脂质体与无机材料的核－壳式纳米复合粒子及其制备方法和应用

技术领域：本发明涉及的是一种脂质体与无机材料复合粒子及其制备方法， 特别是一种脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子及其制备方法和应用，属于 生物医学工程领域。

背景技术：纳米生物技术是当前国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医 药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景。目前，国际上纳米生物技术在 医药领域的研究非常积极。而要发展纳米技术在生物医药领域的应用，还有一个 至关重要的问题，就是如何将纳米粒子在物理化学性质上的优良特性与生物活性 结合起来，如纳米粒子的输运特性与药物活性，纳米粒子的高比表面积与生物识 别的敏感性特异性等等。只有很好地解决这个问题，才有可能在生物医学应用中 充分发挥纳米技术的优势，取得突破性进展。但目前一直困难重重，主要是因为 纳米粒子巨大的表面能，及其引起的不稳定性，使它们与生物活性物质的作用缺 乏特异性和可控性，而要对表面进行修饰，各个粒子之间各个表面位置的反应很 不均匀，因而结果也很分散，不可控，所以，这是一个发展生物医学应用普遍面 临的瓶颈问题，关键就是要解决纳米粒子的表面稳定性，并提供良好的生物相容 性以及稳定的生物活性。经文献检索，至今尚未发现与本发明有相同或相类似的 文献报道。

发明内容：本发明针对现有技术的不足，提供一种脂质体与无机材料的核- 壳式纳米复合粒子及其制备方法和应用，本发明可制备一种形貌可控和粒度单分 散的稳定的纳米复合粒子，赋予复合粒子稳定可靠的生物反应界面，准确可控地 发挥其生物活性，从而实现在生物医学研究、药物传输以及生物制备等多方面的 应用。本发明以脂质体内水相为纳米反应器，合成具有核-壳式显微结构特点的纳 米复合粒子，以脂质等双亲性分子为膜材自组装成脂质体，以该脂质体形成的内 水相为反应器，以无机化合物为原料，在其中合成无机纳米粒子，形成以脂质体 为壳体，合成的纳米粒子为核的核-壳式复合粒子，所述的脂质体为粒度小于100 微米的以分子膜为隔离的包含内水相的自组装胶体粒子，其代表为磷脂脂质体， 所述的无机化合物原料为溶于水、或酸、或碱、或有机溶剂的固体、液体或气体， 所述的合成方法为化学合成。

纳米复合粒子是一组装物，其结构为：核心是合成的纳米无机粒子，壳体是 脂质体，核-壳间可包含内水相，核-壳中可包埋药物等生物活性物质，壳表面可 修饰了具有特定生物学特性的功能性分子；组装物包括：无机粒子核心为羟基磷 灰石、磷酸钙、碳酸钙、硫酸钡、钛酸钡、铝酸钡、铝酸镁、铝酸钙、铝酸锶、 银、金、锰、钴、镍、硅、锗、硒、以及半导体化合物，包括III-V族化合物半导 体、II-IV族化合物半导体、IV-VI族化合物半导体、V-VI族化合物半导体、氧化 物半导体、硫化物半导体、稀土化合物半导体，尤其是四氧化三铁、三氧化二铁、 铁黄、二氧化钛、二氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化银、硫化镉、硫化锌、 硒化镉、硒化锌、磷化铟、砷化铟、砷化镓、以及上述化合物的任意组合。

在复合粒子中可包含一种或多种药物、或诊断试剂或其他生物活性物质，在 脂质膜上可修饰一种或多种具有增强粒子稳定性，定向输运，控制降解和释放， 或特异性识别等作用的功能性分子，所述的药物和诊断试剂为小分子药物、蛋白、 核酸、微生物、细胞、同位素、荧光标记、磁粒等生物活性物质，它们被包埋在 无机粒子内、脂质体内水相中，或者脂质膜内部或表面，包埋方式为物理结合， 生物结合，或者化学结合，所述的功能性分子为各类聚合物分子，蛋白，核酸， 小分子配体，及其组合，它们与复合粒子表面的结合方法为物理作用，生物作用， 或化学反应。

脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子，其中：复合粒子的脂质膜的构成 为磷脂分子、lysolipid分子、糖脂(glycolipid)分子、甾醇(sterol)分子、 阳离子脂质分子、去垢剂(detergent)分子、以及双亲性聚合物等，及其任意组 合。

脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子，其中：复合粒子的无机材料为羟 基磷灰石、磷酸钙、碳酸钙、硫酸钡、钛酸钡、铝酸钡、铝酸镁、铝酸钙、铝酸 锶、银、金、锰、钴、镍、硅、锗、硒、以及半导体化合物，包括III-V族化合物 半导体、II-IV族化合物半导体、IV-VI族化合物半导体、V-VI族化合物半导体、 氧化物半导体、硫化物半导体、稀土化合物半导体，尤其是四氧化三铁、三氧化 二铁、铁黄、二氧化钛、二氧化硅、三氧化二铝、氧化锌、氧化银、硫化镉、硫 化锌、硒化镉、硒化锌、磷化铟、砷化铟、砷化镓、以及上述化合物的任意组合。

脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子，其中：复合粒子表面修饰的功能 分子为亲水性聚合物，疏水性聚合物，配体，抗体，细胞因子，多肽，核酸等， 及其任意组合，分子量为50-50000 Dalton.它们与表面分子的作用为物理作用， 生物作用，或化学键连，表面的修饰度为0-99％摩尔比。

脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子的制备方法为：先制备包埋待反应 的一种或多种离子的脂质体混悬液，除去脂质体外未被包埋的待反应的离子，然 后加入待反应的另一种或多种离子溶液，调节温度、pH等反应条件，拌以搅拌， 达到预计的反应目标后停止反应，用缓冲液冲洗，0-4℃存放，所述的混悬液的连 续相为去离子水或蒸馏水或0.9％的生理盐水或缓冲液，所述的脂质体由任意一种 常规方法制备，并控制粒径为10nm-10um间的任一单分散窄分布区间，所述的pH 反应值为pH0-pH14，所述的反应温度为0℃-100℃。

所述复合粒子中所包含的药物或其他生物活性物质是在脂质体制备之前或者 同时加入的。

所述复合粒子中所包含的药物或其他生物活性物质是在无机粒子合成时加入 的。

所述复合粒子中所包含的药物或其他生物活性物质是在无机粒子合成之后加 入的。

所述复合粒子中所包含的药物或其他生物活性物质是在复合粒子表面修饰之 前加入的。

所述复合粒子中所包含的药物或其他生物活性物质是在复合粒子表面修饰之 后加入的。

所述复合粒子表面的功能性分子是指在脂质体制备之前或同时加入的。

所述复合粒子表面的功能性分子是指在无机粒子合成时加入的。

所述复合粒子表面的功能性分子是指在无机粒子合成之后加入的。

所述复合粒子表面的功能性分子是指在复合粒子药物装载之前加入的。

所述复合粒子表面的功能性分子是指在复合粒子药物装载之后加入的。

所述复合粒子中的生物活性分子以及表面的功能性分子，与复合粒子的结合 方法包括物理作用，化学反应，生物作用等。

脂质体与无机材料的核-壳式纳米复合粒子，其应用范围为：生物医学研究、 药物输送、生物制备。

本发明具有实质性特点和显著进步，本发明是一种从纳米粒子的合成到纳米 粒子的组织与应用同时实现的新方案，实现了在生物医学研究、药物输送、生物 制备的应用。

具体实施方式：以下结合本发明的内容提供具体实施例：

实施例1：修饰了膜融合蛋白的羟基磷灰石-脂质体纳米复合粒子的仿生合成， 及其与癌细胞的作用

以大豆磷脂为脂质体膜材，采用薄膜分散法制备包埋Ca2+的脂质体，高压乳 匀，并反复经过100nm滤膜挤压，过离子交换柱除去脂质体外水相游离的Ca2+。 向脂质体混悬液中加入(NH4)2HPO4进行反应，磁力搅拌，半小时后，即得羟基磷灰 石-脂质体的核-壳式纳米复合粒子。将复合粒子离心分离，清洗，并过滤除菌， 重新混悬在PBS中。同时取80％摩尔比的PEG2000-PE，10％Rhodamine-PE与10％ pH敏感型溶膜蛋白GALA混合形成的胶束溶液，与复合粒子溶液等量混合，在4℃ 下搅拌24小时，再一次离心分离复合粒子。即得到PEG表面修饰的，含有膜蛋白 GALA的荧光复合纳米粒子。将该粒子加入细胞培养液中，可以观察到荧光复合粒 子被细胞吞噬，并由于GALA在endosome中随着pH的降低表现出膜融合作用，羟 基磷灰石被释放到细胞质中。

实施例2：包埋抗癌药物紫杉醇的四氧化三铁-脂质体复合纳米粒子的合成， 及其靶向输送功能

将65％摩尔比的DPPC，30％DOPE，5％PEG2000-PE和紫杉醇共溶于氯仿中，常 温下减压旋转蒸发挥净氯仿成薄膜，然后加入FeCl3溶液、或FeCl2溶液、或FeCl2 与FeCl3的混合溶液、或FeCl2与Fe(NO3)3的混合溶液，高压乳匀并反复经过100nm 滤膜挤压，过离子交换柱除去未包埋的Fe2+和Fe3+离子。然后滴加NaOH溶液或 NH3·HO，室温下磁力搅拌，即得表面带有PEG修饰的包埋紫杉醇的四氧化三铁- 脂质体核-壳式纳米复合粒子。将该粒子纯化，清洗，灭菌。在动物实验中，静脉 注射后，该粒子表面的PEG修饰能够明显延长其在血液中的循环时间，再通过外 加磁场的作用，可以使靶向部位检测到的紫杉醇药物浓度有很大的提高。

实施例3：结合特异性的四氧化三铁-脂质体复合纳米粒子的合成，及其在癌 细胞检测中的应用

制备70％摩尔比的DPPC，30％DOPE脂质体，并在内水相中包裹FeCl3溶液、或 FeCl2溶液、或FeCl2与FeCl3的混合溶液、或FeCl2与Fe(NO3)3的混合溶液，高压 乳匀并反复经过100nm滤膜挤压，过离子交换柱除去未包埋的Fe2+和Fe3+离子。然 后滴加NaOH溶液或NH3·HO，室温下磁力搅拌，即得到四氧化三铁-脂质体的核- 壳式纳米复合粒子。将该粒子纯化，清洗，灭菌，与EGFR抗体-PEG-DPPE与 mPEG-DPPE的溶液混合，在4℃下搅拌24小时，再一次离心分离复合粒子。即得 到PEG表面修饰的具有EGFR结合特异性的磁性复合纳米粒子。在动物试验中，该 粒子能够特异性地结合表面EGFR高量表达的细胞(多种癌细胞)，然后通过核磁共 振成象就可以检测这类细胞的存在及其密集部位的位置。