Synthesis of the encoded polymer

【発明の詳細な説明】 コードされるポリマーの合成発明の分野 本発明は、生体高分子合成および薬剤設計に関する。 さらに詳細には、本発明は、解読を促進するようにコードされる、含有ポリマーに会合（association） した、生物学的に活性なポリマーのライブラリーを合成する方法に関する。 発明の背景近年の製薬工学は、新規治療化合物の研究において２つに分岐した。 合理的な薬剤設計は、結合部位の分子構造の徹底的な分析、および所望の結合部位を特異的に補足する化合物の設計により結果を成就する。 例えば、新規抗高血圧化合物の調製に関連するものは、X線結晶学および／または高度NMR法により、β-アドレナリンレセプター結合部位の分子構造を分析し得、次に、その結合部位に適合し、そして帯電分布を補足するように設計された化合物を合成し得る。 その他の研究は、化合物の巨大なライブラリーを調製し、所望の活性を示す化合物のみを選択することである。 この研究は、大規模な並行様式でのスクリーニング工程を行って同時に大量の異なる化合物をスクリーニングすることによる、 設計／合成／試験／合成変形の従来の製薬サイクルとは異なる。 この研究の挑戦は、第一に、スクリーニングのための化合物群であって、求められている活性がその群中で示されることを確実にするのに十分な量であり多様である化合物を提供すること、そして第二に、その群中で低濃度で活性化合物を同定することである。 Rutterらの米国特許第5,010,175号には、実質的に当モルのペプチド混合物を得るために、反応速度に比例して各活性化ペプチドの濃度を調節することにより多様なペプチド混合物を調製する方法が開示されている。 さらに、Rutterは、ペプチド混合物（少なくとも50個の異なるペプチド）の提供、および所望の特性を有する１つ以上のペプチドの選択、およびそのペプチドの残りのペプチドからの分離の方法を開示した。 ZuckermannらのPCT第WO91/17823号には、固相樹脂上での多様なオリゴペプチド混合物の代替調製法、および必須操作実施用の自動装置が開示された。 この方法では、樹脂粒子のプールを多数のグループ（各グループは１つ以上の分離反応として定義される）に分離し、各グルーブ内で異なるアミノ酸が樹脂にカップリングした。 次に、そのグループを一緒に混合し、多くのグループに分け、再度、 各グループについて異なるアミノ酸とカップリングさせる。 このサイクルを、オリゴペプチドあたりの所望のアミノ酸数が得られるまで繰り返す。 この研究の１ つの利点は、各カップリング反応が、その他の反応物から単離され、各反応物の初期濃度を注意深く調整することなく、各補足反応を遂行し得ることである。 さらにこの方法は、ペプチド鎖中のいくつかの位置が一定に保たれたオリゴペプチドの調製を促進し、そのいくつかの位置は、全アミノ酸数未満に制限される。 例えば、この方法は、式 X ₁ -X ₂ -X ₃ -Glu-Ala-X ₄ -X ₅ -X ₆ （ここで、 X _nは任意のアミノ酸であり得る）のペプチドを調製するために使用され得る。 所望であれば、例えば、X ₃およびX ₅は疎水性残基に限定され得る。 さらに、Zucker mannは、この方法が、オリゴヌクレオチド合成に適用され得ることを開示した。 このオリゴヌクレオチドは、次に生物学的発現用のクローニングおよび発現ベクターに挿入され得る。 BartlettらのPCT第WO91/19735号には、、非アミノ酸モノマーの多様なセットが、「ペプトイド（peptoid）」と呼ばれる化合物の混合物を形成するために使用される、Zuckermannらの変法が開示された。 ペプトイドは、モノマー間の連結型に依存して、従来のオリゴペプチドより間隔を置いた物理化学パラメーターの異なる領域をサンプリングし、側鎖中の多様性（または差異）によりペプチドライブラリーに得られない活性を示し得る。 Houghtenの米国特許第4,631,211号には、「ティーバッグ（tea-bag）」ペプチド合成法が開示されている。 「ティーバッグ」は、ペプチド合成用の樹脂ビーズを含む網目バッグである。 Houghtenの方法は、生産物を混合することなく、多くの異なるオリゴペプチドに同じアミノ酸を付加し得る。 多くの「ティーバッグ」 は、共通ポット中でアミノ酸と反応し得、次に物理的に分離され得る。 Cookの欧州特許第383620号は、多発性硬化症の治療において活性を有する、平均分子量23 kDaの、Ala、Glu、Lys、およびTyrのランダムポリマーであるCOP-1 の合成を記載した。 COP-1は、アミノ酸の化学重合による先行技術で生産された。 しかし、Cookは、オリゴヌクレオチドのランダム重合により生産された遺伝子からの発現および最高活性を有するCOP-1を発現するクローンの選択を記載した。 Leblらの欧州特許第445915号には、平面支持体表面を使用した、多重同時ペプチド合成を実施するための機械が記載された。 平面支持体は、例えは、紙あるいは綿である。 Kauffmanらの第WO86/05803号には、部分的あるいは全体的に「確率的」である合成遺伝子からの発現による、ペプチドライブラリーの生産が開示されている。 確率的遺伝子は、少なくとも３つのオリゴヌクレオチド（少なくともヘプタマー）の混合物を重合し、二本鎖確率的配列を形成し、発現ベクタに確率的配列を連結することにより調製される。 Lamらの第WO92/00091号には、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、およびペプチド／ヌクレオヂドキメラのライブラリー、ならびに活性化合物に対するライブラリーのスクリーニング方法が開示されている。 しかし、Lamは、活性配列およびコーディング配列を有する結合体（conjugate）を開示しなかった。 K． M． Derbyshireら、 Gene （1986） 46 ：145-52には、モノマーの夾雑プールを使用したオリゴヌクレオチド合成によって、 DNAセグメントの「飽和変異誘発（saturation mutagenesis）」の方法が開示された。 各A、C、G、およびＴのリザーバーは、その他の塩基の各々の1/54部を含有した。 その目的は、配列あたり１つあるいは２つの変異を有するDNAセグメント混合物を調製することであった。 おそらくカップリング率の差異により、等頻度の変異は認められなかった。 純粋塩基を含有する４つのリザーバー、およびカップリング率のバランスを保つのに必要な濃度で４つ全ての塩基の混合物を含有する１つのリザーバーを使用した、配列合成が示唆された。 J． F． Reidhaar-Olsonら、 Science （1988） 241 ：53-57には、２つのコドンをランダムヌクレオチド（NNG/C）に置換することによる、変異体λリプレッサータンパク質の生成が開示された。 得られた変異タンパク質は、活性についてアッセイされ、どのアミノ酸位置が臨界的であるかどうか、そしてどの位置が保存されるどうかを決定した。 I． S． Dunnら、 Prot Eng （1988） 2 ：283-91には、そのうちあるものは未変性配列α-ペプチドより優れた特性を示す、変異β-ラクタマーゼα-ペプチドを生成するランダムポリヌクレオチドの使用が開示された。 A． R． OliphantおよびK． Struhl、 Nuc Acids Res （1988） 16 ：7673-83には、 プロモーター機能を研究するためのランダムポリヌクレオチドの使用が開示された。 ランダムポリヌクレオチドの断片が、E． coliに薬剤耐性を与える遺伝子の- 35から-10領域に挿入され、そして形質転換体が、耐性についてスクリーニングされた。 生存物がクローニングされ、配列決定されて、機能性の共通配列を提供した。 F． W． Studier、 Proc Natl Acad Sci USA （1989） 86 ：6917-21には、コスミドライブラリーのランダムプライミングにより大量のDNAを配列決定する方法が開示された。 A． R． Oliphantら、 Proc Natl Acad Sci USA （1989） 86 ：9094-98には、特性が変化したβ-ラクタマーゼ変異体の、β-ラクタマーゼ遺伝子へのランダムポリヌクレオチドクローニングによる生成が開示された。 D． K． Dubeら、 Biochem （1989） 28 ：5703-07には、特性が変化したβ-ラクタマーゼ変異体の、β-ラクタマーゼ遺伝子へのランダムポリヌクレオチドクローニングによる生成が開示された。 R． A． Owensら、 Biochem Biophys Res Comm （1991） 181 ：402-08には、240,00 0テトラペプチド（22混合物中）のライブラリーからのHIVプロテアーゼインヒビターの選択が開示された。 その混合物は、「混合樹脂」法により調製された。 これらの方法は、多様な化合物のライブラリーの調製を可能する。 しかし、得られた化合物の同定の問題は、めったに焦点をあてられたことはない。 オリゴペプチドは典型的には、親化合物（通常は樹脂に固定化される）から各アミノ酸を逐次切断し、切断部分のクロマトグラフィー分析により、配列決定される。 感度の鋭敏な方法が、20あるいはそれを超えるアミノ酸を区別するのに必要とされる。 分析は、非一般的なアミノ酸が使用されるとき（この方法による）、特にモノマーがアミド結合によらずに連結されるときに、さらに複雑になる。 発明の要旨本発明は、会合されたコーディングポリマーを伴って、多様なオリゴペプチドおよび／またはペプチド様化合物の純混合物を合成する方法を提供し、このコーディングポリマーは、所望の活性を示すそれらの化合物を容易に分析することを可能にする。 本発明は、ペプチド／ペプトイドと共に同時にコーディングDNA鎖を合成することを包含する。 各特有のペプチド／ペプトイド配列は、その特有の、DNA鎖に会合して、本発明の結合体を提供する。 これらの結合体は、どのペプチド／ペプトイド化合物が所望の活性を示すかを決定するためにスクリーニングされ、その活性結合体は、DNA配列決定法により分析されて、推定により、接続される（attached）ペプチド／ペプトイド配列が決定される。 すなわち、各DNA 配列は、既知のペプチド／ペプトイドに会合されるので、そのDNA配列が一旦決定されると、ペプチド／ペプトイド配列は推定される。 本発明のその他の局面は、コーディングポリマー（CP）、例えば、核酸（NA） にカップリングおよび／または直接会合したペプチドまたはペプトイドを有する結合体である。 ペプチド／ペプトイド／CP結合体は、直接に（すなわち、直接あるいは小有機分子を介する共有結合）、あるいは、同じ支持体に連結することにより（例えば、樹脂の同じ粒子あるいはビーズ上でペプチド／ペプトイドおよびCP鎖の両方を合成することによる）、連結され得る。 本発明の重要な目的は、DNA鎖のような特有のコードされるポリマーを伴ったペプチドおよび／またはペプトイドのライブラリーの生産を可能にする化学合成法を提供することであり、このコードされるポリマーは、そのペプチドまたはペプトイドの配列を容易に決定することを可能にする。 本発明の利点は、その方法論が、所望の生物学的活性を有するペプチドおよび／またはペプトイドを、容易に同定および配列決定することを可能にすることである。 本発明の特徴は、非一般的なアミノ酸を含有するペプトイドあるいはペプチドの配列が、ペプトイドと同時に合成され、それらをコードする、DNA配列のような会合されたポリマーを配列決定することにより、容易に決定され得ることである。 本発明の、これらおよびその他の、目的、利点、および特徴は、本明細書の一部をなす添付の図面を参照し、以下により十分に記載されている構造、合成、および使用の説明を読むことにより、当業者には明白になる。 図面の簡単な説明図１は、本発明の結合体の特定の実施態様を示す略図であり、結合体は、固体支持基材に接続された「結合」鎖あるいは活性ポリマーを含み、この基材はまた、情報蓄積部あるいは「コーディング」鎖を結合している。 図２は、コードされるライブラリーが、固体支持基材としてのビーズ上でどのようにして合成され得るかを示す、略流れ図である。 図３は、固相および液相ライブラリーの合成法を示す略図である。 図４は、非水和性樹脂の誘導体化により生じた樹脂担持ライブラリーを示す略図である。 図５は、非水和性樹脂連結を介して同時に合成された結合ペプチド鎖およびコーディングペプチド鎖のHPLCクロマトグラムである。 図６は、水和性樹脂連結を介して合成されたコーディング鎖および結合鎖付加物のHPLCクロマトグラムである。 図７は、結合／コーディング配列に対する結合配列のELISA競合のプロットを示す。 図８は、固相アンプタイド（amptlde）分析を示す略図である。 図９は、液相アンプタイド分析を示す略流れ図である。 好ましい実施態様の詳細な説明本発明の合成法、結合体、およびこれを使用する方法を記載する前に、本発明は、このように記載された特定の方法論、結合体、あるいは使用に限定されず、 これらは無論のこと変化し得ることが理解されるべきである。 さらに、本明細書に使用されている用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することは意図しない。 本明細書および添付の請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「 an」、および「the」は、その他に内容が明白に記載されていなければ、複数概念も包含する。 従って、例えば、「ペプチド」には、ペプチドの混合物が包含され、「アミノ酸」には、その混合物が包含され、そして「反応」には、一般的に当業者に理解されるような、同じ型の１つ以上の反応が包含される。 その他に全く定義されていないときには、本明細書に使用されている全技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。 本明細書に記載されているものと同じかあるいは等価である方法および材料が、本発明の実施あるいは試みに使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。 本明細書に掲載されている全刊行物は、参考文献が関連して掲載されている特定の情報を記載および開示するために、参考として援用されている。 概して、本発明は、結合体が、ペプチド／ペプトイド配列、例えば、特有のコーディング配列（例えば、DNA配列）と会合したアミノ酸配列、から構成される多量の結合体を合成するための迅速方法を提供する。 結合体は容易に合成され得、その後、生物学的活性についてスクリーニングされ得、そして活性が認められるときには、その活性が認められた特定のペプチド／ペプトイド配列が、その会合されたコーディング（DNA）鎖によって容易に同定され得る。 本発明の各結合体は、少なくとも２つの成分から構成され、その成分の１つは、 目的のレセプターに結合するペプチドまたはペプトイド配列であり、他の１つの配列は、結合配列をコードするポリマーである。 本発明は、標準アミノ酸およびコーディングモノマーとしてDNAを使用して、液相あるいは固相結合体の化学的に多様なライブラリーを生産し得る。 さらに本発明を詳細に記載するために、以下の定義を提供する。 A． 定義用語「核酸」および「NA」は、標準的なDNA配列決定法により配列決定され得るDNAおよび／またはRNA塩基から構成されたオリゴマーのことである。 本明細書に使用されているNAは、このような塩基が、使用されるべきDNA配列決定法で用いられるその他の塩基と区別されるかぎり、非一般的な塩基を包含し得、そして、ペプチド-核酸（PNA）（Nielsen，PE，Egholm，M.，Berg，RH，およびBuc hardt，O.， Science （1991）254、1497-1500によって開示された）を包含し得る。 このようなPNAは、コーディング鎖として機能し得、その検出は、ハイブリダイゼーションによってなされる。 NAは通常、ホスホジエステル結合によって連結されたモノマーから構成されるが、所望であればその他の同様の連結が置換され得る。 例えば、ホスホロチオエートが、不安定性を減少させるために使用され得る。 本明細書に使用されているように、用語「ペプチド」とは、20の通常天然に存在するアミノ酸のことである：アラニン（A）、システイン（C）、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）、フェニルアラニン（F）、グリシン（G）、ヒスチジン（H）、イソロイシン（I）、リシン（K）、ロイシン（L）、メチオニン（M ）、アスパラギン（N）、プロリン（P）、グルタミン（Q）、アルギニン（R）、 セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）、トリプトファン（W）、およびチロシン（Y）。 本明細書に使用されているように、用語「ペプトイド」とは、一般式（R） _n -X -（L） _mの非ペプチド性モノマーのことであり、ここで、Rは側鎖基であり、nは少なくとも１であり、Lは連結基であり、mは少なくとも２であり、そしてXは小有機ラジカルである。 個別に保護され、そして脱保護され得るLラジカルを選択することが好ましい。 好ましくは、nは１あるいは２であり、mは２である。 mが３あるいはそれを超えるモノマーは、分枝活性ポリマーを形成するために使用され得る。 本発明で好ましいモノマーは、下式のN置換グリシン誘導体である。

ここで、Rは、2-6個の炭素原子のアルキル、1-6個の炭素原子のハロアルキル（ ハロはF、Cl、Br、あるいはI）、2-6個の炭素原子のアルケニル、2-6個の炭素原子のアルキニル、3-8個の炭素原子のシクロアルキル、2-8個の炭素原子のアルコキシアルキル、6-10個の炭素原子のアリール、7-12個の炭素原子のアリールアルキル、ハロおよびニトロおよびヒドロキシから独立的に選択される1-3個のラジカルで置換された7-12個の炭素原子のアリールアルキル、1-6個の炭素原子のアミノアルキル、1-6個の炭素原子のヒドロキシアルキル、カルボキシ、2-6個の炭素原子のカルボキシアルキル、3-10個の炭素原子のカルボアルコキシ-アルキル、カルバミル、2-6個の炭素原子のカルバミルアルキル、イミダゾリル、4-10個の炭素原子のイミダゾリルアルキル、ピリジル、6-10個の炭素原子のピリジルアルキル、ピペリジル、5-10個の炭素原子のピペリジルアルキル、インドリル、あるいは9-15個の炭素原子のインドリルアルキルである。 従って、これらのモノマーで構成された活性ポリマーは、各窒素原子に接続された側鎖を有するポリグリシンと等価である。 これらおよびその他のモノマーは、本明細書に参考として援用されている係属中の出願てある米国特許出願第07/715,823号、およびPCT第WO91/19735号に記載されている。 用語「コーディング（coding）」および「コーディング（encoding）」は、１ つ以上のコーディングモノマーが、特定の活性モノマーに直接および比類なく対応することを示す。 例えば、従来の核酸は20の天然アミノ酸をコードする（３群で）。 各コードに使用されるコーディングモノマー数は、異なるコーディングモノマー数および異なる活性モノマー数に依存する。 典型的には、使用される異なる活性モノマー数は、約５から約30である。 ４コーディングモノマーの基本セットが、２コーディングモノマーの「コドン」を採用して、16までの活性モノマーをコードし得る。 コーディングモノマー基本セットが５つの異なるモノマーにまで増加することにより、25までの異なるペプチド／ペプトイドモノマーをコードし得る。 ４コーディングモノマーの基本セットは、３コーディングモノマーの「 コドン」を採用して、64までのペプチド／ペプトイドモノマーをコードし得る。 そのコードは、縮重あるいは非縮重であり得、さらなるコーディング情報がその配列中に挿入され得ることに注目のこと。 例えば、各コドンを同じ塩基（例えば、G）で開始することを望み得れば、最初の位置にのみその塩基を使用し、このため各コドンの始まりを明確に同定し得る。 実際的なこととして、コーディングモノマーとしての使用に選択されるモノマー群は、活性ポリマーより配列決定がより容易であるポリマーを形成する。 すなわち、 コーディングモノマーは、活性ポリマーのモノマーに比較して、今日の配列決定法を用いて、より容易に同定され得る。 この技術による、コーディングモノマーの好ましい順位は、核酸＞ペプチド＞ペプトイドである。 核酸は、コーディング配列が、当該分野に周知であるクローニングあるいはPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法によって増幅され得るというさらなる利点を有する。 用語「活性ポリマー」および／または「結合ポリマー」とは、所望の生物学的活性を有するポリマーのことである。 適切な生物学的活性には、天然レセプターへの結合、薬学的効果、免疫原性／抗原性などが含まれる。 「免疫原性」とは、 投与後に鳥類あるいは哺乳動物で、免疫応答（全体的あるいは部分的な血清仲介免疫および／または細胞仲介免疫）を刺激する能力のことである。 抗原性は、活性ポリマーが、抗体の抗原結合部位に結合することのみを必要とする。 本発明の目的に対する薬学的活性は、一般的には、活性ポリマーが、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、あるいは被験体に存在するその他の化合物に結合する能力に依存する。 例えば、活性ポリマーは、細胞表面レセプターに結合し、そして、レセプターの活性化を伴うか伴わずに、レセプターの天然リガンドと競合し得る。 その他の有用な薬学的活性には、内生分子の切断（例えば、プロテアーゼ活性、核酸活性など）、主としてのあるいは補因子としてのいすれかの反応触媒、官能基（例えば、アシル、ATP、アルキルなど）の供与、孔形成などが含まれる。 活性ポリマーは、逐次的に連結される一連のモノマーを含む。 そのモノマーは、本発明の実施においては一般的に、ペプチド、ペプトイド、あるいは炭水化物である。 本明細書に使用されているように、用語「混合物」とは、１つの容器内に複数の同類成分を有する組成物のことである。 本明細書に使用されているように、用語「カップリングする」とは、共有結合の形成のことである。 用語「カップリング部分」とは、１つ以上の活性モノマーおよび対応のコーディングモノマーが接続され得る、可溶性あるいは不溶性の支持体のことである。 不溶性支持体（「固体支持手段」）は、活性ポリマーおよびコーディングポリマーの合成に必要な反応条件に対して安定な、任意の固体あるいは半固体の表面であり得、そして、両ポリマーの共有結合による接続および固定化に適し、例えば、MBHA、Rinkなどのような、DNAおよびペプチド合成に一般的に使用されるほとんどの樹脂である。 使用される特定の樹脂は、コーディングポリマーおよび活性ポリマーの選択、およびそれらの会合される合成化学物質に依存する。 可溶性カップリング部分は、活性モノマーおよびコーディングモノマーが接続され得る官能基を有する分子である。 活性ポリマーおよびコーディングポリマーは1：1の割合で存在する必要はないが、各可溶性カップリング部分は、少なくとも１つのコーディングポリマーおよび少なくとも１つの活性ポリマーを収容し得なければならない。 可溶性カップリング部分は、その側鎖に官能基を有するアミノ酸と同程度に単純であり得るか、あるいは機能化（可溶性）ポリマーと同程度に複雑であり得る。 本明細書に使用されているように、用語「結合体」は、任意の「活性ポリマー」およびその会合「コーディング」ポリマーの組合せのことである。 結合体は、 「カップリング部分」を用いて、あるいは、２つのポリマーが互いに会合されるように互いを密接に近接させて、同じ支持体表面に「活性ポリマー」と「コーディングポリマー」とを結合させることにより、形成され得る。 両ポリマーが、小ビーズのような同じ支持体表面に結合するとき、コーディングポリマーは、ビーズから容易に切り離されて配列決定され得、一旦コーディング配列が判明すると、ビーズ上に残った他方の「活性ポリマー」が同定される。 B．

関連ライブラリーおよびそれを生産するための合成方法論ペプチドライブラリーのレセプター結合特性を調べる最近の技術には多くの限界がある。 繊維状バクテリオファージライブラリーは、今日までのあらゆる最新技術によるペプチド多様性（約10

⁷ -10

⁸の異なる成分）の最大の材料源を提供する（Scott，J．およびSmith，G.，

Science ，（1990），249，386-390；Devlin， J.，Panganiban，L．およびDevlin，P.，

Science ，（1990），249，404-406；Cw irla，S.，Peters，E.，Barret，R．およびDower，W.，

Proc．Natl．Acad Sci．

U．S．A.， （1990），87，6378-6382）。 しかし、これらのライブラリーは、 天然のアミノ酸セットに限定され、生物学的片寄り（すなわち、成長、タンパク質分解などの速度の変化）を受け、さらに実施において、高レベルのバックグラウンド結合を受ける。 本発明は、これらの困難を克服するように設計されている。 多重ペプチド合成技術は、個別のペプチドを生産する能力を実質的に増大した（Geysen，H.，Meloen，R．およびBarteling，S.，

Proc．Natl．Acad．Sci．U．

S．A. ，（1984），81，3998-4002；Houghten，R.，

Proc．Natl．Acad．Sci．U．

S．A. ，（1984），5131-5135；Schnorrenberg，G.およびGerhardt，H.，

Tetrahe

dron ，（1989），45，7759-7764；Gausepohl，H.，Kraft，M.，Boulin，C.およびFrank，R．

Peptides：Chemlstry，Structure and Biology（Proceedings of t

he llth American PeDtide Symposium ，（1990），Rivier J．およびMarshall， rlng，R.，

Tetrahedron ，（1988），44，6031-6040；Fodor，S.，Read，J.，Pir rung，M.，Stryer，L.，Lu，A．およびSolas，D.，

Science ，（1991），251，76 7-773）。ガラス薄板１cm

²あたり約10

⁴の個別のペプチドの合成は、この技術の多様性の限界を示す（Fodor，S.，Read，J.，Pirrung，M.，Stryer，L.，Lu，A ．およびSolas，D.，

Science ，（1991），251，767-773）。 487-493）が、液相ライブラリー（Houghten，R.，Pinilla，C.，Blondelle，S. ，Appel，J.，Dooley，C．およびCuervo， J.，

Nature ，（1991），354，84-86）および樹脂担持ペプチドライブラリー（La m，K.，Salmon，S.，Hersh，E.，Hruby，V.，Kazmiersky，W.およびKnapp，R.，

Nature ，（1991），354，82-84）を生成するために近年使用されており、それぞれに、約10

⁶および約10

⁷成分が含有される。 液相ライブラリーは、定量的なレセプター結合情報を提供するという利点を与える（Zuckermann，R.，Kerr，J.，Si ani，M.，Banville，S．およびSanti，D．V.，

Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，89，4505-4509（1992））。 さらに、これらのライブラリーにより、リガンドの液コンフォメーションの親和性が決定され得、合理的な薬剤設計に必要な量が決定される。 当モルペプチド混合物の自動合成のための装置が、Zuckermann，RN，Kerr，JM，Siani，MAおよびBanville，SC，

Int．

J．

Pep．

Pro．

Res. ，（1992），40，498-507に開示されている。 上記に掲載および考察された刊行物は、本発明の結合体の生産に使用される活性ポリマーあるいは結合ポリマーを生産するために使用され得る。 従って、これらの全刊行物の開示は、ペプチドおよびペプトイド合成方法論を開示するために、参考として本明細書に援用されている。 これらの参考文献に考察されている方法論は、異なる型の結合ポリマーの大量生産に関して非常に有益であるが、この方法論で生産されたポリマーの混合物は、しばしば大きくて複雑であり、実際的な分析および使用に関して、多くの実施上の制限が存在する。 本発明は、このような方法論により生産されたタンパク質を分析する、効率的で商業上実際的な方法を提供するために、このような合成方法論によって、容易に適用され得る。 しかし、混合樹脂法および液相法では、ペプチド合成の限界により、多くの非標準アミノ酸を取り込むことができない。 特に、樹脂担持ペプチドライブラリーは、相対的に分析速度が遅く（ペプチド配列決定は１日あたり３ビーズ）、複雑度（complexity）は約10

⁷ビーズ／mlに制限される。 「完全」ペプチドライブラリーを生成するために、任意の特定ペプチド配列の多重コピー（＞10）が存在しなければならない。 これは、同じ「ヒット（hit）」配列が何度も生じ得るので、配列決定段階で問題になる。 その代替法は、結合する配列を失うことを覚悟して、完全でないライブラリーで操作することである。 本発明の方法論によるときには、生物学的に活性なタンパク質の配列は、目的のタンパク質を単離することなく容易に決定され得る。 これは、小ビーズのような、多数の異なる支持体表面上で、大量の異なるタンパク質を合成することによりなされ得る。 コーディングポリマーは、ビーズに接続され、各タンパク質を同定する。 次に、試験されるべきサンプルがビーズと接触させられて、そしてそのビーズが、タンパク質がサンプル中のレセプター部位に結合することに関して観察される。 それに結合したレセプターを有するビーズが、これもまたビーズ上で合成されたコーディングポリマーを配列決定することにより分析される。 コーディングポリマーが配列決定されたとき、活性ポリマー（ペプチドであり得る）の配列は、容易に推定され得る。 従って、本発明は、活性を決定し、生物学的に活性なペプチドのような活性ポリマーを、そのペプチドを単離することなく、配列決定することを可能にする。 C．

一般的な方法論本発明には、非標準アミノ酸および非アミドベースポリマーをも含む大きな合成ポリマーライブラリーを、合成およびスクリーニングするための方法論が記載される。 その戦略は、同時に２つのポリマー配列を合成するために、改変された混合樹脂ペプチド合成方法論を使用する：その１つのポリマー鎖（「結合」鎖） は、レセプター結合を目的として合成され、そして第二の鎖（「コーディング」 鎖）は、標準アミノ酸、あるいは、結合鎖をコードするデオキシリボヌクレオチドを含む（図１）。 標準的なペプチド法あるいはオリゴヌクレオチド法を用いるコーディング鎖の分析によって結合配列を解読することができると、多様なリガンドライブラリー中に、広範囲の新規構築ブロックおよびコンフォメーション拘束を加えることが可能になる。 本発明にはさらに、リガンドライブラリーの大きさを増大（＞10

⁸ ）し、スクリーニング速度を増大させる方法論が記載される。 この方法は、上記のように２ つのポリマーを使用するが、特に「コーディング」鎖にオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用する。 コーディング鎖としてのDNAの使用により、 検出感度を増すことが可能になる（ペプチド分析に対するfmol対pmol）。 この感度の増大により、検出に必要とされるポリマー量が劇的に減少するので、ライブラリーの大きさをより大きくすることが可能になる。 レセプター結合因子（bind er）の配列決定速度は、多くのサンプルが並行して分析され得るので、増大する。 ポリマーの配列情報と、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチド配列とをカップリングするために、各ポリマーを互いに明確に相関させる方法が必要とされる。 従って、いずれの特定の非標準アミノ酸（あるいは、その他のモノマー）もが「 結合」ポリマー鎖に付加されるとき、対応情報（アミノ酸あるいはヌクレオチドモノマー）もまた「コーディング」鎖に付加されなければならない。 従って、「 遺伝コード」は、各結合モノマーが、コーディング鎖上の（複数の）標準的なアミノ酸あるいはヌクレオチドに対応するように確立される（表１）。 例えば、３ つの標準的なアミノ酸あるいはヌクレオチドを新規モノマーと3：1の割合で使用することは、27の新規モノマーを明確に示し得る。 コード化ライブラリーの合成は、改変混合樹脂演算法を必要とする（図２）。 樹脂ビーズは、等比で分けられ、特定のモノマーが「結合」鎖に付加され、その後、対応アミノ酸あるいはヌクレオチドが「コーディング」鎖にカップリングされる。 次に、樹脂の一部を混ぜて混合物を生成させる。 従って、適合する保護基のセットが、好ましく脱保護して独立して各鎖を伸長させるために必要とされる。 ２つの合成型が、アンプタイドライブラリーに対して可能であり、１つは、樹脂担持ライブラリーを生成し、もう一方は、液相ライブラリーを生成する（図３ ）。 樹脂担持ライブラリーは、「結合」モノマー鎖および「コーディング」モノマー鎖によって誘導体化された非水和性リンカーを使用して合成され得る。 液相ライブラリーは、水和性リンカーを介して樹脂に接続された、1：1のポリマー：ペプチド／DNA結合体として合成され得る。

「コーディング」鎖としてのペプチド塩基不安定性Fmoc保護モノマーおよび酸不安定性（N

^α -Ddz-保護アミノ酸（Bi rr，C.，Nassal，M.，Pipkorn，R.，

Int．Ｊ．Peptide Protein Res. ，（1979） ，13，287-295）を用いることにより、例えば、選択的脱保護および２つの個別ポリマー鎖へのカップリングが可能になる。樹脂担持ライブラリーは、1：1比（ あるいは、いずれもの所望比）のFmoc：Ddzモノマーによる非水和性樹脂の誘導体化により生成され得る（図４）。これは、独立的に伸長され得る２つの異なる保護アミノ酸を導入する。1：1比の結合鎖：コーディング鎖を含有する液相ライブラリーは、α-アミノ基およびε-アミノ基の両方で鎖の伸長を可能にする水和性Fmoc−リシン（Moz）-OHリンカーを使用することにより合成され得る。官能基を含まないアミノ酸は、望ましくない結合相互作用を最小限にするために、「コーディング」鎖に好ましい。 レセプター結合リガンドは、ビーズ染色法によって同定され得（Lam．K.，Sal mon，S.，Hersh，E.，Hruby，V.，Kazmiersky，W．およびKnapp，R.，

Nature ， （1991），354，82-84）、そして配列は、N末端エドマン分解によって決定される。「コーディング」鎖のみが配列決定されることを確実にするために、「結合」鎖のN末端はアセチル化されるか、あるいは他に配列決定されないようにすることが必要である。

「コーディング」鎖としてのDNAコーディング鎖としてのDNAを有するライブラリーの構築は、ペプチドを有するものと同様であるが、いくつかの利点を提供する：DNAの情報蓄積および複製特性は、検出感度の増大、より大きなライブラリーの大きさ、および配列決定速度の増大を可能にする。 コーディングポリマーとしてのDNA合成は、Fmoc-ベースモノマーの組立と標準的なDNA化学物質との間の適合性を必要とする。これらの合成戦略は、適合しているようである（（ａ）Juby，C.，Richardson，C.およびBrousseau，R.，

Tet．

Letters ，（1991），32，879-882．（b）Haralambidis，J.，Duncan，L.，Angus ，B.およびTregear W.，

Nucleic Acid Res. ，（1990），18，493-499）（表２を参照のこと）。 あるいは、アリルベースの保護の戦略が、ペプチド（Lyttle，M. H．：Hudson，D.，

Peptldes：Chmistry and Biology（Proceedins of the 12th

American Peptide Symposium ）：Smith，J．およびRivier，J．E.，編．；ESCOM ，Leiden，1992，583-584頁）およびオリゴデオキシリボヌクレオチド（Hayakaw a，Y.，Wakabayashi，S.，Kato，H．およびNoyori，R.，

J．Am．Chem．Soc. ，（ 1990），112，1691-1696）の両方の合成に対して存在する。 液相ライブラリーのアッセイは、コーディング鎖にピリミジンのみを使用することにより促進され得、それにより個別の鎖間で塩基が対合するという潜在的な問題を回避する。 コーディングポリマーおよび活性ポリマーの合成のための戦略、および、遺伝タッグを提供するための、活性ポリマーのコーディングポリマーとの適正さ（ma tching）は、本明細書に参考として援用されている、Brennerら、

Proc．

Natl．

A

cad．

Sci．

USA ，

89 ：5381-5383（1992年6月）に記載されている。 樹脂担持ライブラリーは、非水和性リンカーを、ペプチドのＣ末端およびオリゴヌクレオチドの3'末端の両方を同じビーズに接続するために使用することにより、合成され得る。 液相ライブラリーは、1：1のペプチド-オリゴヌクレオチド結合体として合成され得、そこでは、ペプチドのＣ末端が、樹脂に接続される水和性Fmoc-Ser（O-Dmt）リンカーを介して、オリゴヌクレオチドの3'末端に接続される。 樹脂担持ペプチドライブラリー中の結合因子の同定は、ビーズ染色方法論によって検出され得る（Lam．K.，Salmon，S.，Hersh，E.，Hruby，V.，Kazmiersky ，W.およびKnapp，R.，

Nature ，（1991），354，82-84）。 ペプチドは固相に結合されるが、DNAはその配列が決定される前に増幅され得るので、1：1のペプチド-オリゴヌクレオチド比である必要はない。 事実、ポリマーの結合特性による妨害を少なくするために、DNAはより少ないことが好まれる。 一旦、ビーズが同定されると、DNA配列は、PCR増幅後あるいは熱サイクル配列決定によって決定される（Stahl，S.，Hultman，T.，Olsson，A.，Mois，T.ら、

Nucleic Acid Res. ，（1988），16，3025-3038）（図８）。 これは、オリゴヌクレオチドのコーディング領域に隣接する、１つ以上のプライマー部位の含有を必要とする。 同様に、液相ライブラリーの使用は、各配列の互いからの単離を必要とする。 これは、 PCR増幅後DNAを制限酵素処理し、クローンの単離のためにそれをMl3（あるいは、その他の適切なベクター）に挿入し、そして配列決定することにより達成され得る（図９）。

実施例以下の実施例は、本発明をいかに実施および使用するかを完全に開示するために当業者に提供するが、本発明の範囲を限定することを意図しない。 使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確であることが期されているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。 他に示されていない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏度、そして圧力は大気圧または近似大気圧である。

実施例１ ２つの明確な相関した配列の独立した合成が、首尾よく完了した。 次の「コーディング」鎖の配列分析もまた実証された。 便宜上、２つのペプチド配列を選択した。 「結合」鎖を、N

^α -Fmoc-保護アミノ酸を用いて合成し、「コーディング」鎖を、N

^α -Ddz-保護アミノ酸を用いて合成した。 ２つのペプチド鎖の同時合成を、２つの型で試験した：1）樹脂担持ペプチドライブラリー合成、および2）水和性Fmoc-Lys（Moz）-OHリンカーを使用した液相ペプチドライブラリー（Wang， SS．；Chen，ST，Wang，KT，およびMerrifield，RB，

Int．J．Peptide P

rotein Res. ，（1987），30，662-667）。 これらの合成を、研究概念の実証として、そして、合成産物の全特徴を考慮するために、１つのペプチド（ライブラリーではない）で実施した。 A．

樹脂担持ライブラリーモデルの合成

合成スキーム ： TFA脱保護後に、モデルライブラリービーズは、２つの独立的に合成された配列を有し、アッセイ用に準備される。 コーディング鎖のみが遊離α-アミノ基を有し、そしてN末端エドマン分解によって特徴づけられ得る。 結合鎖はアセチル化され、従って配列決定を妨害しない。 ２つのペプチドは、HFで樹脂から切断され、そのことによって、遊離ペプチドとして「結合」配列および「コーディング」配列の両方が提供される。 アミノ酸組成、質量分析、およびN末端配列決定のデータは、正確な産物と一致する。 （図５、６、および７を参照のこと。）

質量分析 ：

アミノ酸組成 ：

樹脂ビーズのＮ末端エドマン配列決定（コーディングペプチドのみ） ：

実施例２

液相ペプチドライブラリーモデルの合成本実施例では、「結合」鎖および「コーディング」鎖間の1：1の液相付加物を合成し、十分に特徴づけを行った。 「結合」鎖をFmoc-保護モノマーで組み立て、「コーディング」鎖をDdz-保護モノマーで組み立てた。

合成スキーム ： TFA切断および脱保護後、モデル液相ライブラリーは、1：1 Fmoc/Ddz複合ペプチドを含む。 反応産物を十分に特徴づけるために、１つのペプチド配列を合成し、混合物ではなかった。 アミノ酸組成および質量分析データは、正確な産物と一致する。 さらに、「結合」および「コーディング」ハイブリッドペプチドを、競合ELISA法で試験した。 ELSTRPnL「結合」配列は、マイクロモル以下の親和性で、抗gp120抗体に結合する。 この値は、「コーディング」ペプチドの存在による影響はなかった。

質量分析 ： 理論値 実測値Fmoc/Ddzペプチド結合体： 1492.7 1492.6

アミノ酸組成 ： 本発明は、最も実際的で好ましい実施態様であるとみなされるものについて示し、説明している。 しかし、本発明の範囲内の逸脱が本明細書の開示からなされ得、そして当業者がこの開示を読むことにより明白な改変が生じ得ることが認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】 ター部位に結合することに関して、決定がなされる。 活性結合タンパク質が決定されるとき、その活性ポリマーに会合されたコーディングポリマーが配列決定され、そして推定により、活性ポリマーの配列が決定される。