ＤＮＡ 고정화 기체의 재사용법{METHOD OF REUSING DNA-IMMOBILIZATION SUBSTRATE}
본 발명은 DNA 고정화 기체(基體)의 재사용법에 관한 것이다.
종래부터 유전자해석 등의 수단의 하나로서 DNA 진단용 기체가 사용되고 있다. DNA 고정화 기체란 다수의 DNA 단편이나 올리고머 뉴클레오티드를 고상(固相) 표면에 정렬시킨 것으로, 생화학적, 분자생물학적, 유전자공학적 연구 또는 의료검사에서 한 번에 다수의 미량 시료를 처리하여, 그 처리반응의 결과를 분광학적으로 신속ㆍ간편하게 할 수 있는 것으로서 최근 주목받고 있다. DNA 고정화 기체에 대해서는, 매우 고가임에도 불구하고, 불필요하게 된 후에 다른 DNA를 고정하여 재사용하는 방법에 대한 개발이 별로 진행되지 않았었다. 이 때문에 1회용으로 되는 경우도 있고, 또 재이용해도 이전에 고정한 DNA가 잔존되어 있거나 하여 실용에 적합하지 않은 경우도 있었다. 본 발명은 상기 문제점을 해결하여, 고가인 DNA 고정화 기체를 유효하게 활용하고, 또한 신품과 동일한 성능을 갖고 실용에도 지장이 없는 DNA 고정화 기체의 재사용법을 제공하여, DNA 고정화 기체의 사용자에 대한 경제적, 기술적 부담을 저하시키고자 하는 것이다.
도1은 고정화 및 재고정화의 확인 결과를 나타낸 영동사진이다. 발명을 실시하기 위한 최량의 형태 본 발명의 DNA 고정화 기체의 재사용법은, DNA가 올리고머 뉴클레오티드를 통해 산아미드 결합에 의해 고정화되어 있는 DNA 고정화 기체로부터 고정되어 있는 DNA를 제거하고 새로운 DNA를 고정가능한 상태로 하는 데에 있어서, 기체-DNA간 산아미드 결합을 산 또는 알칼리로 가수분해하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 재사용법의 대상이 되는 DNA 고정화 기체는 아미노기 수식된 기체 표면에 산아미드 결합을 통해 DNA가 고정화되어 있다. 아미노기를 화학수식한 기체란 다이아몬드, 규소, 유리 외에, 금, 은, 구리, 알루미늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속 ; 상기 금속과 세라믹스의 적층체 : 폴리카보네이트, 불소수지 등의 플라스틱 등과 같은 기체의 표면을 아미노화한 것이 바람직하다. 기체의 재료는 상기 열거한 것 이외에도 화학적으로 안정된 재료이면 사용할 수 있으며, 예를 들어 그라파이트, 다이아몬드 라이크 카본을 들 수 있다. 또 플라스틱과 상기 금속, 세라믹스, 다이아몬드 등의 혼합체이어도 된다. 또 규소, 유리, 금속, 그라파이트, 플라스틱 등의 표면에 다이아몬드나 다이아몬드 라이크 카본이 코팅된 것도 바람직하다. 이들 중 열전도성의 관점에서 다이아몬드가 바람직하다. 다이아몬드는 열전도성이 우수하고, 급속한 승온 및 냉각이 가능하기 때문에, DNA를 결합시킬 때의 가열 냉각을 반복하는 히트 사이클 시간을 효과적으로 단축할 수 있다. 구체적으로는 기체 재료의 열전도율이 0.1W/㎝ㆍK 이상, 바람직하게는 0.5W/㎝ㆍK 이상, 특히 바람직하게는 1.0W/㎝ㆍK 이상인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 다이아몬드를 기체로 한 소재로서 합성 다이아몬드, 고압 형성 다이아몬드 또는 천연 다이아몬드 등의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또 이들 구조가 단결정체 혹은 다결정체 중 어느 것이어도 상관없다. 생산성의 관점에서 마이크로파 플라스마 CVD법 등의 기상(氣相)합성법을 사용하여 제조된 다이아몬드를 사용하는 것이 바람직하다. 기체의 형성방법은 공지된 방법으로 실행할 수 있다. 예를 들어 마이크로파 플라스마 CVD법, ECRCVD법, IPC법, 직류 스퍼터링법, ECR 스퍼터링법, 이온플레이팅법, 아크이온플레이팅법, EB 증착법, 저항가열증착법 등을 들 수 있다. 또 금속 분말이나 세라믹 분말 등에 수지를 바인더로 하여 혼합함으로써 결합 형성한 것을 들 수 있다. 또 금속 분말이나 세라믹 분말 등의 원료를 프레스 성형기를 사용하여 압축한 것을 고온에서 소결(燒結)한 것도 들 수 있다. 기체 표면은 의도적으로 조면화(粗面化)되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 조면화 표면은 기체의 표면적이 증가하여 다량의 DNA 등을 고정시키는 데에 적합하기 때문이다. 기체의 형상은 평판형상, 실형상, 구형상, 다각형상, 분말형상 등 특별히 한정되지 않는다. 또 그 크기도 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서는 다이아몬드 기체와 같은 경우는 다이아몬드와 다른 물질의 복합체 (예를 들어 다이아몬드와 다이아몬드 라이크 카본의 2상체) 를 함유하는 것이어도 된다. 이와 같은 기체 표면의 아미노기 수식은, 예를 들어 염소가스 중에서 고체 지지체에 자외선 조사하여 표면을 염소화하고, 이어서 암모니아가스 중에서 자외선 조사하여 아미노화함으로써 달성된다. 아미노기로 수식된 기체 표면의 카르복실산 수식은, 적당한 산클로리드를 사용하여 카르복실화하고, 말단의 카르복실기를 카르보디이미드 혹은 디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드와 탈수 축합함으로써 실행할 수 있다. 이 방법을 채용하는 경우의 탈수 축합에 대해 일례를 들어 설명하면, 표면을 화학수식하여 카르복실기를 갖는 상태의 고체 지지체를 카르보디이미드 또는 디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드 혹은 p-니트로페놀을 용해한 1,4-디옥산용액 중에 침지시켜 세정한 후 건조시킨다. 이와 같이 하여 N-숙신이미드에스테르기나 p-니트로페놀에스테르기를 말단에 갖는 탄화수소기가 결합된 기체가 얻어진다. 또 상기 방법의 보다 바람직한 방법으로서, 미리 다이아몬드 기체 상에 형성된 제1급 아미노기에, 활성화 디에스테르의 일방의 에스테르기를 탈수 축합시켜 형성시켜 두는 방법을 들 수 있다. 활성화 디에스테르란 상기 활성 에스테르기를 2개 갖는 것을 말한다. 에스테르기는 활성화 디에스테르 중의 양 단에 위치하는 것이 바람직하고, 탄소수 0∼12, 바람직하게는 0∼6인 것이 바람직하다. 에스테르기를 제거한 골격 부분은 직쇄상 포화지방산이 바람직하다. 활성화 디에스테르를 사용한 방법으로서, 동일하게 염소화하고 이어서 아미노화한 후, 이 아미노기에 대해 미리 숙신산 (디카르복실산) 을 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르화하여 얻어지는 활성화 에스테르를 반응시켜 원하는 기체를 얻는 방법을 들 수 있다. 이와 같이 카르복실산 수식된 기체 표면에 올리고머 뉴클레오티드를 통해 DNA를 고정화한 것이 본 발명의 재사용법의 대상이다. 고정화하는 DNA에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 단일쇄의 cDNA (complementary DNA : 상보적 DNA), 이중쇄의 gDNA (genomic DNA : 염색체 DNA) 중 어느 것이어도 되고, 또 사슬길이에 대해서도 특별히 한정되지 않는다. 올리고머 뉴클레오티드에 대해서는 결합하려는 DNA의 종류에 따라 적절히 선택한다. 단일쇄의 cDNA를 고정화하는 경우에는, mRNA를 주형으로 하는 역전사반응을 이용하기 위해, 올리고머 뉴클레오티드로서 역전사반응의 프라이머가 되는 올리고 dT 등을 사용할 수 있다. 한편 이중쇄의 gDNA의 고정화는 제한효소 절단부위를 이용하여 실행할 수 있으나, 이 경우에는 올리고머 뉴클레오티드로서 DNA 결합측에 제한효소 절단부위를 갖는 것을 사용하게 된다. 본 발명에서는 불필요하게 된 DNA 고정화 기체를 산 또는 알칼리 용액에 침지하고, 기체-DNA간 산아미드 결합을 가수분해에 의해 분리시켜 아미노기 수식 표면으로 한다. 가수분해에 사용하는 산은 염산 등의 광산인 것이 바람직하나, 산아미드 결합을 가수분해할 수 있는 것이면 광산 외에 유기산이어도 된다. 또, 알칼리를 가수분해에 사용하는 경우는 알칼리 금속의 수산화물을 사용하는 것이 바람직하나, 알칼리 금속의 탄산염 등 알칼리성을 나타내는 염류를 사용해도 된다. 가수분해의 조건은 산가수분해의 경우에는 6M 염산 중에 DNA가 고정화되어 있는 기체를 넣고, 80∼100℃에서 수시간∼24시간 반응시켜 기체-DNA간 산아미드 결합을 안전하게 가수분해한다. 알칼리 가수분해의 경우에는 2M NaOH 중에 DNA가 고정화되어 있는 기체를 넣고, 실온에서 수시간∼24시간 반응시켜, 기체-DNA간 산아미드 결합을 가수분해한다. 산을 사용하여 가수분해를 실행한 경우에는 기체 표면이 음이온의 상태로 되어 있다. 따라서 알칼리에 침지하여 음이온을 제거하고 수세(水洗)하는 것이 바람직하다. 한편, 알칼리를 사용하여 가수분해한 경우에는 수세만으로 충분하다. 이에 의해 DNA 고정화 기체의 기체-DNA간 산아미드 결합이 가수분해되어, 아미노기 수식 표면이 노출된 상태로 된다. 이와 같은 상태로 되면 상기와 동일하게 하여 카르복실산 수식, 올리고머 뉴클레오티드 고정, DNA를 고정하여 기체를 재사용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 검토한 결과, 여러 번이나 PCR 증폭에 이용한 DNA 고정화 기체로부터의 DNA의 완전 제거 방법을 발견함과 동시에, DNA의 재고정화가 가능해지는 것도 발견하였다. 즉 제 1 항에 기재된 본 발명은, DNA가 올리고머 뉴클레오티드를 통해 산아미드 결합에 의해 고정화되어 있는 DNA 고정화 기체로부터 고정되어 있는 DNA를 제거하고 새로운 DNA를 고정가능한 상태로 하는 데에 있어서, 기체-DNA간 산아미드 결합을 산 또는 알칼리로 가수분해하는 것을 특징으로 하는 DNA 고정화 기체의 재사용법을 제공하는 것이다. 제 2 항에 기재된 본 발명은, DNA가 산아미드 결합에 의해 고정화되어 있는 DNA 고정화 기체를, 기체-DNA간 산아미드 결합을 산으로 가수분해한 후, 알칼리에 침지하여 음이온을 제거하고, 기체 표면을 아미노기 수식 표면으로 하는 것을 특징으로 하는 DNA 고정화 기체의 재사용법을 제공하는 것이다. 제 3 항에 기재된 본 발명은, DNA가 산아미드 결합에 의해 고정화되어 있는 DNA 고정화 기체를, 기체-DNA간 산아미드 결합을 알칼리로 가수분해하고, 기체 표면을 아미노기 수식 표면으로 하는 것을 특징으로 하는 DNA 고정화 기체의 재사용법을 제공하는 것이다. 이 경우에 있어서, 제 4 항에 기재된 본 발명과 같이 가수분해에 사용하는 산은 광산 및 유기산의 1종 또는 2종 이상의 산인 것이 바람직하다. 또 이 경우에 있어서, 제 5 항에 기재된 본 발명과 같이 가수분해에 사용하는 알칼리가 알칼리 금속의 수산화물 및/또는 알칼리 금속의 염류인 것이 바람직하다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다. 실시예 1 기체로서 다이아몬드 기체를 사용하였다. 이하 다이아몬드 기체를 간단히 기체라고 한다. 6N 염산 중에 DNA를 고정한 기체를 넣고 95℃, 5시간 반응시켜 가수분해한 후 기체를 수세하였다 (3회 정도). 이 상태에서 기체는 염산염으로 되어 있기 때문에 0.1N 칼륨용액에 침지하여 염소 이온을 제거한다. 기체를 수세하고 (3∼5회 정도), 아미노기 수식 표면으로 하였다. 클로로포름 1㎖ 중에 0.1m㏖의 숙신산클로라이드를 첨가하고, 그 중에 상기 재이용 가능하게 된 아미노기 수식 기체를 삽입하고 실온에서 30분 반응시켰다. 이어서 기체를 클로로포름으로 세정ㆍ건조시키고, 순수(純水) 중에 1시간 침지하고, 마지막에 순수로 세정하고 (3∼5회 정도) 숙신산 수식 표면으로 하였다. 0.1m㏖의 수용성 카르보디이미드와 0.1m㏖의 히드록시숙신이미드를 90% 1,4-디옥산 1㎖에 용해시키고, 숙신산 수식한 기체를 침지하여 휘저으면서 고온에서 15분 반응시켰다. 기체를 꺼내 1,4-디옥산 (2∼4회 정도) 및 순수 (3∼5회 정도) 로 세정하였다. 제한효소 (EcoRI) 부위를 포함하고, 또한 5' 말단에 (dA) 3 를 함유하는 올리고머 뉴클레오티드를 용해한 수용액 (농도:500f㏖/㎕ 기체 1장에 대해 50㎕) 에 기체를 침지하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 고정화한 올리고머 뉴클레오티드와 상보적 배열을 가진 올리고머 뉴클레오티드 수용액 (농도=500f㏖/㎕ 기체 1장에 대해 50㎕) 에 4℃, 30분 침지하여 하이브리다이즈시켰다. EcoRI 반응액 중에 기체를 침지하여 37℃, 1시간 반응시켜, 반응액을 4℃로 냉각한 후, 기체를 꺼내어 4℃로 냉각한 멸균수로 세정하고 (3∼5회 정도), 다음에 4℃로 냉각시킨 60% 에탄올 수용액으로 세정한 후에, 가볍게 (에탄올이 증발할 때까지) 건조시켰다. λDNA를 EcoRI 로 처리하여 얻어지는 21kbp 프래그먼트를 첨가한 리가아제 용액에 기체를 침지하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜 DNA를 고정화시켰다. 가수분해 및 DNA의 재고정화를 확인하기 위해 21kbp λDNA 프래그먼트 내의 500bp 프래그먼트를 증폭하는 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행하고, DNA 증폭의 유무에 의해 확인하였다. 도1에 그 결과를 나타낸다. 도1은 고정화 및 재고정화의 확인 결과를 나타낸 영동사진이다. 도1에서 영동사진의 하부에 기재한 부호의 M은 100bp 래그마커를 나타내고, 레인 0 은 가수분해 전의 기체를, 레인 1, 2 는 가수분해 후의 기체를, 레인 3, 4 는 재고정화 후의 기체의 결과를 각각 나타낸다. 도1에 나타낸 바와 같이 가수분해 후의 기체는 가수분해에 의해 DNA 가 기체로부터 분리되고, 재고정화에 의해 DNA가 고정화되어 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 재사용방법에 의하면, 불필요하게 된 DNA 고정화 기체에 대해, DNA를 완전히 제거하여 새로운 DNA를 결합시킬 수 있다. 또 본 발명의 재사용법은 특별한 시약이나 장치를 필요로 하지 않으므로, 간편하고 저가로 실행할 수 있다. 또한 고가의 DNA 고정화 기체를 재사용할 수 있으므로, 유전자진단 등의 DNA 고정화 기체를 이용하는 진단이나 연구를 경제적으로 진행시킬 수도 있다. 따라서 본 발명의 재사용법은 의료분야나 분자생물학, 생화학, 유전자공학의 각 분야에서 유용하다. |
