택 라이브러리 화합물, 조성물, 키트 및 사용 방법

택 라이브러리 화합물, 조성물, 키트 및 사용 방법{TAG LIBRARY COMPOUNDS, COMPOSITIONS, KITS AND METHODS OF USE}

사람 게놈이 해명됨에 따라, 특이적 서열의 존재를 측정하기 위한 분석을 수행하고, 동형접합체 및 이형접합체에서 대립형질을 구분하고, 돌연변이의 존재를 측정하고, 세포 발현 패턴을 평가하는 등의 수많은 기회가 있을 것이다. 이들 경우 중 대부분은 동일한 샘플의 많은 상이한 특징을 단일 반응에서 측정하기를 원할 것이다. 또한, 1가지 이상의 병원균, 그것들의 항생물질 내성 유전자, 유전적 아형 등의 존재를 측정하는데도 관심이 있을 것이다.

많은 분석에서는 특이적 서열의 존재와 이것이 게놈, 합성 또는 cDNA인지의 여부를 측정하는데 관심이 있을 것이다. 이들 서열은 유전자, 조절 서열, 반복체, 다중체 영역, 발현 패턴 등과 각별히 연관될 수 있다.

상이한 개체의 서열의 비교가 계속되어 왔으며 앞으로도 그럴 것이다. 1000개 염기 당 약 1개의 다형성이 있을 것이라고 여겨지며, 그래서 광대한 수의 개체간 차이가 있을 것이라고 예상할 수 있다. 단일 뉴클레오티드 다형성(snp)에 의해 집단에서 실질적으로 더 적은 퍼센트로 존재하는 1개 이상의 잔존 염기를 갖는 부위에 우세한 뉴클레오티드가 있게 될 것이다.

대개 snp는 주로 유전자들 사이의 비-코딩 영역에 있을 것이나 엑손 및 인트론에도 존재할 것이다. 게다가, snp 중 많은 비율은 개체의 표현형에는 영향을 미치지 않을 것이나 유전자형에는 분명히 영향을 미칠 것이다. snp는 흥미로운 많은 특성을 가진다. snp는 유전될 것이므로 개체의 snp 및/또는 snp 패턴은 유전자에 있는 1개 이상의 염기를 수반하는 결실, 삽입 및 돌연변이와 같은 유전적 결함에 관련될 수 있다. 표적 유전자를 분리하여 서열화하는 것보다 오히려 수반된 snp를 확인하는 것이 충분할 것이다.

게다가, snp는 개체를 확인하기 위해 법의학에 사용될 수 있다. 다른 유전적 마커도 이용할 수 있지만, 염색체에 있는 많은 수의 snp와 그것들의 광범한 분포가 snp를 매력적인 표적으로 만든다. 또한, 특이적 표현형에 연관된 복수의 snp를 측정함에 의해, 표현형에 관련된 유전자의 측정을 요하기보다는 오히려 표현형의 표식으로서 snp 패턴을 사용할 수 있다.

혈액 또는 다른 생물학적 유체에서 많은 분석물질 또는 핵산 서열(예를 들어, 다수 병원균 또는 다수 유전자 또는 다수 유전적 변이체)을 측정해야 할 필요가 많은 의약 부문에서 점점 분명해지고 있다. 독물학적으로 관련 있는 결과를 측정하기 위해 다수 유전자의 상이한 발현을 연구해야 할 필요와 높은 민감도로 바이러스성 오염물질에 대해 수혈된 혈액을 스크린해야 할 필요도 분명하다.

따라서, 대부분의 다중-분석물질 분석 또는 다수 핵산 서열을 검출하는 분석은 다수의 단계를 포함하며, 빈약한 민감성 및 빈약한 동적 범위(분석물질 농도의2 내지 100배 차이가 측정된다)를 가지고, 일부는 정교한 기계를 필요로 한다.

다중-분석물질 분석의 공지된 전형적인 방법 중 일부는 다음을 포함한다:

a. 2가지의 상이한 방사성 동위원소 표지를 사용한 2가지의 상이한 분석물질의 구분.

b. 2가지 이상의 상이한 형광 표지를 사용한 2가지 이상의 분석물질의 구분.

c. 란탄족 킬레이트의 사용. 이 경우 라이프타임 및 파장이 2가지 이상의 분석물질을 구분하는데 모두 사용된다.

d. 형광 및 화학발광 표지를 사용한 2가지 이상의 분석물질의 구분.

e. 2가지의 상이한 효소를 사용한 2가지 이상의 분석물질의 구분.

f. 효소 및 아크리디늄 에스테르를 사용한 2가지 이상의 분석물질의 구분.

g. 다수 분석물질을 확인하고 정량하기 위한 예를 들어 어레이 위의 상이한 분석물질의 공간적 해상도.

h. 아크리디늄 에스테르 표지의 사용. 이 경우 라이프타임 또는 디옥세탄 형성이 2가지 상이한 바이러스성 표적을 정량하는데 사용된다.

따라서, 더 높은 민감도, 큰 동적 범위(표적 레벨의 10 ³ 내지 10 ⁴ 배 차이), 더 큰 다중도, 및 더 적고 더 많은 안정한 시약을 가지는 분석이 다중-분석물질 분석의 평이성 및 신뢰성을 증가시킬 것이다.

DNA의 센티모르간에 잠재적으로 분포된 많은 수의 염기나 서열을 확인하고 정량해야 할 필요는 주요한 도전을 제공한다. 모든 방법은 정확하고, 필요한 시약의 양을 제한하는데 있어 경제적으로 타탕하며, 상이한 snp의 구별 또는 다수 유전자의 구별 및 정량을 허용하는 단일 분석을 제공해야 한다.

마지막으로, 핵산 서열이 생물학적 상황 또는 다른 관심의 상황에 대해 극도의 다양성을 제공하지만, 프로테오믹스(proteomics)에 있는 단백질 같은 다른 종류의 화합물도 다중 측정의 기회를 제공할 수 있다.

관련 분야에 대한 간단한 설명

Holland(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:7276)는 증폭과 동시적으로 특이적 검출가능한 신호를 생성하기 위한 PCR 증폭에서의 열안정성 효소인 써무스 아쿠아티쿠스 DNA 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성을 개시한다.

TaqMan 분석은 Lee에 의해 Nucleic Acid Research (1993) 21:16 3761에서 논의된다.

White(Trends Biotechnology (1996) 14(12):478-483)는 TaqMan

Marino, Electrophoresis (1996) 17:1499는 저긴축도-서열 특이적 PCR(LSSP-PCR)을 설명한다. PCR 증폭된 서열은 낮은 긴축도 조건하에서 단일 프라이머 증폭되어 상이한 길이 범위의 앰플리콘을 생성한다. 상이한 패턴들은 서열에 차이가 있을 때 얻어진다. 이 패턴들은 개체마다 독특하며 동일성 시험에 대한 가능한 판단기준이다.

단일가닥 입체구조 다형성(SSCP)도 유사한 결과를 제공한다. 이 방법에서는 PCE 증폭된 DNA가 변성되며, 단일가닥의 서열 의존성 입체구조가 겔 전기영동 동안의 이동 속도의 차이에 의해 검출된다. 상기 LSSP-PCR 처럼 상이한 패턴들이 서열에서의 신호 차이로 얻어진다. 그러나, LSSP-PCR 또는 SSCP는 특이적 서열 정보를 제공하지 않으며, 둘 다 서열에 있는 변화된 어떤 염기가 결실 가능성이 있는 입체구조적 변화를 일으킬 것이라는 미심쩍은 가정에 의존한다. Pastinen, Clin Chem. (1996) 42:1391은 표적 DNA를 증폭시키고 이 앰플리콘을 고정시킨다. 다음에, 다수 프라이머를 3' 및 관심의 snp("단일 뉴클레오티드 다형성") 부위와 접촉하는 부위에 혼성화시킨다. 각 프라이머는 코드로서 작용하도록 상이한 크기를 가진다. 혼성화된 프라이머는 형광 표지된 디디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하여 1개 염기까지 확장된다. 겔 전기영동에 의해 측정된 생성된 각 형광 생성물의 크기가 서열을 나타내며 따라서 snp의 위치를 나타낸다. snp 부위에서의 염기 동일성은 사용된 트리포스페이트에 의해 규정된다. 유사한 접근법이 Haff, Nucleic Acid Res. (1997) 25:3749에 의해 행해지는데, 단 여기서는 질량분광법에 의해 크기를 나누어 표지의 필요성을 피한다. 그러나, 두 방법 모두 다수 부위의 스크리닝이 까다로운 2차 구조를 가지고 합성하는데 고비용이 들 수 있는 매우 순수한 큰 프라이머를 필요로 한다는 심각한 한계를 가진다.

Hacia, Nat. Genet. (1996) 14:441은 올리고뉴클레오티드의 고밀도 어레이를 사용한다. 표지된 DNA 샘플이 96,600개의 20-염기 올리고뉴클레오티드와 결합되어 상이한 개체로부터 생성된 결합 패턴이 비교되었다. 이 방법은 snp가 직접적으로 확인될 수 있다는 점에서 매력적이지만, 어레이가 고가이고 비특이적 혼성화가 유전 정보의 정확성을 혼동할 수 있다.

Fan(1997, 10월 6-8, IBC, 매릴랜드 애나폴리스)은 사람 서열-택 부위에 대한 대규모 스크리닝의 결과를 보고했다. 단일 뉴클레오티드 다형성 스크리닝의 정확성은 종래의 ABI 재서열화에 의해 측정되었다.

질량분광법과 함께 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화가 Ross에 의해 Anal. Chem. (1997) 69:4197에 논의된다.

Holland 등의 PANS USA (1991) 88, 7276-7280은 PCR 생성물의 검출을 위한 DNA 폴리머라제 5'-3' 엔도뉴클레아제 활성의 사용을 설명한다.

미국 특허 번호 5,807,682는 복수의 핵산 표적을 검출하기 위한 프로브 조성물을 설명한다.

본 발명의 분야는 다중 분석 검출에 사용되는 분리가능한 조성물이다.

발명의 개요

택의 개별적 물성에 기초하여 유리된 확인용 택들의 편리한 분리를 가능하게 하는 다중 측정을 위한 화합물 및 방법이 제공된다. 본 방법은 단일 용기에서 수행될 수 있으며, 동시에 또는 연속하여 첨가되는 복수의 시약을 포함할 수 있다. 일군의 구체예에서, 질량이 분리를 허용하는 특징에 포함될 것이다. 동전기학적 분석을 위한 일군의 확인용 택은 (1) 절단가능한 연결 영역; (2) 질량-변경 영역; (3) 전하-변경 영역; 및 (4) 검출가능한 영역으로서 작용하는 영역을 가지는 것을 특징으로 하며, 상이한 영역의 수는 분리 및 확인 방법에 일부 의존한다. 이들 구분된 영역을 가지는 화합물은 이 영역들이 동일한 부분에 통합된 다른 화합물과 함께 사용할 수 있다. 특히 관심의 것은 빌딩블록을 사용하여 이 화합물을 형성하는것인데, 이 경우 합성은 복수의 단계에서 동일한 연결 화학을 사용하여 반복 방식으로 수행된다. 당해 화합물은 확인을 위해 결합 화합물에 연결되어 확인용 시약을 제공하며, 이 경우 분석 시스템에서 확인용 시약 표적의 결합이 확인용 택(이후 "eTag ^TM 리포터"로 간주)의 유리를 가져오고, 여기에서 eTag 리포터들이 구별될 수 있다. 다수의 eTag 리포터가 결합 화합물에 결합되는 연결 작용기를 포함하는 키트에 제공될 수 있거나, 또는 빌딩블록의 키트가 결합 화합물의 합성과 함께 인시투로 eTag 리포터를 합성하기 위해 제공될 수 있다. 특히 관심의 것은 핵산 및 단백질의 확인에서 당해 eTag 리포터의 사용이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 효소 분석 동안 CE ² LabCard ^TM 장치에 이용된 전형적인 고전압 배치를 예시하는 개략도이다.

도 2는 CE ² LabCard를 사용한 eTag 리포터 분석을 설명하는 2개의 일렉트로페로그램이다. 이 도면은 감광제 비드를 사용한 때와 사용하지 않은 때의 정제된 표지된 아미노덱스트란의 분리를 나타낸다. 감광제 비드의 첨가는 680nm에서 조사시 감광제에 의해 생성된 싱글렛 산소를 사용하여 아미노덱스트란으로부터 eTag 리포터의 유리를 가져온다. 실험 조건은 분리 완충액 20.0mM HEPES pH=7.4 및 0.5% PEO, 도 1에 나타낸 전압 배치이고, 분석 혼합물은 감광제 비드 코팅된 29㎍/ml 스트렙토아비딘을 가졌으며, 680±10nm 필터 및 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사했다.

도 3은 CE ² LabCard를 사용한 eTag 리포터 분석을 설명하는 다수의 일렉트로페로그램이다. 이 도면은 상이한 시간 동안 조사된 정제된 표지된 아미노덱스트란의 분리를 나타낸다. 실험 조건은 분리 완충액 20.0mM HEPES pH=7.4 및 0.5% PEO, 도 1에 나타낸 전압 배치이고, 분석 혼합물은 감광제 비드 코팅된 27㎍/ml 스트렙토아비딘을 가졌으며, 680±10nm 필터 및 150W 램프를 사용하여 680nm에서 조사했다.

도 4는 CE ² LabCard를 사용한 eTag 리포터 분석을 설명하는 다수의 일렉트로페로그램이다. 이 도면은 상이한 농도의 감광제 비드를 사용한 때의 정제된 표지된 아미노덱스트란의 분리를 나타낸다. 고동도의 감광제 비드는 표지된 아미노덱스트란으로부터 eTag 리포터의 더 많은 유리를 가져온다. 실험 조건은 분리 완충액 20.0mM HEPES pH=7.4 및 0.5% PEO, 도 1에 나타낸 전압 배치이고, 분석 혼합물을 680±10nm 필터 및 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사했다.

도 5는 감광제 비드 농도의 함수로서 eTag 리포터의 유리에 대한 선형 검정 곡선을 묘사한다. 결과들은 CE ² LabCard를 사용하여 얻었다. 실험 조건은 분리 완충액 20.0mM HEPES pH=7.4 및 0.5% PEO, 도 1에 나타낸 전압 배치이고, 분석 혼합물을 680±10nm 필터 및 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사했다.

도 6은 eTag 리포터 유리에 대한 표지된 아미노덱스트란의 농도의 효과를 나타내는 데이타 곡선이다. 이 도면은 감광제 비드의 주어진 농도에 대해 저농도의 표지된 아미노덱스트란이 더 효과적인 eTag 리포터 유리(또는, 이 양의 표지된 아미노덱스트란에서 유리된 더 높은 비율의 eTag 리포터)를 가져온다는 것을 증명한다. 결과들은 CE ² LabCard를 사용하여 얻었다. 실험 조건은 분리 완충액 20.0mM HEPES pH=7.4 및 0.5% PEO, 도 1에 나타낸 전압 배치이고, 분석 혼합물은 감광제 비드 29㎍/ml를 가졌으며, 680±10nm 필터 및 150W 램프를 사용하여 680nm에서 1분간 조사했다.

도 7은 개별 eTag 리포터의 분리를 나타내는 다수의 일렉트로페로그램이다. 이 도면은 리포터의 ACLA 수에 의해 확인된 리포터의 획득가능한 해상도를 예시한다.

도 8은 아비딘의 첨가 없이 프로브 및 프라이머의 존재하에 증폭 반응 후 발생된 310 분석기 상의 분리를 나타내는 다수의 일렉트로페로그램이다.

도 9는 아비딘이 첨가된 프로브 및 프라이머의 존재하에 증폭 반응 후 발생된 310 분석기 상의 분리를 나타내는 다수의 일렉트로페로그램이다.

특정 구체예에 대한 설명

본 방법 및 화합물은 다중 측정을 제공하며, 여기에서 화합물은 샘플에 있는 상호 결합 화합물의 검출을 위해 결합 화합물에 연결될 수 있다. 본 방법은 구별되는 eTag 리셉터에 콘쥬게이트된 결합 화합물의 혼합물을 사용하는 단일 용기에서의 복수의 결합 사건, 표적 화합물에 결합된 결합 화합물의 확인용 eTag 리셉터의 유리, 및 단일 런(run)에서 택의 분리에 의한 유리된 확인용 택의 검출에 의해 구분지어 진다. eTag 리셉터는 그것이 분리 및 검출되도록 허용하는 1가지 이상의물리적 특징에 의해 구분지어 진다.

본 방법은 eTag 리포터에 결합된 결합 화합물의 혼합물을 사용하며, 여기에서 각 eTag 리포터는 그것이 단일 분리 런에서 유일하게 검출되도록 허용하는 특징을 가진다. 본 방법은 결합 화합물이 어떤 상호 결합 파트너와 결합하여 결합 복합체를 형성하는 조건하에서 eTag 리포터 콘쥬게이트 결합 화합물과 샘플을 합하여 복수의 표적의 존재를 측정하는 것을 포함한다. 결합이 생성될 만큼 충분한 시간 후, eTag 리포터가 동일한 용기 안에서 결합 복합체로부터 유리될 수 있다. 다양한 기술이 복합체에 결합된 eTag 리포터를 유리시키기 위해 결합 화합물의 성질에 따라서 사용된다. 다음에, 유리된 eTag가 분리되며, 결합 화합물에 여전히 결합되어 있는 eTag 리포터로부터의 방해 없이 그것들의 구별가능한 특징에 의해 확인된다. 복합체에 결합된 eTag 리포터와 복합체에 결합되지 않은 eTag 리포터를 구별하는 기술은, 절단이 일어날 수 있는 복합체를 필요로 하는 효소 반응, 리간드가 결합 화합물의 일부이고, 그래서 절단 후 결합 화합물에 여전히 결합되어 있는 eTag 리셉터가 변형되는 리간드/리셉터 결합을 사용함에 의한 변형, 선택적으로 결합 화합물에 결합된 eTag 리셉터가 변형되는 eTag 리셉터의 유리를 가져오는 표적과의 이원 결합 등을 포함한다.

한 세트의 eTag 리셉터는 특징으로서 질량을 포함하는 차이점들에 의해 구분된다. 이들 eTag 리포터는 2개 이상, 통상 3개 이상의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드에 근거한 차이에는 의존하지 않지만, 서로 편리하게 조합되어 다수의 구별가능한 화합물을 제공하는 유기화학 빌딩블록에는 다소 의존한다. 따라서, 원래eTag 리포터 또는 결합 화합물에 콘쥬게이트된 eTag 리포터는 2개 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있지만, 결합 화합물로부터 유리되었을 때 이 유리된 eTag 리포터는 3개 이하, 통상 2개 이하의 뉴클레오티드를 가질 것이다. 특히 관심의 것은 그것들의 질량/전하 비에 있어서의 차이를 특징으로 하는 eTag 리셉터이다. 이들 화합물은 이동도의 차이에 의해 구분되고, (1) 절단가능한 연결 영역; (2) 질량-변경 영역; (3) 전하-변경 영역; 및 (4) 검출가능한 영역으로서 작용하는 영역을 가지는 것을 특징으로 하며, 여기에서 이 영역들은 분리 및 구분되거나 또는 조합될 수 있고, 차이점을 제공하는 적어도 2개의 구분된 영역이 있다. 이들 eTag 리포터는 단일 영역 내에 이 영역들을 모두 갖는 화합물을 갖는 키트 및 분석에 조합될 수 있으며, 이로써 다중 측정에서 eTag 리포터로 사용되는 상이한 화합물의 수가 더 확대된다. 이들 화합물은 상이한 영역, 예를 들어 1 내지 2개 영역이 동일한 부분에 존재하는 다른 화합물과 함께 사용될 수 있으며, 이 경우 전하-변경 영역은 검출가능한 영역 또는 질량-변경 영역일 수도 있다. 확인용 분자로서 작용할 수 있는 복수의 화합물에 의해, 표적 화합물의 혼합물이 단일 용기에서 분석될 수 있다. 이동도의 차이로 인해 확인할 수 있는 결합 화합물로부터 eTag ^TM 리포터의 유리를 가져오는 프로토콜을 사용함에 의해, eTag 리포터는 실질적으로 방해 물질로부터 자유롭고, 그것들의 이동도 차이가 정확한 검출 및 정량을 허용할 것이므로, 분석이 대단히 간단해진다.

eTag 리포터는 검출 방법에 따라 변할 것이다. 10개의 상이한 결합 화합물에 결합된 적어도 10개의 eTag 리포터 기들이 측정에 사용될 수 있다. 이 eTag 리포터는 동일한 절단 메카니즘에 의해 동일한 용기에서 결합 화합물로부터 절단될 수 있고, 분리 및 개별 검출을 허락하는 공유된 특징을 가지며, 측정 방법과 양립가능하고, 약 30 내지 3000dal의 분자량 범위, 통상 약 35 내지 1500dal 분자량 범위라는 것을 특징으로 한다. 변수는 질량분광계(자기장을 사용하여 분리)를 사용한 질량, 일렉트로키네시스(전기장을 사용하여 분리하고, 또한 시브 및/또는 흡수 중합체를 포함할 수 있다)를 사용한 질량/전하 비, 크로마토그래피, 예를 들어 기체 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피(극성 및 반데르발스 상호작용을 사용하여 분리)를 사용한 흡착일 수 있다.

특징으로서 질량에 의존하는 eTag 리포터에 대해서, 질량분광법을 사용하여 분석할 때 각 eTag 리포터의 질량 단위 차이는 단지 1, 바람직하게 적어도 약 2면 족하다. 통상적으로, 전기영동은 질량/전하 비에 관하여 적어도 3, 통상 5 단위 차이, 바람직하게 적어도 약 7 단위 차이를 가지지만, 더 짧은 거리를 사용하여 분리하기 원한다면 10 이상의 단위 차이를 가질 것이다. 이들 단위 차이는 유사한 구조의 분자를 위한 것이며, 이어서 논의되는 것처럼, 구조는 질량/전하 비를 변화시키지 않고 이동도에 영향을 미칠 수 있다.

대개 독립적인 영역을 갖는 eTag 리포터는 다음의 식을 가질 것이다.

상기 식에서,

L은 말단 연결 영역이고;

M은 질량-변경 영역이고;

C는 전하-변경 영역이고;

D는 검출가능한 영역이며, 이것은 eTag 리포터가 분광광도계 측정을 사용하여 검출될 때 존재하고, eTag 리포터가 질량분광계 측정을 사용하여 검출될 때는 존재하지 않고;

n은 0 또는 1이며, 분광광도계 측정에 대해 1이고, 질량분광계 측정에 대해 0이고;

* 는 어떤 부위에서 나머지 기들 중 어느 것에 M, C 및 D가 결합될 수 있다는 것을 의미하며,

독립적인 구분된 영역이 아닐 때,

M, C 및 D 중 어느 것은 함께 통합되어 단일 영역에서 다수 기능을 제공할 수 있으며, 이 영역들은 서로 직접 결합되거나 또는 연결기 또는 연결 영역에 산재될 수 있다. 즉, 한 영역의 부분이 전체 또는 다른 영역의 부분에 의해 분리될 수 있다. 또한, 이미 지적된 바와 같이, 이 상이한 영역들은 3개 이상의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 영역, 통상 2개 이상의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 영역을 함유하지 않을 것이다.

eTag 리포터가 결합 화합물에 결합된 경우, eTag 리포터는 다음 식을 가질것이다.

상기 식에서,

B는 L'에 결합된 결합 화합물이고;

L'는 B와의 결합으로서 생긴 변형된 연결기이고;

나머지 기호는 앞에 정의된 바와 같다.

유리된 eTag 리포터는 다음 식을 가질 것이다.

상기 식에서,

L''는 연결 영역의 잔기이며, 이것은 결합 화합물의 일부를 포함하거나 또는 연결 영역의 일부만을 보유함에 의해, 연결 영역과 결합 화합물을 연결함으로써 만들어진 결합 이외의 다른 곳에서 절단함에 의해, 원래의 연결기보다 많거나 또는 적게 포함할 수 있고;

나머지 기호는 앞에 정의된 바와 같다.

각 영역은 상이한 작용기 및 합성 프로토콜을 사용하여 다양한 방식으로 연결될 수 있으며, 이 경우 연결 방식은 영역들 중 하나로서 작용할 수 있는데, 예를 들어 음으로 하전된 결합을 가져오는 포스페이트 결합이 있다.

연결 영역은 잔여 eTag 리포터와 결합 화합물 간의 결합으로서 작용한다. L은 본래적인 또는 활성화 부분과 반응시킴으로써 만들어진 반응성 작용기, 결합 화합물과 연결함으로써 형성된 결합일 수 있는 절단가능한 결합, 및 나머지 영역 중 하나 이상과 결합되는 기(들)라는 3가지 양태를 가진다. 결합 화합물과의 결합을 위해서, 상이한 반응성 작용기들이 결합 화합물의 성질에 따라 사용될 수 있다.

결합 화합물이 올리고뉴클레오티드, 즉 DNA, RNA, 이것들의 조합 및 이것들의 유사체, 예를 들어 티오 유사체인 경우, 알콜과 반응하는 기가 보통 사용될 것이다. 반응성 기는 포스포라미다이트, 예를 들어 디알킬 포스포라미디트, 여기에서 알킬은 1 내지 6개 탄소 원자이고; 알킬, 시아노에틸 포스포라미다이트, 여기에서 알킬은 1 내지 6개 탄소 원자이고; 트리알킬 포스파이트 또는 포스페이트, 여기에서 알킬은 1 내지 6개 탄소 원자이고; 아실 할라이드, 무수물 및 활성 에스테르, 예를 들어 디니트로페닐 에스테르와 같은 카르복실산 또는 그것의 유사체; α-할로메틸옥소- 및 비-옥소와 같은 활성 할라이드, 여기에서 할로는 원자 번호 17 내지 53, 클로로, 브로모 및 요도이고; 등을 포함한다. 생성물은 에스테르, 무기 및 유기산 에스테르, 및 에테르일 수 있다. 또는 달리, 어떤 경우 연결 단위로서 포스페이트 유도체 이외의 다른 것을 사용할 수 있는데, 대신에 글리신 및 치환 글리신과 같은 아미노산을 사용한다. 이 경우에, eTag 리포터 단위는 유사한 화학을 사용하여 eTag 리포터를 인시투 합성한다. 전형적인 링커가 예시되며 포괄적인 것은 아니다.

대개 올리고뉴클레오티드에 있어서 절단은 뉴클레아제 활성, 예를 들어 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단된 2개 뉴클레오티드 사이의 포스페이트 결합에서 있을 것이다. 따라서, 연결 영역은 통상 아데닌, 시토신, 구아노신, 티미딘 및 우라실과 같은 적합한 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 말단 히드록시와의 커플링을 위해 인산 유도체를 포함할 것이다. 이어서 논의되는 바와 같이, 당, 리보스 또는 디옥시리보스의 다른 이용가능한 히드록실기는 나머지 영역 중 하나로 치환될 수 있다. 뉴클레아제 활성 이외의 다른 방법이 eTag 리포터의 유리를 위해 사용되는 경우, 다음에 나머지 작용기 중 어느 것이 올리고뉴클레오티드와의 연결을 위해 사용될 수 있다. 다음에, 연결 영역은 특이적 절단을 허용하는 작용체를 포함할 것이다.

특이적 핵산 서열의 검출을 위해 올리고뉴클레오티드를 사용할 필요는 없다. ssDNA 또는 dsDNA와 같은 특정 서열을 인식하는 결합 화합물을 사용함에 의해, 상이한 eTag 리포터가 상이한 결합 화합물 각각에 부착될 수 있다. eTag 리포터 표지된 결합 화합물과 핵산 샘플의 조합은 결합 화합물과 샘플에 존재하는 서열의 결합을 가져온다. 다양한 프로토콜이 결합 화합물의 성질에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 헤테로 고리 화합물의 올리고머, 특히 2개의 원자 사슬로 연결된 특히 -NH-기를 가지는 아졸 화합물, 예를 들어 피롤, 이미다졸, 히드록시이미다졸, 및 아미노산, 예를 들어 글리신, 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산 등이 사용된다. 아졸은 보통, 바람직하게 2 내지 4 또는 5 위치에 -NH- 기를 함유하는 2개의 원자 브릿지에 의해 연결된다. 이들 화합물은 서열에 대해 높은 친화성 및 특이성으로 dsDNA의 마이너 그로브에서 결합하는 헤어핀을 형성한다. 예를 들어, 결합 서열을 설명하기 위해 본원에 참고자료로 수록된 미국 특허 번호 6,090,947 및5,998,140 참조.

무손상 또는 단편화된 dsDNA를 포함할 수 있는 dsDNA 샘플에 적합한 올리고머를 첨가하고, 비결합 올리고머로부터 결합 올리고머를 격리시키고, dsDNA에 결합된 eTag 리포터를 유리시킴에 의해, 샘플에서 dsDNA 서열의 존재를 빠르게 측정할 수 있다. 격리는 예를 들어 리간드를 지니는 프라이머를 사용하는 PCR 등을 사용하여, dsDNA와 결합되는 리간드에 의해 dsDNA와 결합하는 단백질을 사용하여 달성될 수 있다. 또는 달리, eTag 리포터의 유리시 결합 화합물과 함께 보유되는 결합 화합물에 콘쥬게이트된 eTag 리포터에 결합된 바이오틴 또는 다른 리간드에 의해, 유리된 eTag 리포터에 반대 전하를 갖는 리간드 리셉터를 첨가할 수 있고, 이로써 전기영동에서 eTag 리포터가 반대 방향으로 이동할 수 있다. 본 방법은 특히 시스템의 감도가 증폭을 피하고 변성 없이 서열의 존재를 직접 측정하는데 적합한 경우에 사용할 수 있다. 이 접근법은 감염성 유기체, 예를 들어 박테리아, 바이러스 및 원생생물의 검출, 특이적 교차점의 확인, 게놈의 확인 등과 함께 사용할 수 있다.

결합 화합물과의 결합 사건을 위해 사용되는 조건하에서 안정한, 많은 수의 상이한 작용체가 있으며, 다음에 eTag 리포터에 불리한 영향을 미치지 않고 절단될 수 있다. 작용체는 산화, 환원, 가용매분해, 예를 들어 가수분해, 광분해, 열분해, 전해질분해, 화학적 치환 등을 포함하는 화학적 또는 물리적 방법에 의해 절단될 수 있다. 특이적 작용체는 싱글렛 산소로 절단될 수 있는 티오에테르, 티올로 절단될 수 있는 디술파이드, 퍼망가네이트 또는 사산화오늄에 의해 절단될 수 있는디케톤, β-술폰, 테트라알킬암모늄, 트리알킬술포늄, 테트라알킬포스포늄 등, 여기에서 α-탄소가 염기로 절단될 수 있는 카르보닐, 니트로 등으로 활성화되며, 환원에 의해 제거되는 퀴논, 광분해적으로 절단될 수 있는 치환 벤질에테르, 열적으로 절단될 수 있는 카르보네이트, 리간드가 더 높은 친화성 리간드로 대체될 수 있는 금속 킬레이트, 뿐만 아니라 문헌에 공지된 많은 다른 작용체를 포함한다. 절단 프로토콜은 미국 특허 번호 5,789,172, 6,001,579 및 거기에 인용된 참고자료에 설명된다.

eTag 리포터는 복수의 표적체를 포함하는 측정에서도 사용된다. 통상 적어도 약 3개 표적체, 더욱 통상적으로 적어도 5개, 주로 적어도 약 10개 이상에 관심이 있을 것이며, 적어도 약 20개 이상, 심지어 약 100개 이상에도 관심이 있을 수 있다. eTag 리포터의 수는 통상 표적체의 수와 동일하지만, 어떤 상황에서는 동일한 eTag 리포터가 복수의 관련된 표적체를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 그후 개별 표적체에 관한 결과를 분리할 수 있다. 결합 구성원에 결합된 eTag 리포터는 개별적으로 또는 조합하여 샘플에 첨가되며, 그후 프로세스되어 표적체의 존재를 측정한다.

관심의 것은 이동도가 밀접하게 유사한, 통상 관련되지 않은 eTag 리포터보다 이동도가 서로 더 가까운 2개의 eTag 리포터를 가지는 것이다. 일렉트로페로그램에서 근접해 있는 eTag 리포터를 가짐에 의해, 대립형질, MHC 항원, 단일 뉴클레오티드 다형성 등과 같이 쌍을 이루고 있는 상황이 분석될 경우, 특히 그것들이 구분할 수 있는 검출가능한 영역, 예를 들어 상이한 파장에서의 형광물질 형광을 가지는 경우, 샘플에 쌍들 중 아무것도 존재하지 않거나, 1개 존재하거나, 또는 2개 모두 존재한다면 빠른 측정이 얻어진다.

유전 분석은 많은 형태를 취할 수 있으며 상이한 정보의 측정을 포함한다. 유전 분석은 서열화, 특이적 유전자 또는 조절 서열의 존재와 관련된 특이적 서열의 검출, 유기체의 확인, 상이한 세포, 상이한 세포 단계 및 외부 자극과 관련된 전사 사건의 확인, 단일 뉴클레오티드 다형성, 대립형질, 반복 서열, 색소체 DNA, 미토콘드리아 DNA 등의 확인, 법의학 등에 연루된다. 각 경우에, 다수의 결합 사건에 관심이 있는 경우에는 복합체 샘플이 분석될 것이다. 각 사건에 대해 독특한 eTag 리포터를 제공함에 의해, 동일한 플라스크 안에서 단일 샘플 또는 소수의 샘플 알리쿼트를 사용하여 많은 분석을 동시에 수행할 수 있다. 예를 들어, 분석이 각 용기에 단일 뉴클레오티드 포함하는 경우, 각 뉴클레오티드에 대해 하나씩 4개 용기를 사용할 것이다. 대부분의 경우에, eTag 리포터는 분석 혼합물의 다른 성분으로부터 분리되어 eTag 리포터에 대한 분석시 이들 다른 성분으로부터의 방해를 실질적으로 감소시킬 수 있다.

혼성화의 결과로서 핵산 서열의 포스페이트 결합의 절단을 포함하는 많은 유전 분석이 있다. 대개, 초기 단계는 용액에서 행해질 것이나, 최초 및 후속 단계의 측정에서 고체 지지체에 결합된 1가지 이상의 시약을 가질 수 있다. 한 기술이 미국 특허 번호 5,876,930 및 5,723,591에 설명되며, 여기에서 프라이머 및 프로브가 표적 서열에 결합되고, 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용한 프라이머 확장에 의해, 말단 뉴클레오티드가 표적 DNA를 따라 폴리머라제 프로세스로서 절단된다. 말단 및/또는 내부 뉴클레오티드(들)에 결합된 eTag 리포터를 가짐에 의해, eTag 리포터가 표적 핵산이 존재할 때 유리될 것이다. 다른 기술은 클레아바제로서 언급되는 효소를 사용하며, 이 효소는 표적 핵산, 프라이머 및 프로브의 3원 복합체를 인식한다. 미국 특허 번호 5,719,028 참조. 3원 복합체가 형성된 경우, 프로브의 말단에 부착된 것이 클레아바제(cleavase)에 의해 유리되는 eTag 리포터이다.

단일 뉴클레오티드 다형성(snp)을 검출하기 위해서, 다양한 기술이 복잡성을 변화시키면서 사용될 수 있다. 한 기술에서, 앞선 snp에 바로 인접한 뉴클레오티드에서 종결하는 프라이머가 사용된다. 프라이머에 결합된 eTag 리포터 및 snp에 상호적인 뉴클레오티드에 결합된 리간드를 가질 수 있다. 상이한 표지된 뉴클레오티드를 각각 갖는 4개의 용기를 가지거나, 또는 상이한 표지를 갖는 각각의 표지된 뉴클레오티드를 갖는 1개의 용기를 가질 수 있다. 3'-5' 에디팅을 사용하는 다양한 폴리머라제를 사용하여 확실히 미스매치가 별로 없도록 할 수 있다. 그후, 확장된 프라이머가 예를 들어 리간드, 예를 들어 바이오틴을 가짐에 의해서, 그리고 확장 혼합물과 지지체에 결합된 상호 리셉터, 예를 들어 스트렙토아비딘을 접촉시킴에 의해서 포착될 수 있으며, eTag 리포터가 유리 및 분석된다. snp에 대해 동일한 뉴클레오티드를 갖는 관심의 표적들을 분류함에 의해, 분석이 복수의 표적에 대해 다중화될 수 있다. 다른 기술은 snp가 미스매치된 프로브를 갖는 것을 포함한다. 미스매치 뉴클레오티드는 eTag 리포터로 표지된다. snp가 존재할 때, eTag 리포터 표지된 뉴클레오티드가 검출을 위해 유리될 것이다. 미국 특허 번호5,811,239 참조.

다른 변형에서, 프라이머와 프로브를 리게이트할 수 있으며, 여기에서 1개는 표적 핵산과 혼성화되었을 때 나머지의 3'이다. 절단가능한 결합을 갖는 eTag 리포터를 갖는 프라이머와 프로브 쌍 중 1개 및 다른 제제와 함께 절단가능한 결합의 절단을 일으킬 수 있는 제제를 갖는 쌍의 나머지를 가짐에 의해, 프라이머와 프로브는 표적에 결합되었을 때 함께 리게이트될 수 있다. 예를 들어 열에 의해 표적으로부터 리게이트된 쌍을 유리시키고, 혼합물을 냉각시켜 프라이머와 프로브를 혼성화시키고, 표적에 결합된 프라이머와 프로브를 리게이트시킨 후, 변성시켜 리게이트된 프라이머와 프로브를 유리시키고, 리게이트된 프라이머와 프로브의 수를 증폭시킴에 의해 재이용할 수 있다. 일단 바람직한 증폭도가 달성되면, eTag 리포터의 유리를 가져오는 추가의 시약을 제공할 수 있다.

프라이머를 포함하는 PCR 또는 다른 증폭 반응이 사용되는 경우, 프라이머는 증폭된 DNA의 격리를 허용하는 리간드로 표지될 수 있고, 그후 지지체에 결합된 리간드에 상호적인 리셉터에 의해 DNA를 격리시킬 수 있고, 프로브 서열에 특이적인 eTag 리포터로 표지된 프로브를 첨가한다. 혼성화시키고 세척하여 비-특이적으로 결합된 핵산 및 결합되지 않은 핵산을 제거한 후, eTag 리포터를 유리시켜 분석한다.

핵산 분석 대신 단백질 분석에 관심이 있을 수 있다. 단백질 혼합물을 측정하기 위해서, 무손상 세포, 무손상 바이러스, 바이러스 감염된 세포, 세포용해액, 색소체, 미토콘드리아 또는 다른 세포소기관, 분별된 샘플, 또는 다른 단백질 응집체를 단독으로 또는 다른 화합물과 함께 사용할 수 있다. 복수의 단백질을 확인하는데 관심이 있는 경우, 단백질 혼합물의 어떤 공급원도 사용될 수 있다.

대사, 유사분열, 감수분열 동안의 세포 발현, 외부 자극, 예를 들어 약물, 바이러스, 영양물 및 보조인자 과잉 또는 결핍, 스트레스, 노화, 특정 균주의 유기체의 존재를 포함하는 물리적 또는 화학적 상태의 변화에 대한 반응, 및 유기체 및 균주, 다수 약물 내성 등을 확인하는데에 관심이 있는 경우, 프로테오믹스가 유력한 역할을 한다. 단일 샘플에서 많은 수의 단백질을 확인하는 것 뿐만 아니라 검출될 상이한 단백질의 어떤 정량을 제공하기 위한 수단을 가져야할 필요가 있다. 한 분석에서, 표적 단백질에 특이적인 결합 단백질을 사용할 수 있다. 결합 단백질의 일군은 용기 또는 채널벽, 자성 또는 비-자성 입자, 예를 들어 라텍스 입자, 덱스트로스, 세파로스, 셀룰로스 등과 같은 지지체에 결합되며, 이 경우 지지체는 이 지지체에서 표적 단백질을 격리시키는 것을 허락한다. 가장 일반적으로, 항혈청보다는 오히려 항체, 특히 단일클론 항체가 사용될 것이나, 항혈청이 사용될 수도 있다. 어떤 상황에서는 렉틴, 효소, 표면 맴브레인 단백질 등과 같은 다른 리셉터가 사용될 수 있으며, 어떤 상황에서는 단백질에 대한 리간드가 사용될 수 있다. 상호-결합 구성원인 리셉터 및 리간드가 공유 또는 비-공유 결합을 통해 지지체에 결합될 수 있다. 활성화된 표면이 사용되기도 하며, 이 경우 표면은 상호-결합 구성원과 반응하여 표면과의 안정한 결합을 제공하는 활성 작용기, 예를 들어 실릴 클로라이드 변성 유리, 시아노겐 브로마이드 변성 다당 등을 가진다. 단백질을 어떤 플라스틱 표면과 타이트하게 결합하며, 그래서 공유 결합이 불필요하다.리간드는 표면과 결합하는 활성 작용기를 가지거나 또는 활성 작용기와 함께 제공될 수 있다. 표면과의 바람직한 결합이 리간드과 상호 결합 구성원을 결합시키는 단계 및 리간드 결합 구성원과 지지체를 결합시키는 단계에 의해 2 단계로 달성될 수 있다면, 리간드로서 바이오틴 및 리간드 결합 구성원으로서 스트렙트/아비딘을 가질 수 있거나, 또는 표적 단백질에 결합된 항체와 결합할 수 있는 표면에 결합된 항-Ig를 가질 수 있다. 게다가, 환경 변화가 국소적인 경우 큰 농도의 중화작용 제제, 예들 들어 다량의 pH 7 완충액, 예를 들어 200mM 포스페이트를 가질 수 있으며, 이 경우 암모니아가 국소적 염기성 환경을 만들기 위해 생성된다.

샘플은 지지체에 결합될 수 있거나 또는 이어서 지지체에 결합될 수 있는 상호 결합 구성원과 조합된다. 세척하여 혼합물의 나머지 성분을 없앤 후, 특정 리셉터에 특이적인 eTag 리포터 분자로 표지된 표적 단백질에 대한 리셉터가 결합된 표적 단백질에 첨가되며, 이로써 표적 단백질을 통해 지지체에 결합되게 된다. 1개 이상의 eTag 리포터 분자가 리셉터에 결합될 것이며, 통상 약 20개 미만, 주로 약 10개 미만이다. 이 수는 eTag 리포터 분자의 수가 증가됨에 따라 결합 친화성의 손실 정도에 의해 제한될 것이다. 보통, 지지체 결합 리셉터 및 eTag 리포터 표지 리셉터는 표적 단백질의 상이한 에피토프에 결합할 것이나, 표적이 복수의 동일한 에피토프를 가지는 어떤 상황에서는, 리셉터는 동일한 에피토프에 특이적일 수 있다. 세척하여 표적 단백질(들)에 특이적으로 결합되지 않은 eTag 리포터 표지 리셉터를 모두 없앤 후, eTag 리포터 분자가 유리되어 분석된다.

표적이 2개의 상호 결합 구성원의 결합을 허락하는 경우나, 또는 이 사건을허락하는 추가의 시약이 제공되는 경우, "채널링" 또는 에너지 전달을 포함하는 측정을 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,843,666 및 5,573,906 참조. 채널링을 포함하는 수많은 방법이 문헌상에 있으며, 대개의 경우에 채널링은 직접 검출가능한 신호, 통상 빛의 흡수 또는 유리의 변화를 생성하는데 연루되었다. 채널링은 2가지 시약을 포함하며, 여기에서 제 1 시약은 제 2 시약에 근접해 있을 때 검출가능한 신호를 생성한다. eTag 리포터에 대해서, 검출가능한 신호는 결합 성분으로부터 eTag 리포터의 유리이다. 유리는 통상 화학종 또는 광활성화된 여기된 종과 같은 단명하는 존재의 생성의 작용일 것이나, 벌크 용액과 비교하여 국소 환경을 변화시킨 결과일 수도 있다. 화학종에 관해, 예를 들어 이 종은 싱글렛 산소, 과산화 수소, NADH, 및 히드록실 라디칼을 포함한다. 동일한 표적 부분에 결합하는 상호 결합 구성원을 가지는 2개의 존재가 사용된다. 존재 중 1개는 활성종을 생성한다. 나머지 존재는 활성종과 상호작용하여 eTag 리포터의 유리를 가져오거나, 또는 변화된 국소 환경에 대해 반응하여 eTag 리포터를 유리시킨다. 활성종이 단명하여 활성종 부근을 지나서는 활성종이 불활성화되기 때문에 유의한 바탕값을 만들 수 없게 하거나, 또는 활성종을 효과적으로 치우는 스캐빈져를 사용하여 표적에 결합되지 않은 민감한 작용기와의 반응에 이용할 수 없게 한다.

반응성 종의 생성제는 과산화 수소를 생성하는 글루코스 옥시다제, 크산텐 옥시다제, D-아미노산 옥시다제, NADH-FMN 옥시도리덕타제, 갈락토스 옥시다제, 글리세릴 포스페이트 옥시다제, 사르코신 옥시다제, 콜린 옥시다제 및 알콜 옥시다제와 같은 옥시다제, 히드록실 라디칼을 생성하는 양고추냉이 퍼옥시다제, NADH 또는NADPH를 생성하는 다양한 디히드로게나제, 암모니아를 생성하여 높은 국소 pH를 만드는 우레아제와 같은 효소를 포함한다. 한 절단가능한 결합은 황 또는 셀레늄의 산화에 대한 기초가 될 수 있으며, 이 경우 티오에테르, 술폭시드 또는 그것의 셀레늄 유사체가 활성화기에 관한 α- 또는 β-위치에 존재하고, 이것이 활성화기에 대한 α 수소를 산성으로 만들어 염기에 의해 제거될 수 있게 하고, 이로써 eTag 리포터가 부착된 산화된 작용기를 유리시키거나, 또는 eTag 리포터의 유리과 함께 산화된다. 또는 달리, 한 산화 상태에서는 안정하고 다른 산화 상태에서는 불안정한 금속 킬레이트를 사용할 수 있다. 다른 화합물은 술포닐, 옥시, 아미노 등과 같은 이탈기를 통해 결합된 eTag 리포터를 갖는 α-치환 메틸퀴논을 포함한다.

이종성 시스템을 사용함에 의해, 절단을 일으키기 위한 제 1 제제가 표면에 결합되어, 표면과 결합되었을 때 eTag 리포터의 유리를 위한 환경을 제공할 수 있다. 제 2 제제가 eTag 리포터의 유리를 일으키기 위해 필요한 경우, 제 2 제제는 eTag 리포터 콘쥬게이트 결합 화합물이 표면에 결합될 만큼 충분한 시간 후에 첨가된다. 표적이 핵산인 경우, 핵산은 표면에 결합된 ssDNA 결합 단백질을 가짐에 의하거나 또는 본 분야에 공지된 다른 편리한 수단에 의해 표면을 함유하는 제 1 제제에 결합될 수 있다. 일단 표적이 표면에 결합되면, eTag 리포터 콘쥬게이트 올리고뉴클레오티드 상동성 표적 핵산 서열이 첨가된 후 제 2 제제가 첨가된다. 리간드 및 단백질에 있어서, 표면에 한 부위에서 결합하는 리셉터를 가지고, 본 분야에서 "샌드위치"라고 언급되는 것을 형성하는 상이한 부위에서 결합하는 eTag 리포터 결합 화합물을 가질 수 있다.

싱글렛 산소에 대해서, 스쿠아레이트 유도체와 같은 다양한 감광제를 사용할 수 있다. 예를 들어, Ullmna 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430(1994) 참조. 본 발명에 사용하는 조합의 예는 미국 특허 번호 5,536,498; 5,536,834; 및 거기에 인용된 참고자료; HH Wasserman 및 RW Murray. Singlet Oxygen. 아카데믹 프레스, 뉴욕 (1979); AL Baumstark. Singlet Oxygen, Vol.2, 씨알씨 프레스 아이엔씨, 보카 라똥, 프랑스 1983에서 알 수 있다. 다른 절단 메카니즘은 WO 99/64519; WO 99/13108; WO 98/01533 및 WO 97/28275에서 알 수 있다.

싱글렛 산소는 광범위한 이중 결합과 반응하며, 산소기에서 이중 결합이 절단되면서 eTag 리포터가 분리된다. 예를 들어, 올레핀은 비닐 술파이드, 비닐 에테르, 엔아민, α-메틴(CH, 적어도 1개의 수소 원자를 갖는 탄소 원자)으로 탄소 원자에서 치환된 이민을 포함하며, 여기에서 비닐기는 고리에 있을 수 있고, 헤테로 원자도 고리에 있을 수 있거나, 또는 고리 올레핀 탄소 원자 상에서 치환될 수 있고, 올레핀 탄소 원자에 결합된 적어도 1개 및 4개까지의 헤테로 원자가 있을 것이다. 결과의 디옥세탄은 주변 온도 이상, 통상 약 75℃ 이하에서 가열함에 의해, 산 또는 염기와의 반응에 의해, 또는 감광제의 부재 또는 존재하에 광분해에 의해 자발적으로 분해될 수 있다. 수많은 논문이 싱글렛 산소로 분해될 수 있는 여러 가지의 화합물을 설명하는데, 이 경우 논문은 주로 광유리에 관심이 있고, 그래서 이 화합물들은 단지 절단만이 결합 화합물로부터 eTag 리포터를 유리하는데 필요한 당해 목적에 필요한 것보다 더욱 복잡한 구조를 가진다. 따라서, 대개 합성의 편리성, 결합 화합물과 연결하는 조건 및 결합 조건하에서의 안정성, 유리의 효율이특정한 구조를 선택하는데 있어서 주요한 요인일 것이다.

훨씬 더 많은 문헌의 예시인 관심의 논문들은 Adam 및 Liu, J. Amer. Chem. Soc. 94. 1206-1209, 1972, Ando 등, JCS Chem. Comm. 1972, 477-8, Ando 등, Tetrahedron 29, 1507-13, 1973, Ando 등, J. Amer. Chem. Soc. 96, 6766-8, 1794, Ando 및 Migita, 같은 책 97, 5028-9, 1975, Wasserman 및 Terao, Tetra. Lett. 21, 1735-38, 1975, Ando 및 Watanabe, 같은 책, 47, 4127-30, 1975, Zaklika 등, Photochemistsry and Photobiology 30, 35-44, 1979 및 Adam 등, Tetra. Lett. 36, 7853-4, 1995를 포함한다. 또한, 미국 특허 번호 5,756,726 참조.

디옥세탄 형성은 올레핀의 1개 탄소 원자에서 eTag 리포터로 그리고 올레핀의 나머지 탄소 원자에서 결합 화합물로 치환된 활성화된 올레핀과 싱글렛 산소의 반응에 의해 얻어진다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,807,675 참조.

이들 화합물은 다음 식에 의해 나타낼 수 있다.

(eTag 리포터 - W)(X) _n C _α = C _β (Y)(Z)

상기 식에서,

W는 결합, 헤테로 원자, 예를 들어 O, S, N, P, M(안정한 공유 결합을 형성하는 금속을 지정함), 또는 카르보닐, 이미노 등과 같은 작용기일 수 있으며, X 또는 C _α 에 결합될 수 있고;

적어도 1개의 X는 지방족, 방향족, 지환족 또는 헤테로 고리일 것이며, 헤테로 원자, 예를 들어 N, O 또는 S를 통해 C _α 에 결합되고, 나머지 X는 동일하거나 또는 상이하며, 게다가 수소, 지방족, 방향족, 지환족 또는 헤테로 고리, 통상 방향족 또는 방향족 헤테로 고리일 수 있으며, 여기에서 1개의 X는 Y와 함께 하나로 합쳐져서 고리를, 통상 그것들이 부착된 탄소 원자, 일반적으로 수소 원자 이외에 약 1 내지 20개, 통상 1 내지 12개, 더욱 통상적으로 1 내지 8개 탄소 원자와 함께 헤테로 고리를 형성하고, 1개 X는 0 내지 6개, 통상 0 내지 4개 헤테로 원자를 가질 것이며, 나머지 X는 적어도 1개 헤테로 원자 및 6개까지의 헤테로 원자, 통상 1 내지 4개 헤테로 원자를 가질 것이고;

Y는 X의 정의 내에 있을 것이며, 통상 헤테로 원자를 통해 C _β 에 결합되고, 나타낸 바와 같이 X와 함께 합쳐져서 헤테로 고리를 형성하고;

Z는 상술된 바와 같이 통상 약 4 내지 12개, 통상 4 내지 10개 탄소 원자 및 0 내지 4개 헤테로 원자의 헤테로 고리 방향족을 포함하는 방향족일 것이며, 상술된 바와 같이 C _β 에 직접 또는 헤테로 원자를 통해 결합되고;

n은 eTag 리포터가 C _α 또는 X에 결합되는지의 여부에 따라서 1 또는 2이고;

여기에서, Y 및 Z 중 1개는 결합 구성원과의 결합을 위하거나 또한 결합 구성원에 결합되는 작용기를 가질 것이다.

식에 나타내지는 않았지만, 1개 또는 모든 X에 결합된 1개 이상의 eTag 리포터를 가짐에 의해 단일 분자 내에 복수의 eTag 리포터를 가질 수 있다.

예를 들어, 화합물은 S-(eTag 리포터) 3-티올아크릴산, N-(eTag 리포터), N-메틸 4-아미노-4-부텐산, O-(eTag 리포터), 3-히드록시아크롤레인, N-(4-카르복시페닐) 2-(eTag 리포터) 이미다졸, 옥사졸, 및 티아졸을 포함한다.

또한, 관심의 것은 식 -(CO)X ¹ (A)-의 2가 기로 9번 위치에서 치환된 N-알킬 아크리디닐 유도체이다.

상기 식에서, X ¹ 은 O, S, N 및 Se로 구성된 군으로부터 선택된 헤테로 원자이며, 통상 처음 3개 중 1개이고;

A는 eTag 리포터로 치환된 적어도 2개 탄소 원자이며, 통상 6개 미만의 탄소 원자의 사슬이며, 바람직하게 A의 나머지 원자가는 수소에 의해 충족되지만, 이 사슬은 알킬, 아릴, 헤테로 고리 등의 기와 같은 다른 기들로 치환될 수 있으며, A는 일반적으로 10개 미만의 탄소 원자이다.

또한, 관심의 것은 치환된 이미다졸, 티아졸, 옥사졸 등에 의해 예시된 디헤테로시클로펜타디엔과 같은 헤테로 고리 화합물이며, 여기에서 고리는 통상 적어도 1개의 방향족 기로 치환될 것이고, 어떤 경우에는 가수분해가 eTag 리포터를 유리시키는데 필요할 것이다.

또한, 관심의 것은 텔루르(Te) 유도체이며, 이 경우 Te는 Te 원자에 대한 β 수소 원자를 갖는 에틸렌기에 결합되고, 여기에서 에틸렌기는 바람직하게 방향족 고리에 융합된 옥소기를 가질 수 있는 지환족 또는 헤테로 고리의 일부이고, Te의 나머지 원자가는 eTag 리포터에 결합된다. 이 고리는 쿠마린, 벤족사진, 테트랄린 등일 수 있다.

전하-변경 영역 또는 검출가능한 표지를 포함하지 않는 때, 질량-변경 영역은 통산 중성 유기기, 지방족, 지환족, 방향족 또는 헤테로 고리일 것이며, 이 경우 헤테로 원자는 분석 프로토콜에 사용되는 조건하에서 중성일 것이다. 헤테로 원자는 옥시 또는 비-옥소- 또는 옥소-카르보닐로서의 산소, 티오 또는 티오노로서의 황, 할로, 아미드, 니트로 또는 시아노로서의 질소, 포스파이트 또는 포스페이트 트리에스테르로서의 3가 인 등일 수 있다. 편리하게, 이 영역은 폴리메틸렌을 포함하는 메틸렌, 폴리알킬렌옥시를 포함하는 알킬렌옥시, 특히 2 내지 3개 탄소 원자의 알킬렌, 아릴 또는 치환된 아릴, 예를 들어 페닐렌, 디페닐렌, 시아노페닐렌, 니트로페닐렌, 티오페닐렌, 클로로페닐렌, 푸라닐렌, 아미노산, 예를 들어 치환된 글리신아미드를 포함하는 N-아실 글리신아미드 및 폴리글리신아미드, 시클로펜틸렌, 비스-비페닐렌-E 등일 수 있으며, 여기에서 E는 카르보닐, 옥시, 티오, 우레이도, 메틸렌, 이소프로필렌 등이다. 질량-변경 영역은 일반적으로 수소 원자 이외에 약 1 내지 100개, 더욱 통상적으로 1 내지 60개 원자일 것이며, 일반적으로 적어도 1개의 탄소 원자 및 60개까지의 탄소 원자 및 약 0 내지 40개 헤테로 원자, 통상 약 0 내지 30개 헤테로 원자를 가진다.

전하-변경 영역은 나머지 기들의 존재와 분자 내에 비중성 전하의 수를 감소시키기를 원하는지 아니면 비중성 전하의 수를 증가시키기를 원하는지의 여부에 따라서 변할 것이다. 분자의 전하는 표지와 같은 전하-변경기 이외의 다른 것으로부터 유래할 수 있으며, 영역들 간의 연결기가 전하-변경 영역, 연결 영역, 및 eTag 리포터와 함께 보유된 결합 화합물의 어떤 잔기에 포함될 수 있다. 대개 eTag 리포터는 전체적으로 음전하를 가질 것이나, 어떤 경우에는, 특히 양 및 음의 eTag리포터가 동일한 전기영동 분리에서 측정된다면 전체적으로 양전하일 수 있다. 음전하는 포스포네이트, 포스피네이트, 티오포스페이트 등을 포함하는 포스페이트, 보레이트, 카르복실레이트, 술포네이트, 엔올레이트, 페녹시드 등에 의해 제공될 수 있다. 양전하는 아민 및 치환된 아민, 예를 들어 암모늄, 술포늄, 히드라진, 이민, 아미딘, 금속 이온, 특히 킬레이트 및 메탈로센으로서의 금속 이온 등에 의해 제공될 수 있다. 전하-변경 영역은 수소 이외에 1 내지 60개 원자, 통상 약 1 내지 30개 원자를 가질 수 있으며, 여기에서 적어도 1개의 헤테로 원자가 있을 것이며, 이것은 산소, 질소, 황, 붕소, 3가 인, 금속 이온 등일 수 있다.

폴리(아미노산)을 사용한 편리한 방식으로 질량-변경과 전하-변경 기능을 단일 영역 내에 합칠 수 있으며, 이 경우 천연발생한 아스파르테이트 및 글루타메이트가 음전하를 제공할 수 있으며, 천연발생한 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 양전하를 제공할 수 있다. 그러나, 술폰산, 포스폰산 및 보론산 치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산을 사용할 수도 있다. 다른 영역과 함께 적합하게 선택함에 의해, 다수의 상이한 이동도가 달성될 수 있다. 질량-변경 영역과 조합하여 사용되었을 때, 상이한 이동도를 갖는 eTag 리포터의 수는 대단히 확대된다.

치환체가 하전된 치환된 디올 또는 디아민 및 2염기성 산의 조합을 사용하여 디에스테르 및 디아미드를 형성할 수 있다. 그러한 올리고머의 예는 디올 또는 디아미노의 조합, 예를 들어 2,3-디히드록시프로피온산, 2,3-디히드록시숙신산, 2,3-디아미노숙신산, 2,4-디히드록시글루타르산 등이다. 디올 또는 디아미노 화합물은 2염기성 산에 의해 연결될 수 있으며, 이 2염기성 산은 상기 나타낸 무기 2염기성산 뿐만 아니라 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 카르본산, 시트르산, 타르타르산 등과 같은 2염기성 산도 포함한다. 또는 달리, 히드록실 또는 아민을 알킬렌 또는 아릴렌기, 디카르보닐, 활성화된 디할로 화합물 등과 연결시킬 수 있다. 다른 조합은 디엔, 활성화된 디할로 화합물 등과 공중합될 수 있는 치환된 디티올을 포함한다. 따라서, 상이한 모노머의 적합한 선택에 의해, 낮은 차수의 올리고머가 생성되고, 그후 분자량에 의해 분리될 수 있다.

검출 영역은 분광광도적으로 및/또는 전기화학적으로 검출될 수 있는 어떤 표지를 포함할 수 있다. 광범위한 표지가 전기영동 장치에서의 검출에 이용가능하다. 통상 사용되는 형광물질은 플루오레세인 및 플루오레세인 유도체, 란타나이드 염료, 로다민 및 로다민 유도체, Cy-5, Cy-3, HEX, TET, 스쿠아레이트, 및 시아닌 염료를 포함한다. 염료는 하전되거나 하전되지 않을 수 있으며, 이로써 분자의 전체 전하를 더하거나 또는 줄인다. 또한, 페로센 및 루테늄 착물과 같은 전기화학적 표지가 사용되기도 한다.

경제적인 이유 및 조작상의 이유로, 일반적으로 여기를 위해 레이저를 가능한 적게 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 주로 형광물질인 에너지 흡수제/전달제와 통상 형광물질인 에너지 리시버/유리제의 조합을 사용하는 것이 바람직하며, 이로써 여기 동안 에너지 흡수가 일정하게 계속되고, 여기에서 2개 존재 간의 에너지 교환이 스톡스 이동의 변화로 인한 유리 파장의 변동을 허용한다. 염료의 조합은 플로오레세인 및 HEX(ex _488mm , em _560mm ), 및 프탈로시아닌(ex _488mm , em _690mm )을 포함한다. 에너지 전달을 위해 적합한 근접도로 결합되는 형광물질의 다양한 조합을 제공할 수 있다. 연결 영역 또는 질량-변경 영역 에 있는 리보실기가 에너지 전달쌍의 구성원의 결합을 위한 1개의 히드록실기 및 사슬로의 삽입을 위한 2개의 히드록실을 제공하는 반면, 2개 형광물질로 치환된 디옥시리보스는 측쇄인 히드록실기와 반응할 수 있다. 에너지 전달쌍의 구성원이 결합되는 사용된 특정한 단위는 질량-변경 및/또는 전하-변경을 제공하도록 선택될 수 있다.

eTag 리포터의 이동도는 공식 (M/z) ^2/3 에 따르는 질량/전하 비에 의존할 뿐만 아니라 구조에도 의존할 것이다. 단단하고 분자를 확장시키는 eTag 리포터 내의 존재는 드래그를 증대시켜서 이동도를 감소시킨다. 따라서, 방향족, 5- 및 6-원 헤테로 고리, 예를 들어 테트라히드로푸란, 폴리엔 및 폴리아세틸렌과 같은 단단한 기를 사용함에 의해, 심지어 질량 대 전하의 비가 유의하게 차이나지 않는 동안에도 이동도의 차이를 증대시킬 수 있다.

뉴클레오티드를 포함하는 eTag의 합성은 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하는 프로브 합성 동안 고체상 지지체 위의 어셈블리에 의해 쉽게 그리고 효과적으로 달성될 수 있다. eTag 리포터는 최종 뉴클레오시드 잔기의 커플링 후 프로브의 5'-단부에서 조립되며, 이 잔기는 분석 동안 eTag 리포터의 부분이 된다. eTag 리포터의 빌딩블록의 말단 중 1개에 결합된 뉴클레오티드 트리포스페이트를 가질 수 있다. 한 접근법에서, eTag 리포터는 단일 또는 몇몇 모노머 포스포라미다이트 빌딩블록(검출가능한 영역, 예를 들어 염료를 함유하는 것)으로부터 순차적으로 구성되며, 이 빌딩블록은 질량 대 전하 비에 기초하여 독특한 전기영동도를 갖는 eTag 리포터를 생성하도록 선택된다. 따라서, eTag 리포터는 포스페이트 링커에 의해 브릿지된 다양한 전하 대 질량 비의 모노머 단위로 이루어진다(그림 A). 9 질량 단위에 의해 구별되는 eTag 리포터의 분리(표 1)가 증명되었다. eTag 리포터 합성에 사용되는 뉴클레오시드 포스포라미다이트는 처음으로 변성되거나 또는 천연 잔기이다. 플루오레세인이 처음 사용된 염료였으나, 다른 염료도 사용될 수 있다.

그림 A. 앞에 설명된 표준 포스포라미다이트 커플링 화학을 사용한 고체상 지지체 위의 eTag 리포터의 디자인 및 합성.

예상된 용출 시간을 갖는 포스포라미다이트 빌딩블록의 조합 중 일부가 표 2에 제시된다. 그림 B에 나타낸 바와 같이, eTag 리포터는 연속 스펙트럼의 신호를 발생시키도록 합성되며, 그것들 중 어느 것도 함께 용리하지 않고 하나가 용리한 후 또 다른 하나가 용리한다.

그림 B. 독특한 전하 대 질량 비를 지니도록 디자인된 eTag 리포터의 분리.

C ₃ , C ₆ , C ₉ , C ₁₈ 은 글랜 리서치(버지니아 스터링)에서 상업적으로 입수가능한 포스포라미다이트 스페이서이다. 이 단위들은 N,N-디이소프로필, O-시아노에틸 포스포라미다이트의 유도체이며, 이것은 "Q"로 나타낸다. C ₃ 은 DMT(디메톡시트리틸)옥시프로필 Q이고; C ₆ 은 DMT옥시헥실 Q이고; C ₉ 는 DMT옥시(트리에틸렌옥시) Q이고; C ₁₂ 는 DMT옥시도데실 Q이고; C ₁₈ 은 DMT옥시(헥사에틸렌옥시) Q이다.

상기 eTag 리포터는 모두 잘 일하며 쉽게 분리할 수 있고 40분 후 용리한다.더 빨리 용리하는 eTag 리포터를 생성하기 위해서, 고도로 하전된 저분자량 eTag 리포터가 필요하다. 몇 종류의 포스포라미다이트 모노머가 이른 용리 시간을 갖는 고도로 하전된 eTag 리포터의 합성을 허용한다. 디카르복실레이트 포스포라미다이트(그림 C)의 사용은 모노머의 커플링 당 3 음전하의 부가를 허용한다. 통상의 인산화 시약과 조합된 폴리히드록실화 포스포라미다이트(그림 D)는 고도로 인산화된 eTag 리포터의 합성을 가능하게 한다. 다른 질량 변경제 링커 포스포라미다이트를 갖는 이들 시약의 조합은 이른 용리 시간을 갖는 eTag 리포터의 합성을 허용한다.

그림 C. 전하 변경제 포스포라미다이트(EC 또는 CE는 시아노에틸이다)

그림 D. 폴리히드록실화된 전하 변경제 포스포라미다이트

상이한 전기영동도를 갖는 전술된 표지 콘쥬게이트는 다중 증폭 및 다수 표적, 예를 들어 핵산 표적의 검출을 허락한다. 표지 콘쥬게이트는 효소적으로 절단가능한 결합에 의해서, 일반적인 표지에 대한 것과 유사한 방식으로 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 그것은 물론 다중 측정을 수행하기 위한 어떤 수의 표지 콘쥬게이트를 제조하는 본 발명의 범위 내이다. 따라서, 예를 들어 단일 분리 채널 내에서 분리된 40 내지 50개의 상이한 표지 콘쥬게이트 및 단일 미소유체 칩 상에 96개 분리 채널을 갖는 96개의 상이한 증폭 반응에서, 4000 내지 5000개의 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출할 수 있다.

9 질량 단위로 구별되는 eTag 리포터의 분리(표 1)가 도 7에 나타낸 바와 같이 증명되었다. 프로브 합성 동안에 두번째 커플링이 상업적으로 입수가능한 변성된(및 변성되지 않은) 포스포라미다이트(표 2)를 사용하여 처음으로 수행된다. 이 잔기는 표적 가닥에서 그것의 파트너와 수소 결합을 형성할 수 있으며, 질량 변경제로 고려되지만 잠재적으로는 전하 변경제일 수도 있다. 이 커플링 동안 형성된 포스페이트 브릿지는 5'-뉴클레아제 분석 동안 끊어지는 결합이다. 최종 커플링이 포스포라미다이트 유사체인 염료를 사용하여 행해진다. 플루오레세인이 편리하게 사용되지만 다름 염료도 사용될 수 있다.

한 합성 접근법이 반응식 1에 개략되어 있다. 상업적으로 입수가능한 6-카르복시플루오레세인을 사용하여 출발하며 페놀 히드록실기가 무수물을 사용하여 보호된다. 피리딘 중의 무수 이소부티르산이 사용되었지만, 다른 변이체가 동일하게 적합하다. 보호기로서 에스테르 작용기를 선택하는 것의 중요성을 주지하는 것이 중요하다. 이 종은 포스포라미다이트 모노머 합성 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드 구성 동안에도 그대로 잔존한다. 이들 기는 합성된 올리고가 암모니아를 사용하여 탈보호될 때까지 제거되지 않는다. 보호 후 미정제 물질이 커플링제로서 DCC를 사용하여 N-히드록시 숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르)를 형성함에 의해 인시투 활성화된다. DCU 부생성물은 여과되어 없어지고 아미노 알콜이 첨가된다. 많은 아미노 알콜이 상업적으로 입수가능하며, 그 중 일부는 아미노산의 환원으로부터 유도된다. 단지 아민만이 N-히드록시 숙신이미드를 대체할 만큼 충분히 반응성이다.

표준 추출 워크업에 의해 수율 95%의 생성물이 얻어진다. 이 물질은 포스피틸화되어 포스포라미다이트 모노머를 생성한다(반응식 1). 추가의 eTag 리포터의 합성을 위해서, 대칭의 비스아미노 알콜 링커가 아미노 알콜로서 사용된다(반응식 2). 그후, 그러한 제 2 아민은 포스피틸화 반응 전에 다수의 카르복실산 유도체(표 1)와 커플링된다. 이 방법을 사용하여 전하 대 질량 비를 변화시키면서 수백 심지어 수천개의 eTag 리포터가 표준 화학을 사용하여 DNA 합성기 상에서 프로브를 합성하는 동안 쉽게 조립될 수 있다.

추가의 eTag 리포터는 출발 물질로서 5-아미노플루오레세인을 사용하는 다른 전략에 의해 접근된다(반응식 3). 큰 부피의 용매 중의 매우 과량의 2산 2염화물에 5-아미노플루오레세인의 첨가는 다이머 형성을 넘어서는 모노아크릴화 생성물의 우세한 형성을 허용한다. 페놀성 기는 이들 조건하에서 반응하지 않는다. 수성 워크업은 말단 산 염화물을 카르복실산으로 전환시킨다. 이 생성물은 6-카르복시 플루오레세인과 유사하며, 동일한 일련의 단계를 사용하여 그것의 보호된 포스포라미다이트 모노머로 전환된다(반응식 3). 많은 상업적으로 입수가능한 2산 2염화물 및 SOCl ₂ 또는 염화 아세틸을 사용하여 2산 염화물로 전환될 수 있는 2산이 있다. 이 방법은 제 2의 질량 변경제가 사용된다는 점에서 매우 매력적이다. 이와 같이, 10개의 상업적 변성 포스포라미다이트 및 10개의 2산 2염화물 및 10개의 아미노 알콜에 접근할 수 있다면, 1000개의 상이한 eTag 리포터의 가능성이 있다. 많은 상업적인 2산 2염화물 및 아미노 알콜이 있다(표 3). 이들 합성 접근법은 이상적으로 조합 화학에 적합하게 된다.

치환된 아릴기가 질량- 및 전하-변경 영역으로 모두 작용될 수 있다(표 4). 다양한 작용기가 방향족 기, 예를 들어 페닐 위에서 치환되어 eTag 리포터에 질량 및 전하를 제공할 수 있다. 아릴기는 말단기일 수 있으며, 이 경우 단지 1개의 연결 작용기만이 필요하고, 그래서 자유 히드록실기는 아세틸화되거나, eTag 리포터 사슬에 존재하는 히드록실에 측쇄로서 부착되거나, 또는 2개의 작용기, 예를 들어 포스파이트 에스테르 형성에 사용할 수 있는 페놀성 히드록실 및 다른 치환체, 예를 들어 하전되거나 또는 하전되지 않을 수 있는 할로, 할로알킬, 니트로, 시아노, 알콕시카르보닐, 알킬티오 등을 가질 수 있다.

또한, 여러 가지의 말레이미드 유도된 eTag 리포터가 합성되었다. 이들 화합물은 이어서 5'-티올 장식된 DNA 서열에 바이오콘쥬게이트되었고, 5'-뉴클레아제 분석되었다. 절단에 의해 형성된 종을 표 5에 나타낸다.

eTag 리포터는 결합 화합물에 연결하기 위해 한 단부에 적합한 작용기를 가지도록 조립될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 대해서, 특히 올리고뉴클레오티드가 합성된 후, 5' 또는 3'인 올리고뉴클레오티드 사슬에 결합하기 위해 연결 부위에 포스포라미다이트 또는 포스페이트 에스테르를 가질 것이나, 고체 지지체 위와 차단기가 제거되기 전에도 역시 그럴 것이다. 말레이미드와 티올, 또는 아미노와 카르복시, 또는 환원성 아미노화 조건하에서의 아미노와 케토 같이, 올리고뉴클레오티드 말단에 eTag 리포터의 작용기와 특이적으로 반응하는 작용기를 가지는 것과 같은, 올리고뉴클레오티드와 eTag 리포터를 연결시키는 다른 기술이 존재하지만, 포스포라미다이트 부가가 바람직하다. 펩티드-결합 화합물에 대해서, 여러 가지 작용기가 사용될 수 있으며, 대부분 올리고뉴클레오티드 작용기를 사용하지만, 포스포라미다이트 화학이 때로 적합할 수 있다. 따라서, 카르복시, 아미노, 히드록시 및 티올과 같은 보통 펩티드에 존재하는 작용기가 공유 결합을 형성하기 위한 반응성 작용기의 표적일 수 있다.

eTag 리포터 표지된 핵산 결합 화합물을 제조하는데 있어 특히 관심의 것은 고체 지지체 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성의 부분으로서 eTag 리포터를 조립하는 것이다. 이 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 사슬의 5' 또는 3' 위치, 통상 5' 위치에 다음의 계속하는 포스페이트를 부착시킨다. 부가된 포스포라미다이트는 중성 뉴클레오티드 또는 비중성 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 포스포라미다이트 화학 대신에 티오 유사체, 아미노산 유사체 등과 같은 다른 종류의 링커를 사용할 수 있다. 또한, 치환된 뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 이 경우 질량-변경 영역 및/또는 전하-변경 영역이 뉴클레오티드에 부착될 수 있거나, 또는 리간드가 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 이 방식에서, 포스포라미다이트 결합은 eTag 리포터의 영역을 포함하도록 부가되며, 이로써 올리고뉴클레오티드의 합성이 완료될 때, eTag 리포터 영역의 부가를 계속하여 분자를 완성한다. 편리하게, 한 단부에 포스포라미다이트 또는 포스페이트 에스테르를 갖는 상이한 영역에 대한 각각의 빌딩블록 및 차단된 작용기가 제공될 것이며, 여기에서 자유 작용기, 주로 히드록실이 포스포라미다이트와 반응할 수 있다. 한 부위에 포스포라미다이트를 가지고, 다른 부위에 보호된 히드록실을 가지는 상이한 영역을 위한 분자를 사용함에 의해, eTag 리포터가 말단 영역이 보호된 히드록실을 필요로 하지 않을 때까지 조립될 수 있다.

합성의 예는 디올을 사용하는 것일 것이며, 예를 들어 2 내지 3개 탄소 원자의 알킬렌을 갖는 알킬렌 디올, 폴리알킬렌 디올이나, 알킬렌 아민 또는 폴리(알킬렌 아민) 디올을 사용하며, 여기에서 알킬렌은 2 내지 3개 탄소 원자이고, 질소가 예를 들어 차단기 또는 1 내지 6개 탄소 원자의 알킬기로 치환되며, 여기에서 한 디올은 디메틸트리틸기와 같은 편리한 보호기로 차단된다. 이 기는 질량-변경 영역으로 사용할 수 있고, 아미노기를 가지면 전하-변경 영역으로도 사용할 수 있다. 원한다면 질량 변경제가 포스포라미다이트 화학을 통해 연결되는 빌딩블록을 사용함에 의해 조립될 수 있다. 이 방식에서 전하 변경제가 질량 변경제 사이에 산재될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, n 단위를 갖는 일련의 폴리에틸렌 옥시드 분자를 제조할 수 있다. 많은 음전하를 도입하기 원하는 경우에, 작은 폴리에틸렌 옥시드 단위를 사용할 수 있고, 포스페이트 단위에 의해 연결된 복수의 폴리에틸렌 옥시드 단위를 가짐에 의해 질량 및 전하-변경 영역을 조립할 수 있다. 또는 달리, 큰 스페이서를 사용함으로써 더 적은 포스페이트기가 존재할 것이며, 그래서 큰 질량 차이 없이 질량 대 전하 비에 큰 차이를 가질 것이다.

사용되는 화학은 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 종래의 화학이며, 이 경우 뉴클레오티드 이외의 빌딩블록이 사용되지만, 반응은 종래의 포스포라미다이트 화학이며 차단기는 종래의 디메톡시트리틸기이다. 물론 자동 합성기와 양립가능한 다른 화학이 사용될 수도 있으나, 과정에 추가의 복잡성을 더할 이유가 없다.

펩티드에 대해서, eTag 리포터는 연결기의 화학 및 펩티드 결합 화합물의 작용기의 이용성에 따라서 연결될 것이다. 예를 들어, 표적 화합물에 특이적인 Fab 단편에 있어 티올기가 티오에테르 형성을 위해 활성 올레핀, 예를 들어 말레이미드를 사용하는데 이용가능할 것이다. 리신이 이용가능한 경우 물에서 반응할 수 있는 활성화된 에스테르, 예를 들어 니트로페닐 에스테르 또는 펜타플루오로페닐 에스테르, 또는 카르보디이미드 및 반-에스테르 카르본산 처럼 혼합 무수물을 사용할 수 있다. 문헌에 콘쥬게이션에 대한 광범한 화학이 있으며, 그래서 각 특이적 상황에 대해서 문헌에 콘쥬게이션에 대한 광범한 전례가 있다.

일단 eTag 리포터와 콘쥬게이트된 결합 화합물이 제조되면, 그것은 많은 상이한 분석에 사용될 수 있으며 이 중 대부분은 이미 논의되었다. 샘플은 세포용해, 단백질 및 지질로부터의 핵산 분리 및 그 반대, 및 상이한 부분의 부화를 사용하여 프로세스될 수 있다. 핵산 관련 측정에 대해서, DNA의 공급원은 어떤 유기체, 원핵 및 진핵 세포, 조직, 환경 샘플 등일 수 있다. DNA 또는 RNA는 종래의 수단에 의해 분리될 수 있고, RNA는 역번역될 수 있고, DNA는 PCR 처럼 증폭될 수 있고, 프라이머는 후속 프로세싱에 사용되는 리간드와 함께 사용될 수 있고, DNA는 제한 효소를 사용하여 단편화될 수 있고, 특이적 서열은 지지체에 결합된 동종 서열을 사용하여 농축 또는 제거될 수 있다. 단백질은 침전, 추출 및 크로마토그래피를 사용하여 분리될 수 있다. 단백질은 개별 단백질로 존재하거나 또는 세포소기관, 세포, 바이러스 등과 같은 다양한 응집체에 조합될 수 있다. 일단 표적 화합물이 예비적으로 처리되고, 그후 샘플이 eTag 리포터 표적화 결합 단백질과 조합될 수 있다.

핵산 샘플에 대해서, 프로세싱 후에 표적 서열에 대한 eTag 리포터의 프로브 혼합물이 필요에 따라 다른 시약과 함께 혼성화 조건하에서 샘플과 조합될 것이다. 반응이 이종성인 경우, 표적 서열은 eTag 리포터가 결합된 혼성체를 격리시키기 위해 상호 결합 구성원에 결합하는 리간드를 가질 것이다. 이 경우 eTag 리포터 표지된 프로브를 가지는지에 관계 없이 리간드를 지니는 모든 DNA 샘플이 격리될 것이다. 샘플을 격리시키고, 승온에서의 세척, 염농도, 유기 용매 등을 사용하여 프로브 서열에 기초한 정해진 긴축도하에서 비-특이적 결합 eTag 리포터 표지된 프로브를 제거한 후, eTag 리포터가 분석용 전기영동 완충용액으로 유리된다.

동종성 분석에 대해서, 샘플, eTag 리포터 표지된 프로브 혼합물 및 보조 시약이 연결 영역의 절단을 지원하는 반응 혼합물에서 조합된다. 이 혼합물은 혼합물의 다른 성분으로부터 eTag 리포터를 분리하도록 프로세스된다. 그후, eTag 리포터 부화를 가지거나 또는 가지지 않는 혼합물은 전기영동 장치, 통상 미소유체 또는 모세관 전기영동 장치 및 전기영동 분리에 필요한 변성 배지로 옮겨질 수 있다. 무손상 eTag 리포터 분자를 분리 채널로부터 제거하기 원하는 경우, 리간드가 eTag 리포터에 결합되며 이것은 eTag 리포터가 유리되는 때 유리되지 않는다. 또는 달리, eTag 리포터의 반대 전하를 갖는 상호 결합 구성원을 첨가함으로써 전체 전하가 eTag 리포터의 전하에 반대로 되고, 이들 분자는 유리된 eTag 리포터 분자로부터 반대 전극을 향해 이동할 것이다. 예를 들어, 바이오틴 및 스트렙토아비딘을 사용할 수 있는데, 이 경우 스트렙토아비딘이 양전하를 지닌다. 올리고뉴클레오티드의 경우, eTag 리포터 표지가 적어도 2개의 뉴클레오티드에 결합될 것이며, 여기에서 절단이 2개 뉴클레오티드 사이에서 일어나서, 바이오틴으로 표지된 디뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드와 함께 eTag 리포터가 유리된다(eTag 리포터는 바이오틴화된 뉴클레오티드 없이 유리될 것이다). 펩티드 분석물질의 경우, 리간드가 펩티드 분석물질과 함께 잔존하는 부위에서 절단을 가질 것이다. 예를 들어, 메티오닌의 메틸기가 치환된 eTag 리포터를 가질 수 있다. 변성 메티오닌의 피라졸론을 사용하여 이용가능한 리신에 결합시킬 수 있다. 피라졸론의 아미노기는 바이오틴으로 치환될 것이다. 그후, 절단이 시아노겐 브로마이드를 사용하여 달성되어 eTag 리포터를 유리시키지만, 바이오틴은 펩티드 및 결합 구성원으로부터 유리되지 않은 어떤 eTag 리포터와 함께 잔존할 것이다. 그후, 아비딘을 사용하여 극성을 변화시키거나 또는 결합 화합물에 콘쥬게이트된 eTag 리포터를 격리시킨다.

전기영동에 의한 eTag 리포터의 분리는 종래의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,750,015; 5,866,345; 5,935,401; 6,103,199 및 6,110 ,343 및 WO 98/5269 및 거기에 인용된 참고자료 참조. 또한, 샘플은 종래의 방식으로 질량분광법에 대해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,965,363; 6,043,031; 6,057,543 및 6,111,251 참조.

편의를 위해, eTag 리포터의 인시투 제조를 위한 빌딩블록을 포함하는 키트가 제공될 수 있거나, 또는 키트가 결합 화합물에 직접 결합하는 eTag 리포터를 조립한다. 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 eTag 리포터를 인시투 제조하기 위해서, 포스포라미다이트 또는 포스페이트를 제공할 것이며, 여기에서 에스테르는 특히 1 내지 3개 탄소 원자의 알킬기, 및 시아노에틸기, 포스포라미다이트에 대해서는 디알킬아미노를 포함할 것이고, 여기에서 알킬기는 1 내지 4개 탄소 원자이고, 나머지 기는 히드록시로 보호될 것이며, 여기에서 보호기는 올리고뉴클레오티드 합성에 공통되는 것, 예를 들어 디메톡시트리틸일 것이다. 다수의 eTag 리포터, 즉 20개 이상에 대해서, 1개 키트는 질량-변경 영역 및 전하-변경 영역을 각각 적어도 3개 공급할 것이며, 이 각각은 적어도 포스페이트 연결기 및 보호된 히드록실을 가진다. 2개의 작용기는 2개 이상의 원자, 통상 약 60개 미만의 원자에 의해 분리될 수 있으며, 비시날(αβ 내지 αω)일 수 있다. 화합물의 성질은 이전에 논의되었다. 가장 단순한 경우에, 아인산 유도체가 전하-변경 영역으로 작용할 것이며, 그래서 질량-변경 영역 및 전하-변경 영역이 단일 기로서 부가될 것이다. 게다가, 적어도 2개의 검출가능한 영역을 가질 것이며, 이것은 포스페이트 링커 및 합성의 목적을 위해 보호된 다른 작용기를 갖는 형광물질일 것이다. 또는 달리, 검출가능한 영역이 연결에 사용될 수 있는 2개의 작용기의 존재를 허용하는 검출 영역 말단 영역을 가지는 대신에, 나머지 영역 중 하나가 말단 영역으로 작용할 수 있다. 또한, 영역들 중 하나가 편리하게 올리고뉴클레오티드 사슬에 직접 연결하기 위해 모노- 또는 디-뉴클레오티드에 연결될 수 있으며, 이 경우 절단은 eTag 리포터에 부착된 뉴클레오티드의 3' 부위에서 일어날 것이다. 트리- 또는 테트라-치환된 기를 사용함에 의해, 에너지 전달쌍을 제공하는 검출가능한 영역을 제공할 수 있다. 단지 1개 또는 2개의 상이한 에너지 전달 제제를 가질 것이 요구되지만, 상이한 eTag 리포터의 수를 크게 확대시키기 위해 복수의 유리 제제를 가질 수도 있다.

유용한 다른 시약은 리간드-변경 뉴클레오티드 및 그것의 리셉터를 포함한다. 리간드와 리셉터는 바이오틴과 스트렙트/아비딘, 리간드와 항리간드, 예를 들어 디곡신 또는 그것의 유도체와 항디곡신 등을 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 콘쥬게이트된 리간드를 가짐에 의해, eTag 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 리셉터를 갖는 그것의 표적을 격리시키고, 혼성화되지 않은 eTag 리포터 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드를 제거한 후, 결합된 eTag 리포터를 유리시키거나 또는 반대로 하전된 리셉터를 결합시켜서, eTag 리포터를 갖는 리간드-리셉터 복합체가 반대 방향으로 이동한다.

eTag 리포터를 제조하는 경우 추가의 연결 영역이 있을 것이며, 이것은 상기 설명에서 아인산 유도체 또는 모노- 또는 디-뉴클레오티드 단위 아인산 유도체에 의해 작용된다. 이들 eTag 리포터에 대해서, 포스페이트 결합에 제한될 필요는 없으나, 다른 편리한 화학, 특히 자동화된 화학을 사용할 수 있다. 따라서, 아인산 및 보호된 알콜 대신에, 카르복시 및 알콜 또는 아미노, 활성화된 올레핀 및 티올, 특히 환원성 아민화를 갖는 아미노 및 옥소-카르보닐, 에테르를 형성하기 위한 활성 할라이드 또는 또 다른 히드록시를 갖는 히드록시 등을 사용할 수 있다. 동일하거나 또는 상이한 작용기를 갖는 2작용성인 화합물을 사용할 수 있으며, 이 경우eTag 리포터를 생성하는 2산 및 디올 또는 히드록시산 또는 고리 에스테르를 가질 수 있다. 이들 종류의 화합물에 대한 수많은 예가 이미 설명되었으며 문헌에 잘 공지되어 있다. 모노머 및 조건을 적합하게 선택함에 의해, 특정한 차수의 반응, 즉 반응하는 모노머의 수를 선택할 수 있거나, 또는 상이한 이동도에 의해 혼합물을 분리할 수 있다.

수착, 흡착 및/또는 흡착에 기초한 분리에 대해서, 차이점을 제공할 수 있는 eTag 리포터의 성질은 비교적 단순할 수 있다. 지방족 화합물, 방향족 화합물 및 그것의 할로 유도체와 같은 조성의 차이를 사용함에 의해, 기체 크로마토그래피, 전자 포착 또는 음전성 원자가 존재할 때의 음이온 질량분광법을 사용하여 측정할 수 있다. 이 방식에서, 유리가능한 링커에 결합된 eTag 리포터로서 탄화수소 또는 할로-치환된 탄화수소를 사용할 수 있다. 미국 특허 번호 5,565,324 및 6,001,579를 참조하며, 이것은 구체적으로 절단가능한 기 및 검출가능한 기를 고찰하는 관련 설명에 관한 참고자료로서 수록된다.

키트는 이동도에 의해 분리될 수 있는 적어도 10개, 통상 적어도 20개, 주로 적어도 50개 이상의 상이한 eTag 리포터를 가지기 위해 적어도 2개의 검출가능한 영역 및 충분한 시약을 포함할 것이다.

20개의 상이한 eTag 리포터에 대해서, 단지 5개의 상이한 질량-변경 영역, 1개의 포스페이트 결합, 및 4개의 상이한 검출가능한 영역만이 필요하다. 120개의 eTag 리포터에 대해서, 단지 10개의 상이한 질량-변경 영역, 3개의 상이한 전하-변경 영역, 및 4개의 상이한 검출가능한 영역만이 필요하다. 500개의 상이한 eTag리포터에 대해서, 단지 25개의 상이한 질량-변경 영역, 5개의 상이한 전하-변경 영역, 및 4개의 상이한 검출가능한 영역만이 필요하다.

당해 발명이 사용될 수 있는 다양한 방식의 리스트가 다음의 표에 제공되나, 이것은 예시를 위한 것이며 다른 것에 배타적이지 않다.

다음 실시예들은 예시의 방식으로 제공되며 제한하는 방식은 아니다.

변성 플루오레세인 포스포라미다이트의 합성 제조

피발로일 보호된 카르복시플루오레세인:

50mL 둥근바닥 플라스크에 5(6)-카르복시플루오레세인(0.94g, 2.5mmol), 탄산칼륨(1.0g, 7.5mmol) 및 건성 DMF 20mL를 두었다. 반응물을 10분간 질소하에서 교반한 후, 주사기를 통해 무수 트리메틸아세트산(1.1mL, 5.5mmol)을 가했다. 반응물을 하룻밤 실온에서 교반한 후, 여과하여 과잉의 탄산칼륨을 제거하고 마지막으로 50mL의 10% HCl에 부었다. 끈적끈적한 황색 고체가 용액에서 침전했다. 수용액을 가만히 따라서 버리고 잔류 고체를 메탄올 10mL에 용해시켰다. 10% HCl에이 용액을 적가하여 미세한 황색 침전물을 얻었고, 이것을 여과하고 공기 건조하여 회색이 도는 흰색 고체(0.88g, 62%)를 얻었다. TLC(45:45:10 Hxn, EtOAc, MeOH)

보호된 피발로일 카르복시플루오레세인의 NHS 에스테르.

200mL 둥근바닥 플라스크에 보호된 카르복시플루오레세인(2.77g, 5.1mmol) 및 디클로로메탄 50mL를 두었다. N-히드록시숙신이미드(0.88g, 7.6mmol) 및 디시클로헥실카르보이미드(1.57g, 7.6mmol)를 가하고 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반했다. 그후, 반응물을 여과하여 침전된 디시클로헥실 우레아 부생성물을 제거하고, 진공에서 용매를 대략 10mL까지 줄였다. 생성된 황색-오랜지색 고체를 냉각하면서 헥산을 적가하여 헥산으로 바수고, 여과하고 공기 건조하여 3.17g(95%)의 생성물을 얻었다. TLC(45:45:10 Hxn, EtOAc, MeOH)

알콜.

100mL 둥근바닥 플라스크에 NHS 에스테르(0.86g, 1.34mmol) 및 디클로로메탄 25mL를 두었다. 이 용액을 질소하에서 교반한 후, 주사기를 통해 아미노에탄올(81㎕, 1당량)을 가했다. 반응물을 TLC(45:45:10 Hxn, EtOAc, MeOH)에 의해 모니터링하여 10분 후 반응이 완료된 것을 알았다. 그후, 진공에서 디클로로메탄을 제거하고, 잔류물을 EtOAc에 용해시켜 여과하고 실리카겔 1g 위에 흡수시켰다. 이것을 50g 실리카 칼럼 위에 놓고 Hxn:EtOAc:MeOH(9:9:1)로 용리하여 125mg(20%)의 깨끗한 생성물을 얻었다.

포스포라미다이트.

알콜 125mg을 함유하는 10mL 둥근바닥 플라스크에 디클로로메탄 5mL를 가했다. 디이소프로필 에틸아민(139㎕, 0.8mmol)을 주사기를 통해 첨가했다. 무색 용액이 담황색으로 변했다. 2-시아노에틸 디이소프로필클로로포스포라미다이트(81㎕, 0.34mmol)를 주사기를 통해 가하여 이 용액이 바로 무색으로 되었다. 1시간 후에 TLC(45:45:10 Hxn:EtOAc:TEA)가 2개의 가깝게 용리된 이성질체의 형성과 함께 반응이 완료되었음을 나타냈다. 물질을 2개 이성질체를 모두 함께 분리하는 실리카 칼럼(45:45:10 Hxn:EtOAc:TEA) 상에서 정제하여 130mg (85%)을 얻었다.

카르복실산.

4mL 바이알에 12-아미노도데칸산(0.1g, 0.5mmol) 및 피리딘 2mL를 두었다. 이 현탁액에 주사기를 통해 클로로트리메틸 실란(69㎕, 1.1당량)을 가했다. 모든 물질을 NHS 에스테르(210mg, 0.66당량)에 용해(10분)시킨 후 가했다. 반응물을 하룻밤 실온에서 교반한 후, 물에 부어서 황색 고체를 침전시키고, 이것을 여과하고 물로 세척하고 공기 건조시켰다. TLC(45:45:10 Hxn:EtOAc:MeOH)는 2개 이성질체의 혼합물을 나타냈다.

나머지 합성에 대한 일반적 과정.

상술된 형성된 카르복실산을 디클로로메탄 중의 1.5당량의 N-히드록시숙신이미드 및 디시클로헥실카르보이미드를 사용하여 NHS 에스테르 형성에 의해 활성화시켰다. 결과의 디시클로헥실우레아를 여과한 후, 1당량의 변화하는 아미노 알콜로 처리하는 것은 아미드 결합을 형성하여 말단 알콜을 만들 것이다. 상술된 표준 조건을 사용한 포스피틸화는 포스포라미다이트를 제공할 것이다.

바이오틴화된 2'-디옥시시토신 포스포라미다이트의 합성; 반응식 1

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-2'-디옥시우리딘(1)의 합성:

2'-디옥시우리딘(4gm, 17.5mmol) 및 이미다졸(3.47gm, 52.5mmol)을 건성 DMF 30mL에 용해시키고, 이 용액을 교반하면서 실온에서 t-부틸디메틸-실릴 클로라이드 (7.87gm, 52.5mmol)를 가했다. 3시간 후 실리카겔 상의 TLC(10% MeOH+90% CH ₂ Cl ₂ )는 모든 출발 물질이 더 높은 R _f 를 갖는 새로운 화합물로 전환되었음을 나타냈다. 이 용액을 작은 부피로 농축한 후, 약 200mL의 에테르를 가하고 NaCl 포화 수용액으로 3번 세척했다. 유기층을 무수 Na ₂ SO ₄ 로 건조시키고, 여과물을 증발시켜 무색의 고무질 물질을 얻었고, 이것은 흰색 고체 생성물(8gm, 100%)로 전환된다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-N ⁴ -(1,2,4-트리아졸로)-2'-디옥시시티딘(2)의 합성:

1,2,4-트리아졸(19.45gm, 282mmol)을 0℃에서 무수 CH ₃ CN 300mL에 현탁시키고, POCl ₃ 8mL, 다음에 트리에틸아민 50mL를 5분내에 서서히 가했다. 1시간 후에 3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-2'-디옥시우리딘(1)(9gm, 19.7mmol)을 200mL의 건성 CH ₃ CN에 용해시키고, 20분에 걸쳐서 반응물에 가했다. 실온에서 16시간 동안 반응물을 교반한 후, TLC(100% 에테르)는 모든 출발 물질이 더 낮은 R _f 를 갖는 새로운 화합물로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 여과하고, CH ₃ CN의 부피를 줄이고, 에틸 아세테이트로 희석하고, NaHCO ₃ 포화 수용액으로 세척한 후, NaCl 포화 수용액으로 2번 세척했다. 유기층을 무수 Na ₂ SO ₄ 에서 건조시키고, 용매를 증발시키고, 톨루엔으로부터 공동 증발시켜 황색 고체 생성물(10gm. 100%)을 얻었다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-N ⁴ -(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노)-2'-디옥시시티딘(3)의 합성:

4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(10.44gm, 47.4mmol)을 디옥산 100mL에 용해시킨 후, 3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-4-(1,2,4-트리아졸로)-2'-디옥시시티딘 (2)(8.03gm, 15.8mmol)을 디옥산 200ml에 용해시키고(약 50℃까지 가열하고 냉각시켜 실온으로 만들었다), 실온에서 격렬하게 교반중인 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 용액에 10분내에 적가했다. 실리카겔 상의 TLC는 모든 출발 물질이 더 낮은 Rf를 갖는 새로운 생성물로 전환되었음을 나타냈고, 결과의 혼합물을 증발시켜 건조한 상태로 만들었다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고 5% 중탄산 나트륨 용액 및 염화 나트륨 포화 용액으로 2번 세척했다. 유기층을 황산 나트륨에서 건조시키고 여과하고 건조한 상태로 증발시켜 황색의 고무질 생성물(7.87gm)을 얻었다. 이 생성물을 1% 트리에틸아민을 갖는 디클로로메탄에 용해된 0 내지 10% 구배의 메탄올로 용리하는 실리카겔 칼럼에서 정제했다. 생성물은 누르스름한 고무로서 얻었다(5.66gm, 54%%). 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(4)의 합성:

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노)-2'-디옥시시티딘(3)(2.657gm, 4.43mmol) 및 바이오틴-NHS 에스테르(1.814gm, 5.316 mmol)를 건성 DMF 20mL에 용해시키고 트리에틸아민 1mL를 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, DMF를 모두 증발시켜 반응을 멈추고 황색 고무 물질(4.36gm)을 얻었다. 이 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, NaCl 포화 용액으로 3번 세척하고, 황산 나트륨에서 건조시키고 건조한 상태로 증발시켰다. 실리카겔 상의 TLC(5% MeOH+1% TEA+94% CH ₂ Cl ₂ )는 R _f 가 더 높은 새로운 생성물의 형성을 나타냈다. 이 생성물을 (99% CH ₂ CL ₂ +1% TEA)에서 (1% MeOH+1% TEA+98% CH ₂ Cl ₂ )를 사용하는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 황색의 거품이 이는 생성물 (2.13gm, 60%)을 얻었다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(5)의 합성:

3',5'-O-디-t-부틸디메틸실릴-4-N-(4,7,10-트리옥사-l-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(4)(1.6gm, 1.8mmol)을 건성 THF 50mL에 용해시킨 후, THF 중의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 약 5.5mL를 실온에서 교반하면서 2분내에 가했다. 3시간 후에 실리카겔 상의 TLC(10% MeOH+1% TEA+89% CH ₂ Cl ₂ )는 더 낮은 R _f 를 갖는 새로운 생성물이 형성되었음을 나타냈다. 용매를 증발시켜 황색의 유질 생성물을 얻었다. (99% CH ₂ Cl ² +1% TEA)에서 (7% MeOH+1% TEA+92% CH ₂ Cl ₂ )를 사용하여 용리하는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 고무질의 무색 생성물(1.14gm, 97%)을 얻었다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘의 바이오틴(6)의 t-부틸벤조일화:

4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(5)(14.14gm, 21.5mmol)을 건성 피리딘 100mL에 용해시켰다. 클로로트리메틸 실란(11.62gm, 107.6mmol)을 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. 4-t-부틸벤조일 클로라이드(5.07gm, 25.8mmol)를 가하고, 혼합물을 실온에서 또 2시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 얼음조에서 냉각시키고, 물 50mL 및 28% 암모니아 수용액 50mL를 가하여 반응을 멈추었다. 이 용액을 실온에서 20분간 계속 교반한 후, 고진공에서 증발시켜 건조한 상태로 만들고, 마지막으로 톨루엔으로부터 2번 공동 증발시켰다. 이 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 5% 중탄산 나트륨 수용액으로 2번 추출했다. 유기층을 황산 나트륨에서 건조시키고, 건조한 상태로 증발시키고, 디클로로메탄에 다시 용해시켜 실리카겔 칼럼에 적용했다. 칼럼을 디클로로메탄에 용해된 0 내지 10% 구배의 메탄올로 용리하여, 흰색 거품(9.4gm, 53.5%)으로서 생성물얼 얻었다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(7)의 합성:

화합물(6)(10.82gm, 13.3mmol)을 건성 피리딘으로부터 2번 공동 증발시킨 후, 피리딘(100mL)에 용해시키고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(DMT-Cl)(6.76gm, 19.95mmol)를 가하고, 결과의 혼합물을 3시간 동안 교반했다. TLC(10% MeOH+1% TEA+89% CH2Cl2)는 더 높은 Rf를 갖는 새로운 생성물의 형성을 나타냈으며, 일부 출발 물질이 반응하지 않고 남아 있었고, 그후 또 다른 양의 DMT-Cl(2gm)을 가하여 2시간 동안 계속 교반했다. 에탄올을 가하여 반응을 멈추고 혼합물을 15분간 교반했다. 건조한 상태로 증발시키고 톨루엔으로부터 공동 증발시킨 후, 이 물질을 디클로로메탄에 용해시켰다. 유기층을 5% 중탄산 나트륨 수용액으로 2번 세척하고, 황산 나트륨에서 건조시키고, 증발시켜 건조한 상태로 만들었다. 생성물을 디클로로메탄/1% TEA에 용해된 0 내지 5% 구배의 메탄올을 사용하는 실리카겔 칼럼 상에서 정제했다. 생성물을 흰색 거품(4.55gm, 31%)으로서 얻었다. 이 생성물을 HNMR및 ES-MS로 확인했다.

3'-O-[(디이소프로필아민)(2-시아노에톡시)포스피노)]-5'-O-(4,4'디메톡시트리페닐메틸)-4-N-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-2'-디옥시시티딘(8)의 합성:

5'-DMT-바이오틴-dC(7)(507mg, 0.453mmol)을 건성 아세토니트릴(30ml) 및 디클로로메탄(5ml)에 용해시킨 후, 디이소프로필아민(73mg, 0.56mmol), 2-시아노에틸 N,N,N'N'-테트라이소프로필포스판(214mg, 234ul, 0.7mmol) 및 테트라졸(1.15ml, 0.52mmol)을 가하고, 혼합물을 실온에서 질소하에서 교반했다. 2시간 후에 실리카겔 상의 TLC(45%/45%/5%/5%: 에틸 아세테이트/디클로로메탄/트리에틸아민/메탄올)은 단지 약 30%의 생성물만이 형성되었고, 약 70%의 출발 물질이 반응하지 않았음을 나타냈다. 대부분의 출발 물질이 전환되고 단지 약 5%만이 반응하지 않고 남을 때까지 더 많은 시약을 가했다. 용매를 증발시켜 건조한 상태로 만들고, 건성 디클로로메탄에 용해시키고, 중탄산 나트륨 용액(5%), 포화 간수 용액으로 세척한 후, 유기층을 황산 나트륨에서 건조시키고, 증발시켜 건조한 상태로 만들었다. (48%/48%/4%: 에틸 아세테이트/디클로로메탄/트리에틸아민)에서 (47%/47%/5%/1%: 에틸 아세테이트/디클로로메탄/트리에틸아민/메탄올)을 사용하여 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피했다. 바람직한 생성물을 무색의 고무질 생성물(406mg, 70%)로서 얻었다. 이 물질을 건성 벤젠과 디클로로메탄의 혼합물로부터 3번 공동 증발시킨 후, DNA 합성에 사용하기 전에 26시간 동안 진공하에서 P ₂ 0 ₅ 및 NaOH 펠렛을 함유하는 마른 상태로 유지했다.

바이오틴화된 2'-디옥시아데노신 포스포라미다이트; 반응식 2

8-브로모-2'-디옥시아데노신의 합성:

2'-디옥시아데노신(7gm. 25.9mmol)을 약 50℃까지 가온하여 나트륨 아세테이트 완충액(150, 1M, pH 5.0)에 용해시킨 후, 30℃까지 냉각시키고, 다음에 동일한 완충액 100mL 중의 브롬 3mL를 반응물에 실온에서 15분간 적가했다. 6시간 후에 실리카겔 상의 TLC(20% MeOH, CH ₂ Cl ₂ )는 모든 출발 물질이 새로운 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 교반하면서 약간의 나트륨 메타비술파이트(Na ₂ S ₂ 0 ₅ )를 가하여 반응물을 흰색 용액으로 탈색시켰고, NaOH(1M 용액)을 가하여 반응물의 pH를 중화시켰다. 반응 혼합물을 16시간 동안 4℃(냉장고)에서 유지시켰다. 다음날 고체 물질을 여과하고, 찬물로 세척한 후 아세톤으로 세척하여 고체 황색 가루 생성물 (5.75gm. 64%)을 얻었다. 이 생성물의 구조를 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-브로모-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(1)의 합성:

8-브로모-2'-디옥시아데노신(7.7gm, 22.17mmol)을 건성 피리딘으로 공동 증발시켜 건조시키고, 고체를 건성 피리딘 200mL에 현탁시킨 후, 4,4'-디메톡시트리페닐메틸클로라이드(DMT-Cl)(9gm, 26.6mmol)를 가했다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후에 실리카겔 상의 TLC는 새로운 생성물이 형성된 것과 일부 출발 물질이 반응하지 않은 것을 나타냈다. 또 다른 양의 DMT-Cl(3gm)을 첨가하고 실온에서 2시간동안 교반시켰다. TLC가 모든 출발 물질이 더 높은 R _f 를 갖는 새로운 생성물로 전환되었음을 나타냈을 때, 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 트리메틸클로로실란 (12.042gm, 14ml, 110.85mmol)을 냉각하면서 가하고, 40분 후에 교반하면서 벤조일 클로라이드(15.58gm, 12.88ml, 110.85mmol)를 유사하게 가했다. 반응물을 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 찬물(50mL)을 서서히 가하여 반응물을 급냉시킨 후, 진한 암모니아(30%, 50ml)를 가했다. 30분 후에 반응 혼합물을 증발시켜 건조한 상태로 만들엇다. 잔류물을 물에 용해시키고, 용액을 에틸 아세테이트로 3번 추출하고, 유기층을 중탄산 나트륨 포화 용액으로 세척한 후 간수로 세척했다. 유기상을 황산 나트륨에서 건조시키고 증발시켜 건조한 상태로 만들었다. 생성물을 실리카 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 누르스름한 고체 생성물(6.79gm, 41.6% )을 얻었다. 이 생성물의 구조를 H NMR 및 ES-MS로 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-브로모-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'- 디옥시아데노신의 합성:

6N-벤조일-8-브로모-5'-O-(4,4'-디메녹시트리틸)-2'-디옥시아데노신(1)(14gm, 19mmol) 및 이미다졸(1.94gm, 28.5mmol)을 건성 DMF 100ml에 가하고, 실온에서 용액을 교반하면서 t-부틸디메틸-실릴 클로라이드(4.3gm, 28.5mmol)를 가했다. 4시간 후에 실리카겔 상의 TLC(2.5% MeOH, CH ₂ Cl ₂ )는 모든 출발 물질이 더 높은 R _f 를 갖는 새로운 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 용액을 작은 부피로 농축한 후, 약 400ml의 에테르를 가하고 NaCl 포화 수용액으로 3번 세척했다. 유기층을 무수Na ₂ S0 ₄ 에서 건조시키고, 여과물을 증발시켜 회색이 도는 흰색 거품의 생성물(16.18 gm, 100%)을 얻었다. H NMR 및 ES-MS로 구조를 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노)-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(2)의 합성:

N'-벤조일-8-브로모-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(8.31gm. 9.7mmol)을 에탄올 200ml에 용해시킨 후, 50℃에서 계속 교반하면서 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민(6.75gm. 6.7ml. 30mmol)을 한번에 가했다. 16시간 후에 TLC는 모든 출발 물질이 더 낮은 R _f 를 갖는 1개의 주 생성물 및 다른 부 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 용매를 증발시켜 건조한 상태로 만들고, 디클로로메탄에 용해시키고, 간수 용액으로 3번 건조시키고, 무수 Na ₂ SO ₄ 에서 건조시키고, 증발시켜 황색의 고무질 물질을 얻었다. (1% TEA+CH ₂ Cl ₂ )에서 (1% TEA+5% MeOH+CH ₂ Cl ₂ )의 칼럼 크로마토그래피로 주 생성물을 정제하여 회색이 도는 흰색의 고무질 물질(4.53gm. 47%)을 얻었다. 이 생성물을 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신의 합성:

N'-벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노)-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(4.53gm. 4.57mmol) 및 바이오틴-NHS 에스테르(3.12gm. 9.13mmol)를 DMF 75ml에 용해시키고, TEA 몇방울을 가하고 반응물을 실온에서 교반했다. 2시간 후에 실리카겔 상의 TLC(5% MeOH+1% TEA+94 CH ₂ Cl ₂ )는 출발 물질보다 극성이 적은 주 생성물의 형성 및 더 낮은 R _f 를 갖는 다른 부수적인 점들을 나타냈다. 용매를 증발시켜 건조한 상태로 만든 후, CH ₂ Cl ₂ 에 용해시키고, NaCl 포화 용액으로 3번 세척하고, 유기층을 건조시키고, 건조한 상태로 증발시켜 황색의 고무질 물질을 남겼다. 이 물질을 용리액으로서 (1% TEA+CH ₂ Cl ₂ )에서 (1% TEA+2.5% MeOH+CH ₂ Cl ₂ )를 사용하는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 정제했다. 생성물을 함유하는 부분을 증발시킨 후 누르스름한 고체 물질(3.16g, 78%)을 얻었고, 이 구조를 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-5'-0-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(3)의 합성:

N'-벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-3'-Ot-부틸디메틸실릴-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(3.16gm, 2.6mmol)을 건성 THF 100ml에 용해시킨 후, 실온에서 교반하면서 THF 중의 테트라부틸암모늄(약 3.25ml, 3.25mmol)을 5분내에 가했다. 8시간 후에 실리카겔 상의 TLC(10% MeOH +1% TEA+89% CH ₂ Cl ₂ )는 더 낮은 R _f 를 갖는 새로운 생성물이 형성되었음을 나타냈다. 용매를 증발시켜 황색 유질 물질을 얻었다. (99% CH ₂ Cl ₂ +1% TEA)에서 (5% MeOH+1%TEA+94% CH ₂ Cl ₂ )로 용리되는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 생성물을 정제하여 흰색의 거품이 이는 생성물(2.86gm, 100%)을 얻었다. 구조를 HNMR 및 ES-MS로 확인했다.

N ⁶ -벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-3'-0-[(디이소프로필아민)(2-시아노에톡시)포스피노)]-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(4)의 합성:

N ⁶ -벤조일-8-(4,7,10-트리옥사-1-트리데칸아미노바이오틴)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-디옥시아데노신(0.959gm, 0.86mmol)을 건성 아세토니트릴(200ml)과 디클로로메탄(50ml)의 혼합물에 용해시키고, 디이소프로필아민(224ul, 1.29mmol)에 이어서 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필포스판(404ul, 1.29mmol) 및 테트라졸(2.6ml, 1.2mmol, 건성 아세토니트릴에 용해된 0.45M 용액)을 가했다. 첨가 및 후속 반응은 실온에서 교반하면서 아르곤하에서 수행했다. 1.5시간 후에 실리카겔 상의 TLC(5% MeOH+5% TEA+45% EA+45% CH ₂ Cl ₂ )는 단지 약 50%의 출발 물질(SM)만이 새로운 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 반응물에 시약을 상기 양과 동일하게 가하고 실온에서 또 2시간 동안 계속 교반했다. TLC는 약 95%의 SM이 더 높은 Rf를 갖는 새로운 생성물로 전환되었음을 나타낸다. 용매를 증발시켜 건조한 상태로 만든 후, 디클로로메탄에 용해시키고, 5% 중탄산염 용액으로 1번 추출한 후 포화 간수 용액으로 추출하고, 다음에 무수 황산 나트륨에서 건조시키고 증발시켜 건조한 상태로 만들었다. 먼저 (10% TEA+45% EA+45% CH ₂ Cl ₂ )를 다음에 (5% TEA+5% MeOH+45% EA+45% CH ₂ Cl ₂ )를 사용하는 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피했다. 생성물을 함유하는 부분을 증발시킨 후 황색의 고무질 물질(774mg)을 얻었다. 이 물질을 건성 벤젠과 디클로로메탄의 혼합물로부터 3번 공동 증발시킨 후, DNA 합성에 사용하기 전에 24시간 동안 진공하에서 P ₂ 0 ₅ 및 NaOH 펠렛을 함유하는 마른 상태로 유지했다.

바이오틴-dC 및 바이오틴-dA를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성:

부위-특이적으로 위치한 바이오틴-dC 및 바이오틴-dA를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성을 완전 자동화된 DNA 합성기 및 상업적으로 입수가능한 완전히 보호된 디옥시뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용하여 CPG 지지체 상에서 수행했다. 모든 이들 올리고뉴크레오티드이 합성은 1.0 및 0.4μmol 스케일에서 수행했다. 바이오틴-dC 및 dA에 대한 커플링 시간은 900초까지 연장했다. 바이오틴-dC 및 dA 포스포라미다이트의 커플링 효율은 96% 이상으로 판명되었다. 바이오틴화된 포스포라미다이트의 커플링 후에 관심의 eTag 리포터를 포함하는 잔존 잔기를 첨가했다. 올리고뉴클레오티드 합성 완료시 그것들을 65℃에서 1시간 동안 진한 암모니아를 사용하여 탈보호했다. 이들 올리고뉴크레오티드를 역상 HPLC로 정제하고 OPC 칼럼으로 탈염한 후 그대로 사용했다.

ABI 394 DNA 합성기 상에서 ACLA1의 합성 제조

6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 포스포라미다이트를 플루오레세인 포스포라미다이트 0.25g 바틀에 무수 아세토니트릴 2.96ml를 가하여 제조하여 0.1M 용액을 얻는다. 다음에, 이 바틀을 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용하여 ABI 394 DNA 합성기 위의 8번 위치에 로딩한다. 나머지 천연 dA ^bZ (0.1M: 0.25g/2.91mL 무수 아세토니트릴), dC ^AC (0.1M: 0.25g/3.24mL 무수 아세토니트릴), dT(0.1M: 0.25g/3.36mL 무수아세토니트릴), dG ^dmf (O.1M: 0.25g/2.81mL 무수 아세토니트릴) 포스포라미다이트 모노머를 유사한 방식으로 1번에서 4번 포트에 로딩한다. 아세토니트릴을 18번 사이드 포트에 로딩하고, 표준 테트라졸 활성제를 9번 포트에 로딩하고, CAP A를 11번 포트에 로딩하고, CAP B를 12번 포트에 로딩하고, 산화제를 15번 포트에 로딩하고, 탈블록 용액을 14번 포트에 로딩한다. 모두 포준 바틀 교환 프로토콜을 사용한다.

DNA 합성에 사용된 표준 시약:

산화제: 0.02M 요오드(MGB 프로브용 0.015)

탈블록: 디클로로메탄 중의 3% 트리클로로아세트산

활성제: 무수 아세토니트릴 중의 1H-테트라졸

HPLC 그레이드 아세토니트릴(0.002% 물)

Cap A: 무수 아세트산

Cap B: N-메틸 이미다졸

다음에, 관심의 표적 서열을 8번 포트로부터 말단 커플링으로 인풋하여 서열의 5'-단부에 ACLA1을 부착시킨다. 다음에, 원하는 스케일(0.2(mol, 1.0(mol,...등)의 DNA가 합성되도록 변형된 사이클을 선택한다. 변형된 사이클은 6-FMA의 어떤 첨가 후에 800초의 추가 대기 단계를 함유한다. 다음에, DNA가 조립되는 지지체를 함유하는 표준 DNA 합성 칼럼을 DNA 합성기의 4개 위치 중 1개에 로딩한다. eTag 리포터를 함유하는 DNA를 다양한 표준 500Å CPG 지지체(Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG. dT-CPG) 뿐만 아니라 3'-바이오틴, 3'-아미노 링커, 및 마이너 그로브 결합종을 함유하는 특수 지지체에서 합성한다.

합성 완료시 칼럼을 합성기로부터 꺼내어 진공하에서 건조시키거나 또는 칼럼을 통해 공기나 질소를 불어넣어 건조시켜 잔류 아세토니트릴을 제거한다. 다음에, 칼럼을 열어서 CPG를 꺼내어 1-드람 바이알에 둔다. 진한 암모니아(2.0ml)를 가하고 바이알을 실링하여 65℃로 설정된 가열 블록에 최소 2시간 동안 둔다. 2시간 후에 바이알을 실온까지 냉각시키고, 그후 암모니아 용액을 파스퇴르 피펫으로 제거하고 1.5mL 에펜드로프 튜브에 둔다. 이 용액을 진공에서 농축하고 HPLC로 정제한다.

ABI 394 DNA 합성기에서 ACLA2의 합성 제조

6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 포스포라미다이트를 플루오레세인 포스포라미다이트 0.25g 바틀에 무수 아세토니트릴 2.96ml를 가하여 제조하여 0.1M 용액을 얻는다. 다음에, 이 바틀을 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용하여 ABI 394 DNA 합성기 위의 8번 위치에 로딩한다. 나머지 천연 dA ^bZ (0.1M: 0.25g/2.91mL 무수 아세토니트릴), dC ^AC (0.1M: 0.25g/3.24mL 무수 아세토니트릴), dT(0.1M: 0.25g/3.36mL무수아세토니트릴), dG ^dmf (O.1M: 0.25g/2.81mL 무수 아세토니트릴) 포스포라미다이트 모노머를 유사한 방식으로 1번에서 4번 포트에 로딩한다. 아세토니트릴을 18번 사이드 포트에 로딩하고, 표준 테트라졸 활성제를 9번 포트에 로딩하고, CAP A를 11번 포트에 로딩하고, CAP B를 12번 포트에 로딩하고, 산화제를 15번 포트에 로딩하고, 탈블록 용액을 14번 포트에 로딩한다. 모두 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용한다. 다음에, 관심의 표적 서열을 8번 포트로부터 말단 커플링 및 서열의 5'-단부에 티미딘의 두번째 커플링으로 인풋하여 ACLA2를 조립한다. 다음에, 원하는 스케일(0.2μmol, 1.0μmol,... 등)의 DNA가 합성되도록 변형된 사이클을 선택한다. 변형된 사이클은 6-FMA의 어떤 첨가 후에 800초의 추가 대기 단계를 함유한다. 다음에, DNA가 조립되는 지지체를 함유하는 표준 DNA 합성 칼럼을 DNA 합성기의 4개 위치 중 1개에 로딩한다. eTag 리포터를 함유하는 DNA를 다양한 표준 500Å CPG 지지체(Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG. dT-CPG) 뿐만 아니라 3'-바이오틴, 3'-아미노 링커, 및 마이너 그로브 결합종을 함유하는 특수 지지체에서 합성한다.

합성 완료시 칼럼을 합성기로부터 꺼내어 진공하에서 건조시키거나 또는 칼럼을 통해 공기나 질소를 불어넣어 건조시켜 잔류 아세토니트릴을 제거한다. 다음에, 칼럼을 열어서 CPG를 꺼내어 1-드람 바이알에 둔다. 진한 암모니아(2.0ml)를 가하고 바이알을 실링하여 65℃로 설정된 가열 블록에 최소 2시간 동안 둔다. 2시간 후에 바이알을 실온까지 냉각시키고, 그후 암모니아 용액을 파스퇴르 피펫으로 제거하고 1.5mL 에펜드로프 튜브에 둔다. 이 용액을 진공에서 농축하고 HPLC로 정제한다.

ABI 394 DNA 합성기에서 ACLA3의 합성 제조

6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 포스포라미다이트를 플루오레세인 포스포라미다이트 0.25g 바틀에 무수 아세토니트릴 2.96ml를 가하여 제조하여 0.1M 용액을 얻는다. 다음에, 이 바틀을 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용하여 ABI 394 DNA 합성기 위의 8번 위치에 로딩한다. 나머지 천연 dA ^bZ (0.1M: 0.25g/2.91mL 무수 아세토니트릴), dC ^AC (0.1M: 0.25g/3.24mL 무수 아세토니트릴), dT(0.1M: 0.25g/3.36mL 무수아세토니트릴), dG ^dmf (O.1M: 0.25g/2.81mL 무수 아세토니트릴) 포스포라미다이트 모노머를 유사한 방식으로 1번에서 4번 포트에 로딩한다. 아세토니트릴을 18번 사이드 포트에 로딩하고, 표준 테트라졸 활성제를 9번 포트에 로딩하고, CAP A를 11번 포트에 로딩하고, CAP B를 12번 포트에 로딩하고, 산화제를 15번 포트에 로딩하고, 탈블록 용액을 14번 포트에 로딩한다. 모두 포준 바틀 교환 프로토콜을 사용한다. 다음에, 관심의 표적 서열을 8번 포트로부터 말단 커플링 및 서열의 5'-단부에 티미딘의 두번째 커플링으로 인풋하여 ACLA3을 조립한다. 다음에, 원하는 스케일(0.2umol, 1.0umol,... 등)의 DNA가 합성되도록 변형된 사이클을 선택한다. 변형된 사이클은 6-FMA의 어떤 첨가 후에 800초의 추가 대기 단계를 함유한다. 다음에, DNA가 조립되는 지지체를 함유하는 표준 DNA 합성 칼럼을 DNA 합성기의 4개 위치 중 1개에 로딩한다. eTag 리포터를 함유하는 DNA를 다양한 표준 500Å CPG 지지체(Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG. dT-CPG) 뿐만 아니라 3'-바이오틴,3'-아미노 링커, 및 마이너 그로브 결합종을 함유하는 특수 지지체에서 합성한다.

합성 완료시 칼럼을 합성기로부터 꺼내어 진공하에서 건조시키거나 또는 칼럼을 통해 공기나 질소를 불어넣어 건조시켜 잔류 아세토니트릴을 제거한다. 다음에, 칼럼을 열어서 CPG를 꺼내어 1-드람 바이알에 둔다. 진한 암모니아(2.0ml)를 가하고 바이알을 실링하여 65℃로 설정된 가열 블록에 최소 2시간 동안 둔다. 2시간 후에 바이알을 실온까지 냉각시키고, 그후 암모니아 용액을 파스퇴르 피펫으로 제거하고 1.5mL 에펜드로프 튜브에 둔다. 이 용액을 진공에서 농축하고 HPLC로 정제한다.

ABI 394 DNA 합성기에서 ACLA16의 합성

6-카르복시플루오레세인(6-FAM) 포스포라미다이트를 플루오레세인 포스포라미다이트 0.25g 바틀에 무수 아세토니트릴 2.96ml를 가하여 제조하여 0.1M 용액을 얻는다. 다음에, 이 바틀을 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용하여 ABI 394 DNA 합성기 위의 8번 위치에 로딩한다. 나머지 천연 dA ^bZ (0.1M: 0.25g/2.91mL 무수 아세토니트릴), dC ^AC (0.1M: 0.25g/3.24mL 무수 아세토니트릴), dT(0.1M: 0.25g/3.36mL 무수아세토니트릴), dG ^dmf (O.1M: 0.25g/2.81mL 무수 아세토니트릴) 포스포라미다이트 모노머를 유사한 방식으로 1번에서 4번 포트에 로딩한다. 아세토니트릴을 18번 사이드 포트에 로딩하고, 표준 테트라졸 활성제를 9번 포트에 로딩하고, CAP A를 11번 포트에 로딩하고, CAP B를 12번 포트에 로딩하고, 산화제를 15번 포트에 로딩하고, 탈블록 용액을 14번 포트에 로딩한다. 모두 표준 바틀 교환 프로토콜을 사용한다. 다음에, 관심의 표적 서열을 8번 포트로부터 말단 커플링 및 5번 포트로부터 C3 스페이서의 두번째 커플링으로 인풋하여 ACLA16을 조립한다. 다음에, 원하는 스케일(0.2μmol, 1.0μmol,... 등)의 DNA가 합성되도록 변형된 사이클을 선택한다. 변형된 사이클은 6-FMA의 어떤 첨가 후에 800초의 추가 대기 단계를 함유한다. 다음에, DNA가 조립되는 지지체를 함유하는 표준 DNA 합성 칼럼을 DNA 합성기의 4개 위치 중 1개에 로딩한다. eTag 리포터를 함유하는 DNA를 다양한 표준 500Å CPG 지지체(Pac-dA-CPG, dmf-dG-CPG, Ac-dC-CPG. dT-CPG) 뿐만 아니라 3'-바이오틴, 3'-아미노 링커, 및 마이너 그로브 결합종을 함유하는 특수 지지체에서 합성한다.

합성 완료시 칼럼을 합성기로부터 꺼내어 진공하에서 건조시키거나 또는 칼럼을 통해 공기나 질소를 불어넣어 건조시켜 잔류 아세토니트릴을 제거한다. 다음에, 칼럼을 열어서 CPG를 꺼내어 1-드람 바이알에 둔다. 진한 암모니아(2.0ml)를 가하고 바이알을 실링하여 65℃로 설정된 가열 블록에 최소 2시간 동안 둔다. 2시간 후에 바이알을 실온까지 냉각시키고, 그후 암모니아 용액을 파스퇴르 피펫으로 제거하고 1.5mL 에펜드로프 튜브에 둔다. 이 용액을 진공에서 농축하고 HPLC로 정제한다.

모든 다른 eTag 리포터를 상술된 것과 유사한 방식으로 합성한다.

다음의 표 6은 상이한 eTag 리포터의 리스트를 그것들의 구조와 함께 제시하며, 여기에서 기호는 표 2에 정의된 바와 같은데 편의를 위해 여기에 반복한다.C ₃ , C ₆ , C ₉ 및 C ₁₈ 은 글렌 리서치(버지니아 스터링)으로부터 상업적으로 입수가능한 포스포라미다이트 스페이서이다. 이 단위들은 N,N-디이소프로필, O-시아노에틸 포스포라미다이트의 유도체이며, 이것은 O로 나타낸다. 하첨자는 사슬에 있는 원자수를 나타내고, 이것은 DMT로 보호된 다른 말단을 갖는 Q에서 종결하는 에틸렌옥시 단위를 포함한다. 하첨자가 없는 문자 A, T, C 및 G는 종래의 뉴클레오티드를 나타내며, _T ^NH2 는 아미노 티미딘을 의미하고, C ^Br 은 브로모시티딘을 의미한다. 도 7에서 숫자는 하기 표 6에 넘버링된 eTag 리포터를 나타낸다.

eTag 리포터 프로브의 S1 뉴클레아제 다이제션

1.5ml 튜브에 10μM 농도로 eTag 리포터 프로브 10㎕를 첨가하고, 10xS1 뉴클레아제 반응 완충액 1.5㎕를 가하고, S1 뉴클레아제(프로메가, Cat#M5761, 20-100단위/㎕)를 가하고, 트리스-EDTA 완충액 3㎕를 가하여 최종 부피를 15㎕로 만들었다. 반응물을 37℃에서 20분간 인큐베이션한 후 96℃에서 25분간 인큐베이션하여 뉴클레아제를 불활성화시켰다.

세포 용해액에서 특이적 mRNA 발현을 모니터링하기 위한 5' 뉴클레아제 분석

THP-1 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 버지니아 마나사)를 10% 태아 소 혈청(v/v), 2mM L-글루타민, 10mM HEPES, 0.05mM 2-메르캅토에탄올을 갖는 RPMI 1640 배지에서 10nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(시그마 알드리치, 미주리 세인트루이스)의 존재 또는 부재하에 배양했다. 배양 24시간 후에 세포를 수집하고PBS로 2번 세척한 후 세포용해 완충액(20mM 트리스 pH 7.5, 0.5% Nonidet P-40, 5mM MgCl ₂ , 20ng/ul tRNA)를 사용하여 25℃에서 5분간 용해시켰다. 세포 용해액을 75℃에서 15분간 가열한 후 5' 뉴클레아제 분석에서 시험했다.

세포 용해액 10㎕를 단일가닥 상류 침입자 DNA 올리고(5'CTC-TCA-GTT-CT), 단일가닥 하류 바이오틴화 단일 DNA 올리고(eTag-표지), 및 2ng/ul 5' 뉴클레아제 (Cleavase IX)와 완충액(10mM MOPS pH 7.5, 0.05% 트윈-20 및 0.05% Nonidet P-40, 12.5mM MgCl2, 100uM ATP, 2U/ul Rnase 억제제) 20ul 중에서 합쳤다. 반응을 60℃에서 4시간 동안 수행한 후 모세관 전기영동으로 분석했다. 효소의 비-특이적 활성으로 인한 바탕 신호를 제거하기 위해서, 1mg/ml 아비딘 1ul를 반응물에 가하여 모든 eTag-표지된 절단되지 않은 올리고 또는 eTag-표지된 비-특이적으로 절단된 올리고를 제거했다. 도 8 및 도 9는 아비딘을 첨가하여 수행된 것과 첨가하지 않고 수행된 것의 분리를 나타낸다.

eTag 리포터를 사용한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 PCR 증폭

eTag 리포터가 표 6에 설명된다. 제조된 eTag 리포터를 스크린하여 예리한 분리를 제공했던 20개 후보를 제공한다. 31개 eTag 리포터를 TaqMan(다음의 표형식으로 나타낸 조건하의 시약)을 사용하여 합성 표적과 함께 생성시켰다. 합성 표적을 갖는 62개의 반응물이 있었다(eTag 리포터에 대한 한 반응물 및 한 음성 대조표준). 마스터 믹스는 TaqMan 마스터 믹스, 프라이머(리버스 및 포워드) 및 물의 용액을 제조하는 것을 포함한다. 다음에, 이 믹스를 개별 PCR 튜브에 알리쿼트한후 프로브 및 주형을 첨가한다.

다음에, 모든 개별 반응물을 분리 매트릭스로서 POP4를 사용하여 ABI3100 상에서 전개시켰다. 샘플을 0.5xTaqMan 완충액에서 1:20으로 희석하고, 1(1의 아비딘(10mg/ml))을 첨가하여 어떤 무손상 프로브에 결합시켰다. 샘플을 포름아미드를 사용하여 1:2로 더 희석한 후, ABI3100 모세관에 샘플을 주입했다. 분리에 대해 ABI3100에 사용되는 조건에 따른다.

단일 런에서 다수 TAG 리포터의 연속 분리를 도 7에 나타낸 바와 같이 달성했다. 이것의 구조는 상기 표 6에서 확인된다.

eTag 리포터 프로테오믹 유사체 분석

1- eTag 리포터 및 바이오틴으로 아미노덱스트란(MW ~500,000)의 표지화.

아미노덱스트란을 고분자량 분자에 관련된 eTag 리포터 유리를 증명하기 위한 모델로서 사용했고, 이것을 또한 단백질에 대한 모델로서 사용한다. 10mg 아미노덱스트란의 아미노기의 수는 2x10 ^-8 몰로 계산되었다. 1:4 바이오틴 대 eTag 리포터의 비에 대해서, 사용된 바이오틴 NHS 에스테르의 몰수는 1.85x10 ^-6 이었고, 말레이미드 NHS 에스테르의 수는 7.4x10 ^-6 이었다. 아미노덱스트란 10.9mg을 0.1% PBS 완충액 6ml에 용해시켰다. 다음에, 바이오틴-xx NHS 에스테르 10mg 및 EMCS 23.7mg을 DMF 1ml에 함께 용해시켰다. 이 DMF 용액을 빛을 제거한 상태에서 교반하면서 아미노덱스트란 용액에 50㎕씩(30분 간격) 가했다. 마지막 DMF 용액을 첨가한 후 혼합물을 하룻밤 방치했다(빛을 제거한 상태에서 교반하면서). 다음에, 혼합물을 10,000의 컷오프 분자량을 갖는 멤브레인을 사용하여 투석했다. 멤브레인을 교반중인 물 2l를 함유하는 비이커에 담갔다. 이 물을 4번(2시간 간격) 교환했다. 멤브레인을 하룻밤 물에 두었다(빛을 제거한 상태에서 교반하면서). 다음에, 이 용액을 동결건조시키고, 동결건조 가루를 eTag 리포터 표지화에 사용했다.

2- 바이오틴 및 말레이미드 표지된 아미노덱스트란과 eTag 리포터 SAMSA의 반응.

eTag 리포터로 SAMSA[5-((2-(및-3)-S-아세틸메르캅토)숙시노일)아미노)플루오레세인]을 사용하여 아미노덱스트란 분자에 있는 말레이미드와 반응시켰다. 이목적을 위해서, 아미노덱스트란으로 표지된 바이오틴 및 EMCS 0.3mg(~5.3x10 ^-9 몰)을 물 10㎕에 용해시킨 후, 말레이미드의 eTag 리포터로의 전환 완료를 위해 10배 몰비의 SAMSA와 반응시켰다. 따라서, SAMSA 1.1mg(-1.2x10 ^-6 몰)을 0.1M NaOH 120㎕에 용해시키고, 실온에서 15분간 인큐베이션했다(티올기의 활성화를 위해). 다음에, 과잉의 NaOH를 6M HCl 2㎕를 가하여 중화시키고, 포스페이트 완충액(200mM, pH = 7.0) 30㎕를 가하여 용액의 pH를 7.0으로 맞췄다. 활성화된 SAMSA 용액을 표지된 아미노덱스트란 용액 10㎕에 가하여 1시간 동안 인큐베이션했다. eTag 표지된 아미노덱스트란을 세파덱스 G-25(아메르샴)을 사용하여 겔여과로 정제하고 정제된 샘플을 수집했다.

3- 표지된 아미노덱스트란으로부터 eTag의 유리.

스트렙토아비딘 코팅된 감광제 비드(100㎍/ml) 2㎕를 정제된 표지된 아미노덱스트란 5㎕에 암소에서 주의깊게 가하고 15분간 암소에서 인큐베이션했다. 다음에, 이 용액을 680nm에서 1분간 조사했다. eTag 리포터의 유리를 CE ² LabCard ^TM 장치를 사용하여 CE임을 시험했다. 도 1에 나타낸 바와 같이, CE ² LabCard는 증발 콘트롤 및 주입/분리의 2 부분으로 이루어진다. 증발 콘트롤은 2개의 완충액 저장소(직경 2mm)를 갖는 채널과 통합되어 있고, 증발 콘트롤 웰(직경 1mm)이 채널의 중심에 똑바로 있다. 사이드 웰(재충전 웰)의 부피는 4.7㎕인 반면 중앙 웰의 부피는 단지 1.2㎕이고, 중앙 웰 아래에 있는 채널의 부피는 약 40nl이다. CE ₂ 장치의 제 2 부분인 주입/분리 부분은 폭 120㎛ 및 깊이 50㎛의 치수를 갖는 주입 및 분리 채널로 구성된다. 주입 채널은 증발 콘트롤 웰에 직접 연결된다. 이 채널들은 LabCard ^TM 위에 필름(MT40)을 적층함에 의해 가까워진다.

CE ² LabCard 장치를 분리 완충액(20mM HEPES, pH=7.4 및 0.5% PEO)으로 채운 후, 분석 혼합물 300nl를 중앙 웰(샘플 웰)에 가하고 도 1에 나타낸 바와 같이 CE에 의해 분리했다.

도 2는 감광제 비드를 가지는 정제된 표지된 아미노덱스트란과 감광제 비드를 가지지 않는 것의 일렉트로페로그램을 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 감광제 비드의 첨가는 680nm에서의 조사시 감광제에 의해 생성된 싱글렛 산소를 사용하여 아미노덱스트란으로부터 eTag 리포터의 유리를 가져온다. 조사 시간을 최적화하기 위해서, 비드와 감광제의 동일한 혼합물을 함유하는 상이한 튜브를 1분에서 10분까지의 시간 범위에서 상이한 시간 동안 조사했다. 1분 이상 조사하는 동안 eTag 리포터 유리에 유의한 증가는 없다. 도 4는 eTag 리포터 유리에 대한 감광제 비드 농도의 효과를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 고농도의 감광제 비드는 표지된 아미노덱스트란으로부터 eTag 리포터의 더 높은 유리를 가져온다. 도 5는 감광제 비드 농도의 함수로서 eTag 리포터의 유리에 대한 선형 검정 곡선을 나타낸다. 게다가, eTag 리포터 유리에 대한 표지된 아미노덱스트란의 농도의 효과도 시험하였고 그 결과를 도 6에 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 감광제 비드의 주어진 농도에 대해 저농도의 표지된 아미노덱스트란은 더 효과적인 eTag 리포터 유리를가져온다(또는 더 높은 비의 유리된 eTag 리포터 대 표지된 아미노덱스트란의 양).

당해 발명이 다중 측정에 사용되고 다중 측정을 수행하는 조성물을 제조하는 강력한 방식을 제공한다는 것이 상기 결과로부터 증명된다. 본 방법은 동종성 및 이종성 프로토콜을 제공하며, 이것은 모두 화합물의 다른 분류의 예로서 핵산 및 단백질을 사용한다. 핵산 측정에서, snp 측정이 대단히 단순해지며, 이 경우 프로토콜은 단지 1개 내지 4개의 용기에서 수행되며, 많은 수의 snp가 큰 효율과 정확성으로 단시간 내에 쉽게 측정된다. 다른 서열에 대해서, 게놈이 원핵생물 및 진핵생물로부터의 조사될 수 있으며, 원핵생물에 대해서는 약물 내성, 종, 균주 등을 포함하고, 진핵생물에 대해서는 종, 세포 종류, 외부 자극에 대한 반응, 예를 들어 약물, 물리적인 환경 변화 등, 돌연변이, 교차점 등을 포함한다. 단백질에 대해서는 표면 단밸질 집단의 변화, 노화, 신생물, 활성화 또는 다른 자연발생적 현상의 복수의 경로에 관해서, 화학적 및 물리적 환경 변화에 대한 숙주 세포, 세포소기관 등의 반응을 측정할 수 있으며, 여기에서 단백질의 양이 정량될 수 있다.

특히 핵산 측정에 관해서, 당해 eTag 리포터는 프로브, 프라이머 등으로서 사용되는 올리고뉴클레오티드의 합성과 함께 편리하게 합성될 수 있으며, 이 경우 eTag 리포터는 동종성 표적 서열의 존재하에 유리된다. 상이한 측정에 사용되는 빌딩블록 또는 eTag 리포터의 키트가 제공된다.

본 명세서에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자의 기술 수준에 대한 예시이다. 본원에 제시된 모든 공보 및 특허 출원은 각 개별 공보 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고자료로 수록되는 것처럼 동일한 범위로 참고자료로 수록된다.

본 발명은 이제 충분히 설명되었으며, 첨부된 청구항의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다.