Microarray and a method for performing hybridization reaction of a large number of samples on a single microarray

（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００２年５月２４日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３８３，５５９に基づく優先権を主張するものである。
（連邦政府後援による研究又は開発に関する陳述）
適用はない。

ＤＮＡマイクロアレイ技術の出現は、典型的には数平方センチメートルである顕微鏡スライドの表面上の非常に小さい区域において、数十万のＤＮＡシーケンス又はプローブのアレイを作ることを可能にした。 例えば、本明細書において全体を引用によりここに組み入れるＰＣＴ特許公表番号ＷＯ９９／４２８１３，９２／１００９２及び９０／１５０７０、及び米国特許番号第５，１４３，８５４号を参照されたい。 ＤＮＡマイクロアレイベースの検定は、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡ試料をマイクロアレイにハイブリダイズして、このマイクロアレイを走査してハイブリダイゼーションを検出することを含む。 マイクロアレイ内のプローブは、「特徴」（feature）と呼ばれる同様なプローブ区域に組織化される。 実験用ＤＮＡ又はＲＮＡをマイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズして、どの特徴に実験用ＤＮＡ又はＲＮＡがハイブリダイズされたかを検出することにより、相対的に単純な工程である単一の工程において、実験用ＤＮＡ又はＲＮＡについての多くの情報を得ることが可能になる。 この能力を用いて、ＤＮＡマイクロアレイ技術が、遺伝子の発現及び発見、突然変異の検出、対立遺伝子及び進化シーケンスの比較、ゲノムマッピングなどのような分野に適用されている。

最先端のＤＮＡマイクロアレイは、各々が独特なプローブを含む数十万の特徴に対応することができる。 実際、この容量は、マイクロアレイの全容量よりはるかに少ないプローブを含むハイブリダイゼーション検定を含む多数の一般的な有用な実験のニーズを超えるものである。 したがって、幾つかのマイクロアレイは、一組の特徴がマイクロアレイ区域にわたり何度も繰り返されるように構成され、特徴の各々の組は、多数のデータ収集実験が並行して行われるように、最終的には別々の実験用試料に曝される。 この概念は、アレイのアレイと考えることができる。 このことを行うためには、多数の試料に対して同時に用いることができるＤＮＡマイクロアレイを作ることが望ましい。 これを機能させるためには、マイクロアレイの異なる区域に意図される試料間での相互汚染を阻止する措置をとらなくてはいけない。 現在、この目的のために作られたマイクロアレイ（例えば、米国特許番号第５，８７４，２１９号）は、物理的なウェルを用いて、プローブの組を異なる試料に対して分離させ、ウェル壁を対応するプローブの組と整合させて、各々のウェルが正しいプローブを含むようにしなければならない。 しかしながら、ウェル壁を対応するプローブの組と整合させることは、必ずしも達成するのに容易なことではなく、位置ずれは、不正確な結果をもたらすことになる。

本発明は、ウェル壁を対応するプローブの組と整合する必要のない、多数の試料分析のためのマイクロアレイを提供する。 このことは、連続する同一の検出ブロック（各々の検出ブロックが関心のあるプローブの組を含む）を含むマイクロアレイ、及び任意の４つの隣接する検出ブロックが連結するコーナ点を識別する信号を与えることにより達成される。 さらに、マイクロアレイ上のプローブを分離するのに用いられる各々のウェルは、検出ブロックより、すべての寸法において、わずかに大きい。 このような構成により、ウェル壁が検出ブロックと整合しない場合でも、各々のウェルは、依然として、完全な検出ブロックのすべてのプローブを含み、ウェルにおけるプローブの同一性は、さらに該ウェルに含まれているコーナ点を参照することにより求めることができる。

本発明のマイクロアレイは、マイクロアレイ上の分子の種類によって限定されるものではない。 例えば、マイクロアレイは、ポリヌクレオチドマイクロアレイであっても、ポリペプチドマイクロアレイであっても、他の種類の分子のマイクロアレイであってもよい。 本発明のマイクロアレイを作り、これを用いる方法もまた、本発明の範囲内にある。

本発明の意図は、ウェルのような物理的な障壁をマイクロアレイ区域と位置合わせする際の問題を克服して、マイクロアレイを、単一マイクロアレイ上で、多数の並行したハイブリダイゼーション法を行うように用いるのを可能にすることである。 実際、本発明の理念は、ウェルのような物理的な障壁をマイクロアレイ上の特徴又は特徴区域と位置合わせすることに対するあらゆる試みに完全に先んずるものである。 むしろ、ウェル又は障壁は、どのような所定の位置合わせもなしでマイクロアレイ上に置かれる。 ただ、マイクロアレイの大きさに関連する適当なウェルの大きさを選択することにより、必要なデータを収集できることを確実にする。 本発明の裏にある概念は、特徴区域に対する障壁又はウェルの関係を、実験前に、該ウェルを物理的にマイクロアレイと整合させるのを試みることによってではなく、ハイブリッドデータの分析により、ハイブリダイゼーションデータ収集後に定義することである。 この技術は、ハイブリダイゼーション前に物理的に行われた整合ではなく、ハイブリダイゼーションからのデータによりソフトウェアにおいて行われた整合として考えることができる。

この概念を理解するためには、幾つかの用語が役に立つ。 ここでも、特徴は、同様のシーケンスをもつ多数の核酸プローブがすべて固定された、マイクロアレイ上の物理的な区域である。 本発明の目的のためには、検出ブロックは、実験用試料によりプローブされるべき関心のある特徴の１つの完全な組を含む顕微鏡スライド上の区域である。 したがって、実験において２６４の特徴（８×８の特徴の組）を用いる場合には、検出ブロックは、関心のある２６４の特徴の完全な組を含む８×８の特徴区域の１つを意味することになる。 検出ブロックの大きさは、任意の数の特徴とすることができ、マイクロアレイ上には１つより多い検出ブロックがあってよい。 「連続する検出ブロック」とは、境界を共有する互いに隣接する検出ブロックを意味する。 この概念の裏にある理念は、検出ブロックがマイクロアレイにわたりマップされるように、検出ブロックがマイクロアレイ上に、互いに隣接する繰り返される単位で製造されるということである。 検出ブロックが方形又は長方形である場合には、各々の検出ブロック及び３つの隣接する検出ブロックは、該検出ブロックの各コーナにおいて、頂点を共有する。 この頂点は、ここではコーナと呼ばれる。 「同一の検出ブロック」とは、各々の検出ブロック内の関心のある特徴におけるプローブが同一性及び配置において同一であることを意味する。 「同一のブロック」という用語は、或る検定に対して関心のあるプローブに関して定義される。 例えば、対応する位置における特定の検定に対して関心のあるものではない異なるプローブを含む２つの検出ブロックは、これらが別の形で同一のブロックとみなされる場合には、同一のブロックと考えられる。 検出ブロックは、さらに、ブランク位置を含むことができる（プローブに利用可能ではあるが、プローブはないままにされた位置）。 検出ブロックは、さらに、対照に指定された特徴であるか、又は、基準整合目的のために指定された特徴を含むことができる。 検出ブロックは、これがマイクロアレイ区域において繰り返されることが可能である限り、任意の望ましい数の特徴を含むことができる。 検出ブロックは、方形又は長方形である必要はないが、マイクロアレイ上の整合、及びここで想定される基準境界の検出の両方を可能にするどのような幾何学的形状であってもよい。

ここで述べられる技術を用いることにより、本発明のマイクロアレイ上の特徴の組は、物理的な障壁によって、他の特徴から最終的に区画分けされる。 このように形成された区画は、ウェルとも呼ばれる。 各々のウェルは、すべての寸法において検出ブロックより、少なくとも、わずかに大きく、１つのウェルにおけるハイブリダイゼーション反応が別のウェルにおけるハイブリダイゼーション反応と干渉しないように、ハイブリダイゼーション工程中は、他のウェルと流体連通状態にない。 プローブが区画分けされる正確な方法は、本発明には重要ではない。 本発明の目的のためには、各ウェルの形状は問題ではなく、一様であっても多様であってもよい。 ウェルの形状が検出ブロックの形状に近ければ近いほど、より多くのウェルを所定のスライドに形成できる。

前述のように、本発明により与えられるマイクロアレイの利点は、物理的な障壁を検出ブロックと物理的に整合させなくてよいことである。 ウェルがマイクロアレイ上のどこに配置されていても、このウェルが、すべての寸法において、検出ブロックよりわずかに大きい限りは、検出ブロックを形成する特徴の完全な組と、４つの隣接する検出ブロックが交差するコーナ点とを含む。 ウェルにおける特徴の完全な組の相対位置が、別のウェルにおけるそれとは異なっていることがあるとしても、特徴の同一性及びウェルにおける検出ブロックの位置は、最初に、該ウェルに含まれるコーナ点を突き止めることにより、常に求めることができる。 検出ブロックがマイクロアレイ上の連続グリッドに形成される限り、及びウェルが該検出ブロックより十分に大きい限りは、該ウェルの内側区域は、必然的に、４つの検出ブロックが集合する少なくとも１つのコーナを含むことになる。 ここでの理念は、各々のウェルにおける試料に対して完全なデータの組を生成するために、検出ブロックが、コーナを取り囲む特徴からの、特徴の完全なデータの組を組み合わせることにより生成されることである。 したがって、データ収集目的のためには、特徴の仮想検出ブロックは、マイクロアレイを配置したときに設計された物理的な検出ブロックを用いるのではなく、コーナを取り囲む特徴から生成される。

コーナは、典型的には、蛍光走査により、ハイブリダイゼーション工程の出力が読み込まれたときに、このように検出される。 コーナ点を識別することができる多くの技術があり、これらのいずれをも本発明に用いることができる。 例えば、１つ又はそれ以上の正の制御プローブをマイクロアレイ上に配置された特徴に印刷して、コーナ点を識別することができる。 １つの簡単な方法は、相互交差点がコーナ点と一致するように、正の制御プローブを用いて、対照又は基準特徴を物理的な相互形成に構成することである。 コーナを識別するのに用いることができる視覚パターンを生成するのに用いることができる負の制御及び正の制御の組み合わせを用いることにより、任意の数の他の変形を容易に想定することができる。

コーナが検出されると、残りのハイブリダイゼーションデータを再構成して、コーナを取り囲む特徴からのデータを用いることにより、検出ブロックにおける完全なデータの組を生成することができる。 コーナに対する各々の特徴位置を用いて、どのプローブがどの特徴にあるかを識別することができる。 この工程は、ソフトウェアにおいて特徴位置を再構成して、検出ブロック全体を再び組み立てるものと考えることができる。

本発明は、ハイブリダイゼーション検定が、同じ相対的に小さい数のプローブで多数の試料を分析するように用いられる適用例において最も有益である。 以下に説明されるのは、こうした適用例における本発明の好ましいマイクロアレイの実施形態である。

図１に示される本実施形態においては、マイクロアレイは、ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ以下同様と表示が付された６４の同一のブロックを含む。 円１及び２は、マイクロアレイ（図１）上の２つのウェルを表す（図１）。 図２は、同一の検出ブロックのどの１つが同様に見えるかの例である。 この単純化された例においては、ブロック内には、１２の利用可能な特徴位置があり、ハイブリダイゼーション検定においてデータが求められる関心のある特徴の数は１０であり、対照又は基準のために２つの特徴が残る。 図２に示される各々の数の組における第１の数はブロックの特徴位置を定義し、第２の数は各々のプローブに指定される数を定義する。 関心のある１０のプローブは、プローブ１ないし１０と表示が付され、それぞれ、特徴位置１から８、１０、及び１１に配置される。 特徴位置９における特徴にはどのようなプローブも構成されておらず、したがって、これはブランク位置又は負の制御である。 特徴位置１２における特徴は、ハイブリダイゼーションに対しては関心のあるのもではないが、実験用試料の中にスパイクされたヌクレオチドにハイブリダイズされるプローブ、すなわち正の制御を含有する。 図１におけるマイクロアレイのすべての繰り返される検出ブロックは、対応する位置１から１２において、同じ構成の特徴を有する。

図１及び図３は、完全なブロックにおける情報が、隣接するブロックからの部分的な情報をとることにより、どのように再構成されるかを示す。 図１においては、ウェル１は完全な検出ブロックＡを含み、したがって、１つのブロックからのすべての情報を含む。 ウェル１におけるハイブリダイゼーションからの情報は、コーナを求めることにより読み込まれ、該コーナの位置から検出ブロックＡ全体がウェル１にあることが理解され、次いで、単純にデータを検出ブロックから読み込む。

しかしながら、ウェル２は、如何なる単一の全体的な検出ブロックも含まない。 しかしながら、ウェル２に囲まれたブロックＢないしＥの部分に含まれる情報を互いに統合することにより取得することができる全体的なブロックからの情報を含む。 第１に、検出ブロックＢ、Ｃ、Ｄ、及びＥの交差点におけるコーナが突き止められる。 この単純な例においては、コーナは、暗い特徴（検出ブロックＣの特徴９）に隣接する明るくされた特徴（ブロックＢの特徴位置１２）を探すことにより突き止めることができる。 コーナの検出により、検出ブロックと同じ大きさのデータ抽出グリッド３をウェル２の内側に想定することができる（図３）。 グリッドは、このように配置されるため、４つのブロックが互いに連結するコーナ点４がグリッド内に含まれる。 次いで、グリッド内のすべての特徴からのデータを読み込んで、検出ブロック上で表わされるデータの組に組み立てることができる。

データの組においては、暗い特徴の隣に明るくされた特徴の他の例がある傾向があるため、この単純な例におけるコーナを検出するのに用いられる方法は取るに足らないものであり、誤解を受けやすい。 この例は、原理を示すものに過ぎない。 実際の実施においては、データの組における特徴の数、及び対照又は基準の構成は、コーナの明白な検出を可能にするように、必要に応じて綿密にしてよい。 さらに、幾つかの特徴は、ウェルにおいて何度も現れるため、他の特徴、さらにグリッド３の外側にある特徴の冗長な読み込み及び比較を用いてコーナを見出し、検出ブロックが正確に読み込まれていることを確実にすることができる。

上述の情報を互いに統合するマイクロアレイ及びその方法を考慮して、本発明のマイクロアレイを作り、これを用いて多数の試料を分析することは、十分に当業者の能力内にある。

明細書に述べられた本発明の例及び実施形態は、例示的なものであり、本発明を限定することを意図するものではない。 本発明は、特許請求の範囲内にある例及び実施形態のすべての修正形態を包含する。

連続する同一の検出ブロックを含む本発明の１つのマイクロアレイ実施形態を示す。

図１のマイクロアレイによる検出ブロックの一例を示す。

完全な検出ブロックからの情報がどのように互いに統合されるかを示す。