Production method and quantification method using the fluorescent dye compound containing colloidal silica particles |
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申请号 | JP2009284588 | 申请日 | 2009-12-15 | 公开(公告)号 | JP5356204B2 | 公开(公告)日 | 2013-12-04 |
申请人 | 古河電気工業株式会社; 国立大学法人徳島大学; | 发明人 | 英樹 會澤; 典雄 大久保; 教泰 中村; 弘一 三好; | ||||
摘要 | Colloidal silica particles containing a fluorescent dye compound, composed of a silica particle containing a silica component and a fluorescent dye compound chemically bound or adsorbed thereto, wherein the colloidal silica particles containing a fluorescent dye compound have an average diameter of 30 nm or less, and wherein said silica particles are used simultaneously as fluorescent-labelling nanobeads; a fluorescent nano-material comprising said colloidal silica particles; and a biochip and an assay method using the same. | ||||||
权利要求 | 以下の[i]〜[iii]の工程 および(A)〜(D)の条件で調製することを特徴とする蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の製造方法。 [i]蛍光色素化合物(1)とシランカップリング剤(2)とを 、1:0.5〜1:2(モル比)で反応させて、色素シランカップリング剤複合化合物(3)を生成させる工程[ii]前記[i]で得られた色素シランカップリング剤複合化合物(3)を、シリカ化合物(4)と 、前記色素シランカップリング剤複合化合物1モルに対するシリカ化合物の割合をモル比として50〜40,000として重合させて蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)を形成する工程[iii]前記[ii]で得られた蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)を前記第1の分子認識物質を分子認識する第2の物質で修飾する工程 <(A)前記シランカップリング剤が、アミノ基を有するシランカップリグ剤である> <(B)前記シリカ化合物が、テトラエトキシシラン(TEOS)、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、3−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3−イソシアナトプロピルトリエトキシシランからなる群から選ばれる少なくとも一種である> <(C)前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)は、その表面に、アクセプター基として、水酸基、チオール基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基、SCN基、エポキシ基、及び/又はCNO基を有する> <(D)前記蛍光色素化合物が、下記式Cy3で表される化合物、下記式Cy5で表される化合物、 前記蛍光色素化合物がシリカ粒子の表面近傍ないしは表面まで分散している請求項 1に記載の製造方法。 前記蛍光色素化合物の粒子中の濃度が35〜75mmol/Lである請求項1 または2に記載の製造方法。 請求項1〜 3のいずれか1項に記載の製造方法で製造された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いた 検出もしくは定量方法であり、 検体中の標的生体分子が第1の分子認識物質によって修飾されている生体分子の検出もしくは定量方法であって、次の工程 [I]〜[III]を含んでな り、かつ条件(a)〜(i)のいずれかを満たしてなることを特徴とする生体分子の検出もしくは定量方法 。 [I]基板上に固定した標的生体分子認識分子と、前記標的生体分子とを分子認識させる工程、 [II]前記第1の分子認識物質を分子認識する第2の物質によって表面修飾された、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子であって、少なくとも1種の前記蛍光色素化合物が前記シリカ粒子全体に分散しており、その平均粒径が30nm以下である蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を、基板上に固定した前記標的生体分子認識分子と分子認識した後の前記標的生体分子と分子認識させる工程 、 [III]基板上の前記コロイドシリカ粒子の蛍光を検出もしくは定量する工程 、 (a)前記第1の分子認識物質が抗原であり、かつ前記第2の物質が抗体である、 (b)前記第1の分子認識物質が抗体であり、かつ前記第2の物質が抗原である、 (c)前記第1の分子認識物質がビオチンであり、かつ前記第2の物質がアビジンもしくはストレプトアビジンである、 (d)前記第1の分子認識物質がアビジンもしくはストレプトアビジンであり、かつ前記第2の物質がビオチンである、 (e)前記第1の分子認識物質が糖もしくは糖鎖であり、かつ前記第2の物質がそれに特異的に結合する糖結合タンパク質である、 (f)前記第1の分子認識反応物質が糖結合タンパク質であり、かつ前記第2の物質がそれに特異的に結合する糖もしくは糖鎖である、 (g)前記第1の分子認識物質がリガンドであり、かつ前記第2の物質がそれらに特異的に結合する受容体である、 (h)前記第1の分子認識物質が受容体であり、かつ前記第2の物質がそれに特異的に結合するリガンドである、及び(i)前記第1の分子認識物質が化学物質であり、かつ前記第2の物質がそれに特異的に結合する抗体もしくはペプチドである。 請求項1〜 3のいずれか1項に記載の製造方法で製造された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いた 検出もしくは定量方法であって、 蛍光標識用抗体として、標的生体分子の抗体認識部位を認識する抗体によって表面修飾された、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子であって、少なくとも1種の前記蛍光色素化合物が前記シリカ粒子全体に分散しており、その平均粒径が30nm以下である蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いる二抗体サンドイッチ式検出もしくは定量方法。 請求項1〜 3のいずれか1項に記載の製造方法で製造された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いた 検出もしくは定量方法であって、 検体中の標的生体分子を、標的生体分子の抗体認識部位を認識する抗体によって表面修飾された、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子であって、少なくとも1種の前記蛍光色素化合物が前記シリカ粒子全体に分散しており、その平均粒径が30nm以下である蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子で標識する工程、 基板上に固定した標的生体分子認識分子と、前記コロイドシリカ粒子で標識した標的生体分子とを分子認識させる工程、及び 基板上の前記コロイドシリカ粒子の蛍光を検出もしくは定量する工程を含んでなることを特徴とする生体分子の検出もしくは定量方法。 前記標的生体分子が、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド又は化学物質であることを特徴とする請求項 4〜6のいずれか1項に記載の生体分子の検出もしくは定量方法。 請求項 1〜3のいずれか1項に記載の製造方法で製造された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いた 検出もしくは定量方法であって、 標的生体分子の抗体認識部位を認識する抗体によって表面修飾された、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子であって、少なくとも1種の前記蛍光色素化合物が前記シリカ粒子全体に分散しており、その平均粒径が30nm以下である蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いて、検体中の標的DNA又は標的RNAを標識し、これを基板上に固定したDNA又はRNAとハイブリダイズした後、基板上の前記コロイドシリカ粒子の蛍光標識シグナルを検出もしくは定量することを特徴とするDNA又はRNAの検出 もしくは定量方法。 2種以上の標的生体分子を同時に検出もしくは定量することを特徴とする請求項 4〜8のいずれか1項に記載の生体分子の検出もしくは定量方法。 |
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说明书全文 | 本発明は、 蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の製造方法およびこれを用いた定量方法に関する。 テーラーメイド医療、早期診断といった先端医療分野において、バイオチップを用いた診断技術が注目されている。 バイオチップとは、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質などの生体分子あるいは生理活性物質を、捕捉分子として基板上に整列化させ固定化したデバイスの総称である。 しかしながらDNAチップを始めとするバイオチップは、蛍光標識に使用する色素が退色し易いことから、得られるデータの再現性が低く、臨床に応用できるだけのデータの信頼性に欠けていることが課題である。 有機色素を安定化する方法として有機色素をシリカ粒子に閉じ込めた蛍光シリカ粒子が知られている(例えば、非特許文献1〜3参照。)。 本発明は、上述のような問題点を解消するため、同時に用いられる蛍光標識ナノビーズとして、複数個からなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子、遊離の前記蛍光色素化合物に対して、輝度を増加させ、かつ前記蛍光に耐退色性を与えた蛍光標識ナノビーズとしてバイオチップに用いられる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の製造方法 、前記コロイドシリカ粒子からなるナノ蛍光材料、前記シリカ粒子を用いたバイオチップ及び生体分子の定量方法を提供することを課題とする。 本発明によれば、以下の手段が提供される: 下記DY550、5−TAMRA、BODIPY−TMR−X、 下記DY630、DY631、DY633、DY635、DY636、DY650、およびDY651から選ばれる少なくとも1つである。 > (式中、R 5 、R 6 、R 7 、R 8 、R 11 、R 12 、R 13 、R 21 、R 22 、R 23 、R 24 、R 25 、R 26 、R 27 は、それぞれ、活性エステル基、シアノ基、またはアルデヒド基である。)
1〕に記載の製造方法。
検出もしくは定量方法であり、
[I]〜[III]を含んでな り、かつ条件(a)〜(i)のいずれかを満たしてなることを特徴とする生体分子の検出もしくは定量方法 。 [I]基板上に固定した標的生体分子認識分子と、前記標的生体分子とを分子認識させる工程、 [II]前記第1の分子認識物質を分子認識する第2の物質によって表面修飾された、蛍光色素化合物とシリカ成分とが化学的に結合もしくは吸着してなる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子であって、少なくとも1種の前記蛍光色素化合物が前記シリカ粒子全体に分散しており、その平均粒径が30nm以下である蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を、基板上に固定した前記標的生体分子認識分子と分子認識した後の前記標的生体分子と分子認識させる工程 、 [III]基板上の前記コロイドシリカ粒子の蛍光を検出もしくは定量する工程 、
検出もしくは定量方法であって、
検出もしくは定量方法であって、
4〕〜〔6〕のいずれか 1項に記載の生体分子の検出もしくは定量方法。
1〕〜〔3〕のいずれか 1項に記載の製造方法で製造された蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を用いた 検出もしくは定量方法であって、
もしくは定量方法。
4〕〜〔8〕のいずれか 1項に記載の生体分子の検出もしくは定量方法。 本明細書及び特許請求の範囲において、バイオチップ(バイオ素子)とは、前述したように基板上に整列・固定化した生体分子(生理活性物質を含む。以下同様である。)と、それ以外の生体分子又は化合物とを接触させ、生じた特異的相互作用を光学的、電気的あるいは物理的信号変化で検出・定量するための固体基板あるいはその検出手段をいう。 例えば、DNAチップ、プロテインチップ等が挙げられる。 まず、本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子について説明する。 次に、本発明に用いる蛍光色素化合物について説明する。 下記DY550、5−TAMRA、BODIPY−TMR−X、 下記DY630、DY631、DY633、DY635、DY636、DY650、およびDY651から選ばれる少なくとも1つである。 > 式中、 R 5 、R 6 、R 7 、R 8 、R 11 、R 12 、R 13 、 R 21 、R 22 、R 23 、R 24 、R 25 、R 26 、R 27は、それぞれ、前記シリカ成分と共有結合する基であり、NHSエステル基等の活性エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。 次に、本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製について説明する。 本発明者らは、蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法について特許出願している(例えば、特願2004−356608)。 その方法に準じて行なうのがさらに好ましい。 具体的には、前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子は、下記(a)及び(b)の工程を行なうことにより調製することができる。 本発明者らは、カルボン酸化合物とN−ヒドロキシスクシンイミドとをエステル化反応する工程について特許出願している(例えば、特願2004−356608)。 前記NHSエステル基を有する蛍光色素化合物(1)として具体的には、DY550−NHSエステル、DY555−NHSエステル、DY630−NHSエステル、DY635−NHSエステル(いずれも商品名、Dyomics GmbH社製)、5−TAMRA−NHSエステル、Alexa Fluor546−NHSエステル、Alexa Fluor555−NHSエステル、Alexa Fluor633−NHSエステル、Alexa Fluor647−NHSエステル(いずれも商品名、Invitrogen社製)、Oyster643−NHSエステル、Oyster656−NHSエステル(いずれも商品名、Denovo Biolabels社製)等を挙げることができる。 中でも、下記式でそれぞれ表されるDY550−NHSエステル又はDY630−NHSエステルが好ましい。 前記アミノ基を有するシランカップリング剤(2)としては、特に制限されないが、例えば、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−[2−(2−アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル-トリエトキシシラン、N−2(アミノエチル)3−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3−アミノプロピルトリメトキシシランを挙げることができる。 中でも、APSが好ましい。 前記NHSエステル基を有する蛍光色素化合物(1)と前記アミノ基を有するシランカップリング剤(2)との反応は、DMSO(ジメチルスルホキシド)やDMF(N,N−ジメチルホルムアミド)等の溶媒に溶解した後、室温(例えば、25℃)条件下で攪拌しながら反応することによって行うことができる。 斯くして、蛍光色素化合物(1)のカルボニル基と、アミノ基を有するシランカップリング剤(2)のアミノ基とが、アミド結合(−NHCO−)して、色素シランカップリング剤複合化合物(3)が得られる。 すなわち、前記色素シランカップリング剤複合化合物(3)は、アミド結合を介して蛍光色素化合物とシリカ成分が結合している。 次いで工程(b)で、前記色素シランカップリング剤複合化合物(3)をシリカ化合物(4)と反応させる。 前記シリカ化合物(4)としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン(TEOS)、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)、3−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3−[2−(2−アミノエチルアミノ)エチルアミノ]プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。 中でも、TEOS、MPS又はAPSが好ましい。 本発明において、色素シランカップリング剤複合化合物(3)とシリカ化合物(4)の割合は、特に制限はないが、色素シランカップリング剤複合化合物(3)1モルに対するシリカ化合物(4)のモル比として、50〜40000 であり 、100〜2000がより好ましく、150〜1000がさらに好ましい。 この反応は、アルコール、水及びアンモニアの存在下で行うのが好ましい。 ここでアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数1〜3の低級アルコールを挙げることができる。 かかる反応系における水とアルコールの割合は、特に制限されないが、好ましくは水1容量部に対してアルコールを0.5〜20容量部、より好ましくは2〜16容量部、さらに好ましくは4〜10容量部の範囲である。 アンモニアの量も特に制限されないが、アンモニアの濃度が30〜1000mMが好ましく、60〜500mMがより好ましく、80〜200mMがさらに好ましい。 この反応は室温で行うことができ、また攪拌しながら行うことが好ましい。 通常、数十分〜数十時間の反応で、本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)を調製することができる。 なお、前記工程(b)において、使用するシリカ化合物(4)の濃度を調整したり、反応時間を調整することにより、調製するシリカ粒子の大きさ(直径)を適宜調節することができる。 使用するシリカ化合物(4)の濃度を低くしたり、また反応時間を短くすることにより、より小さなシリカ粒子を調製することができる(例えば、Blaaderenet al.,“Synthesis and Characterization of Monodisperse Colloidal Organo−silica Spheres”,J. Colloid and Interface Science 156,1−18.1993参照)。 一方、工程(b)を複数回、繰り返し行えば、より大きなシリカ粒子を調製することができる。 このように、得られる蛍光色素化合物含有シリカ粒子の粒径(直径)を、所望の大きさに、例えばnmオーダーからμmオーダーへと自在に調整することができる。 具体的には、3〜30nmといった微小な大きさを有する蛍光色素化合物含有シリカ粒子を調製することが可能である。 また必要に応じて、その後の処理により希望する粒子径分布となるように調整することもでき、斯くして所望の粒子径分布範囲にあるシリカ粒子を得ることができる。 本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の平均粒径は、3nm〜30nmであることが好ましく、より好ましくは3nm〜20nm、さらに好ましくは3nm〜10nmである。 所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、YM−10、YM−100(いずれも商品名、ミリポア社製)等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きい粒子を除去することで可能である。 蛍光色素化合物をシリカ粒子内に固定し、包含させると、前記蛍光色素化合物がシリカ粒子内に分散して存在しているので、遊離の蛍光色素化合物よりも感度を上げることができる。 すなわち、遊離の蛍光色素化合物よりも輝度を増加させることができる。 次に、前記コロイドシリカ粒子の表面修飾について説明する。 本発明の蛍光色素化合物含有シリカ粒子の表面修飾について、具体的には、上記工程(b)で用いるシリカ化合物(4)の種類に応じて、所望の分子と結合可能なアクセプター基を表面に有する蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子とすることができる。 前記アクセプター基として、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、マレイミド基、スクシンイミジルエステル基等が挙げられる。 なお、上記得られる蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)について、反応に使用したシリカ化合物(4)によって表面に導入されるアクセプター基とは異なるアクセプター基を導入したい場合には、前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子(5)を、さらに工程(b)で使用したシリカ化合物(4)とは異なるシリカ化合物で処理することにより達成できる。 この処理は、工程(b)で使用したシリカ化合物(4)とは異なるシリカ化合物を用いて、上記工程(b)と同様な操作を行うことにより実施することができる。 本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子は、表面に有するアクセプター基の種類に応じて所望の分子〔例えば、抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等〕を表面に結合もしくは吸着させ、修飾させることができる。 本発明において、前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子は、標的生体分子で直接修飾してもよいが、前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子を修飾した所望の分子〔例えば、抗体、DNA、RNA、糖鎖、受容体、ペプチド等〕が、更にそれ自体がアクセプター分子となって、例えば抗原−抗体反応、ビオチン−アビジン反応、塩基配列の相補性を利用したハイブリダイゼーションなどの特異的な分子認識反応を利用して、標的生体分子に特異的に結合させることが好ましい。 次に、複数種の、蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子のセットについて説明する。 本発明のバイオチップとしては、前述のようにDNAチップ、プロテインチップ等が挙げられる。 次に、標的生体分子(標的生理活性物質を含む。)の検出もしくは定量法について説明する。 本発明の検出もしくは定量法は、検体(例えば、任意の細胞抽出液、溶菌液、培養液、溶液、バッファー)中の前記標的生体分子が第1の分子認識物質によって修飾されている場合、 特に、本発明の検出もしくは定量法において、前記第1の分子認識物質及び前記第2の物質の組み合わせが、下記(a)〜(i)からなる群より選ばれるいずれか1つであることが好ましい。 本発明において、前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子が、前記標的生体分子に特異的に結合もしくは吸着する物質(以下、単に「第2の標的生体分子認識分子」という。)で表面修飾されている場合、 本発明の検出もしくは定量法において、検体中の標的生体分子を前記蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子で直接標識する場合、 本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子は、高輝度かつ耐退色性に優れ、あらゆる生体分子もしくは生理活性物質を蛍光標識するのに用いることができる。 以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 <ストレプトアビジンで修飾したDY630含有蛍光コロイドシリカ粒子の調製> (実施例2)DNAチップアッセイ 次に、実施例1で調製した蛍光ナノシリカ粒子群を用いたDNAチップアッセイ方法について説明する。 (2)SSC(クエン酸緩衝液)で前記DNAチップを洗浄後、比較例としてストレプトアビジン修飾したDY550分子(Dyomics GmbH社製)を用いて、または、実施例1で調製したストレプトアビジン修飾DY550含有蛍光シリカ粒子を用いて、それぞれDNAチップの蛍光標識を行った。 本発明の蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子は、DNAチップ等の汎用検出器、いわゆるチップリーダーによる検出およびデータについて互換性があるCy3やCy5と同等の蛍光特性を示す蛍光色素化合物を新しい手法で導入してなる蛍光標識用ナノビーズとして用いることによって、DNAチップを始めとするバイオチップを用いたアッセイにおけるデータの再現性を飛躍的に向上させることができる。 |