Carrier for combinatorial compound library

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野本発明は一般的にコンビナトリアル化合物ライブラリーに関する。 具体的には本発明はコンビナトリアル化合物の合成に使用する特有の符号を持つ担体並びにこれらの担体を用いて製造されるコンビナトリアル化合物ライブラリーに関する。 さらに、本発明はコンビナトリアルライブラリー構成化合物の構造の新規な解読方法に関する。

【０００２】 発明の背景最近、極めて多様な分子ライブラリーを合成するための容易なコンビナトリアル技術を考案することに大きな関心が払われてきた。 このようなライブラリーの主要な有用性は、新規なリード化合物の追求の中で様々な生物学的、薬理学的又は化学的活性についてこれらのライブラリーをスクリーニングすることができることにある。 コンビナトリアル技術は、本質的には、化学的、生物学的又は生合成的手順を用い、化学的構築材料即ちシントンを多数組合せて収集したものの体系的集合に基づいている。 このような集合によって作られる個々の異なるライブラリー構成化合物の潜在的数「Ｎ」は、各工程「ｂ」に対し利用可能な異なるシントンの数及び反応スキームにおける合成工程の数「ｘ」の関数として、次の式、即ち、Ｎ
＝ｂ ^xに従って計算することができる。 こうして、２０の異なるアミノ酸（即ち、シントン）を用いて構築された９ぺプチドのライブラリーは２０ ⁹即ち、５．
１×１０ ¹¹もの異なるライブラリー構成化合物を含み得るであろう。

【０００３】 同様な手順はオリゴヌクレオチドライブラリーの作成についても上記のギャロップら，1994に記述されている。

【０００４】 コンビナトリアルライブラリーは多数の方法により作成しうる。 例えば、フルカら, (1988, 14the Int. Congr. Biochem., Prague, Czechoslovakia 5: 47, 1
991 、Int. J. Pept. Protein Res. 37 : 487-493 ) 及びラムら，(1991, Natur
e 354: 82-84) により最初に記述された「分割−処理−再混合」法又は「分割合成」法があり、そしてアイヒラーら, (1995, Medicinal Research Reviews 15( 6) : 481-496)及びバルケンホールら, (1996, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 :
2288-2337)により後に論じられている。 この分割合成法は、ポリマービーズなどの複数の固体支持体を合成の各工程に対し利用可能なシントンの数を表すｎ個の等画分（例えば、２０個のＬ−アミノ酸、４個の異なるヌクレオチドなど）に分割する工程、それぞれのシントン１個を対応する画分の各ポリマービーズに結合させる工程、及び次に全ての画分のポリマービーズを混ぜて徹底的に混合する工程を含む。 このプロセスは全部でｘサイクル繰り返すとＮ ^Xまでの異なる化合物の推計学的集合ができる。 こうして、結合がアミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質又は複素環化合物等の付加反応を含み、シントンが天然型、合成化合物、又はそれらの組合せである場合、この合成により、膨大な数の分子的に多様な化合物を合成することができる。

【０００５】 従って、このように作製された分子ライブラリーは、目的の受容体ターゲットと相互作用する新規なリガンドの同定用にスクリーニングされうる。 ライブラリーのサイズと構造的多様性が増大するにつれ、任意の所与の受容体ターゲットに対して、随意に分子レパートリーをスクリーニングする工程により、有力なリガンドを首尾よく同定する確率は疑いなく増大するであろう。 しかしながら、このタイプの大きなライブラリーを作製することにともなう固有の難題は任意の選択されたコンビナトリアルライブラリー構成化合物の反応履歴を決定し、それによりその構造を解読する能力にある。 固体支持体が多数そして工程及び／又は処理方法が多数の場合、この「解読」手法は特に困難である。 高い処理量及び迅速な分析が要求される多くの実例において、この問題は従来の方法では処理し難い。

【０００６】 目的のコンビナトリアルライブラリー構成化合物を検出し単離したい場合、従来の分割合成技法は上記の難題にぶつかる。 この点については、質量分光法又はＨＰＬＣなどの技法により構成化合物を同定する前にまずこの固体支持体から該構成化合物を切断することが必要である。 これは時間がかかりそして煩雑であり、時には切断が不可能である。

【０００７】 幾つかのグループが、コンビナトリアルライブラリー構成化合物の合成で使用されるものと異なり直交する反応に依存する化学符号を用いて、これらの先行技術の欠陥を克服しようと試みてきた。 例えば、ヤンダ（1994, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 91:10779-10785 ）は、コンビナトリアルライブラリー構成化合物の各合成工程後に同定用タグを固体支持体に独立に結合する方法を記載している。 一続きの連続的な化学工程を通して、同定用タグの配列が固体支持体上で、合成された化合物と平行して構築される。 コンビナトリアル合成が完了すると、任意の各個体支持体が受けた操作の順序はこのタグ配列を個々に分析することにより遡って追跡できる。 従って、この様式における同定用タグを使用すれば、コンビナトリアルライブラリー構成化合物の合成において個々の固体支持体がどのシントン反応を受けたかを同定できる方法が提供される。 この同定用タグは、その一連の合成において固体支持体が特定のシントン反応を受けたその工程をも記録する。
この点については、国際公開公報WO93/06121を参照しうる。 該公報でドーヴァーらは固体支持体上でコンビナトリアル化合物ライブラリーを合成するための一般的な推計学的方法を開示する。 そのライブラリーの構成化合物は該支持体から切断され可溶性のライブラリーを提供しうる。 該同定用タグは、付随粒子を用い又は用いずにライブラリーの構成化合物に、又は該構成化合物に付着したリンカーに、又はその上で該構成化合物が合成される固体支持体に、又は該構成化合物を担う粒子に付着させた第二粒子に直接付着させてもよい。

【０００８】 ドーヴァーら（前出）はコンビナトリアルライブラリーの形成で利用されうる同定用タグの非常に広いタイプに言及しているが、彼らが提供する唯一の実験的証拠は、配列決定又はハイブリダイゼーションにより同定可能なタグとしてのオリゴヌクレオチドの使用である。 彼らは、微量のオリゴヌクレオチドしか分析用に利用できない場合、オリゴヌクレオチドのタグをＰＣＲにより増幅することにも言及している。 しかし、このような同定方法は多大の時間を要し非効率的であることが理解されよう。 例えば、ＰＣＲの使用はＰＣＲ産物の汚染につながるおそれがあり、ドーヴァーら（前出）により記載されているこの問題を克服するためにさらなる測定を導入する必要が生ずる。 増幅されたＤＮＡを配列決定する必要もあり、これは該同定手法にさらなる工程を加えることになる。

【０００９】 米国特許第5,721,099 号において、スティルらは化合物の複雑なコンビナトリアル化学ライブラリーを構築するプロセスを開示しており、このプロセスで、各化合物は一つの反応シリーズにより作製され、個々の固体支持体と結合し、該支持体には互いに異なる四つの識別可能な同定因子の組合せが結合している。 この組合せは、分析可能なタグ成分、及び選択的に切断されて該タグ成分を解離できる連結成分を含む固有の方法を提供する。 各同定因子又はその組合せは、該固体支持体に結合した化合物に対する該反応系列における個々の工程での情報を符号化する。 該同定因子は互いに組合わせて用いられ、比較的多数の反応産物を符号化するために比較的少数の同定因子の使用を可能とする二次以上の符号化システムを形成する。 しかしながら、スティルら（前出）の方法は該固体支持体上の該タグ成分を直接同定するものではない。 この点で、コンビナトリアルライブラリーの分析前に各々のタグ成分が支持体から切断されることが不可欠であり、従って時間がかかり且つ非効率的な少なくとも一つのさらなる工程が生ずることになる。 ゆえに、ドーヴァーらの方法に関連する同様な不都合がスティルらの方法にも当てはまる。

【００１０】 上述した不都合に加えて、ユンダ（1994、前出）、ドーヴァーら（前出）及びスティルら（前出）により記載されている技法等の化学的符号化法は、同定用タグの平行した直交的合成に依存し、該合成はコンビナトリアル合成の完了にかかる時間を実質的に増やし且つ該合成を妨げる可能性を有する。

【００１１】 固体支持体を分析用分光計に直接据えることによりライブラリー構成化合物を解読することができる分光学的符号化法も記載されている。 これは化学的な切断工程を必要としない。 例えば、ゲイセンら（1996,Chem.Biol.3:679-688）は、反応履歴を符号化するために同位体の異なるタグを用いる方法を記載している。 質量分光計を用いて、多重に同位体標識されたタグにより供される比率用シグナルを測定することにより該反応履歴を解読する。 この方法の不都合は、多重に同位体標識された市販の試薬が比較的数少ないことである。

【００１２】 固体支持体の吸収又は蛍光放射スペクトルが測定される光学的符号化法も記載されている。 例えば、ペプチドのコンビナトリアル合成におけるビーズの標識化のために発色団タグ及び／又は蛍光タグの両方の使用を記載しているセバスチャンら（1993, Pept. 1992 Proc. 22nd Eur. Pept. Symp. 63-64）、カンピアンら（1994, In Innovation and Perspectives on Solid Phase Synthesis Epton, R
., Birmingham: Mayflower, 469-472 ）及びイグナーら（1997, Chem. Commun.
735-736 ）が参照されうる。 この使用はビーズの吸収又は蛍光放射スペクトルを単に読み取ることによりライブラリー構成化合物の構造を解読するという利点を提供するが、大きなライブラリーの符号化には多数の発色団又は蛍光団の使用を要し、おそらくスペクトルの重なりが障害となろう。

【００１３】 ヤマシタとヴァインストック（国際公開公報WO95/32425）は、コンビナトリアルライブラリーを符号化するために、（ｉ）少なくとも２の因子により異なる強度を有する蛍光標識されたタグ及び／又は（ｉｉ）様々な比率で使用できる複数の異なる蛍光タグのビーズへの結合を開示している。 このようなビーズは、分割合成法により一連のコンビナトリアルライブラリーを構築するためにフローサイトメトリーとともに使用されうる。 この点で、第一コンビナトリアルライブラリーは、コンビナトリアル合成の第一ステージにおけるシントンのそれぞれについての選択を符号化するために（ｉ）及び(ii)に従ってタグ化されたビーズ上で特定の一式の反応順序を実施することにより調製される（「ステージ」という用語はコンビナトリアルライブラリー構成化合物の一連の合成の一工程に対応する）
。 第二コンビナトリアルライブラリーは、第一ライブラリーと実質的に同一の特定の一式の反応順序から調製される。 ここで、タグ化ビーズは第一反応の前に混合しそして分離し、第二ステージにおけるシントンの各選択を符号化するために第二反応順前に該ビーズを区分けする。 該区分け工程の特徴は、該ビーズが同様にタグ化されるビーズの群に区分けされることである。 別のライブラリーは、該区分け工程が該コンビナトリアル合成における異なるステージの前に実施されることを除いて、第二ライブラリーの調製に従って調製される。 従って、該シリーズで構築されるライブラリーの数は、該コンビナトリアル合成におけるステージの合計数に等しい。 ここで、異なるステージが各ライブラリー中で符号化される。 合成が終了した後、各ライブラリーは生物学的活性について試験され、種々のシントンのどれが活性に重要でありどれが重要でないかを明らかにするために構造活性相関（ＳＡＲ）研究に類似する集合分析が各ライブラリーについて実施される。 この方法はリード構造の提供に関して利点を有するが、該コンビナトリアル合成に使用されるステージ数に匹敵する多数のライブラリーを構築し分析する必要があり、これは煩雑で時間がかかる。

【００１４】 ケイとトレーシー（国際公開公報WO97/15390）は、化学的に不活性な固体粒子が独特の機械読み取り可能な符号でそれぞれ標識されている物理学的符号化システムを記述している。 該符号は二進数符号でありうるが、二進数以上の符号及び文字と数字の組合せ符号も意図される。 該符号は、ピット、穴、くぼみ、溝、もしくは刻み目、又はこれらの任意の組合わせを含む表面変形から成りうる。 このような変形はミクロ機械加工によって付加される。 別法としては、該符号は該粒子自体の形状に存してもよい。 コンビナトリアル合成の第一相及び機械読み取り可能な符号を含む第二相を含む固体粒子が例として挙げられ、該第二相は第一相上に重ね合わされうるか又は第一相の内部に包み込まれうる。 粒子上の微細な符号には信号を送り、顕微鏡に基づく画像の取込み及び処理システムを用いて該符号を読取る。 ケイとトレーシーの符号化システムは、機械読み取り可能な符号がコンビナトリアル合成の処理工程間で「進行中に」を読取られうるため、各ビーズについて該処理順序又は検査痕跡を記録することができるという点で利点がある。 しかしながら、このシステムには、該固体粒子を作製し該符号を読取るために特殊な目的で構築された機械が必要とされる点で幾つかの不都合がある。 例えば、該固体粒子上への符号の変形を行うには、高価なマイクロ機械技術、必要な粒子の外面的形態を設計するための計算機援用設計（ＣＡＤ）手段、並びに該粒子の形状を描くための適切な写真平板マスクの製造を必要とする。 さらに、所与の符号を正確に決定し証明するために、幾つかの異なる方向から粒子を観察するための特殊な画像処理システム及びソフトウェアを利用する必要がある。

【００１５】 上述した既知の方法の多数の不都合並びに該方法では応じられない多数の要望が本発明で取り組まれ、以下の本明細書でより詳しく記載するように本発明は上述した方法を凌ぐ多くの利点を提供する。

【００１６】 本発明の概要本発明の一側面によれば、その上で化合物を合成できる担体が提供される。 該担体はそれと一体的に関連している少なくとも二つの属性を持っており、該属性の一つが該担体の形状、又は表面変形以外のものであるという条件付きで、該属性は該化合物の合成中に検出可能及び／又は定量可能であり、かつ、該合成の前、間、及び後において該担体を同定する符号を定めるものである。

【００１７】 該属性の少なくとも一つは該担体の内部に（within or internally）含まれることが好ましい。

【００１８】 該属性の少なくとも一つは電磁放射関連属性であることが好ましい。

【００１９】 該電磁放射関連属性は、蛍光放射、ルミネセンス、燐光発光、赤外線放射、光散乱及びＸ線散乱を含む電磁散乱、光透過、光吸収、並びに電気インピーダンスから成る群より選択されるものであることが好ましい。

【００２０】 該電磁放射関連属性は、一つ以上の選択された波長又は一つ以上の選択されたベクトルの入射光で担体を照射することにより検出できる光を放射し、光を透過し又は光を吸収する属性であることが好ましい。

【００２１】 別の一側面において、本発明は、検出可能なように異なっている担体の集団を含み、その上で複数の異なる化合物が合成され得る複数の担体を提供する。 該担体のそれぞれは、該合成の前、間及び後でそれぞれの担体を他の担体と区別して同定し且つ該担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられる符号を持つものであるが、該属性の一つは該担体の形状又は表面変形以外のものであることを条件とする。

【００２２】 さらなる別の一側面において、本発明は、検出可能なように異なっている担体の集団を含む複数の担体を製造する方法に存する。 該方法は、下記の工程、すなわち （ａ）異なる符号を持つ複数の担体を調製する工程であって、各符号がそれぞれの担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられるものである工程、 （ｂ）各担体の該属性を検出及び／又は定量する工程であって、それにより各担体に対し符号を割り当てる工程、 （ｃ）特有の符号を持つ担体を同定する工程、 （ｄ）類似の符号を持つ担体を同定する工程、及び （ｅ）特有の符号を持つ担体を特有でない符号を持つ担体から区別する工程であって、それにより検出可能なように異なっている符号を持つ集団を含む複数の担体を提供する工程、 を含む。

【００２３】 さらなる別の一側面において、本発明は、広く上述した方法から得られる検出可能なように異なっている符号をもつ複数の担体に存する。

【００２４】 さらなる側面において、本発明は、コンビナトリアルライブラリーを合成し解読する方法を提供する。 該方法は、下記の工程、すなわち （ａ）その上で複数の異なる化合物を合成できる複数の担体を複数の反応容器の中に推計学的方法で配分する工程であって、該複数の担体は検出可能なように異なっている担体の集団を含み、そのそれぞれの担体は該合成の前、間及び後でそれぞれの担体を他の担体から区別して同定し且つ該担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられる符号を有するものであるが、該属性の一つは該担体の形状又は表面変形以外のものであることを条件とする工程、 （ｂ）該複数の反応容器の中の特定の反応容器中への、検出可能なように異なっている担体の個々の移動を追跡するために、該複数の担体の符号を決定し記録する工程であって、該符号が工程（ｄ）の前に決定されるものである工程、 （ｃ）各反応容器の中の担体を一つのシントンと反応させる工程、 （ｄ）各反応容器からの担体を集める工程、 （ｅ）複数の反応容器の間に推計学的方法で担体を配分する工程、 （ｆ）各反応容器の中の担体を別の一つのシントンと反応させる工程、 （ｇ）該複数の反応容器の中の特定の反応容器への、検出可能なように異なっている担体の個々の移動を追跡するために、該複数の担体の符号を記録する工程であって、該符号が工程（ｅ）又は工程（ｆ）の後に記録されるものである工程、 （ｈ）各反応容器からの担体を集める工程、及び （ｉ）必要なときは工程（ｅ）から工程（ｈ）までを繰り返してコンビナトリアル化合物ライブラリーを作成する工程であって、該ライブラリーの構成化合物が検出可能なように異なっている担体と関連するものであり、該検出可能なように異なっている担体の受ける反応の順序を同定するため、該記録工程により提供される追跡データを用いることにより、検出可能なように異なっている担体の符号が解読されるものである工程、 を含む。

【００２５】 本発明はさらなる側面において前記の方法により作製されるコンビナトリアル化合物ライブラリーに関する。

【００２６】 本発明は、さらなる側面において、 （ａ）複数の異なる化合物を含むコンビナトリアル化合物ライブラリーであって、各化合物が少なくとも一つの複数担体に結合し、該複数担体は検出可能なように異なっている担体の集団を含み、その担体それぞれは、対応する化合物の合成の前、間及び後でそれぞれの担体を他の担体から区別して同定し且つ該担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられる特有の符号を持つものであるが、該属性の一つは該担体の形状又は表面変形以外のものであることを条件とするライブラリー、及び （ｂ）検出可能なように異なっている担体それぞれが受けた反応の順序を同定するための特有の符号のそれぞれに関する追跡データ、 を含むキットに存する。

【００２７】 発明の詳細な説明

【００２８】 １ 定義本明細書で用いられるとき「担体」という用語は、化合物合成に適した部位をもつ固体支持体を含み、そして幾つかの実施態様ではタグの付着をも包含する。
該担体は任意の適切なサイズ又は形状又は組成を有しうる。 担体は、サイズ、形状、又は組成が不均一であることが好ましい。 一般的に、該担体のサイズは約１
ｎｍから１ｍｍの間の範囲にある。 該担体は球状、立方体、直角柱、角錘、円錐、卵型、シート型又は円筒型に形状化されうる。

【００２９】 本明細書で用いられるとき「化合物」という用語は、一連のシントンを含む分子を指し、該シントンは既知の又は考えられる合成操作により形成されうる及び／又は組立てられうる任意の構造単位を含む。 従って、本発明の化合物はシントンの化学的付加又は酵素的付加から形成される。 このような化合物には、例えば、核酸、多糖類、リン脂質、及び例えばα−、β−、若しくはω−アミノ酸を含むペプチドの、直鎖状、環状、及び分枝状のオリゴマー又はポリマーであって、
例えば既知の薬物が上記のいずれかに共有結合しているヘテロポリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレン スルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート若しくは本開示を検討する際当業者には容易に明らかな他のポリマーが含まれる。 例示した数及び列挙した化合物の型は単なる例示であってこれらに限定するものではない。

【００３０】 「担体と一体的に関連している特性」又は「それと一体的に関連している特性」は、担体の特性並びに／又は担体に付着した一つ以上の元素、分子、基、タグ等の特性を意味する。

【００３１】 「マーカー」とは、形状、サイズ、色、光学密度、示差吸光度若しくは光の放射、化学的反応性、磁気的若しくは電子的に符号化された情報、又は任意の他の識別可能な属性を含むがこれらに限定されない一つ以上の識別可能な属性を有する任意の分子又は分子の群を意味する。

【００３２】 本明細書で用いられるとき、「シントン」には、互いに結合して所望の化合物を形成しうる一連の分子の任意の構成化合物が含まれる。 例えば、シントンは、
アミノ酸、カーボネート、スルホン、スルホキシド、ヌクレオシド、炭水化物、
尿素、ホスホン酸塩、脂質及びエステルを含みうる。 また、シントンは、例えばケイ酸塩及びアルミノケイ酸塩等の無機単位を含みうる。 従って、本発明に有用のシントンには、例えばペプチド合成の例では、一式のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又は合成アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。 シントンの異なる基本セットが本発明の化合物の合成における連続工程で使用されうることも理解されよう。

【００３３】 本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises ）」及び「含む（compriisng）
」という用語は、記載の個体若しくは工程又は個体群若しくは工程群を包含することを意味するが任意の他の個体若しくは工程又は個体群若しくは工程群を除外することを意味するわけではないことが理解されよう。

【００３４】 ２ 本発明の担体本発明は、少なくとも部分的に、その上で化合物を合成できる担体であって、
該担体がそれと一体的に関連している少なくとも二つの属性を持っており、その属性は該化合物の合成中に検出可能及び／又は定量可能である担体に存する。 該属性は、化合物の合成の前、間、及び後において該担体を同定する符号を定めるものであるが、該属性の一つが該担体の形状、又は表面変形以外のものであることを条件とする。 検出可能及び／又は定量可能な複数の属性、好ましくは光学的に検出可能及び／又は定量可能な属性の使用により、本発明の担体は、先行技術の他の担体と比較してより多くの「予め符号化された」情報を提供するので、符号化できるより大きなサイズのコンビナトリアルライブラリーを提供する。 この「予め符号化された」情報は、従来のフローサイトメーターによって読取られ得るものであり、そしてこの情報は以下の本明細書で記載するように、コンビナトリアル工程における個々の担体の合成の履歴を追跡するために使用できる。 本発明者らは、検出可能な及び／又は定量可能な担体の属性の多様性が大きければ大きいほど、担体の大集団における担体の解読又は解像の程度が高くなることを見出した。 この点について、検出可能な及び／又は定量可能な担体の個々の属性は、該担体を他と区別して同定するために必要な情報の少なくとも一部を提供する。 このような属性の数が多いほど、所与の担体について収集可能な情報をより詳細に同定でき、これは他の担体と該担体を識別するために使用されうる。

【００３５】 本発明は、上記の予め符号化された集団を含む複数の担体も包含する。 従って、この集団の個々の担体は、該合成の前、間、及び後において各担体を区別して同定し且つ該担体と一体的に関連している少なくとも二つの検出可能及び／又は定量可能な属性により特徴付けられる符号を有する。 ただし、該属性の一つは該担体の形状、又は表面変形以外のものであることを条件とする。 従って、担体の該集団の多様性は、相互に関して検出可能な属性の異なる組合わせを有する該集団の担体に帰し、そしてこの属性は該担体の各々に対し特有の符号を提供するために用いられる。

【００３６】 本発明の担体は、分割−処理−再混合法を含まないコンビナトリアル化学的手法などの多くの適用に用いられうる。 しかしながら、このような集合は、分割−
処理−再混合法を含むコンビナトリアル化学に用いることが好ましい。

【００３７】 該担体はコンビナトリアル合成用の基剤を提供できる任意の固体材料を含みうる。 例えば、該担体はポリマービーズなどのポリマー支持体であってもよく、該ビーズは１〜５％のジビニルベンゼンで架橋させたポリスチレンから形成されることが好ましい。 ポリマービーズは、ヘキサメチレンジアミン−ポリアクリル樹脂、並びに関連樹脂、ポリ[ Ｎ−｛２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル｝]
アクリルアミド（即ちワンキュウ）、シリカ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリ（ハロメチルスチレン）ビーズ、ポリ（ハロスチレン）ビーズ、ポリ（アセトキシスチレン）ビーズ、ラテックスビーズ、ポリエチレングリコール／ポリスチレン等のグラフト共重合体ビーズ、孔の制御されたガラスビーズ等の多孔性ケイ酸塩、ポリ（アクリロイルサルコシンメチルエステル）ビーズ等のポリアクリルアミドビーズ、Ｎ, Ｎ' −ビス−アクリロリルエチレンジアミンで随意に架橋させたジメチルアクリルアミドビーズ、剛体若しくは半剛体の表面をもつ材料を与える架橋ポリスチレン又はフッ化エチレンポリマーを含む疎水性ポリマーで被覆されたガラス粒子、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）樹脂、Wang
（商標）樹脂、パム樹脂、Merrifield（商標）樹脂、ＰＡＰ及びＳＰＡＲＥポリアミド樹脂、アクリル酸で官能基をつけたポリエチレン、珪藻土／ポリアミド（
ペプシンＫ）、PolyHipe（商標）、ＰＳ／ポリジメチルアクリルアミド共重合体、ＣＰＧ、ＰＳマクロビーズ及び Tentagel 商標）、ＰＥＧ−ＰＳ／ＤＶＢ共重合体から形成されてもよい。

【００３８】 該ポリマービーズは、例えばゴルドンら（1994, J.Med.Chem. 37(10):1385-14
01）に論じられているような当分野で既知のピン又は小片等の他の適切な支持体と取り替えられうることも理解されよう。 該ビーズは、当分野で知られる小球、
円盤、毛細管、中空繊維又は針も含みうる。 参照により本明細書にインコーポレートされる国際公開公報WO93/06121を参照してもよい。 該公報には本発明で使用する担体を構成しうる広い範囲の支持体が記載されている。 例えば、これらの担体は、ラテックス、ガラス、金又は他のコロイド金属粒子等を含む適切な材料から形成されうる。 適切な担体の例を開示している国際公報WO95/25737又はWO97/1
5390を参照してもよい。 これは参照により本明細書にインコーポレートされる。

【００３９】 本発明の複数の担体は任意の適切な方法により調製されうる。 ポリマー粒子及びセラミック粒子を含むコロイド粒子が担体として使用される場合、このような担体のコロイド分散液は安定化されていることが好ましい。 コロイド安定化をもたらす典型的な方法は、例えばハンター，アール・ジェイ（１９８６、「コロイド化学の基礎」、オックスフォードユニバーシティープレス、メルボルン）及びナッパー，ディー・エイチ（１９８３、「コロイド分散液のポリマー安定化」、
アカディミックプレス、ロンドン）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書にインコーポレートされる。 この点で、コロイド安定性に最も広く利用される非イオン性ポリマーの作用は立体的安定化であり、この安定化は、該コロイド粒子の表面上に吸着又は付着したポリマー分子により付与される。 当業者は、異なる安定化機構の組合わせにより安定性を付与することが可能であることを認めるはずである。 例えば、該粒子上の表面電荷は静電安定化によりコロイドの安定性を付与でき、そして付着した高分子電解質は静電機構及び立体機構の組合わせ（「電気立体的安定化」）により安定性を付与できる。 溶液中にある遊離のポリマーもコロイド安定性に影響を及ぼし得る。 遊離ポリマーによる安定化はよく立証されており（ナッパー、１９８３、前出）、「枯渇安定化（depletion
stabilisation)」と呼ばれる。

【００４０】 コロイド分散液の立体的安定化を利用することが好ましい。 この点について、
立体的安定化は、静電安定化を凌ぐ幾つかの特有な利点を供するため広く利用されている。 例えば、一つの利点は、非イオン性連鎖の寸法が該電解質の濃度によってほとんど変化しないため、水溶性の立体的に安定化された分散液は電解質の存在に比較的鈍感であることである。 これは、イオン強度に強く依存する電気的二重層の空間的伸長と明らかに対照をなす。 約 10 ^-2 mol/ dm ^-3より大きなイオン強度で、電気的二重層の厚さは静電反発力がもはやファンデルワールス引力より影響力が小さくなる程度まで縮んだことは明らかである。 これは電解質添加直後に起こる静電気的に安定化された分散液の凝固の原因となる。 他の利点は水性及び非水性の分散媒体の両方で等しく効果があることである。 これは、無極性の分散媒体で比較的効果のない静電安定化と対照をなす。 さらに、立体的安定化は分散相の大容量画分及び小容量画分の両方で等しく効果があり、大容量画分の分散液は比較的低い粘度を示す。 立体的に安定化された分散液の他の利点には、幾つかの適用において望ましい属性でありうる良好な凍結−解凍の安定性、並びに静電気的に安定化された分散液には一般的でない可逆的な凝集能が挙げられる。

【００４１】 任意の適切な安定化部分は、コロイド分散液を安定化するために使用されうる。 コロイド安定化に影響を与える典型的な安定化部分は表Ａに示す。

【００４２】

【表Ａ】

【００４３】 先行技術を凌ぐ本発明の重要な前進は、少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性の組合わせをもつ担体であって、該属性の一つが該担体の形状、又は表面変形以外のものである担体を提供することである。 該属性は、例えば以下の本明細書に記載される方法により該担体が受ける複数の反応工程を容易に解読できる符号を特徴付ける。 好ましい実施態様において、該属性の少なくとも一つは該担体の内部に含まれる。 これは、該担体上の化合物合成に必要な溶媒に該属性を曝すことを低減するため、該属性に対応する符号化情報はより安定であり、該符号のより高い再現性をもたらす。

【００４４】 担体の属性の少なくとも一つは、原子又は分子の蛍光放射、ルミネセンス、燐光発光、赤外線放射、光散乱及びＸ線散乱を含む電磁散乱、光透過、光吸収並びに電気インピーダンスから成る群より適切に選択される電磁放射関連属性であることが好ましい。

【００４５】 蛍光放射は、該担体と付着した又は該担体内に含有される一つ以上の蛍光マーカーの励起に起因しうる。 二つ以上の蛍光マーカーが利用される場合、該マーカーは同一であってもよく、その場合該マーカーは様々な量の蛍光団を含むため強度で識別される。 また、該マーカーは異なってもよく、その場合マーカーは１：
１の比率若しくは様々な比率で存在する。 この点でヤマシタら（国際公開公報WO
95/32425）を参照してもよく、これは参照により本明細書にインコーポレートされる。

【００４６】 本発明に従って使用されうる蛍光団の典型には、ドーヴァーら（参照により本明細書にインコーポレートされる国際公開公報WO93/06121）によって論じられたものが含まれる。 好ましくは蛍光色素が使用される。 本発明の担体へ組入れるために任意の適切な蛍光色素が使用されうる。 例えば、多数の蛍光色素を記載している米国特許第5,573,909 号（シンガーら、参照により本明細書にインコーポレートされる）及び第5,326,692 号（ブリンクレイら、参照により本明細書にインコーポレートされる）を参照してもよい。 米国特許第5,227,487 号、第5,274,11
3 号、第5,405,975 号、第5,433,896 号、第5,442,045 号、第5,451,663 号、第
5,453,517 号、第5,459,276 号、第5,516,864 号、第5,648,270 号及び第5,723,
218 号に記載される蛍光色素を参照してもよく、これらは全て参照により本明細書にインコーポレートされる。

【００４７】 一つ以上の蛍光色素は、ポリマー微粒子又はセラミック微粒子などの微粒子に組入れられることが好ましい。 このような微粒子は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされる同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００９４４
でトラウとブライアントにより開示されているように、コロイド相互作用の使用により該担体に付着されうる。 蛍光性のポリマー又はセラミック微粒子はコンビナトリアル合成用の担体を含むことが好ましい。

【００４８】 該ポリマー微粒子は、スチレン、アクリル酸塩、並びに不飽和の塩化物、エステル、酢酸塩、アミド及びアルコールを含む種々の重合可能なモノマー、ポリスチレン（臭化ポリスチレン等の高密度ポリスチレンラテックスを含む）、ポリメチルメタクリレート及び他のポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロライド、
ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロライド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロライド、並びにポリジビニルベンゼンから調製できるが、これらに限定されない。 該微粒子はスチレンモノマーから調製されうる。 セラミック微粒子はシリカ、アルミナ、チタニア又は任意の他の適切な透明物質から構成されうる。 シリカ粒子を使用することが好ましい。 シリカ微粒子を作製する適切な方法は、例えばラルフ・ケイ・イラー、１９５５年による「シリカ及びケイ酸塩のコロイド化学」（コーネルユニバーシティープレス）及び米国特許第5,439,62
4 号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書にインコーポレートされる。

【００４９】 蛍光色素は、例えばシンガーら（前出、本明細書で引用される参照文献を含む）、カンピアンら（1994年、「固相合成における革新及び展望」、イプトン, アール、バーミンガム：メイフラワー、469 −472 、参照により本明細書にインコーポレートされる）及びイグナーら（1997年、Chem.Commun.735-736 、参照により本明細書にインコーポレートされる）に開示されているように、重合可能なモノマー及び色素含有コモノマーの共重合又は適切な有機溶媒中にある適切な色素誘導体の懸濁水溶液への添加など、当分野で周知の任意の適切な方法により微粒子に組入れられうる。 また、蛍光性の球面領域を少なくとも一つ有する蛍光微粒子が作製されうる。 このような粒子は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされる米国特許第5,786,219 号（ザングら）に記載されたように調製されうる。 好ましい実施態様において、一つ以上の蛍光色素が一つの微粒子内に組入れられる。 蛍光色素の表面付着と比較して、微粒子内への色素の組入れは、コンビナトリアル合成で使用される種々の溶媒への該蛍光色素の物理的接触を少なくするので、担体−蛍光色素複合体の安定性を高める。

【００５０】 異なるポリマー材料及び／又は異なるセラミック材料を含む微粒子も調製されうる。 例として、このような微粒子は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされるカルソら（1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 8523-8524）に記載されるように、一つ以上の異なるポリマーの複数の層を含みうる。 異なる屈折率又は不透明度を有するこの型のポリマー粒子が調製されてもよく、これは本発明により検出可能な属性として使用されうる。 または、微粒子は、複数の層を含みうる。 好ましくは、例えば参照により本明細書にインコーポレートされるファンブラデレンら（1992, Langmuir 8 : 2921-2931 ）に記載されるようなセラミック材料の複合多層を含みうる。 異なるセラミック材料の原子比率は、本発明の検出可能な及び／又は定量可能な属性として使用されうる。 この点について、米国特許第
5,439,624 号を参照してもよく、これは波長分散分光法による粒子のＳｉ／Ａｌ
比の測定を開示している。

【００５１】 蛍光放射を分析する任意の適切な方法が本発明に包含される。 この点で、本発明は、例えばラコヴィックら（1997, Biophys. J., 72: 567、参照により本明細書にインコーポレートされる）により開示されているような２−光量子及び３−
光量子時間分解能蛍光分光法、例えばエリクソンら（1993, Biophys. J., 2 : 64
、参照文献により本明細書にインコーポレートされる）により開示されているような蛍光寿命画像化法、及び例えばユヴァンら（1997, Biotechnology et alia 3: 1-18 ）により開示されているような蛍光共鳴エネルギー移動法を含む技法を意図するが、これらに限定されない。

【００５２】 ルミネセンス及び燐光発光は、当分野で知られる適切なルミネセンス標識又は燐光発光標識からそれぞれ生じうる。 この点で、このような標識を同定する任意の光学的手段が用いられうる。

【００５３】 赤外線放射は適切な赤外線色素から生じうる。 本発明で使用されうる赤外線色素の例としては、参照により本明細書にインコーポレートされるルィスら（1999
, Dyes Pigm. 42( 2): 197 ）、タワら（1998, Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 4
88（有機固相材料の電気的、光学的及び磁気的性質ＩＶ）、885-890 ）、ダネシュヴァールら（1999, J. Immunol. Methods 226( 1-2): 119-128 ）、ラパポートら（1999, Appl. Phys. Lett. 74 (3): 329-331）及びデュリックら（1993, J. R
aman Spectrosc. 24 (5): 281-5）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。 該赤外線色素に信号を送るため任意の適切な赤外線分光法が使用されうる。 この点で、例えば、ラマンら（1998, J. Org. Chem., 63: 6196 、
参照により本明細書にインコーポレートされる）により記載されるフーリエ変換赤外分光法が使用されうる。

【００５４】 電磁散乱は、好ましくは光及びＸ線を含む入射電磁放射の回折、反射、偏光又は屈折から生じうる。 この点について、該担体は、例えば前述したように異なる屈折率などの種々の散乱特性を持つ一連の担体を提供するため異なる材料から形成してもよい。 電磁散乱を検出及び／又は定量する任意の適切且つ認知された技術方法が利用されうる。 この点で、本発明は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされるファン・ヘルデンとブリジ（1980, Journal of Colloidal a
nd Interface Science 76: 419-433）に記載された光散乱におけるコントラスト変化率を使用する方法も意図する。

【００５５】 電磁放射関連属性以外の属性を利用してもよいことは当然である。 このような属性には該担体の大きさ及び形状が含まれる。 例えば、担体、好ましくは粒子、
より好ましくは微粒子は球状、立方体、直角柱、角錐、円錐、卵型、シート型又は円筒型に形状化されうる。 微粒子が使用される場合、典型的には約0.01μｍから約150 μｍの直径を有することが好ましい。 この点で、担体を横切る電気インピーダンスを測定し該担体の体積（クールター体積）を評価することができる。

【００５６】 また、該担体の検出可能な及び／又は定量可能な属性は、ピット、穴、くぼみ、溝、もしくは刻み目、又はこれらの任意の組合わせを含む一つ以上の該担体における表面変形を含みうる。

【００５７】 該属性は発色団標識にも存在する。 このような発色団を含む適切な担体は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされるテントリオら（1980, Journa
l of Colloidal and Interface Science 77: 419-426）に記載されている。 ラマンマイクロプローブ、マイクロ蛍光光度計、又は顕微吸収分光光度計を用いる有機色素及び染料の非破壊的分析のための適切な方法は、例えば参照により本明細書にインコーポレートされるギニュー，ビイ（1989, Cent. Rech. Conserv. Doc
uments Graph., CNRS, Paris, Fr. Stud. Conserv 34 (1): 38-44）に記載されている。

【００５８】 また、該属性は、鉄及び磁鉄鉱を含む磁気材料、若しくは当分野で知られる音響後方散乱により検出可能な属性を含みうる。

【００５９】 異なる検出可能な符号を有する担体の数は、該担体と一体的に関連している検出可能な及び／又は定量可能な異なる属性の数に依存することは上記から理解されよう。 例えば、符号の異質性は、単に異なる形状及び／若しくは大きさの担体の使用、並びに／又は上記の異なる材料から形成された担体の使用によって達成されうる。 または、該符号の異質性は、それと一体的に関連している異なるマーカー及び／又は異なるマーカーの組合わせを有する担体の使用により促進されうる。 符号の異質性は、二つ以上の連結した固体支持体（例えばビーズ又は粒子）
を有する担体の使用によっても増大しうる。

【００６０】 本発明の担体は、固体支持体上で実施できる任意の化学反応型に適用できる。
このような化学反応には、例えば １ ブタジエンの捕捉を含む[ ２＋２] 付加環化； ２ イソオキサゾリン、フラン及び改変ペプチドの合成を含む[ ２＋３] 付加環化； ３ ジオール、アルデヒド及びケトンの固定を含むアセタール形成； ４ アルデヒドの誘導、プロパンジオール類の合成を含むアルドール縮合； ５ アルデヒドの誘導を含むベンゾイン縮合； ６ ベンゾジアゼピン及びヒダントイン、チアゾリジン、ターン擬似体（-turn
mimetics）、ポルフィリン、フタロシアニンを含む環縮合； ７ ジエステルの環化を含むディークマン環化； ８ アクリル酸の誘導を含むディールス−アルダー反応； ９ アルケンへのアルコールの付加を含む求電子付加反応； １０ アルデヒドの誘導を含むグリニャール反応； １１ 二置換アルケンの合成を含むヘック反応； １２ インサイチュでの酸化ニトリルの合成を含むヘンリー反応（[ ２＋３] 付加環化を参照）； １３ フェロモン及びペプチドの合成を含む接触水素化（アルケンの水素化）； １４ スルファニルケトン、ビシクロ[2.2.2] オクタンの合成を含むミハエル反応； １５ アリールエーテル、ペプチジルホスホン酸塩、及びチオエーテルの合成を含むミツノブ反応； １６ キノロンの合成を含む求核芳香族置換； １７ アルデヒド及びケトンの合成を含む酸化； １８ ペンチノールとのノルボルナジエンの環化を含むパウゼン−カンド（Paus
en-Khand) 環化付加； １９ ヘリセンの合成を含む光化学環化； ２０ アルデヒド及び塩化アシルの誘導を含む有機金属化合物との反応； ２１ カルボニル基、カルボン酸基、エステル基及びニトロ基の還元を含むＳｎ
化合物及び複合水素化物での還元； ２２ カルボキシル基の還元を含むソオアイ(Soai)反応； ２３ ビフェニル誘導体の合成を含むスティル(Stille)反応； ２４ 置換シクロヘキサノンの合成を含むストルク(Stork) 反応； ２５ キノロンの合成を含む還元的アミノ化； ２６ フェニル酢酸誘導体の合成を含むスズキ(Suzuki)反応；及び ２７ アルデヒド、フェロモン及びスルファニルケトンの反応を含むウィッティッヒ、ウィッティッヒ−ホルナー反応 が含まれる。

【００６１】 Ｎ−置換されたグリシン、ポリカルバメート、メルカプトアシルプロリン、ジケトピペラジン、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、１−３ジオール、ヒドロキシスチルベンゼン、Ｂ−ラクタム、1,4 −ベンゾジアゼピン−２−５−ジオン、ジヒドロピリジン及びジヒドロピリミジンの製造又は合成を記載しているパーテルら（
１９９６年４月、DDT 1(4) : 134-144 ）を参照してもよい。

【００６２】 例えばローア（1995, Angew. Int. Ed. Engl. 34 : 881-884 ）で論じられているポリケチドの合成を参照してもよい。

【００６３】 本発明の化合物ライブラリーの化学合成又は酵素合成は担体上で行われる。 従って、当業者は、該担体を構築するために用いられる材料が主として幾つかの化学反応基の何れかに付着するように誘導するための受容力並びに化合物合成の化学との両立性により制限されることを理解するであろう。 他に特筆しない限り、
このような担体が誘導されうる化学反応基は、各化合物の固相合成に通常使用されるものであるので、当業者にはよく知られている。 例えば、これらの担体材料は、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＳＯＨ、ＳＳＨ、又は硫酸塩基などの官能基又はリンカーを含むように誘導されうる。

【００６４】 担体と共に用いるリンカーは、フルッチテルら（１９９６年、前出、この全開示は参照により本明細書にインコーポレートされる）の表２に記載される塩基に安定なアンカー基又はフルッチテルら（１９９６年、前出）の表３に記載される酸に安定なアンカー基から選択されうる。 適切なリンカーは、参照により本明細書にインコーポレートされる国際公開公報WO93/06121にも記載されている。

【００６５】 一般的に、ペプチド化学用に開発されたアンカーは塩基か又は弱酸に安定であるが、大部分はカルボン酸の固定化用のみに適している。 しかしながら、特定の官能基の可逆的付着のためには既知のアンカーが誘導化され最適化されなければならず、必要ならば全く新しいアンカーが開発されなければならない。 例えば、
アルコールの固定化用のアンカー基は（６ヒドロキシメチル）−３，４ジヒドロ−２Ｈ−ピランであり、それによりそのナトリウム塩は求核置換反応によりクロロメチル化 Merrifield （商標）樹脂に共有結合する。 アルコールは、ジクロロメタン中のピリジニウムトルエン−４スルホン酸塩（ＰＰＴＳ）の存在下において求電子付加により該支持体に結合する。 得られるテトラヒドロピラニルエーテルは塩基に安定であるが９５％トリフルオロ酢酸によるエーテル交換反応により切断され得る。

【００６６】 ハロゲン化ベンジルは光に不安定なスルファニル基で置換されたフェニルケトンアンカーに結合しうる。

【００６７】 本発明の担体及び／又は工程を用いて調製された化合物は、当分野で周知の方法により目的の活性についてスクリーニングされうることも理解されよう。 例えば、このようなスクリーニングは、例えばニーデルら（1993, Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 90: 10700-10704、参照により本明細書にインコーポレートされる）、ドーヴァーら（前出）、及びケイとトレーシー（国際公開公報WO97/15390、参照により本明細書にインコーポレートされる）により記載されたようにフローサイトメトリーにより達成されうる。

【００６８】 このようにスクリーニングされうる化合物には、細胞膜受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素、毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン、糖、補因子、ペプチド。 酵素基質、麻酔剤及びステロイドを含む薬物、抗体、モノクローナル抗体、特異的抗原決定基に反応する抗血清を含むタンパク質、核酸、レクチン、多糖類、細胞膜並びに細胞小器官が含まれる。

【００６９】 本発明は、化合物としてハイブリダイゼーションによる配列（ＳＢＨ）又は遺伝子発現分析のための複数の特有なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドも包含する。 当業者は、ＳＢＨがより長いターゲットのＤＮＡ鎖についての相補鎖を探索するために一式の短い特定配列のオリゴヌクレオチドプローブを用いることを認識するはずである。 このハイブリダイゼーションの様式は該標的ＤＮＡ配列を再構築するために使用される。 従って、本発明の文脈において、未知配列の蛍光標識一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の水溶液を、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの化合物ライブラリーと接触させる、すると該ｓｓＤＮＡ上の配列と相補的なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの配列を含む担体上でのみ該ｓｓＤＮＡの吸着（ハイブリダイゼーション）が生じる。 これらの担体は、例えばフローサイトメトリー、蛍光光学顕微鏡又は任意の他の適切な技法により同定されうる。

【００７０】 ひとたび所望の活性を有する化合物が得られると、その上で該化合物が合成された担体の受けた反応工程の順序は、例えば以下の本明細書に記載されるように単に該担体の追跡データを分析することにより解読されうる。 従って、目的の化合物を定めるシントンの配列が確かめられうる。 この配列を含む分子は、当分野で知られる常套手段（例えば、アミノ酸合成又はオリゴヌクレオチド合成）により合成できる。

【００７１】 ３ 特有に符号化された担体の濃縮さらなる別の側面において、本発明は、検出可能なように異なっている担体を有する担体の集合を含む複数の担体を製造する方法に存する。 本方法は、（ａ）
異なる符号を持つ複数の担体を製造する工程であって、各符号がそれぞれの担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられるものである工程、（ｂ）適切な検出手段及び／又は定量手段を用いて各担体の該属性を検出する工程であって、それにより各担体に対し符号を割り当てる工程、（ｃ）該検出手段及び／又は定量手段により検出可能に及び／
又は定量可能に解読又は解像できる特有の符号を持つ担体を同定する工程、（ｄ
）類似の符号又は特有でない符号を持つ担体を同定する工程、並びに（ｅ）特有の符号を持つ担体を特有でない符号を持つ担体から区分けする工程であって、それにより検出可能なように異なる符号を持つ集団を含む複数の担体を提供する工程を含む。

【００７２】 検出可能な複数の特有な担体の提供は、該検出手段及び／又は定量手段により検出可能な及び／又は定量可能なパラメータの数、並びにその検出及び／又は定量の解像度によって決まる。 本発明者らは、この点で、検出可手段及び／又は定量手段により検出及び／又は定量できる属性の数が多くなればなるほど、検出可能なように異なる符号を有する担体の数が多くなり且つ符号化されうるライブラリーが大きくなることを見出した。 言い換えれば、検出手段及び／又は定量手段により検出可能な及び／又は定量可能なパラメータの数が多くなるほど、各担体について得られる情報が多くなるので、該手段により識別可能な又は解読可能な特有の符号の数が多くなる。 従って、検出工程及び定量工程（工程（ｂ））は、
各担体の少なくとも三つ、好ましくは少なくとも四つ、より好ましくは少なくとも五つ、並びに最も好ましくは少なくとも六つの異なる属性が符号の記録のために検出及び／又は定量されることをさらに特徴とすることが好ましい。

【００７３】 該同定工程（工程（ｃ）及び工程（ｄ））は、担体の該検出可能な及び／又は定量可能な属性を分析するための任意の適切な方法又は装置の使用により達成される。 これらの工程は、通常光学パラメータを検出するフローサイトメトリーによって達成することが好ましい。 例えば、フローサイトメーターは前方散乱（これは担体の大きさを測定する）、側方散乱（これは粒子の屈折率及び大きさに感度がある（シャピロ、１９９５年、「実践的フローサイトメトリー」、第三版、
ブリスバン、ヴィレー−リス））、並びに蛍光放射を測定するために使用されうる。

【００７４】 当分野で知られるように、フローサイトメトリーは臨床及び研究の用途で高処理量の技法であるが、コンビナトリアル化学には関係がない。 フローサイトメトリーは、細胞又は他の粒子が水流体に懸濁され一つ以上のレーザービームの通路を横切るとき、これらの物理的特性及び化学的特性を迅速に分析するものである。 個々の細胞又は粒子は該レーザービームを遮るので、個々の細胞又は粒子により放射された散乱光及び蛍光が例えば以下の本明細書に記載される任意の適切な追跡アルゴリズムを用いて検出され記録される。

【００７５】 最新のフローサイトメーターの図を図１に呈示する。 最新のフローサイトメーターはこれらの作業を３０００細胞／粒子ｓ ^-1まで実行でき、より最新のフローサイトメーターは１００，０００細胞／粒子ｓ ^-1を処理できる。 フィルター及び二色鏡の光学配列を使用することにより、蛍光の異なる波長を同時に分離し検出できる。 さらに、異なる励起波長をもつ幾つかのレーザーが使用されうる。 そのため、例えば個々の細胞の細胞内特性及び細胞外特性を標的とし研究するために、種々の蛍光団が使用できる。 散乱光の測定により、目的の特異的集団に属する個々の細胞の大きさ、形状、及び粒度も分類できる（シャピロ, 1995，前掲) 。

【００７６】 本発明の方法で使用されうる適切なフローサイトメーターは、単一の励起レーザー、通常は４８８ｎｍのスペクトル線上で１５ｍＷで操作するアルゴンイオン空冷レーザーを用いて、五つの光学パラメータ（表Ｂを参照）を測定しうる。 より最新のフローサイトメーターは、アルゴンイオンレーザー（488 nm又は514 nm
）に加えてＨｅＮｅレーザー（633 nm）又はＨｅＣｄレーザー（325 nm）などの複数の励起レーザーを用いることができる。 異なる光学的に検出可能な及び／又は定量可能な属性に対応する担体の光学パラメータは、フローサイトメーターにより測定され、定性的情報及び／又は定量的情報のマトリックスを提供し、該担体の符号（又は多元空間におけるアドレス設定能）を提供しうる。

【００７７】

【表Ｂ】

【００７８】 例えばビゴスら(1999, Cytometry 36: 36-45) は、三つの励起レーザーを用いる11パラメータのフローサイトメーターを構築し、細胞を免疫表現決定する( すなわち分類する) 目的で前方散乱および側方散乱測定に加えて、識別可能な九つの蛍光団が使用できることを証明した。 現在、商業的に利用可能なパラメータの最大数は、前方散乱、側方散乱、及びそれぞれが五つの蛍光検出器を持つ三つの励起レーザーの１７である。 全てのパラメータが適切に使用できるか否かは、吸収係数、量子収量、及び全ての蛍光団間のスペクトルの重なりの量に大きく依存する( メールメッドら、１９９０年、「フローサイトメトリー及びソーティング」、第ニ版、ニューヨーク、ヴィレー−リス) 。 しかしながら、本発明は特定のフローサイトメーター又は特定のパラメータ群に制限されないことが理解されよう。 この点について、本発明は、従来のフローサイトメーターの代わりに、例えばフーら (1999, Nature Biotechnology 17: 1109-1111) により開示され且つ参照により本明細書にインコーポレートされる微細製造されたフローサイトメーターを使用することも意図する。

【００７９】 フローサイトメーターのさらなる利点は、不均一集団の細胞及び／又は粒子から目的の細胞又は粒子を物理的に分離できる能力にある。 これは、目的外の細胞及び／又は粒子は廃棄容器へ流し続けながら、電気的手段又は機械的手段によってレーザービームより下流の点で所望の細胞及び／又は粒子を回収することで達成される。 この区分け能力を有するフローサイトメーターは、蛍光標示式細胞分取器（FACS）として知られている。 従って、検出可能な特有の担体の集合を得る本方法における区分け工程は、蛍光標示式細胞分取（FACS）等のフローサイトメトリー技法により達成されうる。 しかし、本発明に関して、FACSは、より正確にいえば「蛍光標示式の担体又は固体支持体の分取」( 例えば、「細胞生物学の方法」、３３巻（ダルジンキヴィッツ, ゼットとクリスマン，エイチエイ編集、アカデミックプレス）及びダングルとヘルゼンバーグ、J. Immunol. Methods 52 :
1-14(1982)、両者は参照により本明細書にインコーポレートされる) である。

【００８０】 任意の適切なアルゴリズムは、個々の検出可能な特有の担体を追跡及び／又は区分けするために使用されうる。 好ましくは、実時間アルゴリズムが用いられる。 例えば、実時間アルゴリズムは、本明細書で以下に定義する「パラメータ空間」を予め定義されたより小さなグリッド空間に分割しうる。 ここで全てのグリッド空間は空と記録されている。 試料集団から得られる担体は単独ファイルでフローサイトメーターを横切るため、個々の担体に帰属する検出可能な特性の組合わせは特定のグリッド空間に対応する。 ゆえに以下の二つの結果が生じる。 （ａ）グリッド空間が空で記録されている場合、該担体はフローサイトメーターによって区分けされそして回収され、グリッド空間は詰まったと記録される。 （ｂ）グリッド空間が既に詰まったと記録されている場合、該担体は拒絶される。

【００８１】 担体が複数のグリッド空間に重なる範囲を有することを回避するために、個々のグリッド空間のさらなる微細な区分けが用いられることが好ましい。 従って、
内部の区分け領域が個々のグリッド空間内に設置され、それは個々のパラメータに必要な下方範囲のrl及び上方範囲のrhによって定義される緩衝領域に囲まれる。 個々のグリッド空間の内部区分け領域に落下する場合にのみ担体は回収されうる。 この方法で、検出可能なユニークな担体集団が素集団から区分けされ得る。

【００８２】 適切には、区分け工程( 工程(e))は、検出可能なユニークな担体集団が工程(e
) から生じる複数の担体の少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約７０％、
より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％
を構成するという点で特徴付けられる。

【００８３】 上記から、検出可能なユニークな担体の集団が、好ましくはフローサイトメトリー技法を用いて担体の素集団から作成し得る。 この集団はコンビナトリアル合成で用いるために予め符号化されている。

【００８４】 ４ コンビナトリアル化合物ライブラリーの合成及び解読本発明はコンビナトリアルライブラリーの合成しそして解読する方法にも存する。 本方法は、（ａ）その上で複数の異なる化合物を合成できる複数の担体を複数の反応容器の中に推計学的方法で配分する工程であって、該複数の担体は検出可能なように異なっている担体の集団を含み、そのそれぞれの担体は該合成の前、間及び後でそれぞれの担体を他の担体から区別して同定し、且つ、該担体と一体的に関連する少なくとも二つの検出可能な及び／又は定量可能な属性により特徴付けられる符号を有するものであるが、該属性の一つは該担体の形状又は表面変形以外のものであることを条件とする工程、（ｂ）該複数の反応容器の中の特定の反応容器中への個々の担体の移動を追跡するために、該複数の担体の符号を決定し記録する工程であって、該符号が工程（ｄ）の前に決定されるものである工程、（ｃ）各反応容器の中で担体を一つのシントンと反応させる工程、（ｄ）
各反応容器から担体を集める工程、（ｅ）複数の反応容器の間に推計学的方法で該担体を配分する工程、（ｆ）各反応容器の中で該担体を別の一つのシントンと反応させる工程、（ｆ）該複数の反応容器の中の特定の反応容器への個々の担体の移動を追跡するために、該複数の担体の符号を記録する工程であって、該符号が工程（ｅ）又は工程（ｆ）の後に記録されるものである工程、（ｇ）各反応容器からの担体を集める工程、及び必要なときは工程（ｅ）から工程（ｈ）までを繰り返してコンビナトリアル化合物ライブラリーを作成する工程であって、該ライブラリーの構成化合物が検出可能なように異なっている担体と関連するものであり、検出可能なように異なっている担体の符号が該検出可能なように異なっている担体の受ける反応の順序を同定するため該記録工程から提供される追跡データを用いることにより解読されるものである工程を含む。 該符号はフローサイトメトリー技法により決定されることが好ましい。

【００８５】 より詳細には、複数の担体の符号は第一反応工程前に決定されることが好ましいが、符号は第一回収工程（工程（ｄ））前の任意の時間に決定されてもよい。
複数の担体が反応容器に配分されるたびに、該容器の各々を分析し、検出可能なように異なる担体のどれが各反応容器内にあるかを決定することが好ましい。 従って、全ての担体のデーターベース（即ち、対応するグリッド空間、前出）が更新され、各担体上で合成された化合物の合成履歴を示すことができる。

【００８６】 反応工程中、各反応容器内の該担体は、特定化合物を組立てるために必要なシントンと反応する。 多数の型のシントンから化合物を組立てるには一定セットのシントンに対して適切な結合化学を用いることが必要である。 着実な様式で互いに付着し得る任意のセットのシントンはシントンセットとして有用であり得る。
この付着は、化学的、酵素的、若しくは他の手段、又はこれらの組合わせによって媒介されうる。 得られる化合物は、直鎖状、環状、分枝状であり、又は当業者には明白な他の種々のコンフォメーションを取り得る。 例として、ポリペプチドの固相合成法が例えばメリーフィールド（1963, J. Amer. Chem. Soc. 35 : 2149
-2156 ）に記載されている。 ペプチド結合化学は、参照により本明細書にインコーポレートされる「ペプチド」、１巻（グロス，イーとジェイ，マインホッファー編）、アカデミックプレス、オーランド（１９７９）にも記載されている。

【００８７】 該化合物を合成するために、多数の該担体が幾つかの反応容器内に配分される。 各反応において、異なるシントンが伸長中のオリゴマー鎖に結合する。 該シントンは、化学結合に適するように活性化され得る任意の型、又は酵素結合を受け入れる任意の型であってもよい。 該反応物は別々の反応容器内に含まれうるため、異なる結合化学をもつシントンでさえもオリゴマー化合物を組立てるために使用できる（「ペプチド」を参照、前掲）。 一部のシントンセットでは結合時間が長くてもよい。 このため、好ましい配置はシントン反応が平行して行われるものである。 各結合工程後、その上で該ライブラリーのオリゴマー又は化合物が合成される担体は、回収され混合された後、次の結合工程用に各容器へ再配分される。 このシャフリングプロセスは多くのオリゴマー配列の組合わせをもつ担体を作成する。 各合成工程が高い結合効率を有する場合、一つの担体上にある実質的に全てのオリゴマーが同一の配列を有することになる。 この配列は合成経路（該担体が受けたシントン反応及び反応順序）により所与の担体について決定される。
該オリゴマーの最大長は、長さ約２０のシントンで、好ましくは約３から８でありうる。 １０から１２の残基の長さが好ましい場合もある。 擬似結合を防ぐために、当業者に知られる保護基を使用してもよい（「ペプチド」、３巻、（グロス，イーとジェイ，マインホッファー編）、アカデミックプレス、オーランド（１
９８１）、これは参照により本明細書にインコーポレートされる）。

【００８８】 充分な担体及び効率的な結合により、必要ならば、あるオリゴマーの完全なセットを作成できる。 該担体の適切な大きさは、（１）所望されるオリゴマー合成部位の数；（２）合成される個々の化合物の数（及びスクリーニングに必要な各オリゴマーを保持する担体の数）；並びに（３）特定のスクリーニング法（例えば蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が用いられる）での該担体の大きさの効果によって決まる。 本発明が容易に理解され実用効果を果たすために、下記の非限定的な実施例により具体的な好ましい実施態様が以下に記載される。

【００８９】 実施例 実施例１ 本発明によるコンビナトリアル反応ヒストリーのフローサイトメトリック測定の 要約工程１、工程２、・・・工程ｍの工程を意味するｍ回の工程及び工程ｉ（ｉ＝
１、２、・・・、ｍ）でのｎ（ｉ）個の処理を含む分割−処理−再混合手順は以下のように定義される。 ｉ＝１、２、・・・ｍについて、工程ｉでのｎ（ｉ）個の処理をＰ１（ｉ）、Ｐ２（ｉ）、・・・Ｐｎ（ｉ）（ｉ） としよう。 ｉ＝１
、２、・・・ｍの各工程において、 ・ 担体は、無差別ではあるがおそらく特異的割合で、ｎ（ｉ）個の部分集合Ｓ
１（ｉ）、Ｓ２（ｉ）、・・・Ｓｎ（ｉ）（ｉ）に分割され、 ・ ｊ＝１、２、・・・ｎ（ｉ）に対して、部分集合Ｓｊ（ｉ）中の担体に対して処理Ｐｊ（ｉ）が行われ、 ・担体は再混合される。

【００９０】 この手順の図式的表示を図２及び３に示す。

【００９１】 このような処理の例としては、オリゴヌクレオチド鎖やオリゴペプチド鎖のコンビナトリアル合成が挙げられる。 これらの例では、不溶性のポリマービーズ（
通常直径１〜１０００μｍのコロイド粒子）を担体として使用し、その上に核酸モノマー又はアミノ酸モノマーを付着させそして逐次成長させる。 多数の担体についてこの分割−処理−再混合手順を繰り返し行うことにより、極めて多様な無差別に形成されたオリゴヌクレオチド配列又はポリペプチド配列を合成することができる。 こうして各担体には独特の配列を持つポリマーが付着しており、この配列はこの担体が受けた処理事象の順序（すなわち、図３における担体がたどる特定の経路）により規定される。

【００９２】 前記観点から本発明は、分割−処理−再混合手順に関与する担体のそれぞれに適用される処理の順序を決定する新規かつ便利な方法に関する。 この手順は、ｉ
＝１、２、・・・ｍに対し、そしてｊ＝１、２、・・・ｎ（ｉ）に対して、部分集合Ｓｊ（ｉ）における担体がフローサイトメーターを通過させ部分集合に存在する各担体の特性または符号を得る工程を含む。 各担体の符号は前記担体の特性の組み合わせにより決定されることになる。 この符号データは各担体に適用される処理の順序（すなわち、担体の反応履歴）を決定するために保存される。

【００９３】 処理の履歴を必要とする特定の担体の符号は、各部分集合Ｓｊ（ｉ）について保存された符号のリストに対してチェックされる。 特定の担体の符号が生じる部分集合Ｓｊ（ｉ）の集合は、担体について実施された処理Ｐｊ（ｉ）の集合を決定し、従って全処理履歴を決定する。

【００９４】 従って、いかなる担体の符号も再現可能であり、分割ー処理ー再混合手順に用いられる他のいかなる担体の符号とも識別されうることが望ましい。 これに関し、極めて膨大な識別されうる粒子の効率的な生産を容易にするため、分割ー処理ー再混合手順を担体の製造に採用しうる。 好ましい実施態様では、フローサイトメトリー技術を用いて識別不能な担体の小集団を区分けし、除去する。 しかしながら求められている処理の履歴の部分的又は完全な決定は、完全な符号の識別及び再現の可能性がなくとも得られるであろう。 例えば、仮に二つの粒子が１０工程の分割合成のうちの７工程でで識別不能であると検出されれば、そのときは、
いずれかの粒子の８−１０の工程を用いてこれらの粒子の反応履歴を帰納すればよい。

【００９５】 好ましい担体として微小球を参考に、以下の実施例を考察する。

【００９６】 実施例２ 符号化ストラテジー光学的にユニークな微小球 その光学特性を測定して集団において所与の微小球を陽性と同定するには、所与の微小球が該集団における他の全微小球とは異なるユニークな光学的特性のセットを持つことが要求される。 ２つの微小球が光学的に異なるためには、その光学特性の一つが異なる必要があるだけである。 つまり、一つの識別されうる相違を除いて、それらの各光学特性の全てが同じであることがあろう。

【００９７】 フローサイトメーターで各光学特性即ち「パラメータ」を測定する際には、対応する光電子増倍管からの電流出力は、１０２４の分解能で直線モードで機器を操作すると０と１０２３の間の整数となる、関連する値、すなわち「チャンネル数」に変換される。 従って、唯一の光学特性、例えば９０℃での光散乱度、を用いれば、ユニークな微小球の可能な最大数は１０２４となろう。

【００９８】 さらなる光学特性を得ることができるならば、もとの各１０２４のユニークな値は１０２４新しい値のいずれかと対をなし、１０２４ ²の可能な組み合わせとなる。 従ってκ個の測定可能な光学パラメータの合計に対して、光学的にユニークな組み合わせの最大数は１０２４ ^kとなるであろう。

【００９９】 集合論（フルバセックとイエック，1984「集合論入門」第２版，ニューヨーク，エム・デッカー）を用いると、これは次式のように表される。 すなわち、ｉ番目の光学特性に対して可能な値の集合、Ｒ _iは、

【０１００】

【数１】

【０１０１】 上式中、Ｚ ⁺はゼロを含む全ての正の整数の集合である。 最大値は機器の分解能に等しく、それは本研究を通じて１０２４であった。

【０１０２】 仮に機器がｋ個の独立の光学特性を測定すると、次に該集団における各微小球は、 提供された微小球についてのｋ個の光学特性の順序集合＝Ｓ ₁ ＝＜ｒ１，ｒ２，
ｒ３，・・・，ｒ _k ＞ （２．２） （式中、ｒ１εＲ１、ｒ２εＲ２、ｒ３εＲ３などである）により表されうる。
微小球の非順序回収については、 ｎ個の微小球の集合＝Ｐ＝｛Ｓ ₁ ，Ｓ ₂ ，Ｓ ₃ ，・・・，Ｓ _n ｝ （２．３） （式中、Ｓ _i ＝Ｓ _jは２個の微小球、Ｓｉ及びＳｊがフローサイトメーターにより測定されるκ光学属性から光学的に識別され得ない（本研究を通して、フローサイトメーターにより測定された光学特性、ｋ、の数、は５であり（表Ｂを参照）、典型的な総集団サイズは約１０ ⁵個の微小球であった）を意味する。このように集団における光学的にユニークな微小球の数、Ｐは

【０１０３】

【数２】

【０１０４】 である。

【０１０５】 光学多様性システムにおけるユニークな微小球の数を最大化するために、光学多様集団を合成する必要がある。

【０１０６】 光学多様性はいくつかの独立した光学パラメータの測定に基づく帰納的用語である。 パラメータ群の一つについて同じ値を有する微小球の小集団が、総集団と共に残りの（すなわち、ｋ−１個の）パラメータのみを用いて測定するとき集団合計から識別され得ない場合、その微小球の集団はｋ個のパラメータ全体について「光学多様」であるとみなす。

【０１０７】 このように、微小球の光学多様集団は、

【０１０８】

【数３】

【０１０９】 式中、Ｒ _1x Ｒ _2x Ｒ ₃・・・_x Ｒ _kはｋ光学パラメータについてのパラメータ空間である。 必ずしも全ての集団が光学多様であるわけではないので、ＰはＤの部分集合である。 このパラメータ空間は全多様集団内で光学的に識別され得ない微小球の可能性を許すＤの部分集合でもある。

【０１１０】 光学多様微小球の予備スクリーニング前記議論は２つの重大な仮説、すなわち １． 所与の微小球はその内在性光学特性のいずれにおいても変化せず、且つ、 ２． 各微小球の検出では変化しない、 を前提とする。

【０１１１】 殆どの研究（シャピロ，エイチ．エム．，1995，前記、メラメドら，1990，前記、ケットマンら，1998，Cytometry, 33: 234-243) は、これらの仮説の両方が蛍光体に及ぼす光分解、溶媒極性及びｐＨの効果といった因子により実効性がないことを示唆し、いかなる光学検出システム及び／又は電子工学検出システムに固有のエラーにも言及しない。

【０１１２】 しかしながら、前記議論は唯一の数値の代わりに数値の「範囲」として提供される微小球の各光学特性を記載することによりさらに精密化できる。 数値の範囲はフローサイトメーターにより同じ微小球の反復測定における変化の可能性を表す。

【０１１３】 次に、唯一の光学特性を用いたユニークな微小球の最大数は範囲により分割される機器の分解能に等しくなる。 この範囲はチャンネル数で表される。

【０１１４】 このように、ｋ個の測定可能な光学特性について、ユニークな微小球の最大数は下記の式に等しくなるであろう、すなわち

【０１１５】

【数４】

【０１１６】 式中、ｖ _iはそのｉ番目の光学パラメータの範囲である。

【０１１７】 前記範囲の範囲のコンセプトを用いて光学的にユニークな微小球を得るための二つのアルゴリズム、取得後アルゴリズム及び実時間アルゴリズムを考えた。 これらの両アルゴリズムは実施例５でさらに検証されるが、取得後アルゴリズムは実施が極めて簡単であるが、下記の実時間アルゴリズムの｜Ｕ｜の理論上のサイズ限界を有することが明らかである。 従って、実時間アルゴリズムが好ましいアルゴリズムである。

【０１１８】 実時間アルゴリズムは、パラメータ空間を、より小さい予め決定されたグリッド空間に分割する（図４参照）。 まず全てのグリッド空間を空と標識する（ゼロで表す）。 試料集団からの微小球は一のファイルのフローサイトメータを通過するとき、各微小球に属する光学特性の組み合わせは特定のグリッド空間に対応することになる。 次に、二つの考えられる結果、すなわち （ａ）グリッド空間が空と標識されている場合は、微小球はフローサイトメータにより区分けされ且つ収集され、そしてグリッド空間の標識は詰まった（１
で表す）に変化する、 （ｂ）グリッド空間が既に詰まったと標識されている場合は、微小球は拒絶される（各グリッド空間の集団の合計は決して１を越え得ない） が起こりうる。

【０１１９】 この処理の１例を図５に記載する。 微小球とグリッド空間の間には１対１の関係があるので、各微小球はそれが占めるグリッド空間により表現できる。

【０１２０】 各グリッド空間のさらなる精密化のために、好ましくは複数のグリッド空間に重なる範囲を有する微小球の存在を避けることが要求される。 こうして、内部区分け領域が各グリッド空間内に設定される。 この内部区分け領域は各パラメータについて必要とされる下方の範囲ｒｌ及びより上方の範囲ｒｈにより定義される緩衝領域に囲まれる（図６を参照）。 微小球が各グリッド空間の内部区分け領域に入る場合は、該微小球を回収すればよいだけである。 このように、光学的にユニークな微小球の集団を未処理の集団から抽出することができる。

【０１２１】 コンビナトリアル合成を通じての微小球の追跡実時間アルゴリズムを用いて未処理の集団から光学的にユニークな微小球の集団がつくられると、この集団はここでコンビナトリアルな分割及び混合合成に用いるために予備的に符号化される。

【０１２２】 該集団をｍ個のバッチに分割する度に、バッチのそれぞれをフローサイトメータを用いて分析し、光学的にユニークな微小球のどれが各バッチにあるかを決定する。 このようにして、全ての微小球（又は対応するグリッド空間）のデータベースが更新され、各微小球上で合成される化合物の合成履歴を示すことが可能となる。

【０１２３】 内部区分け領域はもはや要求されないことに注意する。 各微小球はその割り当てられたグリッド空間の境界内に残るはずである。 従って、所与のバッチ内の全ての微小球が取得後に同定できる。 実際、完全なコンビナトリアル合成の全サイクルの全バッチからの記録された全データを編集することにより、全微小球の全合成履歴が後の段階で決定できるであろう。

【０１２４】 この段階で、実験的に要求されるものが何かが明確となる。 第一に、光学的に多様な微小球の集団が合成されなければならない。 第二に、各パラメータについてのｒｌ及びｒｈの大きさが機器を用いて決定し、信頼できるグリッド空間サイズを確立することが必要であり、かつ最後にソフトウェアを開発して実時間区分け及び追跡のアルゴリズムを開発し処理しなければならない。

【０１２５】 実施例３ シリカ微小球導入 コロイド粒子のモデルとしては、シリカ微小球または粒子がＩｌｅｒ（Iler,
RK, 1979, 「シリカの化学: 溶解性、重合性、コロイド及び表面特性、及び生化学」ニューヨーク，ウィリーアンドサンズ）及びその他（ベルグナ, エイチ．
イー., 1994,「シリカのコロイド化学」ワシントンDC, アメリカ化学会) の研究によりよく研究されている。 初期合成処理では、珪酸ナトリウムの希釈溶液を水素イオン交換樹脂床に通し、次にアルカリを加えてｐＨ８−９に上げることにより、シリカのコロイドゾルを調整する。 この溶液の一部を１００℃に温め、加熱した部分が蒸発してより濃縮されるにつれゆっくりと溶液の残り部分を加えることによるこの処理を用いれば、直径１０−１３０ｎｍの安定なゾルが調製されるであろう。 加熱部分の粒子（４−６ｎｍ）は溶液の残りの粒子（２−３ｎｍ）より大きいので、より小さい粒子（＜３ｎｍ）は全て溶解し、Ｏｓｔｗａｌｄ熟成に記載される処理で、均一な割合でより大きい粒子上に沈殿した。 可溶性塩の除去によるゾル安定性を改良するためイオン交換樹脂又は長い透析による精製が要求された（Ｉｌｅｒ，１９７９，前記）。

【０１２６】 より最近では、サイズ８００ｎｍまでの単分散シリカ粒子がボグシュ（1988，
J. Non-Cryst. Solids, 104: 95-106)により加水分解から、及びストーバーら（
1968, J. Colloid. Int. Sci., 26: 62)により最初に実証されたアルコール−アンモニア−水系でオルト珪酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）の沈殿により調製された。 ボグシュら（1988，前記）は反応物質濃度の知識から、最終粒子サイズｄ（ｎ
ｍで）の非機械的経験式、

【０１２７】

【数５】

【０１２８】 （式中、

【０１２９】

【数６】

【０１３０】 及び

【０１３１】

【数７】

【０１３２】 ）をも提供した。

【０１３３】 この方程式は、０．１−０．５Ｍ ＴＥＯＳ、０．５−１７．０ＭのＨ ₂ Ｏ及び０．５−３．０ＭのＮＨ ₃にわたる濃度範囲、２５℃で調製した１００試料について測定した直径の±２０％内を正しく予測することを示した。

【０１３４】 Ｓｔｏｂｅｒ合成での粒子核生成はアンモニア塩基触媒の存在のもと二段階の反応、すなわち 加水分解： Ｓｉ（ＯＣ ₂ Ｈ ₅ ）４＋４Ｈ ₂ Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ） ₄ ＋４Ｃ ₂ Ｈ ₅ ＯＨ （３．２） 濃縮： Ｓｉ（ＯＨ） ₄ →ＳｉＯ ₂ （Ｓ）＋２Ｈ ₂ Ｏ （３．３） を介して起こる。

【０１３５】 粒子の成長を説明する２つのモデルが開発された。 マツオカら（1991, J. Col
loid Int. Sci., 145: 557) のモデル粒子核形成及び２つの加水分解したモノマー間の反応としての成長では、このように粒子はモノマー添加により成長すると考えられるのみである。 彼らは、加水分解の一次速度定数が粒子成長についての一次速度定数に等しいことを発見し、従って粒子成長は加水分解により限定される速度であると結論づけた。 ズコスキーら（1991，J. Colloid Int. Sci., 142: 17)により開発された第２のモデルは、ナノメーターサイズの小粒子の凝集をコントロールとして粒子核生成を記載している。 システムのｐＨ（ｐＨ＞１０）で、シリカ粒子は表面のシラノール基の解離により陰性に電荷している。 一旦凝集物がＤＬＶＯ理論（ハンター，ＲＪ，1987, 前記）に記載されるある一定の臨界半径に達すると、凝集物はコロイド状に安定となり、静電気反発により、より大きい粒子を伴うさらなる凝集が妨害される。 このように粒子は全反応を通して一定に生産されるより小さい粒子との凝集により成長し続ける。 ズコスキーら（19
91，前記）はＴＥＯＳは全て最初の数分以内に加水分解されると主張し、凝縮経路の段階を加水分解よりかなり限定される速度と見なしている。

【０１３６】 バン・ブラーデレン（1992，J. Colloid Int. Sci., 154: 481）も¹³ Ｃ・ＮＭ
Ｒ及び静的光散乱のそれぞれを用いて加水分解及び粒子成長の速度定数を調べ、
粒子成長は加水分解により速度が限定されるというマツオカ（1991, 前記）に賛成している。 彼らは、凝縮は最初はコロイド状の安定な粒子の形成に応答するものであるというズコスキーら（1991，前記）に賛成しているが、最終的な粒子サイズの増大を引き起こすＴＥＯＳの添加の前、塩の添加に先立ち、コロイド状の安定な粒子がすでに形成された（すなわち、濁りが増大することについて）後、
ＬｉＮＯ ₃の添加により最終的粒子サイズは影響されないことを見いだした。 彼らはこの結果から、反応媒質のイオン強度及び粒子表面電荷が強い影響を受ける短い導入時間の後、粒子数は一定となり、粒子成長はモノマーの添加により引き起こると結論づけた。 コロイドの安定性に対し臨界半径が大きければ、小数の粒子のみが形成され、最終的粒子サイズは大きくなるであろう。

【０１３７】 多くの科学者がさらなる成長実験のための種粒子としてストーバー合成を介して形成された粒子を用いてきた。 フィリップス（1994，Langmuir, 10 : 4451-445
8)及びバン・ブルッゲン（1998, Langmuir, 14 : 2245-2255)は、珪酸ナトリウムの析出をコントロールして数ナノメータ深さで、ベーマイト針（ＡｌＯＯＨ）をシリカ層で被覆し、陽性に荷電した針の凝集を避けた。 一旦シリカで被覆すると、次にこれらの針はＳｔｏｂｅｒ合成でのさらに大きな成長のための種粒子として用いることができる。

【０１３８】 ｐＨのコントロールについてはｐＨ９−１０．５を維持することが重要である。 ｐＨが９より低ければ、シリカの二次的均一核生成が起こる。 より小さい二次核は沈降及び濾過により除去することが難しく、かつそれらの表面積の合計はより大きい種粒子よりずっと大きく、二次核は大量のモノマーを消費するのでこれは望ましくない。 凝縮のため利用される表面積を増大することによる二次的核生成を抑制するのに、特に不均一核生成についての自由エネルギーは同種核形成についてのエネルギーより低いので、大きい種粒子の濃度も役立つ（ハンター, アール．ジェイ. 1987, 前記）。 種粒子の濃度はあまり高くなり得ないが、シリカの凝縮は、凝集を生じさせる１秒当たりの粒子間の衝突を多数起こすことができる（フィリップスら，1994, 前記）。

【０１３９】 種を入れた成長を用いて、パン・ブラーデレンら（1992, Langmuir, 8: 292
1-2931) 及びファーヘーグら（1994, Langmuir, 10 : 1427-1438)は、共モノマー、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）のシリカ粒子の核及び／又は二次殻のどちらか又は両方への取り込みを実証した。 この共モノマーは図７にある反応を介していずれかのイソチオシアン酸塩、又はいずれかのスクシニミジルエステルまたは他のアミン反応誘導体に共有結合することができる。 幾つかの別の蛍光殻及び非蛍光殻を含有するシリカ粒子もこの方法により合成した。 イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を含有する蛍光殻について、粒子をエタノールに比べてＤＭＦに分散する際は、蛍光を５２３ｎｍから５３４ｎｍまで赤色シフトしたが、蛍光殻の上に保護的非蛍光シリカ殻を合成した際にはこの赤色シフトは起こらなかった（５１８及び５１９ｎｍ）。 ＴＥＯＳ及び色素結合Ａ
ＰＳを少量添加するだけで、凝縮速度が加水分解速度をまだ越えない短い導入期間に加水分解されたＴＥＯＳの濃度増大により引き起こされるイオン強度の増大による凝集を避けることが可能であった。

【０１４０】 実験 設計コンビナトリアルライブラリーのための固体支持体として実際に使用するため、サイズ既知の市販のシリカ微粒子を購入した。 次に、適当な発蛍光団をｖａｎ
Ｂｌａａｄｅｒｅｎら（１９９２，前記）に実証された方法を用いて取り込んだ。 可能な特定の微小球の数、従ってコンビナトリアルライブラリーの可能なサイズを最大にするために、最終的コンビナトリアルライブラリーの合成に要求される合成とは明確に異なるコンビナトリアル合成を設計し、光学多様なシリカ微小球の集団を合成した。

【０１４１】 このコンビナトリアル合成は、各バッチの発蛍光団濃度は異なる種微小球のバッチを分けることについての、同じ発蛍光団を含有する殻の種晶の成長を含む。
次に、バッチを再度集め、図２及び３のように新しいバッチに無作為に分け、これにより各バッチの微小球について別の成長殻として異なる濃度の新しい発蛍光団が合成される。 適切な選択及び発蛍光団の濃度により、フローサイトメータについての各蛍光パラメータの全範囲が利用でき、このようにしてこのコンビナトリアル合成は、フローサイトメータの全パラメータ空間がアクセスされるようにする。 凝集物、埃及び他の破片から、これらの目的の微小球だけを選択するため、コントロールパラメータとして前方散乱および側方散乱を選んだので、それらは光学多様性のこのコンビナトリアル合成には含まれなかった。

【０１４２】 フローサイトメータを用いてユニークな微小球を特定するので、微小球のサイズは実用上の検出限界値より大きくなければならず、最大のフローサイロメータは約１μｍである。

【０１４３】 材料用いたモノマーはオルト珪酸テトラエチル（ＴＥＯＳ，アルドリッチ）及び色素結合剤３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ，アルドリッチ）であった。 用いた色素は、Ａｌｅｘａ４３０（Ａ４３０，モレキュラー・プローブズ）、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ，シグマ）及びキノリジノ置換フルオレセインイソチオシアン酸塩（ＱＦＩＴＣ，シグマ）であった。 各実験の直前に、アルコール−アンモニア−水溶媒系として変性エタノール、アンモニア溶液（２５％，ＢＤＨ）及びＭｉｌｌｉＱ（商標）濾過水を調製した。 購入した市販のシリカ微小球は２．５μｍの非蛍光（バングズ・ラボラトリーズ）並びに４μｍの青−緑Ｆ、４μｍの青−赤Ｆ、４μｍの青 赤Ｆ、４μｍの青−緑−赤Ｆ、１０μｍの緑Ｆ、１０μｍの赤Ｆ、１２μｍの赤−緑Ｆ及び１５μｍの赤Ｆ
（全てミクロモドより）であった。 各実験は１３．５ｍＬパイレックス（登録商 標）スクリューキャップのテフロン（登録商標）被覆ガラス製バイアル内で実施 した。 使用の前に、各ガラス製バイアルを少なくとも２時間濃硝酸を用いて洗浄 し、ＭｉｌｌｉＱ（商標）水で徹底的にリンスした。 他の全ての試薬は受け取っ たままのものを用いた。

【０１４４】 蛍光色素の結合図７に示す反応により蛍光色素をＡＰＳに結合させた。 各色素につき、エタノール１ｍＬ中で、色素５μｍｏｌをＡＰＳ２５０μｍｏｌと反応させた。 反応は２時間、光退色を妨げるため暗条件下撹拌しながら行った。 チオウレアの高不溶性により、静置時に形成した過剰の色素−ＡＰＳの橙色沈殿を遠心分離により除去した。

【０１４５】 蛍光殻の合成バン・ブラーデレンら（1992, 前記）に記載された方法を適応して市販のシリカ微小球上に蛍光殻を合成した。 ２．５μｍの非蛍光微小球を用いて三つの試料を調製した。 各試料につき、微小球２０ｍｇを変性エタノール２．５ｍｌ及びＭ
ｉｌｌｉＱ（商標）水２．５ｍｌ（二次的核生成を阻害すると見いだされた割合）を入れたガラス製バイアルに再懸濁した。 ２分間音波処理（バン・ブラーデレンらは単分散コロイドのためのコロイド結晶層の形成を報告している）した後、
光学顕微鏡による視覚判断ではもとの市販合成から存在する幾つかの二量体及び三量体が見られたが、重要な凝集塊は全く見られなかった。 この懸濁液に、換気装置内でアンモニア溶液２００μＬを加え、よく撹拌した。 １００μＬのＴＥＯ
Ｓ、次いで特定の色素−ＡＰＳ溶液（表Ｃ（Ｓ１−３）参照）１０μＬを各試料に直ちに加え、ガラス製バイアルを振とうし、密封し、アルホイルで覆い、反応中微小球の沈降を防ぐ自動回転クランプに設置した。 ガラス壁にはいくらか核生成が存在したが、溶液中に凝集は見られなかった。

【０１４６】 ４μｍの青−緑Ｆ及び４μｍの青−赤Ｆの蛍光微小球を用いて９試料を調製した。 反応スキームは微小球２．５μｍの場合と同様であり、表Ｃ（Ｒ１−Ｒ８及びＧ１−３）に示す。 各試料について、１つを除く全ての試薬を一定に保ち、粒子の安定性、殻の蛍光度及び二次的核生成の度合いについて、各試薬の濃度を二倍又は半分にして効果を調べた。

【０１４７】

【表Ｃ】

【０１４８】 反応を完了するため少なくとも１２時間おき、各試料を清潔なガラス製バイアルに移し、次の６回の洗浄手順、即ち１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離、上清の除去、５ｍＬＭｉｌｌｉＱ（商標）水への再懸濁及び音波処理（２．５μｍの非多孔性微小球について２分間、４μｍの多孔性微小球について１５秒間）に供した。 各試料から除去した最初の上清は取っておき、二次的核生成がないか調べた。 Ｒ４及びＲ６からの上清は他の試料より明らかに濁っていた。 １２試料全てからの最初の上清も明らかに蛍光性を有していたが、次の上清は全て澄んでいた。

【０１４９】 蛍光シリカ粒子のコロイド分散物のコンビナトリアル合成粒子の多様な集合を合成するため、コンビナトリアルな分割及び混合技術を用いた。 分割及び混合の各サイクルで、同じ発蛍光団を含むが、各部分について発蛍光団の濃度が異なる殻の種成長に微小球の別別の部分を提供した。 分割及び混合の各サイクルで異なる発蛍光団を用い、かつ１サイクルの間の各反応で異なる濃度の発蛍光団を用いることにより、粒子の光学多様な集合を合成できる。

【０１５０】 コンビナトリアル合成のサイクル１は、未処理のシリカ核粒子の三つの異なるバッチをよく混合する工程を含む。 その各バッチは異なるサイズ範囲の粒子を含む。 混合後、粒子を三部に分割する。

【０１５１】 サイクル２は、第一部の粒子上には低蛍光度の蛍光赤殻を、第二部の粒子上には中蛍光度の蛍光赤殻を、かつ第三部の粒子上には高蛍光度の蛍光赤殻を反応させる工程を含む。 次に、粒子を混合し、三部に分割する。

【０１５２】 サイクル３は、第一部の粒子上には低蛍光度の蛍光緑殻を、第二部の粒子上にば中蛍光度の蛍光緑殻を、かつ第三部の粒子上には高蛍光度の蛍光緑殻を反応させる工程を含む。 次に、粒子を混合し、三部に分割する。

【０１５３】 サイクル４は、第一部の粒子上には低蛍光度の蛍光青殻を、第二部の粒子上には中蛍光度の蛍光青殻を、かつ第三部の粒子上には高蛍光度の蛍光青殻を反応させる工程を含む。 全ての部分を混合した後に、粒子の光学多様な集団が存在する。

【０１５４】 より詳細には、バン・ブラーデレンら、１９９２、前記に記載された方法を適用してシリカ微小球上に蛍光殻を合成した。 用いたモノマーは、オルト珪酸テトラエチル（ＴＥＯＳ，アルドリッチ）及び色素結合剤３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ，アルドリッチ）であった。 用いた色素は、Ａｌｅｘａ４
３０（青）（Ａ４３０，モレキュラー・プローブズ）、イソチオシアン酸フルオレセイン（緑）（ＦＩＴＣ，シグマ）及びキノリジノ置換フルオレセインイソチオシアン酸塩（赤）（ＱＦＩＴＣ，シグマ）であった。 各実験の直前に、アルコール−アンモニア−水溶媒系として変性エタノール、アンモニア溶液（２５％，
ＢＤＨ）及びＭｉｌｌｉＱ（商標）濾過水を調製した。 各実験は１３．５ｍＬパイレックススクリューキャップ付きのＴｅｆｌｏｎ（商標）被覆ガラス製バイアル内において実施した。 使用の前に、各ガラス製バイアルを少なくとも２時間濃硝酸を用いて洗浄し、ＭｉｌｌｉＱ（商標）水で徹底的にリンスした。 他の全ての試薬は受け取ったまま用いた。

【０１５５】 バン・ブラーデレンら、１９９２、前記に記載された反応により、蛍光色素をＡＰＳに結合させた。 各色素につき、エタノール１ｍＬ中で、色素５μｍｏｌをＡＰＳ２５０μｍｏｌと反応させた。 反応は２時間、光退色を妨げるため暗条件下撹拌しながら行った。

【０１５６】 サイクル１で用いた核粒子は、３つの異なるサイズ範囲（０．５０−０．９９
μｍ、１．００−２．４９μｍ及び２．５０−５．００μｍ）の未処理シリカ微小球（バングズ・ラボラトリーズ）である。

【０１５７】 各サイズ範囲からの粒子２０ｍｇを容器内でよく組み合わせ、得られた混合物を重量が等しくなるよう（２０ｍｇ）に分割する。

【０１５８】 サイクル２では、ガラス製バイアル内で変性エタノール２．５ｍＬ及びＭｉｌ
ｌｉＱ（商標）水２．５ｍＬに微小球２０ｍｇの各部を再懸濁する。 各部をバス・ソニケータで２分間音波処理する。 各懸濁液に、アンモニア溶液２００μＬを加え、かつよく混ぜる。 第一部の微小球を即座にＴＥＯＳ１００μＬ及びＱＦＩ
ＴＣ ＡＰＳ溶液５μＬと混合し、第二部の微小球をＴＥＯＳ１００μＬ及びＱ
ＦＩＴＣ−ＡＰＳ溶液１０μＬと混合し、かつ第３部の微小球をＴＥＯＳ１００
μＬ及びＱＦＩＴＣ−ＡＰＳ溶液２０μＬと混合する。 各部を含むガラスバイアルを振とうし、密封し、アルホイルで覆い、そして電動回転クランプ中に置いて反応の間微小球が沈殿するのを防止する。

【０１５９】 少なくとも１２時間後、各試料を清潔なガラス製バイアルに移し、１０００ｒ
ｐｍで５分間の遠心分離、上清の除去、５ｍＬＭｉｌｌｉＱ（商標）水への再懸濁及び２分間の音波処理で６回洗浄する。 各試料から最初の上清を除去し、二次的核生成がないか蛍光顕微鏡により調べる。 部分をよく混合し、次に三つの等部分に分割する。

【０１６０】 サイクル３では、ガラス製バイアル内で変性エタノール及びＭｉｌｌｉＱ（
商標）水の最終５ｍＬ溶液（１：１割合）に微小球の各部を徐々に移す。 各部をバス・ソニケータで２分間音波処理する。 各懸濁液に、アンモニア溶液２００μ
Ｌを加え、かつよく混ぜる。 第１部の微小球を即座にＴＥＯＳ１００μＬ及びＦ
ＩＴＣ−ＡＰＳ溶液５μＬと混合し、第２部をＴＥＯＳ１００μＬ及びＦＩＴＣ
−ＡＰＳ溶液１０μＬと混合し、かつ第３部をＴＥＯＳ１００μＬ及びＦＩＴＣ
−ＡＰＳ溶液２０μＬと混合する。 各部を含有するガラス製バイアルを振とうし、密封し、アルホイルで覆い、反応中微小球の沈降を防ぐ電動回転クランプに設置した。

【０１６１】 少なくとも１２時間後、各試料を清潔なガラス製バイアルに移し、１０００ｒ
ｐｍで５分間の遠心分離、上清の除去、５ｍＬＭｉｌｌｉＱ（商標）水への再懸濁及び２分間の音波処理で６回洗浄する。 各試料から最初の上清を除去し、二次的核生成がないか調べる。 部分をよく混合し、次に三つの等部分に分割する。

【０１６２】 サイクル４では、ガラス製バイアル内で変性エタノール及びＭｉｌｌｉＱ（商標）水の最終５ｍＬ溶液（１：１割合）に微小球の各部を徐々に移す。 各部をバス・ソニケータで２分間音波処理する。 各懸濁液に、アンモニア溶液２００μＬ
を加え、かつよく混ぜる。 第１部の微小球を即座にＴＥＯＳ１００μＬ及びＡｌ
ｅｘａ４３０−ＡＰＳ溶液５μＬと混合し、第２部をＴＥＯＳ１００μＬ及びＡ
ｌｅｘａ４３０−ＡＰＳ溶液１０μＬと混合し、かつ第３部をＴＥＯＳ１００μ
Ｌ及びＡｌｅｘａ４３０−ＡＰＳ溶液２０μＬと混合する。 各部を含有するガラス製バイアルを振とうし、密封し、アルホイルで覆い、反応中微小球の沈降を防ぐ電動回転クランプに設置した。

【０１６３】 少なくとも１２時間後、各試料を清潔なガラス製バイアルに移し、１０００ｒ
ｐｍで５分間の遠心分離、上清の除去、５ｍＬＭｉｌｌｉＱ（商標）水への再懸濁及び２分間の音波処理で６回洗浄する。 各試料から最初の上清を除去し、二次的核生成がないか調べる。 これらの部分をよく混合する。

【０１６４】 次に、光学多様な粒子を望むものとして用いる準備をする。 粒子は、外殻をＴ
ＥＯＳ及びＡＰＳ（色素なし）を用いて合成することにより、例えばＮＨ ₂基で官能基を付加することができる。

【０１６５】 この手順の変形には、色素−ＡＰＳなしにＴＥＯＳを用いた蛍光殻間での非蛍光殻合成が含まれる。 蛍光核粒子はコンビナトリアル分割及び混合の開始に用いてもよい。

【０１６６】 顕微鏡フィルターＵ−ＭＷＵ（励起波長λ _EX ＝３３０−３８５ｎｍ、放射波長λ _EM ＞
４２０ｎｍ）、Ｕ−ＭＷＢ（λ _EX ＝４５０−４８０ｎｍ、放射波長λ _EM ＞５１５
ｎｍ）及びＵ−ＭＷＧ（λ _EX ＝５１０−５５０ｎｍ、放射波長λ _EM ＞５９０ｎｍ
）を備えた蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ−７０）にＣＣＤカメラ（ダイアグノスティック・インストルメンツ）を用いて蛍光顕微鏡写真を撮影した。

【０１６７】 ＩＲ調製キャビネットで乾燥し、Ｐｔで被覆した試料２μＬを用いてＪＥＯＬ
６４００上で走査型電子顕微鏡写真を撮影した。 平均粒子サイズをＩｍａｇｅ−
Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ（商標）４．０を用いて決定し、電子顕微鏡写真から１０μｍ
のスケールバーを用いて計算した。

【０１６８】 結果及び考察 単一の蛍光殻前記のように徹底的に清浄した後もなお、試料Ｒ１−８及びＧ１−３は蛍光を有していた。 試料Ｓ１及びＳ２の蛍光顕微鏡写真を図８に示す。 非蛍光２．５μ
ｍの微小球の蛍光は無視してもよかった。 両サイズのため、Ｕ−ＭＷＢフィルター及びＵ−ＭＷＧフィルターをそれぞれ用いると、ＦＩＴＣ被覆微小球及びＱＦ
ＩＴＣ被覆微小球は明るく蛍光を発していた。

【０１６９】 方程式３．１（ｄ＜６ｎｍ）で予測されたように、Ｒ２（［Ｈ ₂ Ｏ］＝３０．
３５Ｍ）における水の濃度は核生成を阻害することが示された。 Ｒ４及びＲ６におけるＮＨ ₃及びＴＥＯＳのより高い濃度はそれぞれ、種微小球間の凝集及び二次核の存在という結果を生じた。 これは加水分解したＴＥＯＳの増大が、モノマーの急速な析出を惹き起こしそして同質の核生成を生じさせることによる。 異なる濃度の蛍光団−ＡＰＳ（Ｇ１−３に加えてＲ１、Ｒ７及びＲ８）は全体として種成長には影響しないと思われ、得られた蛍光度は蛍光団−ＡＰＳ濃度に比例することが示された（詳細については、実施例４「蛍光被覆微小球の測定」を参照）。 これらの蛍光「殻」の存在を説明する四つの可能性が存在する。 すなわち １． 蛍光団−ＡＰＳは各微小球の表面に単に吸着する、 ２． 蛍光団−ＡＰＳはシリカマトリックスを通って拡散し、かつ内部を染色して留まる、又は ３． 蛍光団−ＡＰＳはバン・バラーデレンらにより示唆されたように種成長殻中に取り込まれる。

【０１７０】 吸着の可能性を排除するため、非ＡＰＳ結合ＱＦＩＴＣを、ＴＥＯＳ又はＡＰ
Ｓの非存在下ではあるが、他の試料と同じアルコール−水−アンモニア系を用いて、非被覆４μｍ青−緑Ｆ微小球に、添加した。 初期蛍光とはいえ、さらなる清浄後、これらの微小球は蛍光定量法及びフローサイトメーターにより確認されたように、もはや蛍光を発しなかった。

【０１７１】 ギーシュら（1991, Dyes and Pigments, 17: 323-340) はアシッドブルーやメチルレッドといった発蛍光団に結合する前にシリカ粒子の表面をアミノ修飾した。 飽和濃度でのこれらの発蛍光団の表面積は、分子あたり１１０−１４０であることが分かった。 従って、これらの大きな芳香族分子は表面上に平らに位置することが、ギーシュら（1991, 前記）により示唆された。 ＦＩＴＣ及びＱＦＩＴＣ
は同様に平面性多芳香族分子であるので、シリカマトリックスを通って蛍光団−
ＡＰＳが拡散することはなさそうである。

【０１７２】 被覆していない微小球およびＱＦＩＴＣ被覆した微小球の２．５μｍ及び４μ
ｍのＳＥＭ顕微鏡写真を図９に示す。 被覆した微小球上に見られる小さい粒子は乾燥時に微小球に付着しただけの二次核の凝集による。 被覆していない微小球と被覆した微小球の間には表面形態の変化に関し他の証拠はない。 方程式３．１を用いた、これらの試料について試薬濃度（すなわち、［ＴＥＯＳ］＝０．１６６
Ｍ，［ＮＨ ₃ ］＝０．４９６Ｍ，［Ｈ ₂ Ｏ］＝２７．２６Ｍ）での任意の二次核の最終粒子サイズは６．７ｎｍであろう。 これらのサイズでは、種微小球とのいかなる物理的付着も凝集となろう。 これらの顕微鏡写真からの粒子サイズ解析では、被覆していない２．５μｍ微小球に比べてＦＩＴＣ又はＱＦＩＴＣで被覆した２．５μｍ微小球のサイズに明確な増大は示されなかった。 微小球（約３０ｎ
ｍ）の平均半径増大があるとはいえ、これらの測定に伴う標準誤差では有意な結果は得られない（表Ｄ）。 Ｇｉｅｓｃｈｅらは、シリカ上のアミノシランの種成長について２０−２５ｎｍの粒子サイズでの同様の増大を観察した。

【０１７３】

【表Ｄ】

【０１７４】 多重蛍光殻様々な蛍光強度そして異なる組み合わせの蛍光色素を持つ殻を有する微小球を調製するためのコンビナトリアルな手順は、前記の通りである。 サイズ及び形の違う異質の微小球を殻形成のための核として用いると、非常に多様な集団の微小球が生じ、その多様性はコンビナトリアル化合物合成において個々の微小球を追跡するために用いることができることになる。

【０１７５】 結論凝集機構によるか又はモノマー付加機構により、蛍光団−ＡＰＳは微小球に永久に結合する。 三つの発蛍光団をこれらの実験に取り込むことに成功したが、いかなるアミン反応性発蛍光団をも用いうるであろう。 粒子半径に増大は見られず、殻の厚さは３０ｎｍ未満であることを示す。 被覆していない微小球の表面特性を複製するため、蛍光団−ＡＰＳ被覆微小球の表面を適切な基、例えば立体安定剤で修飾することにより、次の種成長実験での凝固を避けてもよい。

【０１７６】 実施例４ フローサイトメトリー測定 緒論フローサイトメータで測定される最も普通の光学特性は、前方光散乱、側方光散乱および異なる励起波長及び放射波長での蛍光強度である。 ＵＶ、可視又は近赤外スペクトルから得られる広範囲に利用できる発蛍光団により、これらの光学特性のうち蛍光は微小球を符号化するのに最も有効である（ホーグランド，アール．ピー．1996，前記）。 各発蛍光団は同様の試薬及び合成を用いて微小球に共有的に取り込まれるので、符号化ストラテジーはさらなる発蛍光団を含むよう格上げすることができる。

【０１７７】 光散乱測定球形ミクロメーターサイズの細胞又は粒子の前方光散乱測定は、散乱のＭｉｅ
理論を用いて予測することができ、細胞又は粒子サイズの推定のために頻繁に用いられる。 前方光散乱は生細胞からダメージをうけた細胞を区別するために用いられたが、表面形態や、照射波長での屈折率及び吸収の変化への散乱強度の依存性は独立した再現可能なパラメータとしてその有用性を限定する（シャピロ，19
95，前記）。 さらに、前方散乱測定は流体力学的に焦点を絞られた試料流の流速、直径及び組成といった機器的パラメータにも依存している（ケットマンら，19
98, 前記）。

【０１７８】 反対に、側方散乱は粒子の屈折率及びサイズに非常に感受性であるが、これらの機器的因子の殆どと無関係である。 フォーティンら（1999，Cytometry, 36: 2
7-35) は、モノクローナル抗体で被覆した小さい非蛍光ポリスチレン微小球（０
． １−０．５μｍ）を用いて試料細胞の表面上の特定の抗原の存在を検出した。
細胞表面上のそれらの特異的抗原への結合の際、被覆した微小球は側方散乱測定でよく定義されているシフトを導いた。 最も興味あることには、ケットマン（19
98, 前記）は側方散乱測定を慣用し、それらの微小球に基づく免疫アッセイにおいて破片、埃及び凝集塊から単一の微小球を特定している。 従って、各微小球を光学符号化する多くの蛍光パラメータが得られるが、前方散乱及び側方散乱は目的とするそれら微小球のみを選択するためのコントロールパラメータとして最適である。

【０１７９】 蛍光測定入射光子の吸収の際、発蛍光団は基底状態から励起一重項状態への遷移を受ける。 次に、発蛍光団はフローサイトメトリー測定にとって重要な三つの主な経路を介して基底状態に脱活性化される。

【０１８０】 蛍光 ：発蛍光団の蛍光強度は励起波長でのその吸光係数、その量子収率（大抵環境感受性）及びその濃度に関連する。 ホーグランド（Cell Biology, 42 , 1994
, Methods, Chapter 37 "Spectra of fluorescent dyes used in flow cytometr
y"，アカデミック・プレス，インク．）は、多くの有機色素は対称的な吸収スペクトルを有し、その吸光係数は吸収ピークから±１０−２０ｎｍでは５０％以下及び±２０−４０ｎｍでは９０％以下減少すると記載している。従って、フローサイトメータで用いられる励起レーザー近くを吸収する発蛍光団を選択することが重要である（他のレーザーも利用できるが、通常４８８ｎｍアルゴンイオン又は６３３ｎｍ赤色ＨｅＮｅレーザー）。

【０１８１】 フローサイトメトリーでは、発蛍光団間のスペクトル重なり量も重要である。
各励起レーザーについて、五つの検出器まであってもよく、それぞれ光学装置の配列で用いられる光学フィルター及び二色鏡により指示される特異的範囲の波長を測定する。 発蛍光団は通常、（ａ）励起波長で強く吸収し、かつ（ｂ）提供される検出器により測定される放射波長範囲に特異的であると選択される。 有機色素は典型的には広い放射を有するので（フォーティン，1999, 前記）、他の多数の発蛍光団は提供される検出器により測定される総強度に寄与するであろう。 その放射スペクトル間の最小の重なりを有する発蛍光団を選択することが望ましいが、５つの検出器が同じ励起レーザーで用いられる場合には特に、まれではあるが可能である。

【０１８２】 しかしながら、一つの発蛍光団のみを含む微小球を分析し、該発蛍光団から他の検出器への「過剰」な蛍光量を測定する、「蛍光補正」として知られる処理、
を行うことによりスペクトルの重なりを補正することが可能である。 その狙いは（該発蛍光団のための）正しい検出器により測定される蛍光強度の百分率であって、ゼロ強度に等しくするため他の検出器それぞれから減ずる必要がある量を見いだすことである。 これは、アナログ補正を用い操作時間に行っても、又はソフトウェアデジタル補正を用いて測定後に行ってもよいが、操作時間内にデジタル補正を実施することは未だ可能でない（ビゴスら，1999, Cytometry, 36: 36-45
) 。 利用できるパラメータ空間を可能な限り利用するための、有効な蛍光補正、
好ましくは操作時間デジタル補正には、提唱した符号化ストラテジーが必要不可欠である。

【０１８３】 蛍光共振エネルギー移転 ：スコットら（1997, Bioorg. Medical Chem. Lett., 7 (12): 1567-1572)はポリスチレンに基づく微小球が発蛍光団、ダンシルに共有結合することを実証しているが、蛍光強度は低レベルの負荷（＜１％）の場合各微小球上に負荷されるダンシル量に直接比例し、５％を越える負荷の蛍光強度では急に減少する。 この効果は蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）により引き起こされる。

【０１８４】 ＦＲＥＴは非発光性プロセスであり、このプロセスで、２分子間の距離の６乗に逆比例する双極子−双極子結合により、微小球の一つの部位に付着した励起した供与分子が第２の部位に付着した受容分子にエネルギーを移転する（セルビン，1999, "Applied fluorescence in chemistry, biology and medicine", 19 章
, W Rettig, ニューヨーク，スプリンガー）。 エネルギー移転の効率、Ｅは、エネルギー移転速度定数、ｋＴ、の全プロセスの速度の総和に対する割合により与えられ、これにより供与分子はその基底状態に戻ることができる（クレッグ，Ｒ
Ｍ，1996, "Fluorescence resonance energy transfer", Chapter 7 in Fluores
cence imaging spectroscopy and microscopy （ワング，ＸＦ編集） 。

【０１８５】

【数８】

【０１８６】 式中、Ｒは２分子間の距離であり、Ｒ ₀は有効なエネルギー移転についての臨界距離であり、Ｅ＝０．５（すなわち、Ｒ＝Ｒ ₀ ）により与えられる。 Ｒ ₀は典型的には有機色素につき２０−５０Åである。 スコットらもＲ ₀が供与分子と受容分子の間のストーク・シフトが増大すると共に増大することを見いだした。

【０１８７】 このように、ＦＲＥＴは所与の微小球上に負荷されうる発蛍光団の濃度の上限を設定する。 すなわち、より高濃度の発蛍光団は蛍光強度の増大には至らないが、実際には測定される強度の減少を引き起こすであろう。

【０１８８】 光分解 ：発蛍光団が励起される度に、それが変化を受け、非蛍光性となる一定の確率がある。 これは発蛍光団と分子状酸素やフリーラジカルといった他の反応性分子との間の化学反応か、又は発蛍光団自体の直接的光化学反応により起こり得る（国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ９８／００９４４）。 発蛍光団は通常フローサイトメータのレーザーにより短時間（試料流速および照射するレーザービームの幅に依存して約１０−２０μｓ）励起されるのみであるが、これにより約１００
回の励起−放射サイクルが起こる。 フルオレセインなどの発蛍光団は光分解を受けることがよく知られ、分解前に１０ ⁴ −１０ ⁵励起−放射サイクルを受けることができる（メラメドら，1990, "Flow Cytometry and Sorting"，第２版，ニューヨーク，ウィリー−リス）。 提唱される符号化ストラテジーでの微小球は、予備符号化及び最終スクリーニング分析に加えて、分割及び混合処理の各サイクルにおいて、フローサイトメーターにより再分析される必要があるので、その蛍光強度の大きさに基づき各微小球を確実に符号化するために、微小球に取り込まれた発蛍光団は比較的光に安定であることが不可欠である。

【０１８９】 実験 機器 ５２５、５７５及び６５０ｎｍの検出器を備え、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）
ソフトウェアを用いて獲得したＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｏ
ｒｔ（商標）（ＢＤ ＦＡＣＳ）フローサイトメータ（１５ｍＷ、４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー）により試料を流し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）
ソフトうえあ用いてデータを得た。 データ解析は、ＷｉｎＭＤＩ（商標）２．７
及びＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて実施した。 線形前方光散乱（ＦＣＳ）、側方光散乱（ＳＳＣ）及び蛍光（ＦＬ１、ＦＬ２及びＦＬ３）を、ＭＥＤフロー速度を用い、各事象について記録した（表Ｃ参照）。

【０１９０】 較正目的の微小球を検出する際のフローサイトメータの正確さを評価するため、
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｌｏｗ−Ｃｈｅｃｋ（商標）の微小球６μｍの溶液（既知濃度の１．０ｘ１０ ⁶個の微小球／ｍＬ）の八つの異なる希釈物を試料とし２分間用いた。 （ＦＬ１及びＦＬ３の二変数プロットについての多角形ゲートを用いて）検出した微小球の総カウントは、１：１０００−１：１範囲の希釈に直線的に依存している（Ｒ ² ＝０．９９９６）ことが分かった（図１０参照）。

【０１９１】 集団分類及び区分け三つの異なる微小球の集団を、それぞれＭｉｌｌｉＱ（商標）水２ｍＬに１０
μｍ緑Ｆの１．０ｍｇ、１０μｍ赤Ｆの１．３ｍｇ、１２μｍ赤−緑Ｆの１．１
ｍｇ微小球（全てＭｉｃｒｏｍｏｄ）を分散させて調製した。 次に、１０μｍ緑Ｆ、１０μｍ赤Ｆ及び１２μｍ赤−緑Ｆの懸濁液からそれぞれ７００μＬ、６５
０μＬ及び８００μＬをＢＤ・ＦＡＣＳ試料管中で混合し、１０分間音波処理した。 同様な混合物を調製し、これを、区分けした細胞を集めるために用いるＢＤ
ＦＡＣＳバイアル中のＭｉｌｌｉＱ（商標）水５０ｍＬに加えた。

【０１９２】 ＦＬ１及びＦＬ３について適切なＰＭＴ電圧に設定することにより、三つの異なる微小球をそれぞれ異なる集団に分類することが可能であった（図１１）。 次に、ゲートを用いて１０μｍ緑Ｆ集団から１０００００個の微小球をそして１２
μｍ赤−緑Ｆから１０００００個の微小球を、別のＢＤ ＦＡＣＳ ５０ｍＬバイアルに集めた（図１２及び図１３）。

【０１９３】 三つの５０ｍＬ溶液（もとの混合物、１０μｍ緑Ｆ及び１２μｍ赤−緑Ｆ）を手動の６０ｍＬシリンジを用いて０．８μｍのミリポアフィルターに通した。 次に、各フィルターの蛍光顕微鏡写真を撮影し、もとの混合物と比較して区分け物の純度を可視的に決定した（図１４）。 濾過物には微小球は観察されず、０．８
μｍのミリポアフィルターは調査目的のために微小球を濃縮する有効な方法を提供することが示された。 興味深いことに、微小球はフィルター上にあるインクのグリッドに強いアフィニティーを示した。

【０１９４】 蛍光的に被覆された微小球の測定試料Ｓ１（ＦＩＴＣ）、Ｓ２（ＱＦＩＴＣ）（表Ｃを参照）及び被覆していない２．５μｍ微小球の分散液（全てＭｉｌｌｉＱ（商標）水に分散している）をＦＬ１及びＦＬ３を用いて分析し、被覆していない微小球と被覆した微小球のそれぞれとの間に測定可能な差異があるか否かを決定した。 ＦＬ１及びＦＬ３を用いた三つの全ての集団の間に明確な差があった（図１５）。 ＦＬ１についてのＳ
１及びＦＬ３についてのＳ２のヒストグラムは、被覆していない微小球よりも有意に高い平均値を持つ蛍光強度の分布を示す（図１６を参照）。

【０１９５】 試料Ｒ１、Ｒ７及びＲ８（表Ｃ）並びに被覆していない４μｍ青−緑Ｆ微小球の分散液（全てＭｉｌｌｉＱ（商標）水に分散している）も、ＦＬ１及びＦＬ３
を用いて分析し、ＱＦＩＴＣの濃度に対する平均蛍光強度の変化を測定した。 より高濃度のＱＦＩＴＣで非直線性が存在したならば、蛍光共鳴エネルギー転移の存在も明らかであろう。 全４試料についてのＦＬ１及びＦＬ３の二変量プロットを図１７に示す。 加えたＱＦＩＴＣ量（μＬ）に対する、ＦＬ１強度に対するＦ
Ｌ３強度の割合のグラフを図１８に示す。 グラフの直線（Ｒ ² ＝０．９７５３）
は、エネルギー転移が起こっていないことを示唆する。

【０１９６】 精度の測定実験的にｒｌ及びｒｈの値を（実施例２で「光学多様な微小球の予備符号化」
に定義されている）三つのパラメータ（ＦＳ、ＳＳ及びＦＬ３）について直線値（ｌｏｇ値は実施例５で開発されたソフトウェアと互換性なし）を用いて決定するため、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｆｌｏｗ−Ｃｈｅｃｋ（商標）の６μｍ微小球の集団を区分けしそして再分析した。 パラメータはダブルゲートアプローチを用いて対で評価した。 微小球は最初、評価の際よく定義されたゲートが二つのパラメータ（例えば、ＦＳ及びＳＳ）について確立されるまでは、評価されていないパラメータについて（例えば、ＦＬ３）、広いゲートで制御された。 このため１個の微小球だけが回収された。 凝集は望ましくなかった。 何故なら、再分析の際、微小球が球状であるのに対し、凝集物はレーザービームに関して異なる方向を持つ可能性があるからである。 ２０００００個の微小球の二つの集団をそれぞれ、５０
ｍＬのＢＤ・ＦＡＣＳバイアルに集め、一つにはよく定義されたＦＳ及びＳＳゲートを用い、他方にはよく定義されたＳＳ及びＦＬ３ゲートを用いた（図１９（
ａ））。

【０１９７】 ＦＡＣＳｏｒｔ（商標）は機械的区分けを用いるので、区分けされた微小球を高程度に希釈した（１：５０００以下）。 その溶液５０ｍＬを八つのより小さい培養管に分割し、＜１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、各培養管に約０．２５
ｍＬだけが残るように上清を注意深く除去することにより、０．５ｍＬに再び濃縮した。 充分に形成された微小球のペレットは、ちいさいものの、各培養管ではっきり見ることができた。 これらの培養管全てから残りの溶液を洗浄し、１本のＢＤ ＦＡＣＳ管（ここで全容量は３ｍＬ）に混合した。 この管も＜１０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離し、約０．５ｍＬが残るように注意深くその上清を除去した。 次に、適用されるゲートがないことを除き最初に区分したときと同じ機器設定を用いてこの用量のその全体を分析し、全ての事象を記録した。 ２回の再分析の二変量プロットを図１９（ｂ）に示す。

【０１９８】 データ解析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（商標）を用いて実施し、各パラメータにつきもとのよく定義されたゲートの下方又は上方の各微小球（チャンネル数として表される）の偏差の頻度ヒストグラムを構築した。 次に、ＦＳ、Ｓ
Ｓ及びＦＬ３についてのｒｌ及びｒｈの値（表Ｅ）を、戻された全微小球のうち＞９９．９％を含む最大偏差を見いだすことにより、決定した。

【０１９９】 データ解析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（商標）を用いて実施し、各パラメータにつきもとのよく定義されたゲートの下方又は上方の各微小球（チャンネル数として表される）の偏差の頻度ヒストグラムを構築した。 次に、ＦＳ、Ｓ
Ｓ及びＦＬ３についてのｒｌ及びｒｈの値（表Ｅ参照）を、戻された全微小球のうち＞９９．９％を含む最大偏差を見いだすことにより、決定した。

【０２００】

【表Ｅ】

【０２０１】 考察 光学的多様性異なる濃度の所与の発蛍光団の場合、放射スペクトルの最大強度は変化しうるが、放射スペクトルの形は低濃度の発蛍光団に対して一定を維持することになる。 従って、二つの異なる波長又は領域の蛍光強度の割合は一定を維持することになる。 このことは、図１２及び２０の同じ集団からの微小球間の相関関係に見ることができる。 全蛍光パラメータについての前方光散乱と蛍光強度の間にも強い相関関係がある（すなわち、低い蛍光強度を持つ微小球は低い前方散乱強度を有する）、従って前方散乱は独立したパラメータではない。

【０２０２】 反対に、図１７は赤及び緑の蛍光が互いに関し独立したパラメータであることを実証する。 図１８の緑蛍光に対する赤蛍光の割合と加えたＱＦＩＴＣ−ＡＰＳ
量の間の直線関係は、用いたＱＦＩＴＣ濃度では、蛍光共鳴エネルギー転移は無視してよい程しか起こっていないことを示唆する。 蛍光殻での各発蛍光団の固定した位置も、供与分子と受容分子の有効な配向を妨げうる。 従って、被覆していない４μｍ青−緑Ｆ及び４μｍ青−赤Ｆ微小球の平均傾斜により定義される二つの限界の間で緑蛍光に対する赤蛍光の望ましい平均的割合を有する微小球集団を合成することが可能である。

【０２０３】 ＦＬ１（緑）とＦＬ３（赤）の間の蛍光補償はＢＤ ＢＡＣＳ上では不可能である。 全パラメータ間の有効な蛍光補償の必要を説明するため、図１７のこれらの制限する傾斜の外側にある赤及び緑の蛍光の組み合わせを考えよう。 符号化されうるユニークな微小球の数を最大とするためには、全パラメータ空間を利用すべきである。 これには、参照により本明細書にインコーポレートされるレーデラーら（１９９７，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ２９ ，３２８−３３９）及びビゴスら（
１９９９，前記）に記載されたように用いられた全ての発蛍光団の蛍光補償マトリックスの使用が要求されるであろう。

【０２０４】 分解能フローサイトメータの分解能及び各微小球に取り込まれた発蛍光団の安定性は、各微小球について光学パラメータの再現可能な測定をするためには重要な因子である。 図１０は、検出した微小球の数が試料集団における微小球の数に直接比例し、従って各微小球の検出は、３５±５μＬ／分の試料流速で、調べた濃度範囲内（すなわち、１ｘ１０ ⁶微小球／ｍＬ）の集団濃度によっては影響を受けないことを実証している。 従って、各微小球の検出は分けて考えることができる。

【０２０５】 各微小球の光学パラメータの測定における測定における変動の起こりうる原因は、例えばレーザーパワーの変動、光学照準、電子ノイズといったフローサイトメータから生じるか、又は例えば発蛍光団に対する光分解、溶媒極性及びｐＨの効果といった微小球自体から生じる。 他の重要な因子には、コンビナトリアル合成に要求される有機溶媒中でのコロイドの不安定性による微小球の凝集並びに、
微小球表面上に合成される化合物（例えば、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド）により誘導される散乱強度又は蛍光強度の変動が挙げられる。

【０２０６】 （ａ）光子の蛍光放射、及び（ｂ）検出器中での光電子の遊離といった確率的（すなわち、時間的に無作為な）プロセスが、約１％という理論的最小ＣＶに相当する（セルビンら，１９９９，前記）。 確かに、図１９（ｂ）の再分析された集団はこの分解能に近づけないが、データの分析からさらに洞察が与えられる。
主要なノイズはＦＬ１及びＦＬ３についての多角形ゲートにより除去でき、泡や破片の存在はわずかに蛍光性であるので、これらにより起こるノイズを濾過により除外する（これは図１９（ｂ）の赤蛍光の「微小球」集団の低い強度から明らかである）。 凝集（例えば、二量体及び三量体）は実際の再分析に要求される５
０ｍＬから０．５ｍＬへの区分けされた微小球の容量減少に必要な遠心分離により引き起こされた。 この遠心分離、及び引続き起こる凝集は機械的区分け機よりもむしろ電子的小滴区分け機を用いて避けることができる。 しかしながら、ＦＬ
１及びＦＬ３についてだけでなく、ＦＳ及びＳＳについての凝集集団をゲートにより制御することにより、凝集物を濾別することができる。 このように、図１２
及び１３で用いられるようなゲートの使用により、破片や凝集物は除去することができ、単一の微小球のみを分析することができる。

【０２０７】 表ＥのＦＳ、ＳＳ及びＦＬ３について得られたｒｌ及びｒｈの値は、再分析の際、より低い値への明確なシフトを示す。 ＦＬ１及びＦＬ２は特異的に評価していないとはいえ、光学収集システム、検出器及び電子機器はＦＬ３について用いたものと非常に類似している。 ＦＬ３についての下方シフトは光分解によるものと予測されたが、前方散乱及び側方散乱はより高い値とより低い値の両方にシフトすると予測された。 この全体的な下方シフトは、微小球の長期保存に用いられる界面活性剤溶液から、区分け後の被覆溶液（すなわち、ＭｉｌｌｉＱ（商標）
水）で十分に希釈された溶液への溶媒の変化を考慮すると説明できる。 集団をさらに再分析しても溶媒のこの初期変化の後の下方シフトは持続しないと予測される。

【０２０８】 結論光学多様に接近するＱＦＩＴＣ被覆微小球の集団はフローサイトメトリーを用いて分析された。 エネルギー転移は用いた濃度では起こらないので、ＱＦＩＴＣ
−ＡＰＳ微小球や４μｍ青−緑Ｆ微小球を用いる緑蛍光に対する赤蛍光の任意の望ましい割合を有する微小球集団を合成することが可能である。

【０２０９】 実施例５ ソフトウエア開発緒論 高速フローサイトメーター（例えば、１００，０００事象／ｓ）により提供される速度で微小球を処理するため、二つの重要な課題を達成できるアルゴリズムを設計せねばならなかった。 すなわち １． 各微小球に対するパラメータ値を得、そしてそのパラメータ値に基づいて所与の微小球を集め又は排除することの決定をすること ２． 分割−そして−混合のコンビナトリアル処理を通して微小球の合成履歴を記録すること である。

【０２１０】 二つのアルゴリズム、すなわち、取得後アルゴリズム及び実時間アルゴリズムを開発し、これらの課題を処理するためプログラムした。 両アルゴリズム共実施例２（「光学多様微小球の予備符号化」）で定義したグリッド空間の概念を利用した。 取得後アルゴリズムはグリッド空間の動的配分を使用する静止アルゴリズム（すなわち、時間依存性がない）であるのに対し、実時間アルゴリズムはグリッド空間の静的配分を使用する動的アルゴリズム（すなわち、時間依存性）である。 最も困難なのは、それぞれのアルゴリズムの動的側面である。

【０２１１】 方法表Ｄにおける試料集団のＦＣＳ2.0 ファイルデータ（ディーンら，1990，Cyto
metry, 11: 321-322) は実施例４（「蛍光被覆微小球の測定」) に記述した方法を用いて得た。 総数１０００００の事象を各試料について記録した。 理想的光学多様を持つ集団をシミュレートするため、通常の Microsoft Excel（商標）を用いて多数の無作為データファイルをも作成した。

【０２１２】 このアルゴリズムを用いてフローサイトメトリーのデータを分析するため、 F
CS Express（商標）を用いてＦＣＳ2.0 ファイルの全てのパラメータ値を抽出し、 Microsoft Excel（商標）中に取り込んだ。 これにより、ヘッダーなしにタブを定めたテキストファイルとしてデータを保存でき、そして該データを所望の任意のパラメータについて昇順に整理することもできた。

【０２１３】 Ｃプログラム言語（ケリーとポール，1995，"A book on C", 第 3版, ニューヨーク，アジソン−ウエスレー）を用いて両アルゴリズムをプログラミング、gc
c for DOS コンパイラーを用いてコンパイルした。

【０２１４】 アルゴリズムのスピードの測定は、Dell 400 MHz PC 上で、システムコール・
ツー・ザ・ＤＯＳコマンド・タイムを用いて行った。 各アルゴリズムの能力に関するさらなる情報を得るため、必要なときは、各アルゴリズムに対しては小さな改変も行った。

【０２１５】 取得後のアルゴリズム目的このアルゴリズムの主要な目的は微小球の集団の光学データを得ること、及び該集団内の光学的にユニークな微小球のリストを作成することである。 この研究に使用した装置は改変に利用できなかったので、該アルゴリズムは該装置の改変が一切不要であるように作成した。

【０２１６】 理論微小球，Ｍ _iは下記の式を満足するときは光学的にユニークであるようであった。

【０２１７】

【数９】

【０２１８】 上式中、Ｍ _jは該集団中の任意の他の微小球であり、ｐは該装置により測定される任意のパラメータであり、Ｍ（ｐ）は特定の微小球に対するパラメータｐの値であり、そしてＥ _Pは該パラメータに対する同一集団の反復測定の精度に基づいて使用者が決める値である。

【０２１９】 要件取得後アルゴリズムは４パラメータのデータで使用するためにのみ開発した。
該データはまず第一のパラメータについて（アルゴリズム効率を高めるため）昇順に区分けし、そしてヘッダー情報はすべて除去せねばならない。 データは下記のフォーマットでタブを定めたテキストファイルとしても保存せねばならない。

【０２２０】

【外１】

【０２２１】 最初の整数は該装置により記録された順序で各微小球に与えられる数であり、
その後の４個の整数は４個のパラメータ値のそれぞれに対応する。

【０２２２】 記述取得後アルゴリズムは所与の集団に対するデータを得た後に実施される。 それは該集団で記録された最初の微小球で開始し、方程式５．１を用いて光学的にユニークかどうかを決定する。 もし所与の微小球が光学的にユニークであれば、それは「マスター」リストとして知られる別のリンクしたリストに加えられる。 このマスターリストは該集団の部分集合の中にユニーク微小球が存在すればそれをユニーク微小球として同定することができる。

【０２２３】 もし所与の微小球が光学的にユニークでないときは、それ及びそれと光学的に識別し得ない他のすべての微小球は複製として標識される。 複製は、微小球が該集団から排除されないことをはっきりさせることが重要であるとしても、ユニーク微小球のリストには加えられない。 複製微小球は、その合成履歴が取得後アルゴリズムにより記録されないとしても、該集団中のユニーク微小球と共にコンビナトリアル合成を受け続ける。

【０２２４】 他方、ユニーク微小球は分割−及び−混合プロセスを通って進んでいく。 ユニーク微小球のどれが該分割−及び−混合プロセスの所与のサイクルの間どのバッチにあるかを決定するため、微小球のバッチのそれぞれをフローサイトメーターで再分析し、各バッチについて「正確に」同じ装置条件の下でデータを記録する。

【０２２５】 各バッチから得られるデータを取得後アルゴリズムを用いて処理するとき、該新規なデータをマスターリストと比較する。 次いでこのアルゴリズムを逆に用いて、新規なデータのどの微小球がマスターリストの中のそれと光学的に「識別し得ない」かを決定する。 マスターリストはユニーク微小球のみを含むので、もし新規なデータの微小球がマスターリストの微小球と光学的に識別し得ないときは、それが同じ微小球であるという高度の蓋然性がある。 ついで、このマスターリストを、該分割−及び−混合プロセスの所与のサイクルの間、この特定のバッチに該微小球が存在したことを示すように更新する。 このようにして、光学的にユニークな微小球はコンビナトリアル合成を通して追跡され得る。

【０２２６】 光学的にユニークな微小球と光学的に識別し得ないと記録される誤った微小球に対して但し書きをせねばならない。 この場合、どれが誤った微小球であるかを示すことはできないから、ユニーク微小球をマスターリストから除去する。 従って、使用者が定める精度値、Ｅ _Pの正確な割当てがこのアルゴリズムの有効性にとって不可欠となる。

【０２２７】 結果マスターリストの作成の間アルゴリズム処理時間と集団サイズの間の関係を決定するため、 CreateMaster （商標）中の主要ループの時間測定を行った。 この関係は、各微小球は集団中の他の微小球それぞれと比較されねばならないから、
Ｏ（ｎ ² ）、すなわち処理時間は集団サイズの二乗に比例することが量のオーダーから予測された（スタッブら，1993,"Data structures with abstract data t
ypes", ボストン, PWS)。図２１は異なる集団サイズの無作為データについての測定の結果である。予測されたように、アルゴリズム処理時間は集団サイズの二乗に比例し、Ｒ ² ＝０．９９９８の曲線に二項適合する。

【０２２８】 さらに、集団サイズの関数としての集団におけるユニーク微小球の数は図２２
に示してある。 各パラメータに対しＥ _P ＝５０という値を用いると（「実時間アルゴリズム」に関する「理論」を参照）、約１２０００の微小球が処理された後ユニーク微小球の最大数が約４７００であることが明瞭に示される。

【０２２９】 この効果は、しかしながら、予想されるべきであり、このアルゴリズムを用いて所与の集団から得ることが可能なユニーク微小球の最大数の理論的限界を表すものである。 この限界は、最初は殆ど直線的関係が存在する（すなわち、処理される新規な微小球のそれぞれがユニークである）が、約１０００微小球が処理された後は、さらなる微小球はいずれも先のユニーク微小球とは光学的に識別し得ないという確率が増大し、その結果約１２０００微小球が処理された後には顕著に減少するという事実から生ずる。

【０２３０】 結論−取得後アルゴリズム取得後アルゴリズムは装置の改変を一切必要とせず、テストされ、そして微小球集団からマスターユニークリストを首尾よく作成することが示された。 さらに、ユニーク微小球はコンビナトリアル合成の間、次のバッチに存在するとして同定され得る。 アルゴリズム処理時間と集団サイズの間のＯ（ｎ ² ）という関係は、大きな集団サイズ（１０００００微小球より大）に対する関係を意味するものではあるが、該処理時間は禁止的となる。 しかしながら、それは動的アルゴリズムではなく静的アルゴリズムであるので、迅速な処理時間は不可欠ではない。 より制限的要因は該アルゴリズムの自己制限的性質であり、それによりユニーク微小球の数は集団サイズが最適サイズを越えて増加するにつれ（Ｅ _Pの値に依存して）減少する。

【０２３１】 実時間アルゴリズム 目的このアルゴリズムの主要な目的は、所望の光学的性質に基づき区分けすることにより集団から光学的にユニークな微小球を抽出することであった。 大きなコンビナトリアルライブラリーの合成に使用するため、それは取得後アルゴリズムの限界、即ち、Ｏ（ｎ ² ）関係及び自己制限的性質、をも克服せねばならなかった。

【０２３２】 理論取得後アルゴリズムと異なり、実時間アルゴリズムは予め−定められたグリッド空間を作成し、次いでパラメータ値がこれらのグリッド空間内に分配される微小球を選別する。 該アルゴリズムの二つの異なる使用は、（ａ）光学的にユニークな微小球集団を作成すること、及び（ｂ）この集団中の「全ての」微小球の合成履歴を記録することである。

【０２３３】 （ａ）に対してのみ、内部区分け領域が要求される（図６参照）。 グリッド空間及びその内部区分け領域を作成しそして微小球の集団が分析される前は空と標識化する。 次いで、微小球のパラメータ値が空と標識されているグリッド空間に対応するときは、該微小球を光学的にユニークとみなす。 このグリッド空間はその後詰まったと標識される。 より完全な定義のためには、WriteArray( 商標) の主要ループを参照すること。

【０２３４】 このアルゴリズムは、どの微小球がどのグリッド空間に対応するかを容易に決定するため「整数分割」をも利用する。 整数分割は正規分割に類似するが、回答が最近の整数、例えば２１３／１００＝２又は１４／１５＝０に丸められる点が異なる。

【０２３５】 要件実時間アルゴリズムは任意の数のパラメータを用いて使用するように開発された。 現在、本研究で利用可能な５個のパラメータについて実行される。 ヘッダー情報はすべて除去されねばならず、データは下記のフォーマットでタブが定められたテキストファイルとしても保存されねばならない。

【０２３６】

【外２】

【０２３７】 上式中、各整数は特定のパラメータに対する数値である。 取得後アルゴリズムと異なり、最初の整数に対する識別番号は必要でない。 各微小球から得られるデータは内部に保存されないからである。 さらに、未だ満たされていないが、実時間アルゴリズムを行うコンピュータを経てフローサイトメーターを区分けする機構の要件が実時間制御に提供されるべきである。

【０２３８】 記述 微小球の予備符号化実時間アルゴリズムは微小球集団の分析の間適用される。 整数の配列を作成するため、パラメータの数と各パラメータについてのグリッド空間の幅を選択する入力が使用者に要求される。 実施例２（「光学的多様微小球の予備的符号化」）
に記述したように、全てのグリッド空間は最初空であり、従って該配列におけるそれらの対応する整数は等しくゼロである。

【０２３９】 各微小球が検出されフローサイトメーターにより分析されるにつれ、実時間アルゴリズムはどのグリッド空間にそれが対応するかをそのパラメータ値の整数分割を用いて決定し多次元配列に索引を付ける。 もしそれが対応するグリッド空間の内部区分け領域内にありそしてグリッド空間が空と標識されている（即ち、ゼロ）ときは、該微小球を収集するよう区分け決定がなされる（従って区分け機構の実時間制御の必要がある）。 次いで該グリッド空間の標識は詰まった状態（すなわち、１）に変化する。 もし内部区分け領域の外にある又は該グリッド空間が既に詰まった状態と標識されているときは、該微小球を排除するよう区分け決定がなされる。 このようにして、光学的にユニークな微小球のみが微小球の全集団から集められる。 この区分け決定をする時間は微小球が観察点から滴下点まで移動する時間よりも短くなければならないことに留意すべきである。

【０２４０】 微小球の合成履歴の記録コンビナトリアル合成を通してこれらのユニークな微小球の追跡を持続するために、実時間アルゴリズムは、各バッチがフローサイトメーターにより再分析される時に適用される。 内部区分け領域は光学的にユニークな集団を作成するためにのみ必要であったから、このアルゴリズムは所与の課題バッチに対しどの微小球がどのグリッド空間に対応するかを決定することだけが必要である。 グリッド空間の配列と１対１の対応を有する長さｎの文字列（ここでｎは分割−及び−混合プロセスのサイクル数であり、各文字は特定の試薬を表す）が次に各微小球の合成履歴を含むように更新される。 しかし、これらの課題は分析の後に行うことができ、分析の間に行う必要はない。

【０２４１】 結果各微小球の処理時間が一定であったか否か、従って集団サイズに無関係であったか否かを決定するため、WriteArray (商標) の主要ループの時間測定を行った。 それは、処理時間と主要ループの反復数（集団サイズと等価である）の間の関係がＯ（ｎ）であるという量のオーダー（スタッブズら，1993, 上掲）を用いて予測された。 図２３は異なる数のパラメータに対する異なる数の反復を用いた測定の結果である。 予測された通り、アルゴリズム処理時間は反復数に比例し、Ｒ ² ＝０．９９８１という線形適合又は異なるパラメータ数のそれぞれに対しより良好な適合を示した。

【０２４２】 パラメータの数に対し図２３からのスロープをプロットすると、第二のプロットが得られ（図２４）、これは「１回の」反復に対する時間のための方程式を与える。 すなわち ｙ＝０．４１９ｘ＋０．００２３ （５．２） ここで、ｙは１回の反復のためのマイクロ秒で表した時間であり、ｘはパラメータの数である。 こうして、１７個のパラメータ（市場で入手可能な最大数）に対して、１回の反復に対する総時間は一定の７．１２５μｓである。 この数は高速フローサイトメーター分配機（例えば、Coulter Elite （商標）では６．５μｓ
）で要求される区分け決定時間にうまく匹敵する。

【０２４３】 このアルゴリズムの唯一の理論的限界は全パラメータ空間内に存在できるグリッド空間の最大数である。 これは図２５に示す。 図２５には無作為に作成された集団からのユニーク微小球の数が集団サイズに対してプロットされている。 この曲線の一般形は次式で与えられる、すなわち

【０２４４】

【外３】

【０２４５】 上式中、Ａは利用可能なグリッド空間の総数に等しく、この事例では、４パラメータで与えられ、その各々は１０の領域に再分割される（１０ ⁴ ＝１００００
）。

【０２４６】 実施例４由来のＱＦＩＴＣ−被覆４μｍ青−緑色Ｆ微小球の光学多様混合物（
図２６を参照）のデータを２パラメータ・シミュレーションで予備符号化し、実時間アルゴリズムのデモンストレーションを行った。 各パラメータに沿って８個の区画を用い、ｒｌ＝ｒｈ＝３０チャンネル数の使用者決定値を用いて、該パラメータ空間をそれぞれ１２８×１２８チャンネル数の幅のグリッド空間に分割し（即ち、１０２４／８＝１２８）、内部区分け領域を６８×６８チャンネル数とした。 ＱＦＩＴＣ−被覆微小球はＦＬ１及びＦＬ３の光学多様性のみであるから、残りのパラメータ（ＦＳ、ＳＳ及びＦＬ２）は、その影響を無効にするため、
各微小球に対して同一とされた。 従って、ユニーク微小球の最大数は６４である。 実時間アルゴリズムは、光学的にユニークな微小球のパラメータデータをテキストファイルに保存するために改変された。 それは後にプロットされ、グリッド空間の図式表示に重ねて示された（図２７）。 該グリッド空間の利用可能な６４
個の内部区分け領域のうちの５６個は実時間アルゴリズムを用いて全集団から抽出された各１個の微小球により巧く占有された。

【０２４７】 結論−実時間アルゴリズム実時間アルゴリズムは大きなコンビナトリアルライブラリーのために要求される巨大な数の微小球を処理する能力を持っている。 それは、集団サイズに無関係でありそしてパラメータの数にのみ依存する、方程式５．２により与えられる一定の区分け決定時間を提供する。 １７個のパラメータに対してさえも該区分け決定時間は高い区分け速度で処理することができる（７．１２５μｓ／微小球）。
さらに、ユニーク微小球の最大数は利用可能なグリッド空間の数に等しい。 利用可能なグリッド空間が占める容積は全パラメータ空間に等しい。 従って、これは最大可能数である。

【０２４８】 しかし、このアルゴリズムを完全に実施するためには、フローサイトメーター・エレクトロニクスとコンピュータの間にインターフェイスを設定する必要がある。 これらの必要性は高度に専門的であるが、ドボラックら（1991, J Microcom
puter Appl., 14: 327-341) 及びリアリーら（1993, 米国特許第5199576 、1993
, 米国特許第 5204884、1997，Cytometry, 27: 233-238、1997, Proc SPIE: Int
Soc Opt Eng, 2982 : 342-352)による最近の研究が有用であることが明らかである。 ドボラックら（1991, 上掲）は、フローサイトメーターとマイクロコンピュータの間の電子インターフェイスを記述し、非商業的使用のための完全な作業用図面を供給することを提案する。 これは区分け決定時間を決定し、将来支援ソフトウエアを開発するのに有用であろう。 リアリーら（1993-1997,上掲）は、所与の保証レベル、例えば９５％内に所与の稀な細胞（例えば、１０ ⁶個に１個の出現）を得るために、滴下遅延やパルス積分時間などの至適区分け特性を選択するように動的に「訓練されている」改変高速区分け機を開発し、特許を得た。 この改変高速区分け機の一部の詳細な機構は援助可能として供給もされている（ドボラックら，1991, 上掲、リアリーら，1993，上掲）。 また、ケットマンら（1998
, 上掲) 及びビゴスら(1999,上掲) の両者はその特殊な必要性を満たすためフローサイトメーターの電子機器を首尾よく改変した。

【０２４９】 結論要約すると、取得後アルゴリズムは、コンビナトリアル合成を通して光学的にユニークな微小球を追跡するためにフローサイトメーターに如何なる改変も加えることなく使用することができる。 処理時間と集団サイズの間のＯ（ｎ ² ）関係及びアルゴリズムの自己制限的性質のため、巨大なコンビナトリアルライブラリーの処理への意図的適用には不適当であると推奨される。

【０２５０】 一般的結論本方法は、少なくとも一部には符号化できる最大ライブラリーサイズについて及び試料処理量（即ち、一日に処理される試料の数）について記述される。 集団サイズの関数として抽出される光学的にユニークな微小球の数は図２５に類似の漸近曲線に従う。 １秒当たり検出される微小球の数がほぼ一定値になると、その集団サイズは代わりに時間の単位で表すことができる。 時間の関数として集団から抽出された光学的にユニークな微小球の数、Ｕ、に対する予測方程式が開発されており、下記の一般式を持つ、すなわち

【０２５１】

【数１０】

【０２５２】 この方程式の変数は全て本研究で定義された方程式及び関係式から得ることができる。 方程式５．４は方程式５．３の一般形に基づき、従ってＮは方程式２．
６の僅かな改変により与えられる利用可能なグリッド空間の総数に等しい。

【０２５３】

【数１１】

【０２５４】 上式中、ｐは利用可能なパラメータの数に等しく、ｖ _iはｉ番目のパラメータに対するグリッド空間それぞれの幅である。 各グリッド空間の幅は次式に等しい。 ｖ _i ＝ｒｌ _i ＋ ｒｈ _i ＋ ｗ _i （５．６） 上式中、ｒｌ _i及びｒｈ _iは実施例２で定義された（そして実施例４で実験的に求められた）下方範囲及び上方範囲であり、ｗ _iはｉ番目のパラメータに対するグリッド空間それぞれにおける内部区分け領域の幅である。

【０２５５】 ｗ _iの値も、内部区分け領域が占めるグリッド空間それぞれの百分率を表すα
の計算に重要である。 図２５では、ｒｌとｒｈは等しくゼロであり、従ってα＝
１である。 これは最大の場合を表し、空のグリッド空間を占める微小球すべてが抽出される。 より現実的シナリオでは、α＜１の場合、空のグリッド空間の内部区分け領域を占める微小球だけが抽出される。 従って、αは下記の式により与えられる乗数である。 即ち

【０２５６】

【数１２】

【０２５７】 βの値は１秒間に処理される微小球の数に等しく、従ってβｔは集団サイズに等しい。 βの最大値は方程式５．２の逆数、即ち実時間アルゴリズムを用いて１
秒間に処理される微小球の数により与えられる。

【０２５８】 指数係数、ｋ、は光学多様、微小球の集団のσに正比例し、Ｎに逆比例する。
即ち

【０２５９】

【数１３】

【０２６０】 上式中、無作為データ（最大可能な光学多様）に対してはσ＝１であり、ＱＦ
ＩＴＣ被覆微小球と非被覆４μｍ青−緑色Ｆ微小球の混合物に対してはσ＝０．
２８である（Ｎを変えることにより実験的に求められた）。

【０２６１】 この一連の方程式は所与の時間期間に対する光学的にユニークな微小球の数を予測させる。 これは、（ユニークな微小球の数に比例する）最大ライブラリーサイズを方程式５．４に関与する変数を変えることにより最適化することを可能とするので、貴重な関係である。 さらに、変数、例えばｒｌ、ｒｈ、β、ｐのそれぞれは本研究で述べた概念及び実験を用いて測定し又は評価することができる。

【０２６２】 従って、提案されたストラテジーの実施可能性は方程式５．４を用いて予測することができる。 ビゴスら（1999, 上掲）の蛍光パラメータの数を用いてｐ＝９
、一方これらの蛍光団に対するｒｌ及びｒｈの値を表Ｅから評価でき、ｒｌ＝５
０、及びｒｈ＝１０となる。 市販のフローサイトメーターの現在の最大区分け速度が約２５０００微小球／ｓであるとしても、方程式５．２により与えられる９
個のパラメータに対するβの値は２６５０００微小球／ｓであり、従ってβ＝２
５０００微小球／ｓである。 ＱＦＩＴＣ被覆微小球に対するｋ＝０．２８Ｎの値は実施例３における合成法を用いて達成し得る光学多様の代表である。 α及びＮ
は内部区分け領域の幅、ｗ _iに依存するから、図２８はユニーク微小球の数、Ｕ
、をｗ _iの関数として表す。 ｔの値は単純化のため２４時間であると考えられる。

【０２６３】 従って、上記の条件に対するＵの最大値は１１０の内部区分け領域幅に対応する。 ｗ _i ＝１１０からｗ _i ＝１１１までの鋭い減少に注目する。 図２８に存在する不連続は方程式３２で要求された整数分割によるものである。 ｗ _i ＝１１０を用い、ユニーク微小球の数を図２９で２４時間にわたり時間の関数として表している。 従って、２４時間後に、７．０２×１０ ⁶個のユニーク微小球が抽出され得るであろう。 ２４時間の間２５０００微小球／ｓでフローサイトメーターを維持することの実施可能性は克服することは困難であろう。 例えば被覆流及び試料の一定供給が要求されるからである。 しかしながら、２．００×１０ ⁶個のユニーク微小球が僅か４．５時間、遙に現実的な時間枠のうちに抽出され得るであろう。 さらなる分析全ての時間は、全ての微小球が集められるのでＵ／β秒に等しい。 従って提案されたストラテジーの律速段階は予備的符号化段階である。

【０２６４】 ２百万個の光学的にユニークな微小球は８個のヌクレオチド長の可能総数６５
５３６のオリゴヌクレオチドのコンビナトリアル合成を許容するであろう。 このライブラリーは次にハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列決定に使用できるであろう。 複数の又は縮重した微小球の存在は提案されたストラテジーの全体的エラー強さを改善する。 何故なら、同じ化合物を持つ縮重した微小球は全て最終スクリーニングプロセスで類似の結果を返すはずだからである。 最大ライブラリーサイズを増加させるため、ｒｌ及びｒｈの値をより小さくし並びに光学多様の程度をより高くすることが必要となるであろう。 これは、より効果的な蛍光補償、及び最初の区分け後に全てのパラメータに対する最初の下方シフトを避けるために被覆流として使用される同じ溶媒中での微小球の再分散により達成され得るであろう。

【０２６５】 実施例６ 同一試料の７部分の実施の間の再現性 MilliQ (商標) 水に分散させた15μｍ蛍光シリカ微小球の試料( ミクロモド、
カタログ番号40-15401、10μｇ/ ｍＬ、NH ₂官能基化）を調製し、ＦＡＣＳCali
bur(商標) フローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を通過させた。
１００万事象に対する領域内（図３０）の散乱シグナル及び蛍光シグナルを記録した。 これは各実施の間を１０秒開けて同一試料でさらに６回繰り返した。 ＦＬ
３（赤色蛍光）、前方散乱及び側方散乱の平均値を７回のデータから決定した。
平均の側方散乱は３８７（標準偏差＝２３．６％）、平均の前方散乱は３００３
（標準偏差＝１５３．５％）及び平均ＦＬ３値は３０１（標準偏差＝３１．１０
％）であった。 これらの結果は選択された試料から得られた散乱シグナル／蛍光シグナルの平均値に小さな変動があることを示す。

【０２６６】 実施例７ フローサイトメーターから集められ、フローサイトメーターを再通過させた非蛍 光微小球は再現性のある散乱値を示す １０．２μｍポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５１０Ａ、ＣＶ＝１４．７％、
１０μｇ／ｍＬ水）の試料をフローサイトメーターに通過させた。 二つの領域を設定した。 領域１の微小球は事象として検出された（図３１、パネルＡ）が、領域２の微小球を除き、すべて実施後廃棄した。 領域２の内部の微小球を集め、サイズ５のフィルター（孔サイズ４−１０μｍ）で濾過して再濃縮し、領域２のゲートを除去した後、フローサイトメーターを再通過させた（図３１、パネルＢ）
。 次いでこの微小球を領域１内のどこにでも自由に移動できるようにした。 この図のパネルＢに示すように、この微小球は領域２が除去された場所に再び現れた。

【０２６７】 実施例８ フローサイトメーターから集められ、フローサイトメーターを再通過させたポリ スチレン１０．２及び２１μｍ微小球混合液は再現性のある散乱値及び蛍光値を 示す １０．２μｍポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５１０Ａ、ＣＶ＝１４．７％、
１０μｇ／ｍＬ水）及び２１μｍポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５２０Ａ、Ｃ
Ｖ＝１４．７％、１０μｇ／ｍＬ水）を含む混合液をフローサイトメーターに再通過させた。 二つの領域を設定した。 領域１の微小球は事象として検出された（
図３２、パネルＡ、Ｂ）が、領域２の微小球を除き、全て実施後廃棄した。 領域２の内部の微小球を集め、サイズ５のフィルター（孔サイズ４−１０μｍ）での濾過により再濃縮し、領域２のゲートを除いた後、フローサイトメーターを再通過させた（図３２、パネルＣ、Ｄ）。 次いで、この微小球を領域１の内部に自由に入れるようにした。 図３２のパネルＢに示すように、この微小球は領域２が除去された場所に再び現れた。 これら結果は、属性として光散乱を用いて再現性良く微小球をフローサイトメーターから集め、フローサイトメーターを再通過させることができることを示す。

【０２６８】 実施例９ フローサイトメーターから集めフローサイトメーターを再通過させた蛍光緑色ポ リスチレン微小球は再現性良く散乱値及び蛍光値を示す蛍光性緑色ポリスチレン微小球（６μｍ，ベクトン・ディッキンソン，カリブライト微小球）の試料をフローサイトメーターに通した。 二つの領域を設定した。 領域１の微小球は事象として検出した（図３３、パネルＡ及びＢ）が、領域２
の微小球を除き、全て実施後廃棄した。 領域２内の微小球を集め、サイズ５のフィルター（孔サイズ４−１０μｍ）での濾過により再濃縮し、領域２のゲートを除いた後、フローサイトメーターを再通過させた（図３３、パネルＣ、Ｄ）。 次いでこの微小球を領域１の内部に自由に入れるようにした。 パネルＣに示すように、この微小球は領域２が除去された場所に再び現れた。 このことは、蛍光を属性として用いて、微小球を再現良くフローサイトメーターから集め、フローサイトメーターを再通過させることができることを示す。

【０２６９】 実施例１０ ＤＭＦ中で３時間膨潤させた後ミリキュー水に戻した非蛍光ポリスチレン／ジビ ニルベンゼン（ＤＶＢ）微小球はＤＭＦに曝されなかったものに類似の散乱値を 示す １０．２μｍポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５１０Ａ、ＣＶ＝１４．７％、
１０μｇ／ｍＬ MilliQ(商標) 水）の試料をフローサイトメーターに通し、領域１内の１００００事象の側方散乱及び前方散乱を記録した（図３４、パネルＡ）
。 平均側方散乱値は１１９４であり、平均前方散乱値は３１６であった。

【０２７０】 １０．２μｍポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５１０Ａ、ＣＶ＝１４．７％）
の第２の試料を純ＤＭＦ中で３時間攪拌した後、 MilliQ(商標) 水に徐々に戻した。 この試料（１０μｇ／ｍＬ水）をフローサイトメーターに通過させ、領域１
内の１００００事象の側方散乱及び前方散乱を記録した（図３４、パネルＢ）。
その平均側方散乱値は１２２４であり、平均前方散乱値は３１６であった。

【０２７１】 両試料に対する平均前方散乱値は同一であった。 平均側方散乱値は、対数スケールを用いたことそして１試料の複数回実施で起こる正常な変動範囲であることを考慮すると、良く一致していた。

【０２７２】 実施例１１ ＤＭＦ中で３時間膨潤させた後ミリキュー水に戻した蛍光赤色シリカ微小球はＤ ＭＦに曝されなかったものに類似の散乱値及び蛍光値を示す １５μｍ蛍光シリカ微小球（ミクロモド、カタログ番号40-15401、１０μｇ／
ｍＬ水、ＮＨ ₂官能基化）の試料をフローサイトメーターに通し、領域１内の１
００００事象の側方散乱及びＦＬ３（赤色蛍光）を記録した（図３５、パネルＡ
）。 微小球合成の間にローダミンＢ色素をシリカ微小球の中に組み込んだ。 ＦＬ
３（赤色蛍光）の平均値は３７６であり、側方散乱の平均値は２５３であった。

【０２７３】 １５μｍ蛍光シリカ微小球（ミクロモド、カタログ番号40-15401、１０μｇ／
ｍＬ水、ＮＨ ₂官能基化）の第二の試料を純ＤＭＦ中で３時間攪拌した後、 Mil
liQ(商標) 水に徐々に戻した。 この試料（１０μｇ／ｍＬ水）をフローサイトメーターに通過させ、領域１内の１００００事象の側方散乱及び前方散乱を記録した（図３５、パネルＢ）。 ＦＬ３（赤色蛍光）平均値は３７９であり、側方散乱の平均値は２１８であった。

【０２７４】 実施例１２ アミノ酸結合を受けたポリスチレン／ＤＶＢ微小球は該結合を受けなかったもの に類似の散乱値及び蛍光値を示す MilliQ(商標) 水中の２０μｍテンタゲル微小球（ラップ・ポリメーレＧｍｂ
Ｈ、テンタゲルＭ−ＮＨ ₂ 、カタログ番号Ｍ30202 、１０ｍｇ）の試料を調製した。 この微小球をＤＣＭ中で１０分間第１回目の音波処理を行い、それを徐々にＤＭＦ中に移した後、徐々に MilliQ(商標) 水中に移した。 この方法は微小球の凝集を防止した。 該試料をフローサイトメーターに通し、領域１内の微小球を集めた（図３６、パネルＡ）。

【０２７５】 ２０μｍテンタゲル微小球（ラップ・ポリメーレＧｍｂＨ、テンタゲルＭ−Ｎ
Ｈ ₂ 、カタログ番号Ｍ30202 、１０ｍｇ）の第二の試料をアミノ酸結合に付し、
次いでフローサイトメーターを通過させた。 この試料を調製するため、該微小球をＤＣＭ中で１０分間音波処理を行い、徐々にＤＭＦに移した。 微小球へのアミノ酸結合は普通のＦｍｏｃ化学（１５０ｍｇのＦｍｏｃ−グリシン−ＯＨ（ノバビオケム）、１ｍＬのＨＢＴＵ及び１２０μＬのＤＩＥＡと共に１０分間）を用いて行った。 この微小球をＤＭＦで洗浄し、徐々にミリキュー水に移した。 同一の装置設定を用いフローサイトメーターを通過させたとき、該微小球は領域１内部に再び現れた（図３６、パネルＢ）。

【０２７６】 ２０μｍテンタゲル微小球（ラップ・ポリメーレＧｍｂＨ、テンタゲルＭ−Ｎ
Ｈ ₂ 、カタログ番号Ｍ30202 、１０ｍｇ）の第三の試料を三つのアミノ酸結合に付し、次いでフローサイトメーターを通過させた。 この試料を調製するため、該微小球をＤＣＭ中で１０分間音波処理を行い、徐々にＤＭＦに移した。 微小球へのアミノ酸結合は普通のＦｍｏｃ化学（１５０ｍｇのＦｍｏｃ−グリシン−ＯＨ
（ノバビオケム）、１ｍＬのＨＢＴＵ及び１２０μＬのＤＩＥＡと共に１０分間）を用いて行った。 この微小球をＤＭＦで洗浄し、ピペリジン／ＤＭＦ（１：１
）の６分間を用いてＦｍｏｃ保護基を該微小球から除去した。 ＤＭＦで洗浄した後、通常のＦｍｏｃ化学（１６０ｍｇのＦｍｏｃ−アラニン−ＯＨ（ノバビオケム）、１ｍＬのＨＢＴＵ及び１２０μＬのＤＩＥＡと共に１０分間）を用いて第２のアミノ酸結合を行い、その後ＤＭＦで洗浄した。 ピペリジン／ＤＭＦ（１：
１）を用いる脱保護を繰り返した後、第３回目の結合を行った（１５０ｍｇのＦ
ｍｏｃ−グリシン−ＯＨ（ノバビオケム）、１ｍＬのＨＢＴＵ及び１２０μＬのＤＩＥＡと共に１０分間）。 ＤＭＦで洗浄した後、該微小球を MilliQ(商標) 水に徐々に移し、フローサイトメーターを通過させた。 同一の装置設定を用いてフローサイトメーターを通過させたとき、該微小球は再び領域１内に現れた（図３
６、パネルＣ）。

【０２７７】 実施例１３ 回収し、アミノ酸と反応させ、フローサイトメーターを再通過させた蛍光赤色シ リカ微小球は結合の前後で側方散乱値及び赤色蛍光値を示す MilliQ(商標) 水中の１５μｍ蛍光シリカ微小球（ミクロモド、カタログ番号
40-15401、１０μｇ／ｍＬ水、ＮＨ ₂官能基化）の試料を調製し、フローサイトメーターを通過させた。 １００万事象に対する領域１（図３７、パネルＡ及びＣ
、microcapsglyrerun とmicrocapsglyrerunfs ）内部の散乱シグナル及び蛍光シグナルを記録し、これらの粒子を５０ｍＬ遠心分離管に回収した。 該微小球をサイズ５のフィルター（孔サイズ４−１０μｍ）を通す濾過により濃縮し、徐々にＤＭＦに移した。 微小球へのアミノ酸の結合は通常のＦｍｏｃ化学（１５０ｍｇ
のＦｍｏｃ−グリシン−ＯＨ（ノバビオケム）、１ｍＬのＨＢＴＵ及び１２０μ
ＬのＤＩＥＡと共に１０分間）を用いて行った。 この微小球をＤＭＦで洗浄し、
徐々に MilliQ(商標) 水に移した。 この微小球は、同じ装置設定を用いるフローサイトメーターを通過させたとき、領域１内部に再び現れた（パネルＢ及びＤ）
。

【０２７８】 実施例１４ 担体に小さな蛍光微小球を永続的に結合させることにより光学多様性を増加させ る方法ポリスチレン／ジビニルベンゼン微小球（１０．２μｍ，デューク・サイエンティフィック・コーポレーション、カタログ番号７５１０Ａ、ＣＶ＝１４．７％
、１０μｇ／ｍＬ MilliQ(商標) 水）を緑色蛍光微小球（０．２μｍ、モレキュラー・プローブズ、ラテックス、２０μＬ）と混合する。 この赤色微小球はより大きな微小球に付着し、そして過剰の小微小球は MilliQ(商標) 水（５×２０ｍ
Ｌ）で洗浄することにより除去される。

【０２７９】 付着を増強するために、該蛍光微小球を、１０．２μｍの担体と混合する前に高分子電解質の多層で被覆する。 微小球の被覆手順にはポリエチレンイミン（陽に荷電した高分子電解質）の１％溶液中に２４時間浸漬する工程、 MilliQ(商標
) 水で洗浄する工程、ポリアクリル酸（負に荷電した高分子電解質）の１％溶液中に２４時間浸漬する工程、及び洗浄する工程が含まれる。

【０２８０】 小さな蛍光粒子が付着した担体をフローサイトメーターに通し、ＦＬ１（緑色蛍光）及び前方散乱を測定する（図３８、パネルＡ）。 もし橙色又は赤色の蛍光微小球を緑色の代わりに使用すると、該担体のＦＬ１値は変化する（図３８、パネルＢ及びＣ）。

【０２８１】 本明細書を通して、その目的は、本発明を特定の実施態様または特定の特徴の集まりに限定することなく、本発明の好ましい実施態様を記述することであった。 従って、当業者は本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施態様における様々な改良及び変更をなし得ることを認めるはずである。 このような改良及び変更は全て付属の請求の範囲のうちに含まれるものと意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、最新のフローサイトメーターの図式的表示である。 この中核（試料）
流は、観察点でレーザービームを遮断する前に流体力学的に集束される。 MilliQ
（商標）水は本研究で被覆流として使用した。 該レーザービーム、中核流及び光学的配列は観察点で互いに直交している。 ビームの絞りは透過光を排除するために該ＦＳ検出器の前に据えられる。

【図２】 図２は、例えば、ペプチドライブラリーの合成に関して先行技術で論じたような、分割−処理−再混合手順における一つの工程の図式的表示である。

【図３】 図３は、図１で述べた分割−処理−再混合手順の全体的反復の図式的表示である。

【図４】 図４は、二次元パラメータ空間をグリッド空間に区分する図式的表示である。

【図５】 図５は、光学的に特有な微小球を選別するための実時間アルゴリズムの一例である。 パネル（ａ）では、五つの微小球がすでに回収されたため対応するグリッド空間の標識は充分に標識されている。 パネル（ｂ）では、新しい微小球が空のグリッド空間を占めパネル（ｃ）で区分けされる。 パネル（ｄ）では、別の新しい微小球が詰まったグリッド空間を占有できるように、パネル（ｅ）でシステムから排除される。

【図６】 図６は、光学的に特有な微小球を選別する緻密な方法の図式的表示である。 内部の区分け領域を占有する微小球のみが回収される。 微小球は緩衝領域からは回収されない。

【図７】 図７は、第一級アミンへのイソチオシアン酸塩の結合についての反応スキームである。

【図８】 図８は、（ａ）ＦＩＴＣ被覆された２．５μm の微小球（S1）及び（ｂ）ＱＦ
ＩＴＣ被覆された２．５μm の微小球（Ｓ２）の蛍光顕微鏡写真を示す。 二つの顕微鏡写真は、Ｕ−ＭＷＢフィルターを用いる六回の遠心分離−再分散サイクル後のものである。 本来は市販の合成品として入手できる二量体及び三量体が存在する。

【図９】 図９は、（ａ）被覆されていない２．５μm の微小球、（ｂ）ＦＩＴＣ被覆された２．５μm の微小球（Ｓ１）、（ｃ）被覆されていない４μm の青−緑色Ｆ
微小球、及び（ｄ）ＱＦＩＴＣ被覆された４μm の青−緑色Ｆ微小球（Ｒ７）の走査型電子顕微鏡写真を示す。

【図１０】 図１０は、Flow-Check（商標）微小球を用いるフローサイトメーターの較正を表すグラフである。 それぞれ希釈された試料（総量１ｍＬ）はＭＥＤ流速（３
５±５μＬ／分）で2.00分間走行した。 微小球の算出濃度は1.03ｘ10 ⁶微小球／
ｍＬである。

【図１１】 図１１は、１０μｍの緑色Ｆ、１０μｍの赤色Ｆ及び１２μｍの赤−緑色Ｆの微小球の混合物における三つの異なる集団を示すグラフである。

【図１２】 図１２は、１０μｍの緑色Ｆ集団のみを回収するための多角形のゲートを示すグラフである。 ５０ｍＬの被覆流（MilliQ（商標）水）中に回収された１０００
００個の微小球。

【図１３】 図１３は、１２μｍの赤−緑色Ｆ集団のみを回収するための多角形のゲートを示すグラフである。 ５０ｍＬの被覆流（MilliQ（商標）水）中に回収された１０
００００個の微小球。

【図１４】 図１４は、元の三つの異なる微小球の混合物の蛍光顕微鏡写真である。 緑色、
赤色及びオレンジ色（赤−緑色）の微小球が識別可能でありよく分散している。

【図１５】 図１５は、蛍光被覆された試料のＳ１（ＦＩＴＣ）、Ｓ２（ＱＦＩＴＣ）及び無蛍光の被覆されていない 2.5μｍの微小球の混合物のグラフ表示である。 緑色蛍光に対する赤色蛍光の比率は、所与の蛍光団に対して低濃度で固定されるため、試料内で相関する。

【図１６】 図１６は、無蛍光（黒色）及びＳ１（緑色）についてのＦＬ１値（ａ）のヒストグラムを示す。 ２５番目から７５番目の百分位数は無蛍光及びＳ１についてそれぞれ２１〜３０個及び４３８〜８７７個のチャンネル数である。 （ｂ）無蛍光（黒色）及びＳ２（赤色）についてのＦＬ３値。 ２５番目から７５番目の百分位数は無蛍光及びＳ２についてそれぞれ７〜４７個及び７３〜１６２個のチャンネル数である。

【図１７】 図１７は、被覆されていない４μｍの青−緑色Ｆ微小球及び三つの異なる濃度のＱＦＩＴＣ被覆微小球（Ｒ１、Ｒ８、Ｒ９）についてのＦＬ１及びＦＬ３の二変量プロットである。 ４マイクロメーターの青−赤色Ｆ微小球が含まれており緑色蛍光を含まないＱＦＩＴＣ被覆微小球を表す。 この微小球の混合物は光学的多様性に近くなる。

【図１８】 図１８は、添加されたＱＦＩＴＣ−ＡＰＳの量が増すにつれ赤色蛍光強度が増大するグラフである。 グラフの直線性は、ＦＲＥＴがこれらの濃度では生じないことを示している。

【図１９（ａ）】 図１９（ａ）は、明確な区分けゲートの二変量プロット、及び次のFlow-Check
（商標）微小球を用いる二つの精密実験（表Ｅ及び図２３も参照）についての再分析を示す。 密集した集団は、区分けされた微小球を５０ｍＬから０．５ｍＬに濃縮するために必要な１０００ｒｐｍ未満の遠心分離により生じた。 最初の２０
００００個の区分けされた微小球から回収された集団の大きさは１０〜２０％である。

【図１９（ｂ）】 図１９（ｂ）は、明確な区分けゲートの二変量プロット、及び次のFlow-Check
（商標）微小球を用いる二つの精密実験（表Ｅ及び図２３も参照）についての再分析を示す。 密集した集団は、区分けされた微小球を５０ｍＬから０．５ｍＬに濃縮するために必要な１０００ｒｐｍ未満の遠心分離により生じた。 最初の２０
００００個の区分けされた微小球から回収された集団の大きさは１０〜２０％である。

【図２０】 図２０は、ＦＬ３についてのｒｌを決定するために用いられる頻度ヒストグラムの一例である。 フローシステムにおける乱流がｒｌ値に与える影響に留意したい。 まず記録された最初の５０００の事象を廃棄することにより、乱流データを除去した。 残りの単微小球の９９．９％以上は、最初の区分け（即ち４２３個）
における最小のチャンネル数から４７未満のチャンネル数の偏差しか示さず、従ってｒｌ＝４７であるのに対して、乱流データが除去される前はｒｌ＞７５であった。

【図２１】 図２１は、捕捉後アルゴリズムについての処理時間及び集団のサイズの関係を示すグラフである。

【図２２】 図２２は、特有な微小球の最大数についての理論的限界を示すグラフである（
Ｅｐ＝５０）。

【図２３】 図２３は、実時間アルゴリズムについての処理時間と反復数の関係を示すグラフである。

【図２４】 図２４は、所与のパラメータの数に対する実時間アルゴリズムの一反復の時間を示すグラフである。

【図２５】 図２５は、無作為データについての集団サイズの関数として得られる特有な微小球の数を示すグラフである。 利用できるグリッド空間の総数は１００００である。

【図２６】 図２６は、前符号化前の二つのパラメータ（ＦＬ１及びＦＬ３）についてのＱ
ＦＩＴＣ被覆された４μｍの青−緑色Ｆ微小球の光学的に多様な集団のグラフのプロットである。

【図２７】 図２７は、図２９の集団から抽出された５６個の光学的に特有な微小球のグリッド空間の図式的表示である（ｒｌ＝ｒｈ＝３０）。

【図２８】 図２８は、上述の条件を用いてＵに対するｗ _iの最適値が１１０であることを示すグラフである。

【図２９】 図２９は、方程式５．４による所与の時間後に抽出されうる光学的に特有な微小球の数の予測を示すグラフである。

【図３０】 図３０は、蛍光シリカ粒子の分散／蛍光シグナルの平均値の再現性を示す。 七つの二変量プロットは、微小球の同一試料の等部分の、七回のフローサイトメーター通過に対応して示される。

【図３１】 図３１は、回収され且つフローサイトメーターを再通過させた無蛍光の１０．
２μｍの微小球が再現性ある分散値を示すことを示す。 二つの二変量プロットは、明確な区分けゲート及び引き続いて行われたゲート制御された無蛍光微小球の再分析を示す。

【図３２】 図３２は、回収され且つフローサイトメーターを再通過させた無蛍光の１０．
２μｍ及び２１μｍの微小球の混合物が再現性ある分散値を示すことを示す。 四つの二変量プロットは、明確な区分けゲート及び引き続いて行われたゲート制御された無蛍光微小球の混合物の再分析を示す。

【図３３】 図３３は、回収され且つフローサイトメーターを再通過させた蛍光緑色ポリスチレン微小球が再現性ある分散値及び蛍光値を示すことを示す。 四つの二変量プロットは、明確な区分けゲート及び引き続いて行われたゲート制御された蛍光緑色微小球の再分析を示す。

【図３４】 図３４は、３時間ＤＭＦ中で膨張させミリキュウ水に戻した無蛍光ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）微小球がＤＭＦに曝さなかったものと同様な分散値を示すことを示す。 ゲート制御された蛍光ポリスチレン微小球の二つの二変量プロット、即ち、対照を表す集団（パネルＡ）及びＤＭＦ処理に曝した微小球を表す集団（パネルＢ）が例示される。

【図３５】 図３５は、３時間ＤＭＦ中で膨張させミリキュウ水に戻した蛍光赤色シリカ微小球を示し、ＤＭＦに曝さなかったものと同様な分散値及び蛍光値を示す。 ゲート制御された蛍光シリカ微小球の二つの二変プロット、即ち、対照を表す集団（
パネルＡ）及びＤＭＦ処理に曝した微小球を表す集団（パネルＢ）が示される。

【図３６】 図３６は、ゲート制御された蛍光テンタゲル微小球の二つの二変量プロット、
即ち、対照を表す集団（パネルＡ）及び微小球に結合させた一つのアミノ酸を有する微小球を表す集団（パネルＢ）を示す。

【図３７】 図３７は、ゲート制御された蛍光シリカ微小球の四つの二変量プロットを示し、一つの集団（パネルＡ、赤色蛍光及び側方散乱；パネルＣ、赤色蛍光及び前方散乱）を回収し、グリシンを微小球に結合させ、続いてフローサイトメーターを通過させる（パネルＢ、赤色蛍光及び側方散乱；パネルＤ、赤色蛍光及び前方散乱）。

【図３７続】 図３７続は、ゲート制御された蛍光シリカ微小球の四つの二変量プロットを示し、一つの集団（パネルＡ、赤色蛍光及び側方散乱；パネルＣ、赤色蛍光及び前方散乱）を回収し、グリシンを微小球に結合させ、続いてフローサイトメーターを通過させる（パネルＢ、赤色蛍光及び側方散乱；パネルＤ、赤色蛍光及び前方散乱）。

【図３８】 図３８は、ゲート制御された蛍光緑色（パネルＡ）、蛍光オレンジ色（パネルＢ）及び蛍光赤色（パネルＣ）の１０．２μｍの高分子電解質被覆微小球の三つの二変量プロットを示す。

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