Fractionated micro electronic device array

【発明の詳細な説明】 分画化されたマイクロエレクトロニックデバイスアレイ 本発明は、分画化されたマイクロエレクトロニック流体アレイを備えたシステムに関する。 詳細には、本発明は、合成、スクリーニング、化学的評価検定とを含む様々なプロセスを同時に実行するための、マイクロエレクトロニック流体移送デバイスアレイを含むシステム、およびそのアレイを製作する方法に関する。 同族の化合物を作る従来の方法、または、同族の類似する化合物を含む新規の薬物化合物のテストは、時間のかかるプロセスであった。 何故なら、各化合物または各候補薬物を個々に造って、個々にテストしなければならないからである。 例えば、多くの薬物候補化合物は、複数の物質をテストするために試剤を使ってテストされるが、それらの物質は、恐らく、単アミノ酸基か核酸塩基だけの違いか、あるいは異配列の異なるアミノ酸か核酸を有するかの違いだけである。 最近では、生物学的活性の可能性を持つ種々の化合物の合成と、例えば従来からの半導体技術とを組み合わせることによって、そのプロセスは多少改良されている。 例えば、半導体、または誘電体基板の上に、感光性保護化学物質を含むアミノ基を有する生物学的前駆物質を被覆する。 次に、各々が孔を有する一連のマスクを前駆物質上に実装する。 感光性アミノ酸のなどのカプリング試剤に、孔から光を照射してアミノ化合物と反応させ特定の化合物を生成する。 前駆物質上に異なるペプチドのアレイを形成するために、別のカプリング試剤とともに、別のマスクを使用して、このアレイの生物学的活性の検査を行うことができる。 これは、抗体とかウイルスなどのターゲット分子へアレイ露光して行うのが望ましい。 このアレイは、蛍光標識を有する生物学的受容体に対して露出していて、アレイ全体が受容体と共に培養される。 もし、受容体がアレイ中の何らかの化合物に結合すると、蛍光標識の位置を光学的に検出できる。 この蛍光データは、コンピュータに伝送され、コンピュータは、反応した化合物と、反応の程度とを演算する。 この技法により何週間も、更には何ケ月もかかった何千もの化合物の合成やテストを数日で行うことが可能である。 しかし、各カプリング反応を合成することが必ずしも完全には行われず、バイオポリマーの長さが増すにつれて、収量は減少する。 複数のマスクを整列させてマスク内に孔を開ける順次プロセスには、注意深い整列作業が必要で、時間もかかる。 上記の合成は、平面上での様々な操作や反応を可能にする２つの最新技術の開発により可能となった。 その一つは、ＤＮＡ片の検出と分析、そして特定の化合物との反応によるＤＮＡ片の識別である。 プローブ、ＲＮＡ、ＤＮＡ片は、高感度センサーで分解、標識付け、検出を行うことができる。 ＤＮＡが存在するか否かによって、例えば、病気の細胞を見極めることができる。 もう一つの進歩は、微細チャネル内での、物質分離能力と、そのような微細チャネルを通して流体を移送する能力である。 これは、電気泳動や電気浸透等の種々の界面動電プロセスを用いることによって可能となった。 流体は、電気浸透力によって微小チャネルの内部を推進される。 電気浸透力は、外部電圧によって蓄積された表面電荷を通してチャネル内に蓄積され、流体を“はじいて”流れを発生させる。 この表面電荷と外部電圧は、界面動電流を発生させ、その結果、チャネルに沿う流体流を発生させる。 このような界面動電プロセスは、例えば、米国特許第４，９０８，１１２号に記載されたような装置の基礎である。 こうして、電気泳動およびまたは電気浸透を使った、ごく少量の物質の微細チャネルに沿う移送が実現した。 このような移動は、薬物候補化合物のごく少量の試料のアレイ中での合成や、ごく少量の物質の生物的活性に関するテストに用いることができる。 流体プロセスの完全自動化における一層の進歩により、情報が、 将来の薬物選定に役立つあらゆるタイプの生物的活性に関する膨大な数の化合物の合成とテストにかかる時間と費用を大きく削減することになろう。 本発明のシステムは、基板内にミクロンサイズのウェルと接続チャネルとのデバイス装置アレイを備え、接続チャネル、アレイへの流体の配送と、アレイからの流体の回収、そして、ウェル中での物質の電気光学的測定のためにステーションとインターフェースしている。 ステーションは、制御装置にも接続していて、チャネルやウェルへの流体の流れを、制御し、基板からの測定データを収集する。 上記の構成要素は、相互に依存して、同時に種々の作業を行うことができる。 アレイの個々のウェルと配列は、果たすべき合成や分析によって変わり得る。 このように、アレイの機能を容易に変更できえるが、使用中の特定のアレイへの流体流と行うべきテストまたは合成を監視し制御に適正なインターフェース手段を選ぶことだけは必要である。 一つの実施例において、上記のシステムは、公知のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）プロトコルや、ＤＮＡ検定のためのプライマーやプローブ技術を使って、 ＤＮＡの同時検定などの種々の臨床診断に使用できる。 他の実施例において、スクリーニングを目的として、抗体または抗原の免疫検定に使用できる。 更に別の実施例において、一連の化合物、即ち一連のペプチドまたはオリゴ核酸塩の合成を同時に行うことができる。 アレイ中の各ウェルは基板上の該当モジュール内で、決められた作業を遂行できるように設計されていて、各モジュールは各作業を果たすのに必要な数のウェルを含んでいる。 ウェルは、接続微細チャネルによって相互に、試料源、および試薬流体源に接続されている。 この能力により、病気に対して順次検定では不可能な、幅広い臨床検定が可能になり、抗体のスクリーニングの様な幅広い臨床検定の統計が改良され、同時性により、テストにおけるコストの削減、試験の速さの改善、急速に進行する病気に対する患者への治療の改善が可能になる。 アレイは、適切な誘電体基板内に形成され、アレイ中には、チャネルとウェルが、マスクレス半導体パターン技術を使って形成される。 コンピュータなどのステーションと制御手段は、市販されている装置を含む既存の技術を使用する。 本デバイスアレイは、活性処理を利用してアレイを横切って流体移送し、合成やスクリーニングにかかる必要な時間を削減する。 更に、すべてのタイプの大型のバイオポリマーを、合成化合物を高純度に保ちながら、合成と処理を行うことができる。 本マイクロラボラトリーアレイは、完全自動化して、ウェルからウェルへ、試料や前駆物質の移送、そしてアレイ中への他の流体の移送を可能にするとともに、検定の測定および温度制御等の処理パラメーターの完全制御を可能になるだろう。 本発明の教示は、以下の詳細説明を添付図面とともに考察すれば、容易に理解できる。 ここで： 図１Ａは、臨床検定用に適用する、本発明のシステムの各部の分解図である。 図１Ｂは、本発明の基板の平面図であり、その中に形成したラングルモジュールを示す。 図２は、本発明のモジュールを説明する分解平面図である。 図３は、本発明の光伝送・検出システムの分解断面図である。 図４Ａは、本発明のマイクロラボラトリーディスクのウェルの実施例の断面図である。 図４Ｂは、本発明のマイクロラボラトリーディスクのウェルの、別の実施例の断面図である。 図５Ａは、マイクロラボラトリーディスクのモジュールの一部の断面図であり、典型的なウェル内の装置を示す。 図５Ｂは、カバープレートで覆われた、マイクロラボラトリーディスクのモジュールの一部分の断面図である。 図６Ａは、マイクロラボラトリーディスク断面図であり、光学的システムインターフェースとともに、予め形成装置を内部に有する追加のウェルを示す。 図６Ｂと図６Ｃは、ウェルに隣接するチャネルの内にあって、それぞれ、開放位置と閉止位置にあるバルブを示す。 図７Ａは、免疫検定に適する本発明の別の実施例の分解図である。 図７Ｂは、図７Ａのマイクロラボラトリー上のモジュールを図示する平面図である。 図７Ｃは、流体をチャネル内に、そしてひとつのウェルから別のウェルへ移送するための制御手段の断面図である。 図８は、蛋白質とオリゴ核酸塩を同時に合成するのに適した、ミクロ実験室アレイの別の実施例の略図である。 図９は、図８のシステム用に改変されたステーションを示す略図である。 図１０は、多数の小型分子を同時に合成するのに適したマイクロラボラトリーアレイの更に別の実施例の略図である。 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃは、基板内にクロスオーバーチャネルを形成するのに必要なステップ示す断面図である。 図１１Ｄは、基板内のクロスオーバーチャネルの平面図である。 図１２は、電気浸透によって、チャネル内の流れを制御するためのチャネル“ ゲート”電極の平面図である。 本発明を、先ず、図１Ａを参照に説明する。 図１Ａは、ＤＮＡスクリーニング診断を行うために構成した、本発明のシステム例の各部を図示する。 図１Ａのシステムは、モデムやプリンター１２等の周辺装置にライン１１を介して、電気的に接続されたコンピューター１０を含み、このコンピューターは、マイクロラボラトリーディスク１４へ命令を与えたり、そこから得られたテスト結果を記録するようにプログラムが組まれている。 コンピューター１０は、ライン１５を介して、ステーション１６へ電気的に接続されている。 ステーション１６ には、マイクロラボラトリーディスク支持体１８、試料と試薬をマイクロラボラトリーディスク１４にローディングするための支持体チューブ２０、流体をディスク１４上の特定の仕向地に移送するためのポンプ２２、一つ以上の光源２４、 光ファイバー２５、一つ以上の光検出器２６を含む。 光ファイバー２５は、光源２４からの光を検出器２６へ伝送するよう作動する。 廃流体等を容れる一個以上のリザーバ２８もステーション１６に格納されている。 全血やその他のＤＮＡ含有流体など、試験対象の少量の流体試料を、ローディングシステム３０によってシステム内へ入れる。 システム３０は、マイクロラボラトリーディスク１４の表面内にエッチングされたローディング用キャピラリーチャネル３４に接続してサンプルを収容する一本以上のキャピラリを内臓してもよい。 ローディング用キャピラリ３２は、ローディング用キャピラリチャネル３ ４内へ水平に挿入する。 試料は、ローディング用キャピラリチャネル３４に送られてから、ディスク上の第一のウェル３６に移送される。 代替として、供給チャネル３４へ垂直に挿入するローディングチャネル５０も試料の供給に使用できる。 図１Ｂと図２に、本発明のマイクロラボラトリーディスク１４上で、チャネル３８によって接続された複数のウェル３６、４０、４２を備えた、破線で示した特定のモジュールを図示する。 各モジュールは、それぞれのモジュールからの過剰な流体または廃流体を集めるウェル４６に接続している。 これらの廃流体は回収され、ステーション１６中の廃流体リザーバ２８へ移送される。 試料は、第１ウェル３６を含む一連のウェルの中で順次、処理される。 例えば、全血試料は、ローディング用キャピラリチャネル３４から第１ウェル３６内へ移されて、濾過され、溶解され、白血球と赤血球に分離される。 そして、ＤＮＡ が白血球から分離される。 次に、ＤＮＡ試料は、単一モジュールの全てのウェルを接続する接続チャネル３８を通って、第１ウェルから出されて、第２ウェル４ ０へ移送される。 第２ウェル４０内で、ＤＮＡは、単一の系（Strain）に分離され、よく知られたＰＣＲ手法を使って増幅される。 続いて、処理された試料は、 第２ウェル４０から出て、接続チャネル３８を通って第３ウェル４２へ移送される。 第３ウェル４２で、ＤＮＡは、既知のプローブハイブリッド形成法によって検定される。 このＤＮＡ検定は、第４ウェル４４の中で検出され評価される。 このように、特定の血液試料中のＤＮＡ検定は、一本のチャネルで接続された一連の４個のウェルの中で行われる。 最後に、過剰の試薬等は、マイクロラボラトリーアレイ１４内のすべてのモジュールに共通な第５ウェル４６に集められ、ステーション１６の廃液収集システム２８へ転送される。 ローディングチャネル３４または５０と、ウェル３６、４０、４２、４６、そして接続チャネル３８を組み合わせて、試験マイクロラボラトリーディスク１４ 上に、１個のモジュール４８を形成する。 マイクロラボラトリーディスク１４上の単体モジュールを、平面図ＩＢに破線で示す。 以下に説明するように、マイクロラボラトリーディスク１４中には、複数のモジュールが形成されているので、 多数のモジュール４８上で同時にテストが行える。 図１Ａ、１Ｂおよび図２に示した、モジュールのこの特定した連続性を持つチャネルとウェルは、Greisen他のＤＮＡ検定プロトコルを使って、血液や、他のＤＮＡ含有流体中の病原性バクテリアの検出に役立つ。 “PCR Primers and Prob es for the １６SrRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria，Including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid，J．Clinical Microbiology ３２(２ )，pp３３５-３５１(１９９４)を参照のこと。ディスク１４は最大１５００個の並列モジュールを形成できるように編成されているので、順次検定のシステムでは出来ないであろう広範なＤＮＡスクリーニングを同時に行える。大型並列アレイでのテストを同時に実行できるので、有意な結果を得るための時間も短縮され、その結果、コストも削減される。更に、広範囲なスクリーニングをベースとして、統計を改善することができる。その上、本発明のこのシステムは、腫瘍に見られるＤＮＡ変異体を検出する能力を持つ。 ステーション１６には、光ファイバーアセンブリ２５、一つ以上の光源２４、 一つ以上の検出器２６（図示なし）があって、この検出器は、システムのローディングチャネル３４または５０に命令を送信し、チャネル３４または５０、および第１ウェル３６内の血液や他の流体試料等の物質の透過度や吸光度を測定する。光ファイバーアセンブリ２５により、チャネル３４または５０、あるいはウェル３６内の物質の有無を確認し、測定データをコンピューター１０に転送してその量を確定できる。適当なレーザーや光検出器は市販のものを入手できる。光ファイバーを支持する光ファイバーアダプタも市販されている。これらのアダプタは、光源からファイバーへの光の有効な伝送をするために、レンズ付きであってもよい。 同時モジュール処理か、アレイ処理かの何れかで設計され、予め選択された基板を、ステーション１６内の基板ホルダ上に配置できるようになっている。マイクロラボラトリー１４の各々のモジュール内での処理を行うために、コンピューター１０のソフトウエアに適切な変更を加えるか、あるいは、特定された一連の試薬調製手順を監視できる他の駆動手段を選んだ後に、全く異なったテストおよび処理を、本発明のシステム内で実行できる。このように、マイクロラボラトリーアレイ１４は、様々な、検定、測定、合成に対して個々に設計され、異なることを行う場合にシステム内で変更しなければならないのは、モジュールの構成と駆動手段だけである。 ガラス基板または、その他の基板の表か裏の一方には、薄膜トランジスタ回路（図示なし）が形成され、後で更に説明するリードや電極を通してウェルに電力を提供するとともに、アレイに沿って液体を移送できるように、コンピューター１０などの駆動装置に接続している。 ピンもガラス基板内に形成でき、例えば、 コンピューター１０に接続されている支持体１８上の論理回路によってアドレス指定が可能である。 これらのトランジスターと論理回路も、支持体１８上の基板１４と接触して、マイクロラボラトリーディスク１４とコンピューター１０との間にインターフェイスを提供する。 システムローダー３０は、ステーション１６の外側に設置され、図３に示すローディング用キャピラリ３２へ接続してもよい。 このキャピラリは、内径が約２ ００ミクロン、外径が約６００―７００ミクロンが適正である。 キャピラリ３２ は、公知の方法で前処理を行い、表面に吸着した蛋白質や関連する生体用材料を除去することができる。 この方法は、例えば、Cobb著“Electrophoretic Separa tions of Proteins in Capillaries with Hydrolytically Stable Surface Stru ctures,Anal Chem．６２，（１９９０）pp２４７８-２４８３に開示された方法に類似している。試料物質は、すべてシステムローダー３０によってシステムへローディングされる。システムのキャピラリ３２は、ローディングチャネル３４ を介して、水平に直接、マイクロラボラトリーディスク１４へローディングできる。試料は、ローディング用キャピラリ３２に付したバーコード、または、他の高密度コードを用いて、ディスクアレイ上の位置によって識別される。試料ローディングチューブ３２を、ローディングチャネル３４に挿入する時、キャピラリ試料３２の端部またはローディングチャネルに接着する封止剤により、キャピラリ３２をチャネル３４に封止する。代替として、キャピラリ試料３２は、別のローディングチャネル５０へ水平に挿入され、このことにより、より小さなローディングチャネルを使用できるようになるが、試料は、ステーション１６のポンプ２２から制御を行って送るよりも、重力で接続チャネル３８へ入れる方がよい。 この代替構造を図１乃至図３に示す。 本システムの心臓部は、並列モジュールマイクロラボラトリーディスク１４であり、図１Ａに側面図を、図１Ｂに平面図を示す。図１Ｂと図２は、マイクロラボラトリーディスク１４上の単体のモジュールを示し、ディスクの直径は約８． ５ｃｍが適当である。 マイクロラボラトリーアレイの各モジュールは、一本のチャネルで接続された一つ以上のウェルで構成され、順次、ローディング用キャピラリに接続されている。マイクロラボラトリーディスク１４は、例えば、ガラス、融解石英、石英、 またはシリコンウエーハからできていて、厚さは約１ｍｍが適当で、半導体技術や、ＨＦなどの適当なエッチャントを使って、精密にかつ自在にエッチングできる。高融点ホウケイ酸ガラスや融解石英などの高品質ガラスは、それらの持つＵ Ｖ伝送特性に関して光技術を利用しウェルやチャネルの内で処理や測定を行う場合に好ましい。図ＩＢに示すモジュール４８は、４個の接続したウェルを有するが、これは単なる例であり、ウェルの数は、各モジュールで行うテスト、または合成に従って、また、以下で更に記載するように、テストまたは合成を行うステップの数に従って、それより多くても少なくてもよい。 特定のマイクロラボラトリーディスク用のテストと合成を行うための順次ステップを遂行するのに必要な数のウェルが、マイクロラボラトリーディスクにエッチングで形成される。 各モジュール内の全てのウェルは、一つ以上のチャネルで相互に接続される。 モジュールは、その各々が基板上で効果的に配置できるように設計されている。 各モジュールで必要とするウェルがほんの数個である場合は、２個のモジュールを、ディスクの半径方向の各スライス片（図示なし）に形成することができる。 これにより、一枚のマイクロラボラトリーディスク１４へエッチング加工できるモジュール数を倍にできる。 このように、直径８．５ｃｍディスクに、２６７個のシングルモジュールか、５３４個のダブルモジュールのアレイを容易に製作できる。 試料を、ローディングチャネル５０へ垂直に挿入する場合、必要な基板面積は少なくてすみ、一枚のマイクロラボラトリーディスク上にモジュールを追加でき、一枚のマイクロラボラトリーディスク１４上に、最大１５００個のモジュールを形成することができる。 各モジュールは、本システムの供給システム３０に接続しているので、全モジュール内での同時処理が可能である。 すべてのモジュールの過剰流体や廃棄物は、中央ウェル４６へ送られる。 複数のウェル４６を、共通チャネル４７（図１Ｂ）によって相互に接続してもよい。 基板１４の裏側にある封止チューブは、これら過剰流体用の出口チャネルを提供し、過剰流体をステーション１６内の廃棄リザーバ２８へ送ることができる。 このように、各マイクロラボラトリーアレイに必要な出口チャネル４７はひとつだけである。 マイクロラボラトリーディスク１４のウェルは、以下の手順で作ることができる。 ガラス基板ディスク１４を、連続するエッチャントから保護するため、蒸着や化学蒸着（ＣＶＤ）といった公知の方法で、約１０００オングストロームの厚さの、薄いクローム層と金皮膜でディスク両面を連続的に覆う。 Hoechst-Celanese Corp． 製のDynakem EPA等の２ミクロン厚のフォトレジストをスピン−オン（sp in on）し、マスクか、正方形または長方形のイメージの何れかを使って、そのフォトレジストを露光するが、これには、MRS Technology，Inc． 製のMRS ４５ ００パネルステッパーが適している。 レジストを現像してその中に孔を明け、レジストを焼成して溶剤を飛ばした後、２５ｍｌの水に４ｇのＫＩと１ｇの沃素（ Ｉ２）を含む標準エッチ液を使って、孔内の金層をエッチングする。 次に、下地のクロム層を、KTI Chemicals，Inc． 製の KTI Chrome Etch などの酸化クロムエッチ液を使って、別々にエッチングする。 それから、体積比１４：２０：６６ のHF-HNO３-H20の超音波バス中でガラス基板をエッチングする。 超音波バスでこのエッチャントを使うことにより、様々なウェルに垂直な側壁が形成される。 望ましいウェルの深さが得られるまでウェルのエッチングを続ける。 ウェルの中で果たす機能にもよるが、望ましいウェル深さは、約２００ - ７５０ミクロンが適切である。 次いで、残りのフォトレジストとクロム−金層を除去する場合、幅約２００ミクロン、深さ５０ - １００ミクロンの接続チャネル３８を、ウェル間でエッチングする。 流体物質を、様々な方法で、第１ウェル３６またはローディングチャネル３４ から様々なウェルへ送ってもよい。 外部の機械的ポンプシステム２２を使用して、再生可能で正確に調節された量の流体を配送し、テスト液の純度と無菌性を維持できる。 Watson-Marlow，Inc． 製の２０５Ｕマルチチャネルカセットがふさわしいポンプである。 代替として、マイクロ電子機械システム（ＭＥＭＳ）に基づくミニチュア機械ポンプも使用できる。 これらミニチュアポンプは、各ウェル３ ６、４０、４２、４４の内部にあっても、外部にあってもよい。 このようなポンプは、Shoji 他の、日本電子通信学会誌、パート２，７０，pp ５２ -５９(１９ ８９)の「集積化学分析システム用マイクロポンプの製作」で報告されている。 微細チャネルを通して流体を移送するその他の適切なポンプ手段には、Dasugupta 他によって報告された界面動電ポンプ（electrokinetic pumps）がある。 これについては、Electroosmosis：A Reliable Fluid Propulsion System for Flow In jection Analysis，Anal.Chem． ６６，pp１７９２ - １７９８(１９９４)を参照のこと。 また、不活性金属電極を必要とする電気泳動法も使える。 図４Ａに示したように、例えば、第１ウェル３６の底部金属層５４としての金電極のように、 一つのモジュールの様々なウェル内に金電極を堆積させることができる。 電極５ ４は、リード５５を介して回路や他の電気接続子５６に接続される。 多量の希釈液、緩衝液、洗浄液等の流体を接続チャネル３８に通す必要がある場合、これらの溶液を、チャネル３８を通して目的のウェルに送るために、ステーション１６内の外部機械ポンプ２２を使用する。 必要とする量が少ない場合は、より高い効率のために、ディスク内ポンプシステムが使える。 更に、プラスチックのリリース容器に密封した包装済みの化学薬晶を、必要に応じて特定のテスト用の様々なウェルに置くことができる。 特定のウェルの温度を監視し、変更しなければならない場合は、ウェルの加熱手段または冷却手段をウェル内に組み込む。 詳細は、図４Ｂを参照にして以下に説明する。 この例における第１ウェル３６は、試料調製用ウェルである。 酸化錫やインジウム酸化錫等の適当な金属酸化物５７の薄膜を、ウェル材の上に堆積させ、導電性金属接続子５８によって、ウェル３６の端部、または外側端部に接続される。 酸化錫皮膜５７は、ウェル３６の加熱要素としての役割を果たす。 ウェル３６も、好ましくは、クロム―アルメル合金でできている表面バイメタル皮膜５９とリード６０を有して熱電対を形成し、酸化錫皮膜５７とリード５８に電流源を印加した時の、ウェル内の温度を測定する。 図示したように、マイクロラボラトリーディスク１４の裏側、または、好ましくは表側に堆積させた電極５６を介して、 ウェル３６に印加する電圧によって、ウェル内の温度を調節する。印加する電流の大きさは、リード６０を通して測定された温度に応じて、コンピューター１０ により調節することができる。本モジュール４８の第１ウェル３６も、Pall Co．製の Leukosorb ^TMなどの血液親和性結合物質（図示なし）と、試料の赤血球と白血球を溶解して、第１ウェル３６からＤＮＡを搬送する市販の溶液を含んでいる。このように、各ウェルに必要とされる装置や試薬は、予め作られたものを、ウエル内にローディングしたり、共通ソースからポンプで直接送られる。予めローディングされた流体を、マイクロラボラトリーディスク１４に接続されたローディング用キャピラリ３２につながるステーション１６内のリザーバからウェルへ送るか、あるいは、ウェルに通ずるリザーバとチャネルを、流体を使用するウェルに隣接して形成してもよい。ウェル内に、別の装置を組み込むことができる。例えば、交番磁界を利用した反応物攪拌装置を、ウェル中に組み込むこともできる。例えば、２個以上の電極を、ウェルの各側部に蒸着して、外部リードに接続し、続いて交流電源に接続することができる。この交番磁界は逆の磁場を与え、ウェル中の常磁性粒子を動かすことにより、ウェル中に流体の運動を引き起こす。図５Ａに示す様に、常磁性ビード６１は、本モジュール４８の第２ウェル４０ 内に堆積させて、ＤＮＡ物質を結合し、増幅、検出、検定のために、ＤＮＡを次のウェルへ移す。これらのビードは、例えば、インディアナ州の Bang Laborato ries of Carmel から、ＰＣＲプロトコル用に市販されている。ウェル４０も、 リード６６によって電極５６に接続される。全てのウェルの準備が終わってローディングされると、図５Ｂに示す様に、ガラス製のカバープレート６３がマイクロラボラトリーディスク１４に取り付けられ、接続チャネル３８用のキャピラリ構造が完成し、ウェル内の流体は蒸発しない。このカバープレート６３の材料は、マイクロラボラトリーディスクと同じでも、異っていてもよいが、カバープレート６３の熱膨張係数と、マイクロラボラトリーディスク１４の材料の熱膨張係数は近似していなければならない。カバープレート６３をディスク１４に封止するのに必要なシール温度も、エッチングされたチャネルやウェルの変形を防ぐために、ディスク材料の流動点未満でなければならない。カバープレートをディスクに封止するためには、電界を使うのが適している。というのは、封止が発生する温度は、流動点より低い温度、例えば約７００℃以下であり、この温度は、約１４００℃のシリコン流動点、あるいは、 Corning Glass Co．製の Corning ７０５９ ガラス(約８４４℃)よりかなり低い。本発明を、検定や合成など、異なるプロセスを同時にかつ並行して行うための、異なったモジュールについて記載した例を用いて、更に説明する。しかし、本発明は、ここで述べる詳細に限定される訳ではなく、モジュール中のウェル数、 ウエル中あるいはウェルに隣接して形成される装置、ウェルへの流体の出入りに必要な装置の数や形式、モジュール以外のディスク上へ組み付ける処理装置の数や形式等を、適当に変えることによって、プロセスや合成の追加が容易に行える。 例１ ＤＮＡ分析上記の様に、試料流体はローディングチャネル３４または５０に送られる。次に、試料に電界を加えるか、またはポンプ２２によって、試料はチャネル３８を通って第１ウェル３６へ移送され、そこで、例えば、試料の分離、濾過、溶解、 ＤＮＡ分離が行われる。第１ウェル３６は、図５で詳細を示す様に、加熱および温度調節手段を備えている。先ず、酸化錫層５７が、ＣＶＤによってウェル３６ 内に形成される。ウェル３６内の酸化錫皮膜５７の上に二重膜５９が積層され、 金属接続子６０が、ウェルの側壁に沿って設けられる。電極５６と６０が、マイクロラボラトリーディスク１４の裏側に形成され、リード５８と６０いより熱電対５９は外部コンタクト５６に接続される。リード５８を通る電流と、リード６ ０からの電圧は、コンピューター１０で監視して制御する。ウェル３６にも、Pall BioSupport Div．製の Leukosorb ^TMなどの血液親和性結合物質が事前に、または事後にローディングされる。必要に応じ、他の市販物質も同じ目的で使える。 Leukosorb B の使用量は、第１ウェル内の面積に依る。 Leukosorb Bは、血清試料から血球を濾過する。次に、試料内の赤血球の溶解と洗浄の促進に十分な量の公知の緩衝液を、チャネル３８を介して第１ウェル３６ 内へ送る。次に、例えば、５０ミリモルの ＫＣｌ、pH ８.３の１０ミリモルのT ris HCl、２.５ミリモルのMgCl２、０.４５%のNonidet P４０、６０ mlのプロテイナーゼ Ｋなどの白血球を溶解するのに十分な量の白血球溶解緩衝液を、チャネル３８を介して第１ウェル３６へ送る。続いて、必要とする反応が起こるように、第１ウェル３６を１５分間、５５℃で加熱する。それから、セルを１０分間、１００℃で加熱して、公知の手順に従って、プロテナーゼＫを不活性化する。最後の２つのステップで必要とされる高温により、ウェル３６内には高い蒸気圧が発生し、両方向、つまり試料供給チャネル３４に向かう後方と、次の第２ウェル４０に向かう前方に、背圧を引き起こす。このようにして、図６Ａで示すようにUnderstanding Microvalve Technology ，Sensors，September １９９４ pp ２６ - ３６で、Jerman 他が述べている二種の金属材料で成形したバルブ６２ 、６３を、チャネル３８へ予めローディングする。これらの材料は熱膨張率が異なる。ウェル３６内の温度が低いと、ボールバルブ６２は、常時位置にあり、流体はウェル３６へ自由に流れ込む。図６Ｂの矢印を参照のこと。ウェル３６内の温度が上がるにつれて、ボールバルブ６２は、図６Ｃに示す様に低温位置に向かって移動し、チャネル３８を閉塞して、ウェル３６をチャネル３８から隔離する。これにより、流体が、第１ウェル３６へ出入りするのを防ぐ。ウェルヒーター５７を適正に配置すれば、加熱されたウェル３６からの熱の温度勾配は、バルブ６２、６３を開閉するのには十分なので、バルブ６２、６３を電気的、熱的、あるいは機械的に制御する必要はなくなる。しかし、ウェル３６内の温度や圧力を、より近似して制御する必要がある場合は、それに応じて他の手段を用いてもよい。単純な設計により、例えば、石英、 またはポリテトラフルオロエチレン重合体でできたミクロンサイズの小球で構成し、チャネル３８内に入れて、従来のチェック弁として作用させ、チャネル３８ への逆流を防ぐようにしてもよい。しかし、この設計では、次のウェル４２へ進む流れの流れ止めは無く、連続ウェルの用途や組み合わせによっては、不利になるかもしれない。このチェックバルブ６４を、絶縁体または磁性体の球として用い、外部から静電場または磁場を与えて、バルブを開閉することができる。このような設計により、必要に応じてボールバルブ６４を閉鎖し、チャネル３８内での流体の前後両方向の流れを制御できる。このような設計は、マイクロラボラトリーディスク１４上で、合成手順を行う上で特に有利であろう。図６Ａを更に参照すると、調整と処理を施した血液試料は、次に第１ウェル３ ６で得られたＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅を行うために、第２ウェル４０へ移送される。このウェル４０には常磁性ビードの一層が含まれていて、そこへ送られてきたＤＮＡと結合する。この検定には、最少で約１０ナノグラムのＤＮＡが必要である。ウェル４０内の量は、実際には、ステーション１６内に配置した電子光学的光源２４と検出器２６によって決めることができる。光源２４の光ファイバー２５は、ウェル４０に接続され、直径を２００、４００、６００ミクロンとすることができ、この試料中のＤＮAを検出するために、２６０ｎｍの放射光を提供する。 ２５０―２６０ｎｍで伝送する光ファイバーは市販晶を入手できる。図６ Ａの光ファイバー２５は検出器２６に接続されて、ウェル４０内で測定された光を集光し、安定度の優れた紫外線感光性シリコン光検出器へ伝送する。検出器には、 熱電気的に冷却されたＵＶを高めたシリコン光検出器、またはＵＶ感光性のミニチュア光電子倍増管を有するのが適当であり、何れも市販されている。光電子倍増管型の検出器の感度は高い。 ＤＮＡの公知の吸光度を下表に記載する。

ＤＮＡ検定でよく知られた手法に、ハイブリッド形成手法がある。 第３ウェル４２がこの目的に使われる。 ウェル４２は、ＤＮＡ源とその診断範囲に対してユニークなハイブリッド形成プローブによって嵌合される。 必要とするプローブを、直接ウェル４２内で合成してもよいし、市販のものを使ってもよい。 ＤＮＡ検定用マイクロラボラトリーアレイディスク１４に最も適した方法は、 非放射性の標識を使うことである。 この標識は、例えば、フィコビリ蛋白質、または別のクラスの蛋白質用の蛍光色素を含む。 これらの物質は、６００ｎｍを超える光を吸収する。 ステーション１６内にあって、６００―６５０ｎｍ域の光を放出する小型半導体レーザー２４を使って、標識中で蛍光を発生させることができる。 本例におけるプローブは、６００ｎｍを超える励起波長、つまり６００― ８００ｎｍ域で発光する。 フィコビリ蛋白質蛍光標識薬品は市販されている。 例えば、ペンシルベニア州 West Grove の Jakson Immuno-Researsh Labs． 製のＣ ｙ５

^TMがある。 蛍光も、ステーション１６にある検出器２６で検出される。 また、レーザー放射を阻止するため、図６にで示すように、光電子倍増管光検出器２ ６とレーザー２４の間にフィルター６８を挿入する。 蛍光標識によって発光される蛍光の検出器は、高感度で長期にわたり安定性を持つものが望ましい。 上記以外で、抗体検出用に市販されている他の手段も使える。 例えば、高度に着色された生成物を作り、感度の優れた検出を可能にする酵素、または化学ルミネッセンス化合物を用いて光学的に検出できる。 放射性同位元素も使えるが、テストオペレーターに悪影響を与えないためにも、その使用は賛成されておらず、処理上の問題も生ずる。 光透過検出装置もステーション１６ に配置されている。

例２免疫学的検定マイクロラボラトリーディスク１１４の設計と有用性を説明する第２の例を、 図７Ａと図７Ｂに示すが、この例は複数の免疫学的検定を同時に行うのに適した例である。 ステーション１６、試料ローディングチャネル１３４、そしてチャネル１３８に接続された複数のウェル１３６、１４０、１４２、１４４は、例１に類似しているが、材料、ウェル内で行われるプロセス、必要とされるウェルの数は異なる。 免疫学的検定を行うために、約１００ナノリットルの血液試料、または他の流体試料を濾過して、選択した抗体の標準検出法を使って、検定を確定するのに十分な抗体を有する物質を得る。 マイクロラボラトリーディスク１１４は、２００ -１０００の試料を同時に処理できる。 マイクロラボラトリーアレイ１１４への最初の試料移送は、例１と同じである。 第１ウェル１３６に、細胞壁上の予め選ばれた結合型抗体をローディングし、 適当な試薬を移送して、モジュール１４８の各ウェル１３８への流量を制御することによって、その抗体を検定することができる。 試薬と溶剤の流量は、ステーション１６で制御され、光検出システム２４、２５、２６は、透過率（吸光率） 測定用に設けられる。 一連の異なる抗体を、図７Ｂに示すように、連続するウェル内での様々な抗体の順次テスト用に追加したウェル１４０、１４２、１４４、１４６内に置くことができる。 必要とされるウェルの数は、該当する試薬の数と、テストすべき抗体の数とで決まる。 薬と溶剤の流れを制御する制御装置１７１は、チャネル１３８と第１ウェル１ ３６への流量を制御するスイッチ、またはバルブとしての部品１６２によって作動可能となる。 例えば、コンピューター１０により電場を駆動して、磁性球をボールバルブ１６２とさせることができる。 図７Ｃに示すように、ボールバルブ１６２を、ウェル１３６の両側にあるチャネル１３８に嵌合させる。 電流源１７０を、チャネル１３８に隣接して配置し、 ウェル１３６への流入流出を制御するために、マイクロラボラトリーディスク１ １４の裏側には、リード１７２があって、コンピューター１０などの駆動装置に接続している。

例３蛋白質またはオリゴ核酸塩の合成図８に示すこの例は、大型アレイでの蛋白質またはオリゴ核酸塩の合成を同時に行うことができるモジュラー設計されたマイクロラボラトリーディスク２１４ を図示する。 このような合成は、同族の関連化合物全体がアレイの各ウェル内で合成できて、生物的活性をテストできる場合に、例えば、薬物テストにとって大きな時間節約となる。 例えば、ウェル内での固相オリゴ核酸塩の合成については、The Allylic Prot ection Method in Solid-Phase Oligonucleotide Synthesis． An Efficient Pre paration of Solid-Anchored DNA Oligomers，J． Am． Chem． Soc.，Vol １１２ ，No.． ５，１９９０ pp１６９１-１６９６、でHayakawa 等によって８つの順次ステップで述べられている： ステップ１：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）によるウェル洗浄 ステップ２：３％Ｃ１３ＣＣＯＯＨ−ＣＨ２Ｃ１２によるデトリチレーション（脱トリチル化） ステップ３：アセトニトリルによるウェル洗浄 ステップ４：０．１Ｍフォスフォラミダイト−ＣＨ３ＣＮ、０．５Ｍ（４― ニトロフェニル）テトラゾル−ＣＨ３ＣＮ−ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）等の結合剤の添加 ステップ５：アセトニトリルによるウェル洗浄 ステップ６：Ａｃ２Ｏ−２，６−ルチジン−ＴＨＦ（１：１：８）と６．５ ％の４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）−ＴＨＦによるキャッピング ステップ７：１．１Ｍｔ−Ｃ４Ｈ９００Ｈ−ＣＨ２Ｃ１２による酸化 ステップ８：アセトニトリルによるウェル洗浄を行って過剰な酸を除去異種の保護モノマーを用いて、上記８つのステップを、反応ウェル２３７内で行って、所望する長さのオリゴマーを形成した後、合成したオリゴマーをそれらの支持体から解離する前に、試薬や溶剤を追加して合成用の保護グループを除去する。 次に、各ウェル内の様々なオリゴマーを、スクリーニング用に調製する。 図８に示すように、スクリーニングセル２７４もウェル２３６へ造り込むことができる。 図８の設計では、複数のモジュールまたはウェル２３６が、様々なチャネルによって結合され、異なる化合物の完全な合成が、単一ウェル２３６内で行われる。 このマイクロラボラトリー２１４の設計の更なる特徴は、種々の試薬や溶剤を、各ウェルへ可能に順次配送することのできるアレイの設計にある。 試薬や溶剤は、マイクロラボラトリーアレイ内に造り込んだリザーバ２７６、２７８、２８ ０、２８２に貯えられる。 さもなければ、マイクロラボラトリーアレイの外部、 例えばステーション１６内にあるリザーバから必要に応じて配送してもよい。 図８は、マイクロラボラトリーアレイに適した設計を図示し、ここでは、試薬と溶剤用リザーバ２７６、２７８、２８０、２８２が基板内に含まれる。 そして、図９は、合成用システムの部分概略図であり、ここでは、リザーバ２７６、２ ７９、２８０、２８２の各々が、各モジュールのウェルへの配送のために流体ポンプ２２に接続されている。 このアレイ内の各ウェルは、ウェル２３６の各々に入って出る、複数個の水平チャネル２３８、２３９、２４１、２４３、２４５と、複数個の垂直チャネル２ ４８、２５０、２５２、２５４を有し、チャネルはそれそれ別々のリザーバにつながっている。 試薬と溶剤は、図７Ｃに示すように、流体をチャネルに沿って移送するゲート電極により、チャネル沿って移動する。 図８に示すように、試薬は、異なるリザーバ２７６、２７８、２８０、２８２ から同時に、チャネル２３８、２３９、２４２、２４３へそれぞれ配送される。 これらの各チャネルには、ゲート電極１６２が造り込まれていて、必要に応じて、異なるリザーバからウェル２３６へ流入する流体を監視する。 この実施例では、全ての合成反応がひとつのウェル２３６内で起こるので、各ウェル２３６は一つのアレイ内に置かれ、一本以上のチャネルが、ウェル２３６の各々へおよび各々から通じていて、試薬の配送を同時にまたは順次に行う。 処理を行うための種々のステップのために連続するウェルを使用する場合、モジュラー設計の代わりに、同様のウェル２３６から成るアレイを使用するが、各ウェルでは異なる化学合成が行われる。 総合的設計からすれば、もはや複数個のモジュールではなく、 ウェルのアレイであり、何百という化合物を一枚のマイクロラボラトリー基板２ １４上で合成できる。 すべての合成ステップの完了後、合成を監視し、ウェル２３６に造り込んだスクリーニングセル２７４内へ試料を送ることによって、スクリーニングを行うことができる。 このタイプのアレイは、上記のような繰り返し順次ステップを伴う多数のオリゴマーやペプチドの合成に使うことができる。

例４ 小型分子の合成本例３１４のマイクロラボラトリーアレイは、いくつかの異なる種類の、アルキル化合物のような、小型分子のアレイを生成するように設計されている。 このようなアレイは、各化合物の、例えば、メチル置換、エチル置換、ｎ−プロピル置換、イソプロピル置換化合物等の異なったスタート物質の配送に依存するので、異なるスタート物質が各ウェルに配送されるよう、スタート物質の、リザーバまたは供給源から成る大型アレイが必要になる。 反応物質と溶剤、そして加熱といった反応条件は、必要に応じて配送される。 例１と２を参照のこと。 例えば、１アレイ分の１，４−ベンゾジアゼプリン化合物の合成は、次のように行うことができる。 ： ステップ ａ）： スタート物質４−［４−ベンゾイル−６クロロ−２−フルオレニルメトキシカルボニルアミノベンゾイルオキシ−メチル］フェノキシ酢酸を、アミノメチル樹脂、または、その同等品の上に、チャネル表面の被膜材として結合させる。 ステップ ｂ）：ステーションリザーバ３７６からウェル３３８へ供給される、ＤＭＦ中のピペリジンを使って、結合された材料から９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基を除去する。 ステップ ｃ）：第２リザーバ３７８からのアミノ酸、アルファ−Ｎ−ＦＭＯ Ｃ−アミノ酸（フッ化物）をウェル３３８内でカプリングさせる。 ステップ ｄ）：ＤＭＦ中のピペリジンを、ウェル３３８を通して移送させることによって、ＦＭＯＣ 保護基を除去する。 ステップ ｅ）：ウェル３４０内の第３リザーバ３８０からのＤＭＦ中の５％ 酢酸を使って、環式ベンゾジアゼピン誘導体を形成する。 ステップ ｆ）：ステーションリザーバ３８２からのＤＭＦ中のリチウム塩を使って、ウェル３４２内でアルキル化する。 図１０に示すように、このウェル３ ４２には、ポンプとスイッチの制御装置が嵌合して、コンピューター１０で監視され、異なるアルキル化剤をマイクロラボラトリーアレイ３１４へ選択的に配送する。 このように、アルキル化剤用“リザーバ”は、実際には、一連の全てのアルキル化剤のソースであって、これらアルキル化剤は、アレイ中の特定のウェルへ選択的に供給できるようになっている。 図７Ｃに示すように、ウェルへの流体配送は、制御手段１７１によって制御できる。 このようにして、各ウェルで、異なる化合物が生成される。 しかし、各化合物は、様々な化合物を合成するいくつかのステップを必要とするので、各化合物を合成するには、何個かのウェルを使用してもよいし、このマイクロラボラトリーディスク３１４も、複数のモジュールを備えてもよい。 本発明のもう一つの特徴は、クロスオーバーチャネル構造である。 これは、アレイ内でのウェル／モジュールの高密度編成を可能にし、それによって、２本以上のチャネルを使用して、ウェル内への流体の出し入れ、あるいは処理している物質を次のウェルへ移送することが可能であるという点である。 このようなクロスオーバーチャネルは、以下の方法で形成することができる。 １１Ａを参照すると、基板３１４は、既に記載した通り、その両面をクロム−金の第１層３１０Ａ 、３１０Ｂと、フォトレジスト３１２Ａ、３１２Ｂとで被膜される。 フォトレジスト３１２Ａは、露光現像されて、第１チャネル用孔３１３を形成する。 そして、クロム層３１２Ａは、孔３１３内でエッチング除去される。 次に、ガラス基板３１４は、クロム−金層３１０Ｂまで貫通してエッチングされ、孔３１５を形成する。 フォトレジスト３１２Ａと３１２Ｂは、再露光現像され、ガラス基板３１ ４ の両側に、一対の第２の孔３１６と３１７が形成される。 しかし、層３１２Ａ内の第２の孔３１６は、層３１２Ｂ内の孔３１７に直角で、最初に形成した孔３１ ５に平行である。 孔３１７は、図１１Ｂに示すように、ガラス基板３１４内へ既に形成した孔３１５に隣接して形成される。 次に、ガラス基板は、孔３１５と３ １７の間に通路を開けるためにエッチングされる。 これによって、図１１Ｃに示すように、ガラス基板３１４を貫通して、直角な第２チャネル３１６の下方を横切って延びる連続チャネルが形成される。 図１１Ｄに示されるように、基板３１ ４の両側にカバープレート３１８を接合して、基板３１４の両側にあるクロスオーバーチャネル３１５−３１７−３１５、そして３１６を囲み、交わることなく横断するチャネルを有する基板を完成する。 物質をリザーバからアレイの各ウェルへ移送するために、リザーバからの物質を、一本以上のチャネル３１６へ注入できる。 各チャネル内の物質は、キャピラリ作用によって、チャネル３１６沿いに移動する。 しかしながら、一つ以上の反応にかかる時間は、使用する物質の量によって増減し、チャネルを通る物質の速度を速めたり、遅くしたりして補償する必要があるので、チャネル内の物質の流れを、各ウェル、リザーバ、リザーバからウェルに通じるチャネルの中に椎積させたドレイン電極によって制御できることが望ましい。 ウェルに負電荷を発生させることによって、チャネル沿いの流れは止められ、これによって、各ウェルへの試薬供給を制御できる。 ウェル４３６内、チャネル４３８内、リザーバ４４２ 内に形成したドレイン電極４４０を、図１２の平面図に示す。 広範なテストや合成を迅速に、信頼性をもって、安価に、そして同時に行えるように所望のマイクロラボラトリーアレイを設計することができ、コストは大幅に削減される。 更に、マイクロラボラトリーアレイと、情報を調整し、測定し、 記録する手段とを統合化したので、テストの記録およびスクリーニングデータは、信頼性をもって生成され、保存される。 遺伝子スクリーニングは、将来、血液テストとなるかもしれないので、ＤＮＡテストを迅速に、信頼性をもってかつ低コストで行えるこの能力は、極めて有利となろう。 このように、本発明は、特定の例に関して述べてきたが、本発明は、上記詳細に限定されるものではない。 当該技術に精通する者であれば、別の機械的または電気的手段に置き換えて、チャネルやウェルを通して流体を移送したり、様々な結合剤、スタート物質、試薬を置き換えて、異なる検定や合成をおこなったり、 代替方法でチャネルやウェル内にウェル、チャネル、装置を形成することは容易にできる。 例えば、集積回路も、従来の半導体技術や材料を使って、流体を移送したり、アレイのウェルの監視、測定するために使うことができる。 半導体技術は、リードや電極等の形成にも利用できる。 このように、本発明は、以下に述べる請求項によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マクブライド，スターリング，イー. アメリカ合衆国 ニュージャージー州 ロ ーレンスヴィル フィールドクレスト コ ート 4214