Microanalysis method and apparatus

本発明は、液体の若しくは以前又は現在液状懸濁体をなす細胞等諸物質の、多数の微量サンプルを操作し、移動し、分析する装置及び方法に関する。

マイクロリットル又はそれより小量の試薬又は検体の反応及びその後の分析を要する微小規模に関する化学は、製薬又は多の業界で新物質開発の観点から益々重要な側面をなす。 このような反応及び分析は、各種の条件下で反応及び分析されるべき非常に多数の化合物を含む広大な実験室に配慮するかもしれない。 膨大な数（潜在的に毎日約何十万又は何百万）の化合物の化学分析に用いられる現技術と関連する重要な問題には、膨大な数の化合物及び反応を並行して扱うことが含まれる。

発明が解決すべき課題

現存の技術は、空所（ウエル）毎に約１マイクロリットル乃至１ミリリットルの液状化合物の容量を含む、９６、３８４又は１５３６ウエルプレートを頼っている。 また、概してシリコンチップのような平坦な２次元面上の単一開口を配置した空所での化学反応及び分析を伴う。 百万空所ディスクを形成するために当業界に現存する技術を適用することは実際的ではない。 従って、実験室形式で百万サンプルの分析を可能にする新しい研究手段が必要である。

課題を解決する手段

本発明の１面によると、その１実施形態ではサンプルコレクションから特定された特性を有するサンプルを選択する方法が与えられる。 同方法は、２つの平行な平坦面及び該平坦面に垂直に配置された、アドレスを用いてアクセス可能な複数の貫通孔を有する定盤、即ち、プラテンを用意し、該貫通孔の少なくとも１つに液状の第１サンプルを装入し、該少なくとも１つの貫通孔に第２サンプルを加え、該第１サンプルと該第２サンプルとの間で反応を起こさせ、該特定された特性に関して該貫通孔内の反応を特徴づけることから成る。

本発明の他の実施形態によると、表面張力によって液体サンプルを各貫通孔内に維持するように各貫通孔の寸法が定められ、１００ナノリットル未満の容積を有する。 該複数のアドレスを用いてアクセス可能な貫通孔が一平方メートルにつき１０ ^８を超える密度で存在する。

本発明のさらなる実施形態では、該第１サンプル装入段階が毛管作用で平坦面から該サンプルを引き出すことを含む。 該プラテンを液体貯蔵器と接触させ、該プラテンを該貯蔵器の表面に垂直な軸の回りで回転させるか若しくは該プラテンを該貯蔵器の表面に垂直な軸及び該貯蔵器の表面に平行な軸の少なくとも１つの回りで回転させる。 同方法は、該第１サンプルの蒸発を防止するために湿り大気を維持するか若しくは該液状サンプルを単一層で被覆することをさらに含む。

本発明のさらなる面によると、第１組の複数の液状サンプルの構成要素と第２組の複数の液状サンプルの構成要素の複数の組合せで構成要素を調製する方法が与えられる。 同方法は、貫通孔を有する第１多孔プラテンと、貫通孔を有する第２多孔プラテンとを用意し、第１多孔プラテンの該貫通孔に第１組の液状サンプルを装入し、第２多孔プラテンの該貫通孔に第２組の液状サンプルを装入し、第１多孔プラテンの該貫通孔を第２多孔プラテンの該貫通孔と正しく合わせ、該第１組サンプルを該第２組サンプルと結合させることから成る。

本発明のさらなる面によると、液状サンプルを混合しかつ希釈する方法が与えられる。 同方法は、第１プラテンの貫通孔内に第１組の液状サンプルを装入し、第２プラテンの貫通孔内に第２組の液状サンプルを装入し、次いで、それぞれの組の液状サンプルを混合させるために該第１組の少なくとも１つの貫通孔が該第２組の少なくとも１つの貫通孔と正しく合うように、該第１プラテンの面を該第２プラテンの面と接触させて配置させることから成る。

本発明の他の面によると、複数の液状サンプルを分析するシステムが与えられる。 同システムは、２つの平行な平坦面及び開口と壁とを有する複数の貫通孔を有するプラテンと、光学軸に沿って少なくとも１つの貫通孔を照明する光学放射光源と、該少なくとも１つの貫通孔から発する光を分析する光学装置とから成る。

本発明の上記特徴は、下記添付図と共に詳細な説明を読むことによって一層容易に理解されるであろう。

本発明の望ましい実施形態による液体サンプルの分析用の多重貫通孔を含む積層されたプラテンの一部の断面を示す側面図である。

図１のプラテンの一部を示す上面図である。 図２Ａでは貫通孔は長方形の中心に構成され、図２Ｂでは貫通孔は密集して並べられた６角形配列で構成される。

本発明の実施形態による密集した貫通孔を有する円形サンプルウエーファの上面図である。

毛管及び慣性挿入力で図１のプラテン内へ液体サンプルを装入する装置の側部透視図である。

水成サンプルを入れる疎水性及び親水性層の用法を示す、図１プラテンの単一貫通孔を切り取った図である。

本発明の実施形態による貫通孔内の液状サンプル検査用共焦光学装置の構成図である。

本発明の実施形態によるディスク状プラテンの貫通孔に保持される液状サンプルを連続的に検査する走査装置の透視図である。

本発明の他の形態実施形態による連続処理フィルム型プラテンに保持される液状サンプルを連続的に検査する走査装置の構成図である。

本発明の実施形態による混合又は希釈を見越して貫通孔位置合わせ位置に近接された２つのプラテンの一部断面図である。

２つのプラテンが混合又は希釈を容易にするために接触された後の２プラテンの一部断面図である。

貫通孔空所 本発明の望ましい実施形態により、化学的又は生化学的反応の分析に用いられる各空所（ウエル）の容量は、概して１００ナノリットル（１０ ^−１０ ｍ ^３ ）未満に低減される。 空所の（配列）密度は、それによって先行技術に対して数桁増加され得る。 図１を参照すると、本明細書ではさもなければ「下層」又は「サンプルウエーファ」と呼ばれる、定盤、即ち、プラテン１０の側面図が断面で示される。 プラテン１０は、多数の貫通孔１２のキャリヤであり、貫通孔はプラテン１０の一方の面１４から反対側の面１６までプラテンを横断し、本発明の実施形態により分析くぼみ又は空所（即ち、マイクロウエル）を構成する。 貫通孔１２は、直円柱の形状又はその代わりに長方形の断面を有し得る。 しかし、他の形状の貫通孔は、本発明の範囲内である。 本明細書及び添付された請求の範囲で用いられるように「プラテン」の用語は、実質的に平行な平面を有する構造体であって、横の寸法が実質的に平行な平面間で構造体の厚さを実質的に超えるものを指す。

貫通孔１２の開口は正方形である必要はなく、本発明の代替実施形態によると、フランジ８は貫通孔１２のいくらか又は全部を囲む平面１４の上に伸び得ると同時にくぼみ６が反対側の面１６において貫通孔１２の縁の周りに作られ得る。 フランジ８及びくぼみ６は、プラテンが積重ねられる場合及び、図９〜図１０に関して以下に詳述するように、混合又は希釈処理において連続するプラテン１０の正しい位置合わせに有利に対処し得る。

本発明の実施形態によると貫通孔１２は、液状の第１サンプル１８で装填され得る。 サンプル１８は第２サンプルと反応し得るようにされ、そこでは第２サンプルは各種の試験サンプルを含み得ると共に、例えば、光学マーカを用いた反応生成物の後続又は同時分析によって、多数の反応が並行して処理及び分析され得る。

例えば、生物的分析に適用されると、第１サンプル１８は、例えば、水成懸濁液内の細胞、真核生物（動物、イースト）又は原核生物（バクテリア）、抗体及び酵素であり得る。 しかし、他の生物的又は非生物的分析への適用は、本明細書で請求される本発明の範囲内である。 そのようなすべての試薬は、本明細書及び添付の請求の範囲では「標的（ターゲット）」と呼ばれ得る。 溶液１ミリリットルにつき１０ ^７細胞の典型的イースト細胞濃度は、１００ナノリットル空所につき約１０００細胞を与える。 概して、プラテンの隣接領域を構成する貫通孔空所の完全チップ又はサブセットは、単一系統細胞で占められ得る。

製薬的研究で用いられるような典型的処理分析手順は、１つ又はそれ以上の検体を含む試験サンプルを貫通孔空所に導入する、後続のアドレスを用いた導入を必然的に伴い、選択された物質が１つ又はそれ以上の貫通孔を含むサブセット貫通孔内へ導入される。 サブセット貫通孔内にアドレスを用いてアクセス可能に導入される試験サンプルは、薬剤候補又は既知の薬剤を含み得る。 試験サンプルは、同時か又は後で導入される多数の構成成分で構成され得る。 試験サンプルの構成成分は、検体、拮抗剤、試薬、溶剤又はその他の物質を含むと共に液状又は他の形で導入され得る。 本発明の望ましい実施形態では、試験サンプルは、拡散を経て急速な反応を容易にするために液状で貫通孔空所内へ導入され、第１サンプルは既に貫通孔に液状で存在する。

特定の貫通孔位置にアドレスされた第２サンプルが引き出される１組の物質は、本明細書及び添付された請求の範囲では物質の「ライブラリ（収集物質）」と呼ばれる。 典型的な用途では、ライブラリは相当な大きさであり、従って、多数の物質の並行的反応及び分析を容易にするために本発明の能力を有利に利用できる。 特に製薬的用途では、ライブラリは１０ ^３乃至１０ ^９の物質又はそれらの組合せから構成され得る。

プラテン１０の典型的厚さ２０は、約１〜２ｍｍであり、一方貫通孔１２は約１００〜４００μｍの典型的特性寸法（直径のような）２２を有する。 従って、面１４及び１６間の各貫通孔１２の容量は約１０ ^−７ ｃｍ ^３又はそれ以上である。 貫通孔１２は、中心で典型的に孔の直径の約２倍隔置されるが、すべての間隔が添付された請求の範囲及び本発明の範囲内である。 特に、貫通孔１２は、図２Ａに示すように矩形グリッド上に中心を有するか若しくは図２Ｂに示すように密接配列６角形ラチス（格子）の形状を有する。

図３を参照して記載された本発明の他の実施形態によると、貫通孔１２は、処理装置に関して中心を決めるための中心孔３０２を有する環状サンプルウエーファ３００内の並列内に配置され得る。

再び図１を参照すると、プラテン１０は、その中に貫通孔１２が形成され得る任意の剛性又は擬似剛性物質であり得る。 特に、本発明の各種の実施形態によると、プラテン12は、すべて限定なしに例として与えられる、金属、半導体、ガラス、石英、セラミック又は重合材料で形成され得る。 本発明の望ましい実施形態によると、プラテン１０は、コンパクトディスク読取り専用メモリ（ＣＤ-ＲＯＭ）、即ち、厚さ約１．２ｍｍ、直径約１００ｍｍの重合体ディスクと関連するフォーマットで形成される。

プラテン１０は、中心層２６及び「サンドウイッチ型」外層２８を有する積層材料で形成され得る。 サンプル１８を入れることに関するこの構成体の利点は以下に記載される。

貫通孔１２は、プラテン１０の材料に適切な手段でプラテン１０内に形成され得る。 貫通孔形成方法は、例として、ガラス及び重合体に１００μｍの貫通孔を形成する紫外線（ＵＶ）励起レーザによるレーザ融解を含む。 追加の貫通孔形成技術には、機械的孔あけ、電気化学的方法又は選択的化学又は荷電粒子腐食技術等がある。 さらに、異なった組成のガラス繊維マイクロ毛管束が予備形成物から引抜き加工されてプラテンを形成するために薄片に切られ、次いで貫通孔を形成するために選択的に腐食される。

貫通孔マイクロ空所装填 本発明の実施形態により用いられる寸法規模に関して、貫通孔１２の直径に対する軸の縦横比が１より大きいところでは、貫通孔空所の物質流体動力学の支配において粘性力が慣性力を支配し得る。 結果的に、貫通孔１２をサンプル流体１８で装填するために毛管作用が用いられ得る。 図４を参照すると、貫通孔空所を装填する２つの面が、サンプル挿入装置３０に関して記載されている。 貫通孔マイクロ空所１２は両側で開放されているので、液体の流入及びこの液体に置き換えられてしまう空気の流出に関して、単一開口しか有しない先行技術の空所構造体で起こるように、空所ヘ液体を挿入しても、挿入と同時に、液体で置き換えられてしまう空気を、入って来る流体中に貫流させる必要はない。 ポート３３を介して貯水器３４内へ挿入される液体３２は、既に述べた通り、懸濁液の形で細胞又は他の粒子を含み得る。 プラテン１０の面を横切る方向３６に沿って加えられる力により液体３２内へプラテン１０を駆り立てるように、液体３２は、並列衝撃により貫通孔マイクロ空所１２（図１）内へ強制挿入され得る。 横のピストン力は、軸３８を介するか若しくは機械工学で知られる他の任意の方法で加えられ得る。

本発明の他の実施形態によると、貫通孔の壁に沿った液体３２の毛管作用を通しても液体は同様に挿入され得る。 プラテン１０の下面を濡らすために、プラテン１０は貯水器３４内へ下げられ、軸３８を通して加えられるトルク又は別の方法で、概して約１/４の回転角度に亘って回転される。 あるいは、プラテン１０を液体３２内へ浸し、プラテン面の軸の周りでプラテンを傾けることによってプラテン１０を濡らし、液体３２をマイクロ空所内へ引き入れる。

毛管及び蒸発液体損失に関する安定化 それぞれのマイクロ空所の液状サンプルを維持するために、液体の蒸発は避けられなければならない。 蒸発を防ぐ１方法は、湿度１００％の周囲の大気環境を与えることである。 本発明の実施形態により、蒸発を抑制するために実施し得る数ある方法の中では、例えば、各種のアルコールのような高分子量流体をマイクロ空所の各端に導入し、それによって液体サンプルの蒸発を避けるために分子単層又は他の薄い層を形成し得ることである。

図５を参照すると、貫通孔マイクロ空所を含めるためにプラテン１０の一部断面が示される。 マイクロ空所の毛管装填を向上させかつサンプル液体の毛管転出を避けるために、プラテン１０の面１４及び１６に隣接する、マイクロ空所の外部区域４０は、本発明の望ましい実施形態による疎水性壁面を有し、同時に貫通孔壁の内部区域４２は、親水性面を有し、それによって水成液体サンプルを選択的に引き付ける。 概して、マイクロ空所の内部―１６０μｍ区域は親水性壁面を有し、同時に空所のいずれかの端には長さが約２０μｍの疎水性層がある。 サンプル液体をマイクロ空所内ヘ装入するときには、空所のいずれかの端の概して１０％が満たされないまま残され、次の液状試験サンプルが急速にマイクロ空所の親水性中心まで拡散し、それによって既に存在する液体と混合する。

光学的検査 本発明が適用される用途に依存して、第１液状サンプルと次に加えられる検体との反応結果は、生物学又は生物化学技術の当事者に知られた広範な方法で読み出され得る。 読出しシステムは、特定の反応が起こってしまったかどうかを決めるために、アドレスを用いてアクセス可能なマイクロ空所内のサンプルの検査を可能にする各種のタガント（taggants）を用い得る。 幾つかの反応は光学的に検査され得る。 即ち、比色定量又は蛍光光度計方法若しくはラマンスペクトル方法を含む共鳴又は比共鳴散乱方法が限定なしに含まれる。

図６を参照すると、光学的検査方法（上記の方法はただ例に過ぎない）が実施され得る。 本発明の１実施形態によると、プラテン１０の貫通孔１２内に光線５０を結合し、検出器アレイ５６を構成する検出器５４により、貫通孔１２の反対側開口から現れる光５２を検出することによって実施される。 あるいは、最初の方向で散乱により戻された光が集められ、標準光学技術を用いて分析され得る。 光学信号の信号対雑音比を最適化するために光線形状と貫通孔容積とが適合していることが望ましい。 本発明の望ましい実施形態によると、円筒形断面及び１より大きい縦横比率の貫通孔への光学的適合は、共焦光学形状を通して達成される。 そこでは最初に平行にされた光線５０が、光学要素５８によって貫通孔１２の中心６０において回折限界の焦点を有する光線に変換される。 そこで現れる光線５２が集められ、光学要素６０によって検出器アレイ５６上に収斂される。 貫通孔が矩形断面を有しかつ光学放射が導波管のように貫通孔の壁によって案内されるならば、貫通孔の分量の優れたサンプリングが得られ得る。 光学要素５８及び６０は、光学技術の当事者によく知られているような、レンズ又は鏡若しくはそれらの組合せでよい。 検出器アレイ５６は、電荷転送素子（ＣＣＤ）は、例えば、本発明の１実施形態では、１０００ｘ１０００要素フォーマットが用いられ、各貫通孔が検出器アレイの３つの要素５４上に映される。 ウィンド６２は、プラテン及び検出器アレイ５６間に配置されると共に、上記のように分析が湿った周囲の環境で行われるならば、標準技術を用いて乾燥され得る。 その代わりに、結合要素５８によって貫通孔内に結合された光線５０は、貫通孔内のサンプリングされた分量を効果的に検査するために、導波管を通して案内される波のように貫通孔１２の壁６２によって貫通孔内に結合される。

プラテン１０の材料が、検査中の光学的光線５０の波長において完全に不透明でない場合には、アドレス可能なサンプル分量間の光の漏洩及び混信を避けるために貫通孔１２の壁６２は被覆され得る。

図７は本発明の望ましい実施形態を示し、そこではプラテン１０が上記のＣＤ−ＲＯＭフォーマットで構成され、プラテン１０が中心６６の周りで回転すると同時に検査中の光学的光源５０が半径方向６８に進み得るようにされる。 光学検出器５６アレイは、本発明の実施形態により、光源５０と共に移動し得る。

連続進行分析 図８を参照すると、本発明の有利な実施形態によると、例えば、可撓性重合物質であり得るプラテン１０は、光学的光源７２及び検出器アレイ７４を含む光学的検査システムを通り過ぎる方向７０に運ばれる。 液状のサンプルは、貫通孔１２内に装入されかつ特定された指示が期待される周期間に列７６が光学的に検査されるように、関連した反応回数によって制御されるレートで前進する。

混合及び希釈 図９を参照すると、液状サンプルを調製し、混合し又は希釈する本発明の実施形態により行われる処理（工程）を見越して、互いに隣接される第１プラテン９０及び第２プラテン９２の一部断面図が示される。 プラテン９０の貫通孔１２は、幾つかの特定されたサブセットの貫通孔１２を横切って同一であるか又はプラテン全部につき同一の液状サンプルが装入されてしまっているように示される。 液体サンプル９４は、概略的に示されるように、溶媒９８内の溶液として細胞又は他の標的９６を含み得る。

第２プラテン９２の貫通孔１２は、１つ又はそれ以上の溶媒又は他の試薬を含むことを示した液体サンプル１００及び１０２で装填されていることを示している。 特に、プラテン９２は、各々がプラテン９０の標的９６にさらされるべき別個の混合物（化合物）のライブラリで占められてしまってもよい。

図１０は、それぞれのプラテンの貫通孔が１対１の条件で正しく位置が合うことを可能にするように、互いに接触させられてしまった図９のプラテン９０及び９２を示す。 各プラテンのくぼみ６と突起８との噛み合せは、貫通孔の正しい位置合わせを容易にし、各貫通孔の液状サンプル内容物混合に備える。 従って、図示の通り、第１プラテン９０のサンプル９４からの標的９６の半分がサンプル１００及び１０２溶媒へ移動してしまっている。 混合及び希釈は、通常の静的拡散を通すか又は混合を容易にするために用いられるあらゆる方法によって、このように容易になされ得る。 例えば、混合は、レーザ照射によって誘発される熱渦電流及び乱流の生成によって向上され得る。 混合レートはこの方法で向上されることが発見されている。 例えば、音響的摂動又はミクロピペットでのサンプルの攪拌等あらゆる混合技術は、本明細書に記載されかつ添付の特許請求の範囲に請求された本発明の範囲内である。

本発明により積重ねられ得るプラテン９０及び９２の数は、例としてのみ図９及び１０に示された２つには限定されない。 従って、位置合わせされた貫通孔に相当する数のプラテンを積重ね、相当する積重ねのサンプル容量内に含まれる液体全体を通して標的の移動を可能にすることによって、溶媒９８の標的９６の濃度が特定された程度まで希釈され得る。

生物的サンプルの運搬 本発明の実施形態により本明細書に記載された多孔プラテンは、例えば、同一系統の細胞サンプルを実験室に出荷するために用いられ得る。 この用途では、細胞又は他の生物的サンプルは、水溶液又は他の液状懸濁液にして本発明の貫通孔空所内に導入され得る。 液状キャリヤは、その後蒸発され、細胞又は他の生物的サンプルが、複数の貫通孔空所の煙突形コーティングを形成することを可能にする。 その後サンプルは、続いて濡らすことによって再懸濁され、さらなる検体が導入され得る。

本発明の記載された実施形態は、単なる適例であることを意図し、当業者にとって多数の変形及び変更があることは明らかであろう。 そのようなすべての変形及び変更は、添付された特許請求の範囲で定めるような本発明の範囲内に入ることが意図される。

８ フランジ１０ プラテン１２ 貫通穴１８ 第１サンプル