【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ固定化基体の再使用法に関する。 【０００２】 【従来の技術】従来より、遺伝子解析等の手段のひとつとしてＤＮＡ診断用基体が用いられている。 ＤＮＡ固定化基体とは、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させたものであって、生化学的、分子生物学的、遺伝子工学的研究あるいは医療検査で一度に多数の微量試料を処理し、その処理反応の結果を分光学的に迅速・簡便にできるものとして、近年注目されている。 【０００３】ＤＮＡ固定化基体については、非常に高価であるにもかかわらず、不要になった後に他のＤＮＡを固定して再使用に供する方法についての開発があまり進んでいなかった。 そのため、使い捨てとなる場合もあり、また、再利用しても前に固定したＤＮＡが残存していたりして実用に適さない場合があった。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点を解決し、高価なＤＮＡ固定化基体を有効活用し、かつ新品と同様の性能を有し実用にも支障のないＤＮＡ固定化基体の再使用法を提供し、ＤＮＡ固定化基体ユーザーの経済的、技術的負担を低下させようとするものである。 【０００５】 【課題を解決するための手段】上記目的を達成すべく検討した結果、何度もＰＣＲ増幅に利用したＤＮＡ固定化基体からのＤＮＡの完全除去の方法を見出すと共に、Ｄ
ＮＡの再固定化が可能となることも見出した。 【０００６】すなわち、請求項１記載の本発明は、ＤＮ
Ａがオリゴヌクレオチドを介して酸アミド結合により固定化されているＤＮＡ固定化基体から、固定されているＤＮＡを除去して新たなＤＮＡを固定可能な状態とするにあたり、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合を酸又はアルカリで加水分解することを特徴とする、ＤＮＡ固定化基体の再使用法を提供するものである。 請求項２記載の本発明は、ＤＮＡが酸アミド結合により固定化されているＤＮＡ固定化基体を、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合を酸で加水分解後、アルカリに浸漬して陰イオンを除去して、基体表面をアミノ基修飾表面にすることを特徴とするＤＮＡ固定化基体の再使用法を提供するものである。
請求項３記載の本発明は、ＤＮＡが酸アミド結合により固定化されているＤＮＡ固定化基体を、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合をアルカリで加水分解して、基体表面をアミノ基修飾表面にすることを特徴とするＤＮＡ固定化基体の再使用法を提供するものである。 この場合において、請求項４記載の本発明のように、加水分解に用いる酸は、鉱酸及び有機酸の１種または２種以上の酸であることが望ましい。 また、この場合において、請求項５記載の本発明のように、加水分解に用いるアルカリが、アルカリ金属の水酸化物及び／又はアルカリ金属の塩類であることが望ましい。 【０００７】 【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ固定化基体の再使用法は、ＤＮＡがオリゴヌクレオチドを介して酸アミド結合により固定化されているＤＮＡ固定化基体から、固定されているＤＮＡを除去して新たなＤＮＡを固定可能な状態とするにあたり、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合を、酸又はアルカリで加水分解することを特徴とするものである。 【０００８】本発明の再使用法の対象となるＤＮＡ固定化基体は、アミノ基修飾された基体表面に、酸アミド結合を介してＤＮＡが固定化されているものである。 【０００９】アミノ基を化学修飾した基体とは、ダイヤモンド、シリコン、ガラスのほか、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；上記金属とセラミックスとの積層体；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等の基体の表面をアミノ化したものが好ましい。 基体の材料は、上記列挙したもの以外でも化学的に安定な材料であれば使用でき、例えば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。
また、プラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体でもよい。 また、シリコン、ガラス、金属、グラファイト、プラスチック等の表面にダイヤモンドやダイヤモンドライクカーボンがコーティングされたものも好ましい。 【００１０】これらのうち、熱伝導性の点からダイヤモンドが好ましい。 ダイヤモンドは熱伝導性に優れており、急速な昇温及び冷却が可能であるため、ＤＮＡを結合させる際の加熱冷却を繰り返すヒートサイクル時間を効果的に短縮できる。 具体的には、基体材料の熱伝導率が０．１Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上、好ましくは０．５Ｗ/ｃｍ・
Ｋ以上、特に好ましくは１．０Ｗ/ｃｍ・Ｋ以上のものを用いることが好ましい。 【００１１】ダイヤモンドを基体とした素材として、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。 また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。 生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好ましい。 【００１２】基体の形成方法は公知の方法で行うことができる。 例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲ
ＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。 また、金属粉末やセラミック粉末等に樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものが挙げられる。 また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。 【００１３】基体表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。 このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量のＤＮＡ等を固定させることに好都合であるからである。 基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。 また、その大きさも特に問わない。 本発明では、ダイヤモンド基体という場合は、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、ダイヤモンドとダイヤモンドライクカーボンの２相体）を含むものであってもよい。 【００１４】このような基体の表面のアミノ基修飾は、
例えば、塩素ガス中で固体支持体に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化することにより、達成される。 【００１５】アミノ基で修飾された基体の表面のカルボン酸修飾は、適当な酸クロリドを用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより行うことができる。 この方法を採用する場合の脱水縮合について一例を挙げて説明すると、表面を化学修飾し、カルボキシル基を有する状態の固体支持体をカルボジイミドあるいはジシクロヘキシルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド或いはｐ−ニトロフェノールを溶解した１，４−ジオキサン溶液中に浸漬させ、洗浄後乾燥する。 このようにして、Ｎ−スクシンイミドエステル基やｐ−ニトロフェノールエステル基を末端に有する炭化水素基が結合した基体が得られる。 【００１６】また、上記の方法のより好ましい方法として、あらかじめダイヤモンド基体上に形成された第１級アミノ基に、活性化ジエステルの一方のエステル基を脱水縮合させて形成させておく方法があげられる。 【００１７】活性化ジエステルとは、上記した活性エステル基を２つ有しているものをいう。 エステル基は活性化ジエステル中の両端に位置していることが好ましく、
炭素数０〜１２、好ましくは０〜６のものが好ましい。
エステル基を除いた骨格部分は直鎖状飽和脂肪酸が好ましい。 【００１８】活性化ジエステルを用いた方法として、同様に塩素化し、次いでアミノ化後、このアミノ基に対し、予めコハク酸（ジカルボン酸）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル化して得られる活性化エステルを反応させ、所望の基体を得る方法が挙げられる。 【００１９】このようにカルボン酸修飾された基体表面にオリゴヌクレオチドを介してＤＮＡを固定化したものが本発明の再使用法の対象である。 固定化するＤＮＡについては特に制限はなく、一本鎖のｃＤＮＡ（compleme
ntary DNA：相補的ＤＮＡ）、二本鎖のｇＤＮＡ（genom
ic DNA：染色体ＤＮＡ）のいずれであってもよく、また鎖長についても特に制限はない。 オリゴヌクレオチドについては、結合したいＤＮＡの種類により適宜選択する。 一本鎖のｃＤＮＡを固定化する場合には、ｍＲＮＡ
を鋳型とする逆転写反応を利用すべく、オリゴヌクレオチドとして逆転写反応のプライマーとなるオリゴｄＴ等を用いることができる。 一方、二本鎖のｇＤＮＡの固定化は、制限酵素切断部位を利用して行うことができるが、この場合には、オリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ結合側に制限酵素切断部位を有するものを用いることになる。 【００２０】本発明においては、不要になったＤＮＡ固定化基体を、酸又はアルカリ溶液に浸漬し、基体−ＤＮ
Ａ間の酸アミド結合を加水分解によりはずしてアミノ基修飾表面にする。 加水分解に用いる酸は、塩酸等の鉱酸であることが好ましいが、酸アミド結合を加水分解できるものであれば鉱酸のほか有機酸でもよい。 また、アルカリを加水分解に用いる場合は、アルカリ金属の水酸化物を用いるのが望ましいが、アルカリ金属の炭酸塩等アルカリ性を示す塩類を用いてもよい。 【００２１】加水分解の条件は、酸加水分解の場合には、６Ｍ塩酸中にＤＮＡが固定化されている基体を入れ、８０〜１００℃で数時間〜２４時間反応させて、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合を完全に加水分解する。 アルカリ加水分解の場合には、２Ｍ ＮａＯＨ中にＤＮＡ
が固定化されている基体を入れ、室温で数時間〜２４時間反応させて、基体−ＤＮＡ間の酸アミド結合を加水分解する。 【００２２】酸を用いて加水分解を行った場合には、基体表面が陰イオンの状態になっている。 このため、アルカリに浸漬して陰イオンを除去し、水洗を行うことが望ましい。 一方、アルカリを用いて加水分解を行った場合には、水洗のみでよい。 【００２３】これにより、ＤＮＡ固定化基体の基体−Ｄ
ＮＡ間の酸アミド結合が加水分解し、アミノ基修飾表面が露出した状態となる。 このような状態となったら、上記と同様にしてカルボン酸修飾、オリゴヌクレオチド固定、ＤＮＡ固定を行い基体の再使用が可能である。 【００２４】 【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例１ 基体としてダイヤモンド基体を使用した。 以下、ダイヤモンド基体を単に基体と呼ぶ。 【００２５】６Ｎ塩酸中にＤＮＡを固定した基体を入れ、９５℃、５時間反応させ加水分解を行った後、基体を水洗した（３回程度）。 この状態では基体は塩酸塩になっているため、０．１Ｎカリウム溶液に浸漬し、塩素イオンを除去する。 基体を水洗し（３〜５回程度）、アミノ基修飾表面とした。 【００２６】クロロホルム１ｍＬの中に、０．１ｍｍｏ
ｌのコハク酸クロライドを加え、その中に上記の再利用可能になったアミノ基修飾基体を挿入し、室温で３０分反応させた。 ついで基体をクロロホルムで洗浄・乾燥し、純水中に１時間浸漬し、最後に純水で洗浄し（３〜
５回程度）、コハク酸修飾表面とした。 【００２７】０．１ｍｍｏｌの水溶性カルボジイミドと０．１ｍｍｏｌのヒドロキシスクシンイミドを９０％
１，４−ジオキサン１ｍＬに溶解させ、コハク酸修飾した基体を浸漬し、振り混ぜながら高温で１５分反応させた。 基体を取り出し１，４−ジオキサン（２〜４回程度）および純水（３〜５回程度）で洗浄した。 【００２８】制限酵素（ＥｃｏＲＩ）部位を含み、かつ５'末端に（ｄＡ） ３を含むオリゴヌクレオチドを溶解した水溶液（濃度：５００ｆｍｏｌ／μＬ 基体１枚につき５０μＬ）に基体を浸漬し、室温で１時間反応させた。 【００２９】固定化したオリゴヌクレオチドと相補的配列を持ったオリゴヌクレオチド水溶液（濃度：５００ｆ
ｍｏｌ／μＬ 基体１枚につき５０μＬ）に４℃、３０
分浸漬し、ハイブリダイズさせた。 【００３０】ＥｃｏＲＩ反応液中に基体を浸漬し、３７
℃、１時間反応させ、反応液を４℃に冷却後、基体を取り出し、４℃に冷却した滅菌水で洗浄し（３〜５回程度）、次に４℃に冷却した６０％ エタノール水溶液で洗浄した後に、軽く（エタノールが蒸発するまで）乾燥させる。 【００３１】λＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理して得られる２１ｋｂｐフラグメントを加えたリガーゼ溶液に、基体を浸漬し、４℃で一晩反応させ、ＤＮＡを固定化させた。 【００３２】加水分解およびＤＮＡの再固定化の確認を行うために、２１ｋｂｐ λＤＮＡフラグメント内の５
００ｂｐフラグメントを増幅するプライマーを用いてＰ
ＣＲを行い、ＤＮＡ増幅の有無により確認を行った。 図１にその結果を示す。 図１は、固定化および再固定化の確認の結果を示す泳動写真である。 図１において、泳動写真の下部に記載した符号のＭは１００ｂｐラダーマーカーを示し、レーン０は加水分解前の基体を、レーン１，２は加水分解後の基体を、レーン３，４は再固定化後の基体の結果をそれぞれ示す。 【００３３】図１に示すように、加水分解後の基体は、
加水分解によりＤＮＡが基体から離れ、再固定化によりＤＮＡが固定化していることを確認した。 【００３４】 【発明の効果】本発明の再使用法によれば、不要になったＤＮＡ固定化基体について、ＤＮＡを完全に除去して新たなＤＮＡを結合させることができる。 また、本発明の再使用法は、特別な試薬や装置を必要としないので、
簡便かつ安価に行うことができる。 さらに、高価なＤＮ
Ａ固定化基体を再利用できるので、遺伝子診断等ＤＮＡ
固定化基体を利用する診断や研究を経済的に進めることもできる。 したがって、本発明の再使用法は、医療分野や、分子生物学、生化学、遺伝子工学の各分野において有用である。 【図面の簡単な説明】 【図１】固定化および再固定化の確認の結果を示す泳動写真である。 【符号の説明】 Ｍは１００ｂｐラダーマーカーを示し、レーン０は加水分解前の基体を、レーン１，２は加水分解後の基体を、
レーン３，４は再固定化後の基体の結果をそれぞれ示す。 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 丹花 通文 山口県下松市東豊井1296番地の１ 東洋鋼 鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者 岡村 浩 山口県下松市東豊井1296番地の１ 東洋鋼 鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者 高橋 浩二郎 広島県広島市南区宇品御幸１丁目９番26号 (72)発明者 高井 修 広島県広島市南区宇品東２丁目２番29号 株式会社日本パーカーライジング広島工場 テクノセンター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 HA11 |
