Birk蛋白 酶抑制剂。

其他步骤和方法在本领域中众所周知。反义技术的合适的步骤、材 料和方法可见于：Burkle L，Hibberd，J.M.，Quick，W.P.，Kuhn，C.， Hirner，B.，Frommer，W.B.植物生理学(Plant Physiol.)118(1)：59-68 (1998)；Piquemal J，Lapierre C，Myton K，O′Connell，A.，Schuch，W.， Grima-Pettenati，J.，Boudet，A.M.植物杂志(Plant J.)13(1)：71-83 (1998)；和Temple S.J.，Bagga S.，Sengupta-Gopalan C.植物分子生物学 (Plant Mol Biol.)37(3)：535-47(1998)。共抑制技术的合适的步骤、材 料和方法可见于：Palauqui，J.C.，Vaucheret，H.，美国国家科学院院报 95(16)：9675-80(1998)；Que，Q.，Jorgensen，R.A.遗传学进展(Dev. Genet.)22(1)：100-9(1998)；de Carvalho Niebel，P.，Frendo P.，Van Montagu，M.，Comelissen，M.植物细胞7(3)：347-58(1995)。

与蛋白质成分制备有关的合适的步骤、材料和方法及在食品中的用 途可见于：Liu，KeShun，《大豆-化学、技术与应用》，Chapman& Hall，NY，(1997)；Erickson，D.R.，编，《大豆加工与应用实践手册》， AOCS Press，Champaign，IL and United Soybean Board，St.Louis，MO， (1995)；Applewhite，T.H.(编)《世界植物蛋白质在人类食品和动物饲 料中的应用会议论文集》，美国油类化学家协会，Champaign，IL (1989)；《大豆蛋白质产品——特征、营养方面和应用》，Soy Protein Council，Washington D.C.(1987)；Damodaran，S.和Paraf，Alain，《食 品蛋白质及其应用》(Food Proteins and Their Applications)，Marcel Dekker，Inc.NY(1997)；Gueguen，J.和Popineau，Y.，编.《来源于欧洲 作物的植物蛋白质》(Plant Proteins from European Crops)， Springer-Verlag，NY，1998；Kolar，C.W.，等人，美国油类化学学会杂志 56：389-391，(1979)；Fukushima，D.，国际食品综述(Food Rev.Int.) 7：323-351，(1991)；Hoogenkamp，H.W.，《肉类、家禽和素食中的植物蛋 白质技术价值》(Vegetable Protein Technology Value in Meat，Poultry &Vegetarian Foods)，(1992)；Fox，P.F.，《干酪：化学、物理学和微 生物学》(Cheese：Chemistry，Physics and Microbiology)，第2卷， Major Cheese Groups，pp 339-383，(1987)；Mead，G.C.1989，家禽学报 (Processing of Poultry)，Elsevier Appl.Sci.，NY；Forrest，J.C.等人， 1975，肉食科学原理(Principles of Meat Science)，W.H.Freeman Co.， San Francisco；Wilson，LA.，美国油类化学家协会杂志，(1995)，和Hua， Y.F.等人，J.A.O.C.S.73：1067-1070(1996)，均在此引用作为参考。

本发明还涉及一种制备本发明所述大豆蛋白质组合物的方法，包 括：a)使脱脂大豆材料与水性溶剂接触，形成可溶性和不可溶成分的 混合物，其中一部分蛋白质在该水性溶剂中溶解；b)调节混合物的pH 至6.7以上，以增加在水性溶剂中溶解的蛋白质部分；c)从该混合物中 除去不可溶成分；d)调节该混合物的pH至适当较低的pH，以沉淀在水 性溶剂中溶解的蛋白质部分；e)回收在步骤d)中沉淀的蛋白质部分； f)调节在步骤e)中回收的含蛋白质混合物的pH至6.7-7.2；和g)干燥 该混合物。在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括在pH6.7- 7.2时加热处理的步骤，其中所述加热处理的步骤a)在步骤a与b之间； b)在步骤c与d之间；c)在步骤f与g之间；d)在步骤a和b及步骤f和g之 间；或e)在步骤c和d及步骤f和g之间。在本发明的一个实施方案中，所 述方法中加热处理步骤选自：a)72-90℃，15-20秒钟；b)80-90℃，5- 10分钟；或c)120-154℃，7-20秒钟。

在本发明的一个实施方案中，本发明还涉及一种制备本发明的组合 物的方法，包括：a)使脱脂大豆材料与水性溶剂接触，形成可溶性和 不可溶成分的混合物，其中一部分蛋白质在该水性溶剂中溶解；b)调 节混合物的pH至6.7以上，以增加在水性溶剂中溶解的蛋白质部分；c) 从该混合物中除去不可溶成分；d)使步骤c的混合物通过超滤膜，并加 入水性溶剂保持混合物对膜的浓度，以除去低分子量溶质，直到收集约 1.4倍提取物体积的透过物，浓缩提取物；e)调节在步骤d)中回收的含 蛋白质混合物的pH至6.7-7.2；和f)干燥该混合物。在本发明的又一实 施方案中，所述方法中：a)步骤c的混合物调节为pH6.7-7.2，或b)步 骤c的混合物调节为pH8.5-9.0。在本发明的又一实施方案中，所述方法 进一步包括在pH6.7-7.2时加热处理的步骤，其中所述加热处理的步骤 a)在步骤a与b之间；b)在步骤c与d之间；c)在步骤e与f之间；d)在 步骤a和b及步骤e和f之间；或e)在步骤c和d及步骤e和f比间。

在本发明的又一实施方案中，所述方法中加热处理步骤选自：a) 72-90℃，15-20秒钟；b)80-90℃，5-10分钟；或c)120-154℃，7-20秒 钟。

实施例

下列实施例用以进一步说明本发明，而不是意欲在所附权利要求所 述限制之外限制本发明。涉及大豆蛋白质分离物的应用的那些实施例只 是例子，本领域的技术人员应当知道本发明的哪种特殊大豆蛋白质组合 物能用于生产此处所述的食品。

实施例1

大豆和大豆蛋白质分离物的SDS-PAGE凝胶电泳

1)称取5mg经凯氏法测定已知蛋白质含量的样品(蛋白质＝氮 ×6.25)，并将其置于650微升微量离心管中。

2)加入SDS样品溶解液(含有10％甘油、2.3％SDS、0.0626 M Tris pH6.8、5％2-巯基乙醇、0.05％溴酚蓝)至终蛋白质含量为 4mg/mL。

3)密封离心管，对于SPI样品置于摇床中20分钟。置于沸水浴中10 分钟。

4)将样品冷却至室温。

5)在微量离心机中离心样品(～14000×g)10分钟。

6)回收上清液。

7)加入5-8微升(20-30微克)蛋白质。

电泳/染色条件：

1)所有凝胶都是分析者制备的10-20％总丙烯酰胺(T)和0.75mm 厚的2.67％Laemelli凝胶。用Bio-Rad Protean II xi系统制备并电泳凝 胶，该系统制成大约16cm×16cm的凝胶。

2)积层胶制成15孔，样品不在外侧泳道中电泳。Bio-Rad宽范围分 子量标准加于凝胶的每一侧，以用于表观分子量测定。

3)用恒定电压(60-100伏过夜)或恒定电流(15-30mA/凝胶6-8小 时)电泳凝胶。

4)凝胶在室温下在12.5％三氯乙酸中固定至少1小时。

5)从TCA中取出凝胶，用去离子水短暂漂洗。将其于室温下置于胶 状考马斯溶液A(11％硫酸铵/2％磷酸)中1小时，然后置于由160ml溶液 A、40ml甲醇和4.2ml溶液B(1mg考马斯G250溶于20ml去离子水中)组 成的染色液中。

6)凝胶在室温下在该溶液中染色至少16小时(最好＞24小时)，然 后用去离子水漂洗，并置于7％乙酸中洗去存在的背景染色痕迹。此时凝 胶可用于成像或摄影。

用Kodak Videk Mega-plus电荷耦合装置(CCD)阵列照相机和 BioImage Visage 2000图像分析系统中包含的扫描软件生成考马斯染色的 凝胶的数字图像。CCD阵列照相机产生1024×1024像素的数字图像，具有 代表光密度范围的256数值。在图像获取过程中，对于像素大小和数值校 准该系统。用透射光、17mm镜头、2个中密度滤光片和黄色滤光片扫描 凝胶，以增强考马斯染色的对比度。

用BioImage Whole Band分析软件进行数字图像的分析。利用该软 件，分析者提供泳道边界，该软件确定条带，然后自动生成其边界。分 析者有能力去除不能代表条带的条带边界，并有能力通过显示条带的主 轴辅助确定边界布置。该方法使用与边界确定法相同的算法控制分析者 的偏见。分析者也能手工确定(绘出)条带边界，但该方法只能在其他 所有方法失败时使用(一般少于2％的条带)。Whole Band软件通过加和 条带边界内所有像素的数值确定各条带的数值，产生已知作为综合光密 度或IOD的数值。在相同凝胶上各泳道中电泳商品分子量标准(Bio-Rad 宽范围分子量标准，  目录#161-0317)，用来确定样品条带的表观分子 量。分析者可命名各条带以帮助在条带列表上鉴定。

图像分析的结果以称为“条带列表”的表格形式显示。条带列表含 有按泳道分组的数据，包括条带数(从泳道顶部向底部编号)、条带名 称、条带IOD、％IOD(该条带所代表的泳道中所有定量材料的％)和分 子量。计算机屏幕的拷贝打印为“屏幕映象”。生成显示数字凝胶图像 的屏幕映象，无原位注释，定量条带的中心用虚线表示，完全注释显示 泳道边界、泳道名称、条带中心、条带边界和分子量标准。

实施例2

纯化的BC、实验室大豆蛋白质分离物和

商品蛋白质的中值颗粒直径和粘度

商品大豆蛋白质分离物，Supro760(Com’l SPI A)和Supro 940 (Com’l SPI B)获自Protein Technologies International，St.Louis Missouri。商品大豆蛋白质浓缩物，Promine DS(Com’l SPC)获自 Central Soya company，Inc.，Fort Wayne，Indiana。完整蛋白质分离物 (Lab.SPI)按照Boatright，W.L.等人，美国油类化学家协会杂志 72：1439-1444，1995的方法制备，不同之处是用石油醚抽提脂肪。含有蛋 白质(1％蛋白质)、花生油(10％)、蔗糖(5％水相)、NaCl(70 mM，0.4％水相)和指明的(4mM)CaCl2的乳剂通过超声处理(160 瓦，60秒)制备，中值颗粒直径大小用Malvern mastersizer激光衍射装 置测定。用Bohlin VOR流变仪测定加热处理的样品的粘度(14.61/秒剪 切速度，5分钟，5℃)。乳剂冷冻(4天，-14℃)融化或加热处理 (20mL，于浸入90℃水浴中的玻璃瓶中，60分钟)。

加热处理或冻融的用酪蛋白钠和β-伴大豆球蛋白制备的乳剂之小颗 粒直径证明了β-伴大豆球蛋白在接近pH6.7的乳剂用途中(如营养饮料和 咖啡奶油中)代替酪蛋白钠的能力，如表1所示。

表1.用纯化的β-伴大豆球蛋白、实验室大豆蛋白质分离物和商品蛋白质 成分稳定的乳剂的中值颗粒直径。

 蛋白质                     中值颗粒直径(微米)              0.4％NaCl            0.4％NaCl，4mMCaCl2  酪蛋白钠  β-伴大豆球蛋白  Lab.SPI  Com’l SPI A  Com’l SPI B  Com’l SPC     pH6.0-6.1     1.0     1.2     14.2     30.0     82.7     46.6     pH6.6-6.8     -     1.2     2.2     1.6     56.0     44.6     pH6.0-6.1     1.1     9.8     36.3     69.1     89.2     49.7     pH6.6-6.8     1.1     3.4     14.1     61.9     81.8     60.4

表2.用纯化的β-伴大豆球蛋白、实验室大豆蛋白质分离物和商品蛋白质 成分、0.4％NaCl、5％蔗糖稳定的经加热处理和冻融的乳剂之中值颗粒 直径。

  蛋白质                                 中值颗粒直径(微米)             加热处理的                冻融的     pH6.0-6.1     pH6.6-6.8     pH6.0-6.1     pH6.6-6.8   酪蛋白钠   β-伴大豆球蛋白   Lab.SPI   Com’l SPIA   Com’l SPIB   Com’l SPC     1.0     3.1     39.1     34.9     72.4     47.7     -     1.4     11.5     1.9     49.9     49.9     1.0     4.0     55.0     83.9     111     111     -     13.8     88.0     75.3     104     98.8

表3.用纯化的β-伴大豆球蛋白、实验室大豆蛋白质分离物和商品蛋白质 成分、0.4％NaCl、5％蔗糖稳定的加热处理的乳剂的粘度。

                                       蛋白质     pH     β-伴大豆球蛋     白     Lab.SPI     Com’l SPI A     Com’l SPI B     Com’lSP C     6.6     6.1     5.6     5.0     mPas     50     60     1,490     120     mPas     180     650     270     30     mPas     60     270     110     70     mPas     70     50     30     -     mPas     230     140     110     100

实施例3

高BC-SPI、低BC-SPI和Cntrl-SPI的试验生产制备

A.大豆中脂肪的去除

1.调节大豆湿度为约10％，温度为室温。

2.用破碎机破裂大豆。

3.用Kice吸引器使破裂的大豆去壳。

4.用蒸煮器调节破裂并去壳的大豆为50-60℃。

5.用制片机将经调整的大豆制成薄片。

6.用己烷抽提大豆片。

7.在实验室通风橱中将脱脂大豆粉除溶剂3天。

8.磨碎步骤7的薄片，制成在以下部分C中使用的粉。

B.SPI-酸-hb和SPI-酸-hb的步骤1和2

BC-SPI-酸-hb(酸hb＝酸沉淀前加热)和低BC-SPI-酸-hb如下所述 加工。Cntrl-SPI-酸-hb使用以下部分C中简述的步骤，不同之处在于将 C2的蛋白质调节为pH7.0并在C3之前加热处理(72℃，15秒)。C6中无 加热处理。

1.向200升夹套罐中加入水，调节到27-35℃，并用20％NaOH调节 为pH8.5-9.0。加入脱脂大豆薄片，并用装备有2个螺旋桨的搅拌器和具有 精细、中度和粗糙转子的动力同轴三级混合器混合。在整个提取过程中 使用具有闭环循环的动力同轴混合器降低薄片的颗粒大小，并改善蛋白 质提取。水与大豆粉之比为10/1(w/w)。若浆液的pH低于8.5，则重新 调节浆液的pH为pH8.5-9.0。

2.从提取浆液中离心回收溶解的大豆蛋白质(25-35℃)，首先用 滗析器除去大多数废固体，随后用除淤盘离心机以250-500kg/h的进料速 度澄清含蛋白质的液体。

3.用6％盐酸将澄清蛋白质溶液的pH调节为6.8-7.0。用板框式热交 换器72℃15秒钟或90℃20秒钟加热处理蛋白质溶液，并冷却到25-35 ℃。

4.通过加入盐酸(12％)调节已巴氏灭菌的蛋白质溶液为pH 4.5+/- 0.1，并使之在30-35℃下反应30分钟。

5.以200-400kg/h的进料速度和3分钟的除淤间隔，用除淤盘离心机 回收沉淀的蛋白质。

6.用酸化水(pH4.5+/-0.1，30-35℃)洗涤蛋白质凝乳10-30分钟， 2次。洗涤用水与压积湿固体之比为5∶1(w/w)。用动力同轴混合器破碎 凝乳中的任何结块。每次洗涤后用除淤盘离心机以350-450kg/h的进料速 度回收蛋白质凝乳。

7.已洗涤的凝乳与稀释的氢氧化钠(0.5％)混合以中和(pH 7.0- 7.2)，用水稀释为12-15％固体(优选地15％固体)，重新调节为pH 7.0- 7.2。在喷雾干燥前用动力同轴混合器搅匀浆液。蛋白质溶液在用热交换 器喷雾干燥之前贮存于4℃或尽可能冷却。

8.调节中和的和均匀的蛋白质溶液为45-55℃，用180-185℃的入口 气温和85-90℃的出口气温喷雾干燥。

C.SPI-酸-ha

1.向300升夹套罐中加入水，调节到55℃，并用30％NaOH调节为 pH9.0-9.5。加入脱脂大豆粉，并用螺旋桨型混合器以高速设定值(1725 转/分)混合。水与大豆粉之比为12/1(w./w)。提取时间为45分钟。

2.用除淤盘离心机以250-500kg/h的进料速度从提取浆液中回收溶 解的大豆蛋白质。

3.通过加入盐酸(30％)将澄清蛋白质溶液调节为pH4.5+/-0.1， 并使之在45℃下反应30分钟。

4.用除淤盘离心机以200-400kg/h的进料速度和3分钟的除淤间隔回 收沉淀的蛋白质。

5.用酸化水(pH4.5+/-0.1，30-35℃)洗涤蛋白质凝乳10-30分钟， 2次。洗涤用水与压积湿固体之比为6∶1(w/w)。每次洗涤后用除淤盘离 心机洗涤后以350-450kg/h的进料速度回收蛋白质凝乳。

6.已洗涤的凝乳与稀释的氢氧化钠(30％)混合以调节pH(pH 7.2)，然后用板框式热交换器在72℃下热处理15秒或90℃下20秒，并冷 却到25-35℃。然后用HCl(30％)调节pH为pH6.8。

7.调节蛋白质溶液为45-55℃，用204-215℃的入口气温和88℃的出 口气温喷雾干燥。

D.超滤和渗滤

1.从上述实施例3B或3C的步骤2中获得澄清的蛋白质溶液。为制备 SPI-UF-hb(hb＝加热前)，中和该蛋白质溶液(pH6.8-7.0)，并用板 框式热交换器在72℃下热处理15秒或90℃下20秒。为了制备SPI-UF-ha (ha＝加热后)，使用步骤2获得的蛋白质溶液(pH9.0)，并在步骤4后 中和并加热处理样品。

2.使蛋白质溶液通过分子量截留为100,000道尔顿的超滤膜(例如 中空纤维)。在超滤和渗滤过程中通过加水补偿除去的通透物保持进料 容器中蛋白质溶液的初始体积。

3.存留溶液再循环回进料容器。

4.待通透物为初始给料体积的大约1.3-1.5倍后，停止向进料容器中 加水，收集通透物。

5.经超滤减少进料容器的体积，直到达到约15％固体的固体含量， 加入8％NaOH或6％HCl调节为pH 6.8-7.0。

6.存留物用180-185℃的入口气温和85-90℃的出口气温喷雾干燥。

实施例4

大豆和BC-SPI的组成、溶解度和颜色

材料：

BC-SPI、低BC-SPI和Cntrl-SPI在POS Pilot Plant Corp.，Saskatoon， sK，加拿大和Texas A&M University，College Station，Texas按照实施例3 的方法用酸沉淀法和超滤法制备。BC-SPI-UF pH9的生产包括在SPI提取 溶剂(pH 8.5-9.0)中加入三聚磷酸钠(脱脂片重量的0.5％)，这可能造 成SPI的较高含灰量(表5)。Com’l SPI A、C(部分水解的)和D获自 Protein Technologies International，St.Louis，Missouri。Com’l SPI D、 E和F获自Archer Daniel Midland，Decatur，Illinois。酪蛋白钠(Alanate 180)获自New Zealand Milk Products(North America)Inc.，Santo Rosa， CA。SPI的组成和物理性质如下所示。

蛋白质组成：SPI中的总蛋白质通过燃烧法测定(《AOAC分析的官 方方法》，第16版，1995；990.02，Locator#4.2.08)。SPI中各种蛋白质 的含量用凝胶电泳测定为总蛋白质的百分数(实施例1)。

BC-SPI含有大约2倍于Com’l SPI-A的BC(表6)。在低BC SPI中只 有β-伴大豆球蛋白的β-亚基。

脂肪组成：SPI中脂肪含量用酸水解法测定(《AOAC分析的官方方 法》，第16版，1995；方法992.02(改进的)，Locator#32.1.14)。

胰蛋白酶抑制剂活性：用标准AACC法(1995，第9版，方法71-10) 分析大豆和SPI的胰蛋白酶抑制剂活性。

氮溶解度指数：在120转/分和30℃下，将一部分样品搅拌悬浮于水中 2小时；然后用水稀释为已知体积(5g/250ml，2％)。离心(1500转/ 分)一部分样品提取物，分析等份样品的凯氏蛋白质。分析样品各部分 的总蛋白质。将水溶性氮占总氮的百分数定义为氮溶解度指数(《AOCS 的官方及暂行方法》(1989)，第4版，方法Ba 11-65)。

SPI颜色：将SPI样品置于Hunter比色计中(Hunter ASSociateS Laboratory Inc.，Reston，VA)，对仪器上的3种标度L、a和b测定颜色反 射(美国谷类化学家协会(Am.Assoc.Cereal Chemists)，方法14- 22)。超滤的本发明的BC-SPI具有比其他SPI明显更高的白度和更低的泛 黄度，因此在颜色上更类似于商品酪蛋白钠(Alahate 180)(表4)。

水合SPI颗粒的大小：将蛋白质分离物粉末以获得70％-90％光透射 率所必需的量直接置于Horiba LA910颗粒大小分析仪的水循环中。每一 样品以2的搅拌速度和2的循环速度(蠕动泵)在仪器中混合10分钟。用 1.02-ooi的相对(于水)折射率测定颗粒大小。

本发明的BC-SPI-酸-ha只是未水解的SPIs，其在水中经分散后具有 低于15％的颗粒体积，由大于10微米的颗粒所引起(表4)。

表4.与对照和商业分离物相比，BC-SPI的氮溶解度指数(NSI)，颜色和颗 粒大小分布

     蛋白质分物     NSI      ％   Hunter    L(白    度)     比色计值      b(泛黄      度)     P.Vol＞10 m.*      ％     Med.**      微米     酪蛋白钠     BC-SPI-酸-ha，72C     BC-SPI-酸-ha，90C     Cntrl SPI-酸-ha，72C     Cntrl SPI-酸-ha，90C     Cntrl SPI-UF pH9-ha     BC-SPI-UF-hb，72C     BC-SPI-酸-hb，72C     Cntrl SPI-酸-hb，72C     Cntrl SPI-酸-hb，90C     Com′l SPI A(S760)     Com′l SPI C(S670)     Com′l SPI D(S500E)     Com′l SPI E(P974)     98     96     95     94     94     -     96     34     95     63     63     82     72     67   92.4   86.1   85.9   86.1   86.1   85.2   89.3   85.5   85.2   83.5   85.5   82.8   -   85.8     7.1     10.9     11.3     10.9     11.0     10.6     8.3     11.8     11.5     12.8     15.4     13.5     -     12.6     0.0     7.3     6.9     19.7     18.3     11.0     9.9     30.8     19.4     75.1     74.4     0.9     84.0     92.0     0.30     0.37     0.38     0.39     0.31     0.37     0.30     1.32     0.35     53.2     65.8     0.37     72.2     96.6

  Com′l SPI F(A DHV)   78   86.1   11.4   76.7   71.5

*P Vol＞10m-大于10微米的颗粒的颗粒体积

**中值颗粒直径

hb＝UF或酸沉淀前加热处理的

ha＝酸沉淀后加热处理的

表5.蛋白质分离物的化学组成。蛋白质表示为氮×6.25(可能超出代表的 总大豆蛋白质)。

SPI     蛋白质％，干基     脂肪(酸水解)％，干基     灰％，干基 酪蛋白钠     95.74     0.75     3.71 低-BC-SPI-hb     94.39     4.02     3.89 BC-SPI-酸-hb     91.89     4.57     3.86 BC-SPI-酸-ha     95.24     2.54     3.75 BC-SPI-UF pH7-hb     92.31     3.18     3.65 BC-SPI-UF pH9     88.39     3.57     5.83 Cntrl-SPI-UF pH9-ha     92.28     -     - Cntrl-SPI-酸-hb     93.03     3.05     4.66 Cntrl-SPI-酸-ha     92.34     -     - Com′l SPI A     92.55     4.94     -

表6.SPI的蛋白质组成。BBI＝Bowman Birk蛋白酶抑制剂；KTI＝ Kunitz蛋白质酶抑制剂。

大豆蛋白质分离物                 SPI蛋白质组成(％蛋白质)     蛋白酶抑制剂活性     BC     大豆球蛋白     A3     BBI     KTI     (TIU/mg蛋白质) 低-BC-SPI-酸-hb     12.4*     5.2     5.7     -     2.4     31.5 BC-SPI-酸-hb     51.3     5.5     2.4     0.50     2.5     85.2 BC-SPI-酸-ha     61.9     3.0     1.8     0.35     2.8     45.6 BC-SPI-UF pH7-hb     54.0     4.2     1.8     2.4     3.1     284.6 BC-SPI-UF pH9     40.0**     3.4     1.5     3.1     3.7     347.7 Cntrl-SPI-UF pH9-ha     28.2     45.4     5.9     0.0     2.4     28.3 Cntrl-SPI-酸-hb     30.0     37.4     5.9     0.31     1.7     26.8 Com′l SPI A     26.1     45.2     5.2     0.17     0.7     8.9 Com′l SPI E     28.9     39.8     4.9     0.37     2.5     10.0

    Com′l SPI F     28.3     45.5     5.4     0.31     2.1     10.7

*代表BC的β-亚基。在低BC-SPI中无BC的α或α-prime亚基。

**约62kDa的宽带(总蛋白质的8.2％)可能代表BC的α或α’亚基的水解 产物，但未包含于此处BC的计算中。

表7.大豆的蛋白质组成。高BC大豆的生长地区为IL＝伊利诺斯州，PR＝ 波多黎各。

大豆 β-伴大豆 球蛋白(％ 蛋白质) 大豆球蛋白 (％蛋白质) BBI(％蛋 白质) KTI(％蛋 白质) 胰蛋白酶抑制剂 活性(TIU/mg蛋 白质) 高BC-IL 53.0+/-0.9 2.8+/-0.7 2.9+/-0.1 3.5+/-0.4 92.4+/-3.3 高BC-PR 51.6+/-0.2 1.6+/-0.1 2.6+/-0.4 3.7+/-0.3 77.4+/-2.2 Com′l(H6397) 26.9 36.6 0.9 3.2 31.2 Com′l大豆* -- -- 31.8+/-4.4

*6个品种的平均值(Hartz 6397，6061，5488，6255，616，5088)。

表8.SPI的异黄酮含量。列出的总异黄酮值是染料木黄酮、大豆黄素和黄 豆黄素的各异构体的总和，对其分子量差异标准化以得到总异黄酮浓 度。

          SPIs的异黄酮组成(微克/克干SPI) 异黄酮  BC-SPI-酸-hb  低-BC-酸-hb  CntrlSPI-A  Cntrl-SPI-酸-hb 丙二酰大豆苷     86     31     0     0 丙二酰黄豆黄苷     25     34     88     26 丙二酰染料木苷     300     150     819     204 大豆苷     47     67     190     579 黄豆黄苷     17     32     60     69 染料木苷     200     170     658     1259 乙酰大豆苷     17     0     207     0 乙酰染料木黄酮     41     31     255     28 乙酰黄豆黄苷     0     0     18     0 大豆黄素     106     92     84     191 黄豆黄素     21     35     21     30 染料木黄酮     290     217     116     273 总大豆黄素     188     148     315     544 总染料木黄酮     594     418     1099     1181 总黄豆黄素     45     73     116     88 总并黄酮     827     639     1530     1813

实施例5

BC-SPI的降胆固醇和甘油三酯性质

动物与饮食：在23℃和12小时交替光：暗循环的环境控制的房间中， 在金属丝底不锈钢笼中分开喂养成年仓鼠(雄性Golden Syrian)(94+/- 5.5g)。到达后，仓鼠喂食未纯化的粉状食物啮齿动物食品(Purina，St. Louis，MO)1周，以使其适应粉状食物。仓鼠随机分配到5个食物处理组 之一(每组n＝10)。除蛋白质来源外食物类似(表1)。酪蛋白钠为 Alanate 180，获自New Zealand Milk Products。低BC大豆获自Asgrow 种子公司(A233)，并加工制成低BC-SPI-酸-hb(实施例3B)。对照- SPI和BC-SPI如前所述。所有仓鼠均随意饮食喂养6周，并在第1、3、6 周监视食物摄取。在第0、14、28、42天采集眼眶后血样测定血清脂类 (表10)。在研究结束时，放血杀死仓鼠，取肝测定肝脂水平。

胆固醇和甘油三酯测定：总胆固醇和HDL胆固醇浓度用商品试剂盒 (Wako胆固醇CII酶试剂盒(目录号276-64909)，Sigma HDL(目录号 352-3))酶学测定。甘油三酯用Sigma甘油三酯试剂盒(目录号337)测 定。VLDL和LDL浓度计算为总胆固醇与HDL胆固醇之差。另外，按照 E.S.Krul等人(动脉硬化症(Arteriosclerosis)9：856-868，1989)所述的 方法，通过合并每组的仓鼠血清并在2个Superose 6柱(Pharmacia， Uppsala，瑞典)上分离，直接测定血清脂蛋白胆固醇分布。

粪便胆汁酸和中性固醇测定：粪便胆汁酸按照Van der Meer等人 (Van der Meer等人，《健康与疾病中的胆固醇代谢：荷兰的研究》， Wageningen：Ponsen和Looijen，113-119，1985)的方法从干燥粪便中提 取。提取的胆汁酸如Turley和Dietschy(Turley SD和Dietschy JM，脂类 研究杂志(J.Lipid Res.)19：924-928，1978)所述测定。粪便中性固醇按 照Grundy等人(Grundy SM等人，脂类研究杂志6：397-410，1965)的 方法从干燥粪便中提取。在Hewlett Packard6890型上用HP-5 Ultra 2玻 璃毛细管柱(50m×0.32mm I.D.)分析提取的未衍生的固醇。

表9.基础食物组成

成分             g/100g

蛋白质*          22

米粉             43

混合油**         12

纤维素           7.5

矿物质混合物     3.5

维生素混合物     1.0

麦麸             7.5

氯化胆碱         0.3

碳酸氢钾         2.0

胆固醇           0.1

*蛋白质值基于6.25×氮。

**可可油(25％)、亚麻油(3％)、棕榈油(35％)、红花油(19％)、向日葵油 (85％油酸；18％)。

表10.在含有大豆蛋白质分离物的饮食6周后测定的仓鼠血清和粪便脂类组成和5周后的摄食

 SPI                 血清脂类                                  粪便  胆固醇  (mg/dl)  甘油三酯  (mg/dl)  粪便胆固醇  (μg/g干重/天  粪便胆汁酸  (μmol/g干重)   粪甾醇   (μg/g干重/天)   肝胆固醇   (mg/g肝重)   食物摄取   (g/天)  酪蛋白钠  Com′l SPI A  Cntrl-SPI-酸-hb  低-BC-SPI-酸-hb  BC-SPI-酸-hb  307.2+/-30.1  262.4+/-25.2  248.2+/-20.7  248.2+/-25.8  222.0+/-31.7  243.0+/-130.6  115.0+/-46.7  123.2+/-57.7  105.6+/-29.0  64.6+/-19.7  144+/-14  147+/-4  195+/-14  160+/-5  227+/-45   0.42+/-0.64   2.27+/-1.18   1.09+/-1.09   1.72+/-1.11   2.13+/-1.06   354+/-53   455+/-23   484+/-36   467+/-31   364+/-29   3.89+/-1.28   2.70+/-1.15   2.23+/-0.27   2.29+/-0.51   2.33+/-1.13   8.39+/-0.73   9.17+/-1.08   8.48+/-0.91   8.92+/-0.79   7.40+/-0.95

实施例6

与商品SPI和模型饮料系统中的酪蛋白钠相比BC-SPI的性质

材料：BC-SPI、Cntrl-SPI和Com’l SPI如实施例3和4所述。

乳剂形成：用Dispermat混合器将蛋白质(终浓度为1％，对于大豆 蛋白质使用5.71×氮，对于酪蛋白用6.38×氮)(Morr，C.J.，食品科学 47：1751，1982)缓慢加入5％蔗糖溶液中，并向混合物中加入0.4％NaCl (水相)。根据以前的实验调节溶液的初始pH，使溶液的终pH达到目标 pH。向Dispermat中的蛋白质溶液中缓慢加入花生油(约3分钟)(总制 剂重量为50g)。在50ml塑料烧杯中以烧杯中20ml标记的深度用超声探头 超声处理(160瓦)制剂1分钟。

加热处理：蛋白质稳定的乳剂(20mL)转移到带螺旋盖的玻璃瓶 中，浸于90℃水浴中30分钟，并在冰箱中贮存过夜。

颗粒大小和粘度测定：用Bohlin流变仪测定样品的粘度(C14杯和锯 齿形浮子，5分钟平衡时间，5℃，14.61/秒剪切速率，剪切5分钟)，用 Horiba LA910颗粒大小分析仪测定其中值颗粒直径(容积基础，相对折 射率1.10，最低循环速度)。

结果：酪蛋白钠是一种良好的乳化剂，对聚集稳定，在不同温度、 钙浓度和pH条件下制备的乳剂的小中值颗粒直径(0.8微米)说明了这一 点(表11)。酪蛋白钠的这些理想的性质最适合BC-SPI-酸-ha成分(表 11)。只有酪蛋白钠和BC-SPI-酸-ha在4mM CaCl2存在下产生小乳剂颗 粒。在4mM CaCl2存在下，酪蛋白钠和BC-SPI-酸-ha成分稳定的小颗粒 乳剂可防止贮存期间血清的分离，相反，BC-SPI-酸-hb和Com’l-SPI A稳 定的乳剂有较大的颗粒直径，1天后(pH 6.7，0.4％NaCl，4mM CaCl2)显示5ml和10ml游离血清。BC-SPI-酸-ha在pH 6.5时也比其他SPI 对聚集更稳定，乳剂的小中值颗粒直径说明了这一点(0.8微米，其他所 有SPI＞1.0微米)(表11)。BC-SPI-酸-ha和BC-SPI-酸-hb在冻融条件下 都比商品SPI对聚集更稳定，如BC-SPI稳定的乳剂颗粒直径较小所示 (2.0-3.7微米，相对于9.6-97.6微米)。BC-SPI-酸-ha的稳定性可能部分 归因于用来制备该成分的方法，而不仅仅是由于β-伴大豆球蛋白的含量， 因为对照SPI稳定的乳剂颗粒也有极佳的冻融稳定性。

表11.在指定的pH、盐和冷冻条件下制备或贮存的蛋白质稳定的乳剂的 中值颗粒直径。所有乳剂均含有水相的0.4％NaCl和5％蔗糖，和1％蛋 白质、10％花生油。结果为重复试验的平均值。

蛋白质                         平均颗粒直径(微米)     pH6.7     (微米)     pH6.5     (微米)    pH6.7，    冻融    (微米)     pH6.7，     4mMCa     (微米)   pH6.7，90C，   30分钟   (微米)   pH6.5，90C，   30分钟   (微米) 酪蛋白钠 BC-SPI-酸-ha72C BC-SPI-酸-ha90C Ctrl SPI-酸-ha72C Ctrl SPI-酸-ha90C BC-SPI-UFpH7-hb BC-SPI-酸-hb72C Com.SPI-A Com.SPI-C Com.SPI-E Com.SPI-F     0.8     0.9     0.9     1.1     1.1     1.3     1.7     1.8     11.8     1.0     1.1     0.8     0.8     0.8     1.3     1.6     4.9     2.9     7.7     17.5     1.1     3.7    0.8    2.0    2.9    1.8    1.9    3.3    3.7    86.9    9.6    34.8    97.6     0.8     1.2     1.1*     12.9     13.6     10.6     19.8     36.7     33.8     18.0     19.1   0.8   0.9   0.9   1.7   2.8   5.1   4.6   4.3   19.3   1.0   1.8   0.7   0.9   0.9   1.4   2.9   10.6   6.5   9.7   --   1.4   6.6

*当该乳剂(20mL)在90℃水浴中加热处理30分钟，并在冰箱中冷却时， 颗粒直径仅增加至2.4微米。加热处理的乳剂在贮存(24小时)后不显示 血清分离。

实施例7

在模拟乳化肉食系统的条件下BC-SPI的结构改进性质

材料：BC-SPI和Com’l SPI A、D、E和F如实施例3和4所述。Com’l SPI A象Com’l SPI D一样，可能生产为一种高度变性的SPI，如根据总变 性的焓所确定(Arrese，E.等人，农业食品化学39：1029-1032，1991)。 为制备高度变性的高BC组合物，将在水中分散的BC-SPI-酸-hb和BC- SPI-UF pH7-hb转移到玻璃瓶中，并浸于90℃水浴中30分钟，然后在冰箱 中冷却。Com’l SPI A也用相同方法处理(90℃30分钟)，以确定进一 步的热处理是否影响Com’l SPI A的性质。干燥的蛋清获自Canadian Inovatech Inc.，Abbotsford，British Columbia。

乳剂形成：用Dispermat混合器将蛋白质(终浓度为2％，对于大豆 蛋白质使用5.71×氮，对于蛋清蛋白用6.25×氮)缓慢加入5％蔗糖溶液 中，并向混合物中加入3.5％NaCl(水相)。根据以前的实验调节溶液的 初始pH，使溶液的终pH达到目标pH。向Dispermat中的蛋白质溶液中缓 慢加入花生油(约3分钟)。在50ml塑料烧杯中以烧杯中20ml标记的深度 用超声探头超声处理(160瓦)制剂20秒或1分钟。

胶凝：每种乳剂样品(20mL部分)在玻璃瓶中在70℃水浴中加热30 分钟，或在80℃水浴中加热30分钟，然后贮存于冰箱中(5℃)过夜。乳 剂达到水浴温度的时间约为8-10分钟。

颗粒大小和粘度测定：用Bohlin流变仪测定样品的粘度(C14杯和锯 齿形浮子，5分钟平衡时间，5℃，14.61/秒剪切速率，5分钟剪切)，用 Horiba LA910颗粒大小分析仪测定其中值颗粒直径(容积基础，相对折 射率1.10，最低循环速度)。

结果：蛋清是在大量食品包括肉食产品如日本鱼浆(蟹腿类似物) 中使用的一种出色的胶凝剂。然而，象肉类蛋白质一样，蛋清较大豆蛋 白质昂贵。在模拟乳化肉食系统的条件下，表现最接近于蛋清的大豆蛋 白质成分是高热BC-SPI(表14)。一种解释如下：在约pH7.0和90℃时 制备高热BC组合物，此时发生蛋白质变性，变性蛋白质的聚集受到限 制。当变性蛋白质暴露于为形成精细胶体/聚集结构而优化的条件时，产 生最高粘度(或坚固性，或有关的水和脂肪结合)。对于BC这种胶凝条 件接近pH5.6-6.0，当预变性BC-SPI时，BC的胶凝能在较低的温度下发 生(于或低于天然BC的变性温度)。测试低热BC-SPI以与高热BC-SPI 对比。用低热BC-SPI制备的样品粘度与高热BC-SPI制备的样品粘度的 差，确定了通过高热处理预变性大豆蛋白质所增加的值。预热正常SPI所 增加的值较低，因为大豆球蛋白与BC形成复合物，改变了随后的胶体形 成反应的性质和数量(例如，最佳胶凝条件转移为不同pH值，在BC上有 较少的未聚集位点可用于胶体形成)。

也在低剪切条件(20秒超声处理而不是60秒)下比较了BC-SPI的乳 化和增稠性质。BC-SPI-酸-ha稳定的较小脂肪滴(并在加热处理乳剂 后)形成比商品大豆蛋白质分离物更高的粘度(表15)。

表14.与用商品大豆蛋白质分离物，pH 5.8、3.5％NaCl水溶液、5％蔗糖 水溶液制备的乳剂相比，加热处理的用BC-SPI制备的乳剂的粘度(单位 为mPa)。所有乳剂在加热处理前中值颗粒直径为0.9-1.1微米。

蛋白质分离物   粘度(70℃)5   秒剪切   粘度(70℃)5   分钟剪切   粘度(80℃)   5秒剪切   粘度(80℃)5   分钟剪切 蛋清   464(17)   327(14)   1800(375)   1157(287) 高热BC-SPI UFpH7-hb   222(21)   189(13)   341(10)   278(3) 高热BC-SPI-酸-hb   229(17)   199(6)   404(32)   317(9) BC-SPI UFpH7-hb   149   138   229   202 BC-SPI-酸-hb   142   126   193   167 ″高热″Com′l SPI A   74(4)   73(4)   149(25)   145(6) Corn′l SPI A   115(0)   111(3)   185(4)   164(3)

括号中的数字表示重复试验的标准差。

表15.蛋白质稳定的乳剂的中值颗粒直径，和加热处理的用BC-SPI和商 品分离物制备的乳剂的粘度。所有乳剂均经20秒超声处理制备，并含有 水相的3.5％NaCl和5％蔗糖、2％蛋白质、10％油，pH 5.8。在剪切5分钟 后记录粘度值。

 蛋白质分离物     颗粒大小(微米)     粘度(mpa)70C  BC-SPI-酸-ha，72C     1.6     27  BC-SPI-酸-ha，90C     1.6     32  BC-SPI-UF-hb，72C     1.6     57  Cntrl-SPI-酸-ha，72C     1.9     43  Cntrl-SPI-酸-ha，90C     2.2     58  Com′l SPI D     2.0     14  Com′l SPI E     1.9     11  Com′l SPI F     2.8     12

实施例8

pH5.6左右和低水相NaCl时加热诱导的胶体

样品制备：SPI(如实施例3和4所述)悬液在7％蛋白质和3.5％水相 NaCl中制备，并在冰箱中水合过夜。然后用稀HCl调节溶液的pH为 pH5.6。

动态粘弹性测定：用Bohlin VOR流变仪测定储能模量(Storage modulus)G’。细胞先保存于30℃。向待测细胞中加入样品溶液，用矿物 油覆盖以防止蒸发，并进行1Hz频率和0.025张力的剪切振荡(C14杯和锯 齿形浮子)。将温度由30℃提高到70或90℃，然后以1℃/分钟降低到20 ℃。

结果：BC-SPI-酸-ha成分在测试条件下的胶凝性质远高于对照SPI (G’有4.6-8倍差异)和商品SPI(G’有32-111倍差异)(表16)。

表16.BC-SPI、对照SPI和商品SPI的胶凝性质的对比。将胶体(由70或90 ℃)冷却到20℃时记录SPI胶体(7％蛋白质、0.5％NaCl水相，pH5.6)的 储能模量(G’)。

蛋白质分离物     70C max G′(Pa)     90C max G′(Pa) BC-SPI-酸-ha 90C     2,000     4310 对照SPI-酸-ha，90C     247     933 Com′l SPI-D     25     133 Com′l SPI-E     18     65

实施例9

BC大豆的氨基酸和蛋白质组成

将在Jerseryville，IL收获的BC大豆的蛋白质及氨基酸组成与58种不 同大豆系的平均组成相比较，如表17和18所示。将大豆(7-10克)磨细， 并由Ralston Analytical Laboratories，St.Louis，Missouri按照标准方法分 析氨基酸组成、蛋白质和湿度。富含β-伴大豆球蛋白的大豆含有高水平的 蛋白质、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸和赖氨酸，它们对于动物饲料和 婴儿配方食品特别有价值。

表17.以百分干基为单位显示氨基酸和蛋白质含量。原种系为Hartz 5350。

氨基酸     58个系的平均值     范围     原种系     高BC 赖氨酸     2.42     2.11-2.66     2.65     2.91 甲硫氨酸     0.49     0.41-0.57     0.55     0.62 半胱氨酸+甲硫氨 酸     1.03     0.84-1.19     1.14     1.44 苏氨酸     1.43     1.35-1.59     1.52     1.54 色氨酸     0.48     0.42-0.55     0.50     0.48 精氨酸 总蛋白质     2.74     41.0     2.36-3.51     37.4-44.8     2.91     41.0     3.40     43.0

表18.以mg/克蛋白质为单位的大豆氨基酸数据

氨基酸     58个系的平均值     范围     原种系     高BC 赖氨酸     59.6     49-66     64.6     68.0 甲硫氨酸     12.0     10.5-13.4     13.5     14.5 半胱氨酸+甲硫氨酸     25.3     21-29     28.0     33.8 苏氨酸     35.2     30-40     37.2     36.1 色氨酸     11.8     10.8-13.0     12.1     11.1 精氨酸     67.4     57-78     71.0     79.5

实施例10

大豆蛋白质分离物的氨基酸组成

材料与方法：BC-SPI、Cntrl-SPI和Com’l SPI-A如实施例4所述。由 Ralston Analytical Laboratories，St.Louis，Missouri按照标准方法分析 SPI的氨基酸组成、蛋白质和湿度。

结果：BC-SPI-酸符合FAO.WHO 2-5龄儿童的氨基酸要求(表 19)。BC-SPI-酸不富含半胱氨酸，因为在加工过程中在乳清中丢失大量 富含半胱氨酸的BBI。BC-SPI-UF的同型半胱氨酸组成是在高BC大豆中 高水平表达的BBI保留的结果(实施例4)。

表19.大豆蛋白质分离物的氨基酸组成

氨基酸   低BC-酸-   hb   BC-SPI-   酸-hb  BC-SPI-UF-  pH7hb  Cntrl-酸  -hb   Com′l   SPI-A  FAO.WHO  要求2-5岁龄 胱氨酸(过甲酸) 半胱氨酸   12.49   12.24     18.51   12.39   11.52 赖氨酸   14.16   13.04     14.40   11.70   12.56 总含硫氨基酸   26.64   25.29     32.91   24.08   24.08     25 碱水解色氨酸   14.27   11.21     10.51   11.70   11.18     11 氨基酸(Hi Vac) 天冬氨酸   124.53   119.11     117.83   114.11   111.29 谷氨酸   204.12   203.09     191.54   204.93   195.97 丙氨酸   47.71   45.08     43.77   38.19   41.24 异亮氨酸   48.49   47.71     44.69   41.74   42.40     28 苯丙氨酸   55.52   58.58     52.91   50.92   49.19 精氨酸   76.37   77.57     74.17   74.54   71.08 苏氨酸   41.36   37.53     37.83   34.17   35.94     34 脯氨酸   55.41   51.95     53.26   51.95   50.58 缬氨酸   52.95   48.97     44.80   43.69   44.59     35 亮氨酸   86.06   90.39     81.37   77.41   78.11     66 组氨酸   23.86   26.77     25.60   23.05   22.93     19 丝氨酸   53.62   55.26     54.63   50.92   49.77 甘氨酸   46.49   39.02     38.17   38.88   40.09 酪氨酸   41.25   39.24     38.29   35.44   37.10 赖氨酸   62.10   72.43     71.66   58.03   59.91     58 Phe+Tyr   96.77   97.83     91.20   86.35   86.29     63

含量以mg/g蛋白质表示。

实施例11

加工干酪类似物的物理性质和口感

材料：BC-SPI、部分水解的BC-SPI和Com’l SPI A如实施例4所述。 Com’l SPI G(Supro 710)获自Protein Technologies International，St. Louis，MO。酶凝酪素获自Century Foods Inc.，Sparta，WI；大豆油获自 International Food Products，St.Louis，MO；二水合柠檬酸钠和乳酸 (80％)获自Archer Daniels Midland Company，Decatur，IL；Alcalase 2.4L和Flavourzyme L获自Novo Nordisk Biochem North America，Inc.， Franklinton，NC。Stephan UMC5蒸煮器(Stephan Machinery Co.)装 备有一个含有HF 200硅油(Haake，Paramus，NJ)的循环水浴箱 (Haake，Paramus，NJ)。

干酪熔化试验：使用改进的Arnott法。用钢丝切割装置制造具有控 制尺寸的干酪类似物块状样品。制造后，将干酪块置于密封的塑料袋中4 ℃贮存直到试验。将样品块(14×14mm)置于玻璃培养皿中，加盖，并 置于100℃烤箱中15分钟。从烤箱中取出30分钟后测量每块的中心高度。 计算百分长度降低，并以0-100的标度报告为Arnott熔度。

干酪结构检测：TAX.T2结构分析仪(Texture Technologies Corp.) 使用TA-26切割金属丝探头。切开干酪块(15mm)，并在4℃下贮存于 密封塑料袋中。设置：检测模式是测定压缩力；预检速度为1.0mm/sec.； 检测速度为0.5mm/sec.；检测后速度为5.0mm/sec.；距离为90％，张力和 压力为5克。

湿度检测：将2个CEM玻璃纤维垫在CEM Lab Wave 9000仪器上去 皮重。将干酪类似物(3.5g)均匀涂抹于一个玻璃纤维垫的大面积上。用 另一个玻璃纤维垫覆盖样品，将其置于仪器中以40％功率4分钟和30秒。

用Alcalase处理的BC-SPI制造干酪的方法：

1.向50℃的水(355g)中加入BC-SPI(45-47g；干酪配方中蛋白 质的30％)，并用搅拌器充分混合直到光滑(55℃)。

2.用1N NaOH将溶液的pH调节为8.0。

3.向混合物中加入Alcalase(0.19g，0.51％×g蛋白质)，并搅拌。

4.将混合物置于约55℃的Stephan蒸煮器中，并以250转/分混合45 分钟，使大豆蛋白质有限水解。

5.然后将混合物转移到烧杯中，加热到90℃7-10分钟灭活酶。

6.向双煮锅中所含的柠檬酸钠、氯化钠、酶凝酪素和油(50℃)中 加入浆液。

7.将物质加热到66℃，加入乳酸(pH5.25-5.35)，搅拌混合物4分 钟，即物质达到80℃所需的时间。

8.将热物质转移到Stephan蒸煮器中(80℃)，并以250转/分混合3 分钟，然后注入一个塑料容器中，冷却5分钟，用盖密封，并在冰箱中贮 存(4℃)。

用未处理的SPI制造干酪的方法

也用BC-SPI、Com’l SPI A或Com’l SPI G制造加工干酪类似物，方 法是将水合蛋白质与其他成分在双煮锅中混合，并进行以上步骤7-8。

用Flavourzyme制造干酪的方法：

1.向已知重量的烧杯中加入BC-SPI(45g；干酪配方中蛋白质的 30％)和水(300g)。将烧杯置于去皮重的天平上。该重量记录为水解 前的总重量。

2.不调节该溶液的pH(pH6.4)。

3.向混合物中加入Flavourzyme(0.73g)搅拌。

4.将混合物置于约55℃的Stephan蒸煮器中，并以250转/分混合90 分钟，以使大豆蛋白质有限水解。

5.将混合物转移到步骤1的烧杯中，加热到90℃10分钟，并在冰浴 中冷却10分钟。使烧杯干燥，并置于去皮重的天平上。重量记录为水解 后的总重量。

6.向双煮锅中所含的柠檬酸钠、氯化钠、酶凝酪素和油(50℃)中 加入浆液。

7.将物质加热到66℃，向混合物中缓慢加入水(步骤1的水解前总 重量减步骤5的水解后总重量加另外55克水以补偿干酪制造过程中的蒸 发)和10克乳酸(80％)。通过加入可达2克的乳酸(80％)调节pH至 5.25-5.35。

8.将热物质转移到Stephan蒸煮器中(80℃)，并以600转/分混合4 分钟，然后注入一个塑料容器中，冷却5分钟，用盖密封，并在冰箱中贮 存(4℃)3天。

此干酪为18％蛋白质、27％脂肪和47.5％水分(表20)。干酪的水 分含量高于商品，而使之可能与模型系统中的多种大豆蛋白质成分的性 质相比较，其中某些成分在较低水分含量时混合较差。

结果：含有部分水解的商品SPl(Com′l SPI A和G)和Alacalase-处 理的BC-SPI的干酪类似物具有弹性而不是粉状的质地，熔化极类似于只 含酶凝酪素作为蛋白质来源的干酪(表21)。Flavourzyme-处理的BC- SPI具有类似于干酪涂抹食品的光滑且极易涂抹的质地。这种质地上的差 异用压迫试验定量(表22)。

表20.干酪类似物配方

            成分    重量    (克)     蛋白质     (克)     脂肪     (克)     水分     (克) 酶凝酪素(N×6.38＝79.9％蛋白质)    108.0     86.29 大豆蛋白质(N×5.71＝蛋白质含量)    45.0     35.93 大豆油    184.8     184.8 柠檬酸钠    15.0 氯化钠    10.5 水    300.0    (+25-55)*     300.0 乳酸(80％)    10-12     24 总量    675.3     122.2     184.8     320.8 配方百分数     18.0     27.0     47.5

*加入25或55克以补偿在干酪制造过程中因蒸发引起的水分丢失。

表21.干酪类似物组成、质地和熔化性质

    样品     质地     pH   湿度(％)   熔度(％)* Flavourzyme-处理的 BC-SPI-酸-ha 72C     光滑，易涂抹     5.80     47.0     57.1 Alacalase-处理的BC- SPI-酸-ha 72C     弹性     5.86     47.4     50.0 Alacalase-处理的BC- SPI-酸-hb 72C     弹性     5.69     46.5     50.7(1.0) BC-SPI-酸-hb     粉状     5.89     48.2     39(0.8) Com′l SPI A     粉状     5.86     47.2     41(3.4) Com′l SPI C     弹性     5.73     46.2     55(2.5) Com′l SPI G     弹性     5.92     47.7     65.5(1.7) 酶凝酪素     弹性     5.93     48.8     76.2

*在100℃烤箱中加热15分钟的14mm高干酪块高度的％降低。

括号中的数字显示两天数据的标准差。

表22.通过穿透表面进入干酪样品90％的金属线所需的工作测定的干酪 类似物的结构。

大豆蛋白质分离物                        工作面积(g)

Com’l SPI G                            1389+/-131

Com’l SPI C                            1263+/-87

Alacalase-处理的BC-SPI-酸-ha 72C        1233+/-273

Flavourzyme-处理的BC-SPI-酸-ha 72C      402+/-73

实施例12

作为营养和饮食添加剂的低甲硫氨酸、高精氨酸BC-SPI

含有BC-SPI的低甲硫氨酸、高精氨酸新型制剂可作为营养和饮食添 加剂，用于调节血浆中的总同型半胱氨酸水平。这些BC-SPI的制备使用 限制大豆蛋白之间的二硫化物交换反应的条件(例如使用还原剂如亚硫 酸氢钠)和超滤法以保留β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和γ-伴大豆球蛋 白。富含半胱氨酸和甲硫氨酸的低分子量蛋白质在通透物中通过膜。此 外，通过选择适当的生长条件，与其他大豆杂交，或通过改变大豆组 分，能产生甲硫氨酸缺乏的高BC大豆。通过酸沉淀法由在波多黎各生长 的高BC大豆制成的高β-伴大豆球蛋白的SPI具有高含量的精氨酸(75 mg/g蛋白质)和低含量的甲硫氨酸(低于11mg/g蛋白质)。

实施例13

减少臭味产生的还原的脂氧化酶BC-SPI

已知脂氧化酶通过催化多不饱和脂肪的氧化可引起大豆蛋白质中臭 味的产生(Nishiba，Y.等人，农业食品化学杂志43：738-741)。将Keisuke Kitamura研发的大豆品种的脂氧化酶无效性状(日本培育杂志41：507- 509，1991)转移到缺乏一种脂氧化酶基因的美国食用豆中，然后进一步与 富含β-伴大豆球蛋白的品种杂交，产生低臭味、缺乏全部三种脂氧化 酶、高β-伴大豆球蛋白的大豆品种。

降低臭味的另一种方法是降低大豆中葡糖苷酶的存在，因为这些酶 对大豆异黄酮的活性可提高臭味的强度(Okubo等人，生物科学、生物 技术与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)56：99-103；Matsuura等 人，食品科学杂志54：602-605，1989)。

尽管为了清楚与理解起见通过说明与实施例详细描述了上述发明， 但显然在本发明的范围内可进行某些改变和修改，仅由附加权利要求的 范围限制。

交叉引用参考文献

该申请是于1998年4月3日提交美国接收局的国际申请号 PCT/US98/06579的部分继续申请，命名为U.S.，要求对1997年4月4日提 交的美国临时申请系列号60/042,643的优先权。

发明背景