Molecular tag system |
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| 申请号 | JP2004318624 | 申请日 | 2004-11-01 | 公开(公告)号 | JP4480544B2 | 公开(公告)日 | 2010-06-16 |
| 申请人 | ソレクサ・インコーポレイテッドSolexa,Inc.; | 发明人 | ブレンナー シドニー; | ||||
| 摘要 | The invention provides a method of tracking, identifying, and/or sorting classes or subpopulations of molecules by the use of oligonucleotide tags. Oligonucleotide tags of the invention each consist of a plurality of subunits 3 to 6 nucleotides in length selected from a minimally cross-hybridizing set. A subunit of a minimally cross-hybridizing set forms a duplex or triplex having two or more mismatches with the complement of any other subunit of the same set. The number of oligonucleolicle tags available in a particular embodiment depends on the number of subunits per tag and on the length of the subunit. An important aspect of the invention is the use of the oligonucleotide tags for sorting polynucleotides by specifically hybridizing tags attached to the polynucleotides to their complements on solid phase supports. This embodiment provides a readily automated system for manipulating and sorting polynucleotides, particularly useful in large-scale parallel operations, such as large-scale DNA sequencing, mRNA fingerprinting, and the like, wherein many target polynucleotides or many segments of a single target polynucleotide are sequenced simultaneously. | ||||||
| 权利要求 | 複数のポリヌクレオチドが結合した、微粒子の混合物であって、 各ポリヌクレオチドには、下記形態のオリゴヌクレオチド： Ｓ １ Ｓ ２ Ｓ ３ ． ． ． Ｓ ｎ からなるオリゴヌクレオチドタグが連結されており、ここで、Ｓ １ からＳ ｎ のそれぞれは、３〜６ヌクレオチドの長さを有するサブユニットであり、かつサブユニットのセットから選択され、該サブユニットのヌクレオチド配列は、該セットのサブユニットと、該セットの任意の他のサブユニットの相補物と、の間に形成される二重鎖が少なくとも２つのミスマッチを含むように選択され、ｎは４から１０の範囲にあり、 各ポリヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドタグの相補物が結合した微粒子に、タグ・相補物間のハイブリダイゼーションを介して結合しており、 前記複数の ポリヌクレオチド中のすべての異なるポリヌクレオチド は、異なるオリゴヌクレオチドタグを連結して、異なる微粒子に結合 しており 、各微粒子には、 同一のオリゴヌクレオチドタグが連結された同一のポリヌクレオチドの集団が結合しており、 該ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡフラグメントからなる群から選択される、混合物。 約１０ ５個のポリヌクレオチド分子が前記微粒子のそれぞれに結合している、請求項１に記載の微粒子の混合物。 前記複数のポリヌクレオチドが１０〜１００，０００の異なるポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の微粒子の混合物。 微粒子に結合している複数のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーであって、 各ｃＤＮＡには、下記形態のオリゴヌクレオチド： Ｓ １ Ｓ ２ Ｓ ３ ． ． ． Ｓ ｎ からなるオリゴヌクレオチドタグが連結されており、ここで、Ｓ １ からＳ ｎ のそれぞれは、３〜６ヌクレオチドの長さを有するサブユニットであり、かつサブユニットのセットから選択され、該サブユニットのヌクレオチド配列は、該セットのサブユニットと、該セットの任意の他のサブユニットの相補物と、の間に形成される二重鎖が少なくとも２つのミスマッチを含むように選択され、ｎは４から１０の範囲にあり、 各ｃＤＮＡは、そのオリゴヌクレオチドタグの相補物が結合した微粒子に、タグ・相補物間のハイブリダイゼーションを介して結合しており、 該ライブラリーのすべての異なるｃＤＮＡ は、異なるオリゴヌクレオチドタグを連結して、異なる微粒子に結合しており、各微粒子には、 同一のオリゴヌクレオチドタグが連結された同一のポリヌクレオチドの集団が結合している、ｃＤＮＡライブラリー。 前記複数のｃＤＮＡが、１０，０００個と１００，０００個との間の異なるＤＮＡである、請求項４に記載のｃＤＮＡライブラリー。 微粒子に結合している複数のゲノムＤＮＡフラグメントを含むゲノムＤＮＡフラグメントのライブラリーであって、 各ゲノムＤＮＡフラグメントには、下記形態のオリゴヌクレオチド： Ｓ １ Ｓ ２ Ｓ ３ ． ． ． Ｓ ｎ からなるオリゴヌクレオチドタグが連結されており、ここで、Ｓ １ からＳ ｎ のそれぞれは、３〜６ヌクレオチドの長さを有するサブユニットであり、かつサブユニットのセットから選択され、該サブユニットのヌクレオチド配列は、該セットのサブユニットと、該セットの任意の他のサブユニットの相補物と、の間に形成される二重鎖が少なくとも２つのミスマッチを含むように選択され、ｎは４から１０の範囲にあり、 各ゲノムＤＮＡフラグメントは、そのオリゴヌクレオチドタグの相補物が結合した微粒子に、タグ・相補物間のハイブリダイゼーションを介して結合しており、 該ライブラリーのすべての異なるゲノムＤＮＡフラグメント は、異なるオリゴヌクレオチドタグを連結して、異なる微粒子に結合しており、各微粒子には、 同一のオリゴヌクレオチドタグが連結された同一のポリヌクレオチドの集団が結合している、ライブラリー。 前記複数のゲノムＤＮＡフラグメントが、少なくとも１０００個の異なるゲノムＤＮＡフラグメントである、請求項６に記載のライブラリー。 |
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| 说明书全文 | 本発明は、一般にはオリゴヌクレオチドラベルで分子（特にポリヌクレオチド）を同定、分類、および／または探知するための方法に関し、より詳細にはオリゴヌクレオチドタグへの特異的ハイブリダイゼーションによりポリヌクレオチドを分類する方法に関する。 オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの特異的ハイブリダイゼーションは、広く多様な研究的適用、医学的適用および産業的適用で用いられている基礎的なプロセス（診断アッセイにおける疾患関連のポリヌクレオチドの同定、新規の標的ポリヌクレオチドのクローンのスクリーニング、ポリヌクレオチド混合物のブロットにおける特異的ポリヌクレオチドの同定、特異的な標的ポリヌクレオチドの増幅、不適切に発現された遺伝子の治療的ブロッキング、ＤＮＡ配列決定などを含む）である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）；ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３６：１９２３−１９３７（１９９３）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２（１９９３）；Ｂａｉｎｓ Ｊ． ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｐｐｉｎｇ，４：１４３−１５０（１９９３））。 特異的ハイブリダイゼーションはまた、オリゴヌクレオチドタグで標識された化合物を探知、回収、および同定する方法として提案されている。 例えば、複数のＤＮＡ配列決定において、オリゴヌクレオチドタグは、同じ配列決定反応において生じるＤＮＡフラグメントからなるゲル上の電気泳動的に分離されたバンドを同定するために用いられる。 このように、多くの配列決定反応由来のＤＮＡフラグメントが、ゲルの同じレーンで分離され、次いで異なる固相物質でブロットされる。 そこでは、異なる配列決定反応由来のフラグメントバンドが、相補的なタグに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブで可視化される（Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１８５−１８８（１９８８））。 オリゴヌクレオチドタグの同様の用途はまた、爆発物、潜在的な汚染物質（例えば、原油）、および模造品の防止または検出のために通貨を同定するために提供されてきた（例えば、Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ、２６５−２７４頁、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４）にレビューされた）。 さらに最近、オリゴヌクレオチドタグを用いるシステムはまた、複雑なコンビナトリアルケミカルライブラリー中の個々の分子を操作および同定する方法として（例えば、このような薬物候補物のライブラリーのスクリーニングを助けるために）提案されている（ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９：５３８１−５３８３（１９９２）：Ａｌｐｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１３９９−１４０１（１９９４）：およびＮｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：１０７００−１０７０４（１９９３））。 このようなタグ化スキームをうまく実施することは、タグとその相補的プローブとの間での特異的なハイブリダイゼーションの達成における成功に大部分依存している。 すなわち、オリゴヌクレオチドタグが基質をうまく同定するためには、擬陽性および擬陰性のシグナルの数を最小限にしなければならない。 不幸にも、このような偽のシグナルは希ではない。 なぜなら塩基対形成および塩基の積み重ね（ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ）の自由エネルギーは二重鎖または三重鎖構造におけるヌクレオチドのあいだで広く変化するからである。 例えば、その相補物に結合したデオキシアデニン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）の繰り返し配列からなる二重鎖は、ミスマッチを含む部分的に相補的な標的に結合したデオキシグアニジン（Ｇ）およびデオキシシチジン（Ｃ）の繰り返し配列からなる同じ長さの二重鎖より安定性が低い可能性がある。 従って、大きなコンビナトリアルケミカルライブラリー由来の所望の化合物が前者のオリゴヌクレオチドでタグ化された場合、完全にマッチしたＡＴに富む二重鎖を検出するように設計されたハイブリダイゼーション条件下では、ＧＣに富むオリゴヌクレオチドで標識された所望されない化合物（ミスマッチした二重鎖においてさえ）が、ＡＴに富むタグからなる完全にマッチした二重鎖とともに検出されるという重大な可能性が存在する。 Ｂｒｅｎｎｅｒら（上記）により提案された分子タグ化システムでは、親密に関連するタグの関連するミスハイブリダイゼーションの問題は、いわゆる「無限（ｃｏｍｍａ−ｌｅｓｓ）」コードを用いることにより処理され、これはその相補的タグについて登録をはずれた（またはフレームシフトした）プローブが、その５またはそれ以上の３塩基ワードまたは「コドン」のおのおのについて１つまたはそれ以上のミスマッチを有する二重鎖を生じることを保証する。 たとえ塩化テトラメチルアンモニウムのような試薬がオリゴヌクレオチド二重鎖の塩基特異的安定性の相違を無効にするために利用可能であるとしても、このような試薬の効果はしばしば限定され、そしてその存在は選択された化合物のさらなる操作（例えば、ポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる増幅）を不可能にし得るか、またはより困難にし得る。 このような問題は、例えば多数回ＰＣＲ、リバースドットブロッティングなどを介する多数のまたは複合した遺伝子座の分析における多数のハイブリダイゼーションプローブの同時使用を非常に困難にしている。 その結果、例えばＨＬＡ遺伝子のような特定の座の直接配列決定は、遺伝子型の同定のための特異的ハイブリダイゼーションを用いる間接的な方法に対する信頼し得る代替法として奨励される（例えば、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：７６５２−７６５６（１９８８））。 異なる固相支持体上で、クローン化されかつ同様にタグ化されたＤＮＡを分類する能力は、特に、並行して多くのサンプルに同時に適用し得る非ゲルベースの配列決定方法と連結される場合に、このような配列決定を促進する。 上記を考慮すると、多くのタグのレパートリーを提供するが、また天然の塩基対形成および塩基の積み重ねの自由エネルギーの差違を変化させるための特別な試薬を用いる必要はなく、擬陽性および擬陰性のシグナルの発生を最小限にするオリゴヌクレオチドベースのタグ化システムが利用可能である場合、これは有用である。 このようなタグ化システムにより、コンビナトリアルケミカルライブラリーの構築および使用、ＤＮＡの大スケールのマッピングおよび配列決定、遺伝子同定、医学診断薬などを含む多くの領域での適用が見い出される。 本発明の目的は、二本鎖ＤＮＡを固相支持体に結合させる方法を提供することである （発明の要旨） １つの実施形態において、上記分子または分子亜集団が、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド亜集団である。 好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドの相補物が、固相支持体に結合される。 より好ましい実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団が結合している微粒子である。 さらにより好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグおよび上記相補物が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。 別の実施形態において、上記分子または分子亜集団が、ポリペプチドまたはポリペプチド亜集団である。 好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグの相補物が、固相支持体に結合している。 より好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグおよび上記相補物が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。 さらにより好ましい実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団が結合している微粒子である。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズ、およびポリスチレン微粒子からなる群から選択される。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団を結合している複数の空間的に離れた表面領域を有する平面基板である。 なおさらにより好ましい実施形態において、異なる上記の複数の空間的に離れた表面領域が、異なる上記相補物の均一な集団を有する。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記平面基板が、ガラス、シリコンおよびプラスチックからなる群から選択される。 別の実施形態において、上記分子または分子亜集団が、以下の形態の線形ポリマー分子： 好ましい実施形態において、Ｍは、１〜１６個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリールであるか；３〜８個の炭素原子と、酸素、窒素、およびイオウからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子とを有するヘテロ環である。 より好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグの相補物は、固相支持体に結合されている。 さらにより好ましい実施形態において、上記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズ、およびポリスチレン微粒子からなる群から選択される。 なおさらにより好ましい別の実施形態において、上記固相支持体が、上記オリゴヌクレオチドタグの相補物の均一な集団を内部に結合している複数の離れた非重複表面領域を有する、平面基板である。 なおさらにより好ましい実施形態において、異なる上記の複数の空間的に離れた表面領域が、異なる上記相補物の均一な集団を有する。 別の局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程： １つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグおよび上記相補物が、固相支持体に結合されている。 好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグおよび上記相補物が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。 より好ましい実施形態において、上記生成工程が、上記標的ポリヌクレオチドのランダムに重複するフラグメントを生成する。 さらにより好ましい実施形態において、上記フラグメントのヌクレオチド配列を決定する工程が、単一塩基配列決定方法により、上記の複数のフラグメントについて同時に行われる。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記フラグメントのそれぞれの部分が、１２から５０ヌクレオチドを含む。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記フラグメントのそれぞれの部分が１２から２５ヌクレオチドを含む。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドが、１キロベース長と５０キロベース長との間の長さである。 好ましい別の実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団をそれぞれ結合している複数の微粒子である。 より好ましい実施形態において、上記分類工程後、上記の複数の微粒子が平面基板に固定される。 さらにより好ましい実施形態において、上記の複数の微粒子が、１平方センチメートル当たり約１０００微粒子から約１００，０００微粒子の間の密度で、上記平面基板の表面にランダムに配置される。 別の局面において、本発明は、組成物を提供し、この組成物は： １つの実施形態において、上記の複数のサブユニットが４個から１０個の範囲にある。 好ましい実施形態において、上記固相支持体が、単一の空間的に離れた領域を有する微粒子である。 より好ましい実施形態において、上記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズおよびポリスチレン微粒子からなる群から選択される。 別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド集団を分類する方法を提供し、この方法は、以下の工程： １つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグの相補物が、固相支持体に共有結合される。 好ましい実施形態において、上記固相支持体が微粒子であり、そして上記相補物の均一な集団が、この微粒子各々に結合される。 より好ましい実施形態において、上記ポリヌクレオチドの集団が、ｃＤＮＡライブラリーである。 さらにより好ましい実施形態において、上記ポリヌクレオチドの部分が、１２から５０ヌクレオチドの範囲にある。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記ポリヌクレオチドの部分が、１２から２５ヌクレオチドの範囲にある。 別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドタグのレパートリーを提供し、このレパートリーは、以下の形態のオリゴヌクレオチド： １つの実施形態において、上記サブユニットが、４から５ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、そして上記ｎが６から９の範囲にある。 別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドタグをポリヌクレオチドへ結合させるためのクローニングベクターのレパートリーを提供し、このレパートリーは、以下の形態の二本鎖要素： １つの実施形態において、上記二本鎖要素が、上記ポリヌクレオチドを上記クローニングベクターに挿入するための１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むポリリンカー領域に、隣接する。 別の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド混合物を分類する方法であって、この方法は、以下の工程： １つの実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団を結合している微粒子である。 好ましい実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグおよび上記相補物が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。 より好ましい実施形態において、上記ポリヌクレオチドが５０から５０００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。 さらにより好ましい実施形態において、上記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズ、グリシダルメタクリレート微粒子およびポリスチレン微粒子からなる群から選択される。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記固相支持体が、上記相補物の均一な集団を結合している複数の空間的に離れた表面領域を有する平面基板である。 なおさらにより好ましい実施形態において、上記の異なる複数の空間的に離れた表面領域が、異なる上記相補物の均一な集団を有する。 二本鎖ＤＮＡの末端に、予め決定された長さの一本鎖を生成させる方法であって、該方法は、以下の工程： ｃＤＮＡライブラリーにおいて新規なｃＤＮＡ分子を検出する方法であって、この方法は、以下の工程： １つの実施形態において、上記オリゴヌクレオチドタグの相補物が、固相支持体に共有結合される。 好ましい実施形態において、上記固相支持体が微粒子であり、そして上記相補物の均一な集団が、この微粒子各々に結合される。 より好ましい実施形態において、上記ｃＤＮＡ分子の部分が、１２から５０ヌクレオチドの範囲にある。 さらにより好ましい実施形態において、上記ｃＤＮＡ分子の部分が、１２から２５ヌクレオチドの範囲にある。 本発明の目的は、化合物の探知、回収、および同定のための分子タグ化システムを提供することである。 本発明の別の目的は、オリゴヌクレオチドタグおよびその相補物の特異的ハイブリダイゼーションにより固相物質の表面上の同一の分子、または分子のサブクラス（特にポリヌクレオチド）を分類するための方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、コンビナトリアルケミカルライブラリーを提供することであり、それらのメンバー化合物は、オリゴヌクレオチドタグおよびその相補物の特異的ハイブリダイゼーションにより同定される。 本発明のなおさらなる目的は、同時分析および／または配列決定用の標的ポリヌクレオチドの数千ものフラグメント（特にランダムに重複するフラグメント）をタグ化および分類するためのシステムを提供することである。 本発明の別の目的は、数百塩基対から数万塩基対の範囲の長さを有する標的ポリヌクレオチドを配列決定するための迅速かつ信頼できる方法を提供することである。 本発明は、オリゴヌクレオチドタグの使用により分子の種類または亜集団を探知、同定、および／または分類するための方法および物質を提供することにより、これらおよび他の目的を達成する。 本発明のオリゴヌクレオチドタグは多くのサブユニットからなり、各サブユニットは３から６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなる。 オリゴヌクレオチドタグのサブユニットは、最少に交差ハイブリダイズしているセット（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｅｔ）から選択される。 このようなセットでは、このセットのサブユニットおよびこのセットの任意の他のサブユニットの相補物からなる二重鎖または三重鎖は少なくとも２つのミスマッチを含む。 言い換えると、最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユニットは最良でも、同じセットの任意の他のサブユニットの相補物と２つのミスマッチを有する二重鎖または三重鎖を形成する。 特定の実施態様に用いられ得るオリゴヌクレオチドタグの数は、タグあたりのサブユニット数およびサブユニットの長さに依存する。 その数は、一般的にタグの長さの全ての可能性のある配列の数（１つのタグがｎヌクレオチド長であるタグの数は４ ｎである）よりずっと少ない。 より好ましくは、サブユニットは４から５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。 本発明の１つの局面において、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドタグの相補物は、ポリヌクレオチドをそれぞれタグを含むポリヌクレオチドの混合物から分類するために用いられる。 この実施態様では、オリゴヌクレオチドタグの相補物は、同一配列の集団が特定の領域で産生されるように、微細ビーズのような固相支持体の表面上、または単一の支持体上の合成位置のアレイ（ａｒｒａｙ）上の特定の位置で合成される。 すなわち、各支持体（ビーズの場合）または各領域（アレイの場合）の表面は、特定の配列を有する唯一のタイプの相補物によって誘導体化される。 このようなビーズ集団または領域集団は別個の配列を有する相補物のレパートリーを含み、そのレパートリーのサイズはオリゴヌクレオチドタグあたりのサブユニットの数および用いられたサブユニットの長さに依存する。 同様に、分類すべきポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチドが同じタグを有し、そして異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するようにレパートリー中のオリゴヌクレオチドタグをおのおの含む。 下記でより十分に説明するように、この条件は、タグ化されたポリヌクレオチドの完全なアンサンブルからタグ化されたポリヌクレオチドの十分に小さいサンプルを取ることにより達成される。 従って、支持体およびポリヌクレオチドの集団がそれぞれの相補物とオリゴヌクレオチドタグの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される場合、同一ポリヌクレオチドの亜集団は特定のビーズまたは領域上に分類される。 次いでポリヌクレオチドの亜集団はミクロ生化学的技法により固相支持体上で操作され得る。 一般的に、本発明の方法は以下の工程を包含する：（ａ）分子集団中の各分子にタグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグを結合して、（ｉ）集団中の実質的に全ての同じ分子または分子の同じ亜集団は結合した同じオリゴヌクレオチドタグを有し、そして集団中の実質的に全ての異なる分子または分子の異なる亜集団は結合した異なるオリゴヌクレオチドタグを有し、ならびに（ｉｉ）レパートリー由来の各オリゴヌクレオチドタグは多数のサブユニットを含有し、そして多数の各サブユニットは３から６ヌクレオチドまたは３から６塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、そのサブユニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択される、工程：および（ｂ）それらのそれぞれの相補物とオリゴヌクレオチドタグを特異的にハイブリダイズすることにより、集団の分子または分子の亜集団を分類する、工程。 本発明の重要な局面は、並行する配列決定のためにポリヌクレオチドを分類するためのオリゴヌクレオチドタグの使用である。 好ましくは、このような配列決定は以下の工程により行われる：（ａ）標的ポリヌクレオチドをカバーする多数のフラグメントを標的ポリヌクレオチドから生成する、工程；（ｂ）タグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグをその多数の各フラグメントに結合して、（ｉ）実質的に全ての同じフラグメントは、結合した同じオリゴヌクレオチドタグを有し、そして実質的に全ての異なるフラグメントは、結合した異なるオリゴヌクレオチドタグを有し、ならびに（ｉｉ）そのレパートリー由来の各オリゴヌクレオチドタグは多数のサブユニットを含有し、そして多数の各サブユニットは３から６ヌクレオチドまたは３から６塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、そのサブユニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択される、工程； 本発明は、オリゴヌクレオチドで分子をタグ化または標識する現在の方法の鍵となる欠点を克服する。 本発明に従ってタグの配列をコードすることにより、タグと別のタグに対する相補物との間でミスマッチした任意の二重鎖または三重鎖の安定性は、タグとそれ自身の相補物との間で完全にマッチした任意の二重鎖の安定性よりはるかに低い。 従って、不正確な分類の問題は、ＧＣに富むタグのミスマッチした二重鎖が完全にマッチしたＡＴに富むタグよりも安定であるため、除去される。 微細ビーズのような固相支持体と組み合わせて用いた場合、本発明は、大スケールのＤＮＡ配列決定のような大スケールの並行操作において特に有用なポリヌクレオチドを操作および分類するための容易な自動化システムを提供する。 ここでは、多くの標的ポリヌクレオチドまたは単一標的ポリヌクレオチドの多くの部分が同時に配列決定および／または分析される。 （定義） 本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、モノマー−モノマー相互作用の通常のパターン（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基の積み重ね、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成など）を介して標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは連結物（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのαアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）の直鎖オリゴマーを含む。 通常、モノマーはホスホジエステル結合またはそのアナログにより連結され、少しのモノマーユニット（例えば３〜４）から数十のモノマーユニットの大きさの範囲にわたってオリゴヌクレオチドを形成する。 オリゴヌクレオチドが一連の文字（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）により示される場合はいつも、ヌクレオチドは左から右に５'→３'の順であり、他に記載されない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、および「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。 ホスホジエステル結合のアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを含む。 通常、本発明のオリゴヌクレオチドは４つの天然のヌクレオチドを包含する；しかし、それらは非天然のヌクレオチドアナログも含有し得る。 天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられ得る場合（例えば、酵素によりプロセスされる必要がある場合）、通常天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要であることは当業者には明らかである。 二重鎖に関して「完全にマッチした」は、各鎖中の全てのヌクレオチドが他鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受けるように、二重鎖を作るポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、互いに２本鎖構造を形成することを意味する。 この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対形成を含む。 三重鎖に関しては、この用語は三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第３鎖からなり、ここで、全てのヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合を受けることを意味する。 逆に、二重鎖におけるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖におけるヌクレオチドの対またはトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎおよび／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を受け損なうことを意味する。 本明細書中に用いられる「ヌクレオシド」は、２'−デオキシ型および２'−ヒドロキシル型（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されたように）を含む天然ヌクレオシドを含む。 ヌクレオシドに関して「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載された）を、それらが特異的ハイブリダイゼーションをし得るという条件つきで含む。 このようなアナログは、結合特性を増強し、退化を低減し、特異性を増すなどのように設計された合成ヌクレオシドを包含する。 （発明の詳細な説明） （サブユニットの最少に交差ハイブリダイズしているセットからのオリゴヌクレオチドタグの構築） 図３のアルゴリズムは最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユニットの特性、すなわちメンバー間の塩基の長さ、数の差異、および組成（例えば、２、３、または４種の塩基からなる）を最初に定義することにより実施される。 一定の長さおよび組成の全ての可能性のある配列からなるテーブルＭ ｎ・ｎ＝１が生じる（１００）。 最初のサブユニットＳ １を選択し、そしてテーブルの最後までｉ＝ｎ＋１である連続するサブユニットＳ ｉと比較する（１２０）。 連続するサブユニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットのメンバーであるために必要なミスマッチの数を有する場合はいつも、新たなテーブルＭ ｎ＋１ （１２５）にたくわえられ、これは前述の工程１２０までの経路で以前に選択されたサブユニットをも含む。 例えば、比較の第一セットでは、Ｍ ２はＳ １を含む：比較の第二セットでは、Ｍ ３はＳ １およびＳ ２を含む：比較の第三セットでは、Ｍ ４はＳ １ 、Ｓ ２ 、およびＳ ３を含む：など。 同様に、テーブルＭ ｊにおける比較は、Ｓ ｊと全ての連続サブユニットＭ ｊとの間にある。 各連続するテーブルＭ ｎ＋１は、サブユニットが工程１３０までの連続する経路において除去されるので、その前の物より小さいことに気を付ける。 テーブルＭ ｎの全てのサブユニットが比較された（１４０）後に、古いテーブルは新たなテーブルＭ ｎ＋１に置き換わり、そして次のラウンドの比較が開始される。 選択されたサブユニットＳ ｉに比較するための連続するサブユニットを含まないテーブルＭ ｎ （すなわちＭ ｎ ＝Ｍ ｎ＋１ ）が達する場合、プロセスは停止する（１６０）。 好ましくは、最少に交差ハイブリダイズしているセットはセットの全ての他のサブユニットのように二重鎖安定性にほぼ等しい寄与をするサブユニットを含有する。 このように、全てのサブユニットとその相補物との間で完全にマッチした二重鎖の安定性はほぼ等しい。 このようなセットを選択するためのガイダンスは至適なＰＣＲプライマーの選択および二重鎖安定性の計算についての報告された技術により提供される、例えばＲｙｃｈｌｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：８５４３−８５５１（１９８９）および１８：６４０９−６４１２（１９９０）：Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ，８３：３７４６−３７５０（１９８６）：Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ，２６：２２７−２５９（１９９１）など。 より短いタグ（例えば、約３０ヌクレオチドまたはそれより少ない）について、ＲｙｃｈｌｉｋおよびＷｅｔｍｕｒにより記載されたアルゴリズムが好ましく、より長いタグ（例えば、約３０〜３５ヌクレオチドまたはそれより大きい）については、Ｓｕｇｇｓら、Ｂｒｏｗｎ編のＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ，第２３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）の６８３−６９３頁に開示された演算法が便利に用いられ得る。 明らかに、本発明の範囲内で最少に交差ハイブリダイズしているサブユニットのセットを設計するために当業者に利用可能な多くのアプローチがある。 例えば、サブユニットを組み立てる場合、末端ヌクレオチドの異なる塩基の積み重ねエネルギーの影響を最小にするために、サブユニットは同じ末端ヌクレオチドを有するように提供され得る。 このように、サブユニットを連結する場合、全ての隣接する末端ヌクレオチドの塩基の積み重ねエネルギーの総量は同じであり、これによりタグ融解温度の多様性が低減または除去される。 最少に交差ハイブリダイズしているセットの好ましい実施態様は、そのサブユニットが４つの天然ヌクレオチドのうちの３つからなるセットである。 下記でより詳細に述べるように、オリゴヌクレオチドタグ中のヌクレオチドの１タイプのヌクレオチドの欠損は、ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エクソヌクレアーゼ活性の使用により標的ポリヌクレオチドが固相支持体上にロードされることを可能にする。 以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群から選択される４つのヌクレオチドをおのおの含有するサブユニットの最少に交差ハイブリダイズしているセットの例である： さらなる模範的な最少に交差ハイブリダイズしているセットが下記の表Ｉに挙げられる。 明らかに、さらなるセットは異なるグループのヌクレオチドを置換することにより、または公知の最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユニットを用いることにより生じ得る。 微粒子が支持体として用いられる場合、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相補物のレパートリーは、好ましくは、例えば、Ｓｈｏｒｔｌｅら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４１８に開示されるような「分裂および混合（ｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ）」技術を介するサブユニット様式（ｓｕｂｕｎｉｔ−ｗｉｓｅ）合成により生じる。 簡単に述べると、合成の基本ユニットは、オリゴヌクレオチドタグのサブユニットである。 好ましくは、ホスホルアミダイトケミストリーを用い、３'ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドが最少に交差ハイブリダイズしているセット（例えば、上記に最初に挙げたセットについて、８つの４マー３'−ホスホルアミダイトがある）における各サブユニット用に調製される。 合成は、Ｓｈｏｒｔｌｅらにより開示されたように、またはヌクレオシドモノマーを用いる種々のオリゴヌクレオチドライブラリーを生じるために用いられた技術（例えば、Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３：７１８−７２５（１９９２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：５２７５−５２７９（１９９１）；Ｇｒｏｔｈｕｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：１３２１−１３２２（１９９３）；Ｈａｒｔｌｅｙ、ヨーロッパ特許出願第９０３０４４９６．４号；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４；８２−８４（１９９１）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４０：４９８−５０７（１９９２）；などに開示された）に直接類似してプロセスされる。 一般的に、これらの技術はカップリング工程の間、成長するオリゴヌクレオチドへの活性化されたモノマーの混合物の適用を単に必要とする。 ２本鎖型のタグは、相補物鎖を別個に合成し、続いて二重鎖形成を可能にする条件下で混合することにより作製され得る。 あるいは、２本鎖タグは、プライマー結合部位として働く公知のオリゴヌクレオチド配列に連結した一本鎖レパートリーを最初に合成することにより形成され得る。 次いで、第２の鎖はプライマーと一本鎖レパートリーとを結合し、ポリメラーゼで伸長することにより合成される。 この後者のアプローチは、Ｏｌｉｐｈａｎｔら、Ｇｅｎｅ，４４：１７７−１８３（１９８６）に記載される。 次いで、このような二重鎖タグは、本発明に従って標的ポリヌクレオチドの分類および操作用の標的ポリヌクレオチドと一緒にクローニングベクターに挿入され得る。 特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を経て起きる実施態様では、タグ配列のコード化は、二重鎖形成タグについての原理と同じ原理に従う。 しかし、サブユニット配列の選択において、さらなる制約が存在する。 一般に、結合のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型を経た第３鎖の会合は、２本鎖標的においてホモピリミジン−ホモプリントラックに沿って最も安定である。 通常、塩基トリプレットは、Ｔ−Ａ ＊ ＴまたはＣ−Ｇ ＊ Ｃモチーフ（ここで、「−」はＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成を示し、そして「 ＊ 」は結合のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型を示す）を形成する。 しかし、他のモチーフもまた可能である。 例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成は、鎖の状態および組成に依存して、第３鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）と第３鎖に結合する二重鎖のプリンに富む鎖との間に平行および逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）の配向を可能にする。 特定の実施態様で所望されるように、三重鎖の安定性を最大にするか、またはそうでなければ調節するための、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドまたはデオキシリボースヌクレオシドのどちらが用いられるか）、塩基修飾 （例えば、メチル化シトシンなど）の選択についての広範囲にわたるガイダンスが文献中に見られる。 例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 、８８：９３９７−９４０１（１９９１）；Ｒｏｂ 本発明のオリゴヌクレオチドタグは、１２から６０までのヌクレオチドまたは塩基対を長さの範囲とし得る。 好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、１８から４０までのヌクレオチドまたは塩基対を長さの範囲とする。 さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、２５から４０までのヌクレオチドまたは塩基対を長さの範囲とする。 サブユニットの好ましい数およびさらに好ましい数に関して、それらの範囲は、以下のように表され得る： （分子へのタグの結合）
ｎ −
都合良く、コンビナトリアルライブラリーの生成に用いられ得る広い多様性のホスフェート結合モノマーが存在する。 以下の参考文献は、本発明での使用に適する、いくつかのホスホルアミダイトおよび／または水素ホスホネートモノマーを開示し、そしてそれらの合成およびオリゴヌクレオチドへの包含に対するガイダンスを提供する：Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：１１５５−１１６２（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． 、１１４：７９７６−７９８２（１９９２）；Ｊａｓｃｈｋｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３４：３０１−３０４（１９９２）；Ｍａら、国際出願ＰＣＴ／ＣＡ９２／００４２３；Ｚｏｎら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６６３０；Ｄｕｒａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：６３５３−６３５９（１９９０）；Ｓａｌｕｎｋｈｅら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． 、１１４：８７６８−８７７２（１９９２）；Ｕｒｄｅａら、米国特許第５，０９３，２３２号；Ｒｕｔｈ、米国特許第４，９４８，８８２号；Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ、米国特許第５，０９１，５１９号；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：４８５７−４８７６（１９８７）など。 さらに特に、Ｍは、１〜２０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素、およびイオウからなる群から選択される０〜１０個のヘテロ原子を有する直鎖、環式、または分枝有機分子構造であり得る。 好ましくは、Ｍは、１〜１６個の炭素原子を有するアルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール ；３〜８個の炭素原子および酸素、窒素、およびイオウからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有するヘテロ環；グリコシル；またはヌクレオシジルである。 さらに好ましくは、Ｍは、１〜８個の炭素原子を有する、アルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリール；グリコシル；またはヌクレオシジルである。 好ましくは、Ｌはリン（Ｖ）結合基であり、このリン結合基は、ホシホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネートまたはエチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであり得る。 一般に、ホスホルアミダイトまたは水素ホスホネート前駆体由来の結合が好ましく、そのため本発明の線形ポリマー単位は、市販の自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３９４など）で都合良く合成され得る。 ｎは、ＭおよびＬの性質に依存して顕著に変化し得る。 通常、ｎは、約３から約１００まで変化する。 Ｍが、ヌクレオシドまたはそのアナログまたはヌクレオシドサイズのモノマーであり、そしてＬがリン（Ｖ）結合の場合、その時ｎは約１２から約１００まで変化する。 好ましくは、 Ｍが、ヌクレオシドまたはそのアナログまたはヌクレオシドサイズのモノマーであり、そしてＬがリン（Ｖ）結合の場合、その時ｎは約１２から約４０まで変化する。 ペプチドは、本発明のタグに結合する別の好ましい種類の分子である。 本発明で用いられ得るペプチド−オリゴヌクレオチド結合体の合成は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． 、１１５：９８１２−９８１３（１９９３）；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（上記）および国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８８／００４４１７；Ｔｒｕｆｆｅｒｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５：２３５３−２３５６（１９９４）；ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５：２７３３−２７３６（１９９４）などの参考文献で教示されている。 好ましくは、ペプチド−オリゴヌクレオチド結合体は、下記のように合成される。 本発明に従って合成されたペプチドは、天然アミノ酸モノマーまたは非天然モノマー（天然アミノ酸のＤ異性体などを含む）からなり得る。 （コンビナトリアルケミカルライブラリー） 図４は、オリゴヌクレオチドタグと結合するペプチドのコンビナトリアルケミカルライブラリーを生成するためのスキームを例示する。 固相支持体２００は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（上記）により教示されるようにサルコシンリンカー２０５（以下の式で例示される）により誘導体化され、このリンカーは、試薬の接近を促進する伸長結合部分を有する。 １ 、Ｓ ２ 、Ｓ ３などの代替的な付加により、合成は進行してタグ２１２を形成し、そしてそれらの対応するライブラリー化合物モノマーＡ １ 、Ａ ２ 、Ａ ３などにより、合成は進行してライブラリー化合物２１６を形成する。 「分裂および混合」技術を用ると、多様性が生まれる。 最少に交差ハイブリダイズしているセット中のサブユニットは、ライブラリー化合物中に加えられたモノマーをコードする。 従って、９ワードのセットは、９つのモノマーから構築されるライブラリー化合物を曖昧性なしにコードし得る。 いくつかの曖昧さが受容可能であれば、単一のサブユニットは、１つより多いモノマーをコードし得る。 合成が完了した後、産物は、切断および脱保護され（２２０）、タグライブラリー化合物２２５を形成し、次いで、この化合物は選択２３０（例えば、タンパク質のような予定された標的２３５への結合）を受ける。 次いで、選択プロセス２３０から回収されたライブラリー化合物のサブセットは、固相支持体２４５上で、そのタグ部分（そこでは、相補的サブユニットおよびヌクレオチドがイタリック体で示される）を介して分類される（２４０）。 オリゴヌクレオチドスプリント２４２をタグ相補物２５０に結合し、制限部位２５５を形成した後、結合体は、対応する制限エンドヌクレアーゼで消化され、ライブラリー化合物（図４の実施例中のぺプチド）をオリゴヌクレオチド部分から切断する。 次いで、タグの配列、それゆえライブラリー化合物の同定は、以下に記載の本発明の好ましい単一塩基配列決定技術により決定される。 （固相支持体） タグ相補物は、その上でタグ相補物が合成される固相支持体と共に用いられ得、あるいは、別々に合成され得、そして使用のために固相支持体に結合され得る。 例えば、このことは以下に開示される：Ｌｕｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：１０８６１−１０８８０（１９８８）；Ａｌｂｒｅｔｓｅｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、１８９：４０−５０（１９９０）；Ｗｏｌｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：２９１１−２９２６（１９８７）；またはＧｈｏｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５：５３５３−５３７２（１９８７）。 好ましくは、タグ相補物は、同じ固相支持体上で合成され、そして同じ固相支持体と共に用いられ得、それは、種々の形態を含み、そして種々の結合部分を含み得る。 このような支持体は、タグ相補物の均一集団が合成される領域の微粒子、またはアレイ、またはマトリックスを含み得る。 広い種類の微粒子支持体が、本発明で用いられ得、例えば、徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどにより作製される微粒子が挙げられ、以下の模範的な参考文献中に開示されている：Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． 、Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ、１１−１４７頁、第４４巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７６）；米国特許第４，６７８，８１４号；第４，４１３，０７０号；および第４，０４６，７２０号；ならびにＰｏｎ、１９章、Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻（Ｈｕｍａｎａ 微粒子表面上でタグを結合させるおよび／または合成するための模範的な結合部分は、以下に開示されている：Ｐｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：７６８−７７５（１９８８）；Ｗｅｂｂ、米国特許第４，６５９，７７４号：Ｂａｒａｎｙら、国際特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１０３；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｏｍｍｕｎ． 、１９８９：８９１−８９３；Ｄａｍｈａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：３８１３−３８２１（１９９０）；Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７１９−７２２（１９９３）；ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１６７９−１６８４（１９９２）など。 上記のように、タグ相補物はまた、単一の（または数個の）固相支持体上で合成され得、タグ相補物で均一にコートされた領域のアレイを形成する。 すなわち、このようなアレイ中の各領域内で、同じタグ相補物が合成される。 このようなアレイを合成するための技術は、以下に開示される：ＭｃＧａｌｌら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３７６７；Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 、９１：５０２２−５０２６（１９９４）；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＭａｓｋｏｓ、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１１１４；ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ（上記）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３：１００８−１０１７（１９９２）；およびＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：４６６３−４６６９（１９９３）。 好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補物で均一にコートされた微粒子またはビーズを用いて実行される。 微粒子支持体、およびそれらの表面とオリゴヌクレオチドとを共有結合または非共有結合する方法は、周知であり、以下の参考文献により例示される：ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ（上記）；Ｇａｉｔ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）；および上記の参考文献。 一般に、微粒子のサイズおよび形態は重要ではない；しかし、最少の試薬およびサンプルの使用でオリゴヌクレオチドタグの多くのレパートリーの構築および操作を容易にするので、直径数μｍ（例えば、１〜２μｍ）から数百μｍ（例えば、２００〜１０００μｍ）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。 いくつかの好ましい適用では、市販の徐放性の多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン支持体が、本発明における固相支持体として用いられる。 このような支持体は、塩基不安定性のリンカーおよび結合した最初のヌクレオチド（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いて有効になる。 好ましくは、５００オングストローム〜１０００オングストロームの間のポアサイズを有する微粒子が用いられる。 他の好ましい適用では、小孔のない微粒子が、その光学特性のために用いられ、この微粒子は、平面支持体（例えば、顕微鏡スライド）の上で多くの微粒子を探知する場合、有利に用いられ得る。 特に、好ましい小孔のない微粒子は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏ （標的ポリヌクレオチドの微粒子への結合） オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、多くの方法（例えば、直接酵素的連結による方法、増幅（例としてＰＣＲによるもの）、タグ配列を含むプライマーの使用など）でポリヌクレオチドの集団に連結され得る。 最初の連結工程は、タグ−ポリヌクレオチド結合体の非常に大きな集団を産生し、そのため単一のタグが、一般に多くの異なるポリヌクレオチドに結合する。 しかし、結合体の十分小さいサンプルを採取することにより、「ダブル」を得る可能性（すなわち、２つの異なるポリヌクレオチド上の同じタグ）は、無視できる（サンプル中の同じポリヌクレオチドで異なるタグを得る可能性もあることに注目。この場合、単にプロセスされた（例えば、２回配列された）ポリヌクレオチドを生じ、そのため、通常問題はない）。 以下により十分に説明したように、サンプル中にダブルを得る可能性は、ポアソン分布により評価され得る。 なぜなら、サンプル中の結合体の数は大きく（例えば、千以上の桁数）、そして特別なタグを選択する可能性は小さいからである。 なぜなら、タグのレパートリーは大きい（例えば、１万以上の桁）からである。 一般に、サンプルが大きければ大きいほど、ダブルを得る可能性は大きくなる。 従って、タグ−ポリヌクレオチド結合体の大きなサンプルを選択すること（例えば、それは、ショットガン配列決定操作における標的ポリヌクレオチド結合体の適切な適用範囲を確かめる）と最少数のダブルが存在することを確かめる小さなサンプルを選択することとの間に、設計の取引が存在する。 大部分の実施態様では、ダブルの存在は、単にノイズのさらなる供給源を加えるか、または配列決定の場合、スキャニングおよびシグナルプロセシングにおける小さな複雑化要因を加えるのみである。 なぜなら、多数の蛍光シグナルを与える微粒子が簡単に無視され得るからである。 本明細書中で用いられる、タグを分子（特に、ヌクレオチド）に結合することに関する用語「実質的に全て」は、本質的にダブルのないタグ−分子結合体の集団を得るのに用いられるサンプリング手法の統計的な性質を反映するつもりである。 タグ−分子結合体の実際の割合に関して、「実質的に全て」の意味は、タグがどのように用いられているかに依存する。 好ましくは、核酸配列決定において、「実質的に全て」は、少なくともタグの８０％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。 より好ましくは、少なくともタグの９０％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。 さらにより好ましくは、少なくともタグの９５％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。 そして、最も好ましくは、少なくともタグの９９％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。 好ましくは、ポリヌクレオチドの集団が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からなる場合、オリゴヌクレオチドタグは、ｍＲＮＡをタグ配列のプライマー含有相補物のセットで逆転写することにより、結合する。 このようなプライマーの模範的なセットは、以下の配列を有し得る： ９ 」は、４つのヌクレオチドの９つのサブユニットのオリゴヌクレオチドタグの配列を表し、そして「［Ｗ，Ｗ，Ｗ，Ｃ］」は、上記で挙げたサブユニット配列（すなわち、「Ｗ」はＴまたはＡを表す）を表す。 下線を引いた部分の配列は、任意の制限エンドヌクレアーゼ部位と同一である。 その部位は、用いられる場合、ビオチンを介した固相支持体への結合からポリヌクレオチドを放出させるのに用いられ得る。 上記のプライマーに関して、微粒子に結合した相補物は、以下の形態を有し得る：
９ ＴＧＧ−リンカー−微粒子。 逆転写後、ｍＲＮＡは、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ 消化により除去され、そして、ｃＤＮＡの第２の鎖は、例えば、以下の形態のプライマーを用いて合成される：
増幅後の一本鎖のタグを露出させるための一般的な方法は、標的ポリヌクレオチド含有結合体をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼまたは同様の酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性で消化することを含む。 単一ヌクレオシドトリホスフェートの存在下で用いられる場合、このようなポリメラーゼは、単一ヌクレオシドトリホスフェートの相補物がテンプレート鎖に届くまで、２本鎖フラグメントの非テンプレート鎖に存在する３'陥凹（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）末端からヌクレオチドを切断する。 このようなヌクレオチドが届いた場合、５'→３'消化は、効果的に停止する。 というのは、除去活性がヌクレオチドを除去するより早い速度で、ポリメラーゼの伸長活性がヌクレオチドを付加するからである。 結果として、３つのヌクレオチドで構成されるタグは、固相支持体上にロードするために容易に調製される。 この技術はまた、標的ポリヌクレオチドの内部のＦｏｋ Ｉ部位を選択的にメチル化し、一方ポリヌクレオチドの末端で一本鎖のＦｏｋ Ｉ部位をメチル化されないまま残すために用いられる。 最初に、末端Ｆｏｋ Ｉ部位は、デオキシシチジントリホスフェートとともにポリメラーゼを用いて１本鎖とされる。 次いで、フラグメントの２本鎖部分は、メチル化され、その後、１本鎖末端は、４つ全てのヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて満たされ、それによりＦｏｋ Ｉ部位を再生する。 明らかに、この手順は、Ｆｏｋ Ｉ 以外のエンドヌクレアーゼに一般化され得る。 オリゴヌクレオチドタグが、特定のハイブリダイゼーション（例えば、上記のようにそれらを１本鎖にすることにより）のために調製された後、ポリヌクレオチドは、タグとその相補物との間の完全にマッチする二重鎖の形成に有利な条件下で、タグの相補的配列を含む微粒子と混合される。 これらの条件を作るための広範囲のガイダンスが文献中に存在する。 このようなガイダンスを提供する例示的な参考文献としては、Ｗｅｔｍｕｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中のＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２６：２２７−２５９（１９９１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）などが挙げられる。 好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、完全にマッチした配列のみが安定した二重鎖を形成するのに十分にストリンジェントである。 このような条件下で、それらのタグにより特にハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、微粒子に結合した相補的配列に連結される。 最終的に、微粒子は洗浄され、連結されないポリヌクレオチドが除去される。 合成支持体として通常使用されるＣＰＧ微粒子が用いられる場合、微粒子表面上でタグ相補物の密度は、代表的にいくつかの配列決定操作に必要な密度以上である。 すなわち、ポリヌクレオチドを種々の酵素に結合させる連続的な処理を必要とする配列決定アプローチにおいては、空間を密にとったポリヌクレオチドは、比較的大きな酵素のポリヌクレオチドへの接近を阻害する傾向があり得る。 このような場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、タグ相補物が、かなり過剰に（例えば、ポリヌクレオチドに対して１０：１から１００：１まで、あるいはそれ以上）存在するように微粒子と混合される。 このことは、微粒子表面上におけるポリヌクレオチドの密度が、酵素の接近を阻害するほど高くないことを保証する。 好ましくは、微粒子表面上のポリヌクレオチド間の平均空間は、３０〜１００ｎｍの位である。 標準ＣＰＧ支持体およびＢａｌｌｏｔｉｎｉビーズ（固体ガラス支持体の１種）についての割合の選択におけるガイダンスは、ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１６７９−１６８４（１９９２）中に見られる。 好ましくは、配列決定の適用において、そして直径２０〜５０μｍの範囲の標準ＣＰＧビーズが、約１０ ５のポリヌクレオチドでロードされ、そして直径５〜１０μｍの範囲のＧＭＡビーズが、数万（例えば、４×１０ ４ 〜６×１０ ４ ）のポリヌクレオチドでロードされる。 上記の方法は、以下に記載される平行配列決定方法とカップリングする場合、ｍＲＮＡ集団をフィンガープリントするために用いられ得る。 部分配列情報は、上記の方法のような分離された微粒子に結合したｃＤＮＡの大量の（例えば、１万〜１０万）サンプルから同時に得られる。 部分配列の頻度分布は、種々の細胞または組織型、ならびに疾患組織（例えば、ガン）からのｍＲＮＡ集団を同定し得る。 このようなｍＲＮＡフィンガープリントは、病状をモニタリングおよび診断するのに有用である（例えば、国際出願 ＰＣＴ／ＵＳ９５／２１９４４。これは、同じ目的のための発現配列タグ（ＥＳＴ）の使用を記載する）。 （単一塩基ＤＮＡ配列決定） 本発明で用いられるのに適切であり、ＤＮＡフラグメントの電気泳動での分離を必要としないＤＮＡ配列決定の「単一塩基」方法が、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３６７８号に記載されている。 この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）突出鎖を有するポリヌクレオチドの末端にプローブを連結して連結複合体を形成する工程であって、このプローブは、ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な突出鎖を有し、かつ、このプローブは、ヌクレアーゼ認識部位を有する工程；（ｂ）この連結複合体から非連結プローブを除去する工程；（ｃ）連結プローブの同定によりポリヌクレオチドの突出鎖における１つまたはそれ以上のヌクレオチドを同定する工程；（ｄ）ヌクレアーゼで連結複合体を切断する工程；および（ｅ）ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで（ａ）から（ｄ）までの工程を繰り返す工程。 以下にさらに記載するように、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの同定は、標的ポリヌクレオチドからの連結複合体の切断前または切断後のいずれかに行われ得る。 好適には、天然のタンパク質エンドヌクレアーゼが用いられる時は常に、この方法は、配列決定操作の開始時に、標的ポリヌクレオチドをメチル化する工程をさらに包含する。 この方法の重要な特徴は、標的ポリヌクレオチドに連結されるプローブである。 プローブの好適な形態は、図１ａに示されている。 一般に、プローブは、一方の末端１０において突出鎖を有する二本鎖ＤＮＡである。 プローブは、認識部位と突出末端１０との間に少なくとも１つのヌクレアーゼ認識部位１２およびスペーサー領域１４を含む。 好適には、プローブはまた、標識１６を含み、これは、この特定の実施態様において、突出鎖の反対側の末端に示されている。 プローブは、種々の手段により、そして種々の位置において標識され得、唯一の制限は、選択された標識手段が、連結工程またはヌクレアーゼによるプローブの認識を邪魔しないということである。 プローブの突出鎖１０が、５'末端または３'末端であるかどうかは重要ではない。 しかし、標的ポリヌクレオチドおよびプローブの突出鎖が、完全に一致する二重鎖を形成し得、特異的な連結を可能にすることが重要である。 もし、標的ポリヌクレオチドおよびプローブの突出鎖が異なる長さであれば、生じるギャップは、例えば、Ｂａｃｋｍａｎら、欧州特許出願第９１１００９５９．５号に開示されている「ギャップＬＣＲ」におけるように、連結以前にポリメラーゼによってフィルインされ得る。 好適には、プローブおよび標的ポリヌクレオチドの両方の鎖が、フィルイン工程なしに連結され得るように、それぞれの突出鎖におけるヌクレオチドの数が同じである。 好適には、プローブの突出鎖は２〜６のヌクレオチドの長さである。 以下に示すように、突出鎖の長さが長くなるにつれて、各連結および切断サイクルの間に、標的ポリヌクレオチドへ適用されるプローブ混合物の複雑性が増す。 プローブの相補鎖は、好都合にも、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル ３９２または３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）上で、標準的なケミストリーを用いて合成される。 合成後、相補鎖は、組み合わされて二本鎖プローブを形成する。 一般に、プローブの突出鎖は、混合物として合成されるので、すべての可能な配列は、突出部に表される。 例えば、もし、突出部が４つのヌクレオチドからなっているなら、ある実施態様において、４つの混合物が以下のように調製される： ３すなわち６４の異なる配列を含む；すなわち、言い換えれば、４つのプローブのそれぞれは、６４の縮重を有する。 例えば、Ｘ １ Ｘ ２ ． ． ． Ｘ ｉ ＮＮＮＡは、以下の配列を含む： 好適には、ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドについては、プローブの二重鎖形成領域は、長さが約１２〜約３０塩基対であり、より好適には、その長さは、約１５〜約２５塩基対である。 従来のリガーゼが本発明に用いられる場合、以下にさらに記載されるように、プローブの５'末端が、ある実施態様においてリン酸化され得る。 ５'モノホスフェートが、化学的にまたはキナーゼを用いて酵素的に（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））のいずれかで第２のオリゴヌクレオチドに結合され得る。 化学的リン酸化は、ＨｏｒｎおよびＵｒｄｅａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． 、２７：４７０５（１９８６）に記載され、開示されたプロトコルを実施するための試薬は、市販されている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からの５'Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＯＮ ＴＭ ））。 従って、ある実施態様において、プローブは、以下の形態を有し得る： 上記のプローブは、種々の方法で標識され得る（放射性部分、蛍光部分、比色部分、化学ルミネセンスマーカーなどの直接または間接結合を含む）。 ＤＮＡの標識およびＤＮＡプローブの構築のための方法の多くの包括的な概説が、本発明のプローブの構築に適用可能な指針を提供している。 このような概説は、Ｋｒｉｃｋａ編、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ 好適には、プローブは、１つまたはそれ以上の蛍光色素で標識される（例えば、Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号； Ｂｅｇｏｔら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に開示されている）。 この方法によれば、プローブは、標的ポリヌクレオチドの末端へ連結され、各連結および切断のサイクルにおいて連結複合体を形成する。 連結複合体は、標的ポリヌクレオチドおよびプローブの突出鎖がアニールし、そして、少なくとも一対のプローブおよび標的の同じ向きの鎖が連結された、すなわち、互いに共有結合された後に、形成された二本鎖構造である。 連結は、酵素的または化学的のいずれかで達成され得る。 化学的連結方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｆｅｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、８：４０７−４１４（１９８９）； Ｓｈａｂａｒｏｖａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９；４２４７−４２５１ （１９９１）など）。 しかし、好適には、連結は、標準的なプロトコルにおいてリガーゼを用いて、酵素的に行われる。 多くのリガーゼが公知であり、本発明の使用に適している（例えば、Ｌｅｈｍａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８６： ７９０−７９７ （１９７４）； Ｅｎｇｌｅｒら、ＤＮＡリガーゼ、３−３０頁、Ｂｏｙｅｒ編、Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｖｏｌ．１５Ｂ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）など）。 好適なリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡ リガーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびＴｔｈリガーゼを含む。 これらの使用の際のプロトコルは、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）； Ｂ 非リン酸化プローブを用いる配列決定方法の実施態様において、連結工程は、（ｉ） リガーゼで標的ポリヌクレオチドへプローブを連結させ、その結果連結複合体が、一方の鎖上にニックを有して形成される工程；（ｉｉ） 従来のプロトコルを用いて、キナーゼでニックにおいて５'水酸基をリン酸化する工程（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記））；および（ｉｉｉ） 再度連結を行い、ニックにおいて鎖を共有的に連結させる、すなわち、ニックを除去する工程を包含する。 （微粒子表面での酵素的プロセスおよび／または結合事象の観察装置） 好適には、発光信号（例えば、化学ルミネセンス、蛍光など）が、事象またはプロセスを検出するために用いられるときは常に、ロードされた微粒子は、平面基板（例えば、ガラススライド）上に、（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９２１７号、同第ＰＣＴ／ＮＬ９０／０００８１号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１８８６号に記載されているような）走査システムでの検査のために広がっている。 走査システムは、再現性よく基板を走査し、かつ、座標系によって、所定の領域に各微粒子の位置を規定し得るべきである。 ポリヌクレオチド配列決定応用において、微粒子の位置同定は、連続的な走査工程において反復可能であることが重要である。 このような走査システムは、市販の構成要素（例えば、１つまたはそれ以上の光電子増倍管、あるいは、ＣＣＤアレイおよび、例えば、蛍光信号を励起、収集および分類するための適切な光学機器を備える検出システムとともに用いられるデジタルコンピューターによって制御されるｘ−ｙ移動テーブル）から構築され得る。 ある実施態様において、共焦光学システムが所望であり得る。 ４色配列決定での使用に適切な走査システムの一例が、図５に模式的に示されている。 基板３００（例えば、固定微粒子を有する顕微鏡スライド）が、ｘ−ｙ移動テーブル３０２上に置かれ、これが、種々の市販のパーソナルコンピューター（例えば、Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）から入手可能な４８６−ベースの機械またはＰｏｗｅｒＰＣ モデル７１００または８１００）のうちのいずれかであり得る適切にプログラムされたデジタルコンピューター３０４に接続され、そしてそれにより制御される。 テーブル移動およびデータ収集機能のためのコンピューターソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なＬａｂ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のような市販の実験ソフトウェアによって提供され得る。 基板３００およびテーブル３０２は、光を集め、基板３００に固定した微粒子へ伝達し得る１つまたはそれ以上の対物レンズ３０８を有する顕微鏡３０６と動作が連動する。 好適にはレーザーである光源３１２からの励起光線３１０が、光線スプリッター３１４（例えば、二色性ミラー）へ指向し、これが、光線を顕微鏡３０６および対物レンズ３０８を通して再指向し、今度は、対物レンズが光線の焦点を基板３００に合わせる。 レンズ３０８は、微粒子から発光された蛍光３１６を集め、それを光線スプリッター３１４を通して信号分配光学機器３１８へ指向し、それが、今度は、蛍光をいくつかの蛍光特性（例えば、強度、寿命など）を電気信号に変換するための１つまたはそれ以上の適切な光学電気デバイスへ指向する。 信号分配光学機器３１８は、帯域通過フィルター、ファイバー光学機器、回転ミラー、固定位置ミラーおよびレンズ、回折格子などのような当該分野において標準的な種々の構成要素を備える得る。 図５に図示するように、信号分配光学機器３１８は蛍光３１６を４つの分離した光電子増倍管３３０、３３２、３３４および３３６へ向け、次いで、これらの出力は、プリアンプおよびフォトンカウンター３５０、３５２、３５４および３５６に向けられる。 フォトンカウンターの出力は、コンピューター３０４によって収集され、そこで、蓄積され、分析され、ビデオ３６０において観察され得る。 あるいは、信号分配光学機器３１８は、蛍光信号３１８をＣＣＤアレイ上に向ける回折格子であり得る。 走査の際の位置付けの安定性および再現性が、間隔が密接な微粒子を分離するための解像度をかなりの程度まで決定する。 好適には、走査システムは、間隔が密接な（例えば、１粒子直径またはそれ以下分だけ分離されている）微粒子を解像し得るべきである。 従って、ほとんどの応用に対して（例えば、ＣＰＧ微粒子を用いて）、走査システムは、少なくとも１０〜１００μｍ程度に対象物を解像する能力を有するべきである。 ある実施態様において、さらに高い解像度が所望であり得るが、解像度が増すにつれて、基板を完全に走査するのに必要な時間が増す。 従って、ある実施態様において、速度と解像度との間で妥協が必要であり得る。 走査時間の増加は、微粒子が配置していることが知られている（例えば、最初のフル走査から）位置のみを走査するシステムによって達成され得る。 好適には、微粒子サイズおよび走査システム解像度が、１ｃｍ ２当たり約１万〜１０万の間の微粒子の密度で平面上にランダムに配置される蛍光標識された微粒子の解像度を可能にするように選択される。 配列決定応用において、ロードされた微粒子は、種々の方法で基板の表面に固定され得る。 固定は、微粒子が、顕著な損失なく、試薬露出および洗浄の連続的なサイクルを行うのに十分に強力であるべきである。 基板がガラスであるとき、その表面は、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、アルキルアミノリンカーで誘導体化され得、これは次に再び従来のケミストリーを用いて、アビジンに架橋され、アビジン化された表面を形成し得る。 ビオチン部分は、多くの方法でロードされた微粒子に導入され得る。 例えば、ポリヌクレオチドにタグを結合するために用いられるクローニングベクターの画分（例えば、１０〜１５パーセント）が、タグの反対側のポリヌクレオチドの末端でポリヌクレオチド挿入物に隣接して（消化において粘着末端を提供する）唯一の制限部位を含有するように操作される。 この部位は、微粒子にロードするためのポリヌクレオチドおよびタグで切り出される。 ロード後、ロードされたポリヌクレオチドの約１０〜１５パーセントが、微粒子表面から遠位の唯一の制限部位を有する。 関連の制限エンドヌクレアーゼで消化後、ビオチン部分を含有している適切な二本鎖アダプターが、粘着末端に連結される。 それから、得られた微粒子が、アビジン化されたガラス表面に広げられ、そこで、ビオチン−アビジン結合を介して固定される。 あるいは、そして好適には、連結による配列決定が用いられると、最初の連結工程において、プローブの混合物が、ロードされた微粒子にアプライされる：プローブの一画分は、配列決定方法に必要であるようなＩＩｓ型制限認識部位を含み、そしてプローブの一画分は、このような認識部位を有さないが、その代わりに、その非連結末端においてビオチン部分を含む。 好適には、混合物は、約１０〜１５パーセントのビオチン化プローブを含む。 さらに別の実施態様において、ＤＮＡがロードされた微粒子が、ガラス基板に塗布されると、ＤＮＡは、数時間（例えば、２４時間）のインキュベーションで、ガラス表面に非特異的に吸着され、微粒子の顕著な損失なく、反復される試薬への露出および洗浄を可能とするために十分に強力な結合を形成し得る。 好適には、このようなガラス基板は、フローセル （ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ） であり、これは、ガラススライドにエッチングされた流路を含み得る。 好適には、このような流路は、流体がそこを通って吸い上げられ得るように閉じられ、かつ、微粒子の単層が規定された観察領域内に閉じ込められるように、微粒子の直径と十分に近い深さを有する。 （並行配列決定） ＋＋の存在下における超音波処理またはＤＮａｓｅ Ｉ 消化）によって断片化される。 断片化後、フラグメントの末端が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されるように修復され、そして修復されたフラグメントは、ゲル電気泳動を用いて、サイズによって分離される。 ３００〜５００塩基対の範囲のフラグメントが選択され、従来の手段によってゲルから溶出され、上記のように、タグを有するベクター中に連結され、タグ−フラグメント結合体のライブラリーを形成する。 上記のように、数千のタグ−フラグメント結合体を含有するサンプルが、ライブラリーから採取され、そして拡大され、その後、タグ−フラグメント挿入物がベクターから切り出され、そして上記のように、微粒子上のタグ相補物への特異的なハイブリダイゼーションのために調製される。 標的ポリヌクレオチドのサイズに応じて、多重サンプルが、標識−フラグメントライブラリーから採取され、別々に拡大され、微粒子上にロードされ、そして配列決定される。 選択された二重の数は、サンプル中に表されたタグレパートリーの画分に依存する（トリプル−−同じタグを有する３つの異なるポリヌクレオチド−−または上記を得る可能性は、安全に無視し得る）。 上記のように、サンプル中のダブルの可能性は、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布 ｐ（ダブル）＝ ｍ ２ ｅ −ｍ ／２（ここで、ｍは、サンプル中のタグレパートリー画分である）から評価され得る。 下の表Ｖは、所与のタグサイズ、サンプルサイズおよびレパートリーの多様性についてサンプル中でダブルを得る可能性を挙げている。 （本発明の方法を実施するためのキット） （ｃＤＮＡライブラリーにおける新規なポリヌクレオチドの同定） ９は、上記のようなタグを表し、「ＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣ」は、二本鎖形態で制限部位を形成する任意の配列であり、そして「プライマー部位」は、ＰＣＲによって目的のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー結合部位として後に用いられる、ライブラリーのすべてのメンバーに共通の配列である。 従来の技術による逆転写および第２鎖合成の後、二本鎖フラグメントが、上記のようにクローニングベクターに挿入され、そして増幅される。 次いで、増幅されたライブラリーがサンプリングされ、そしてサンプルは増幅する。 増幅されたサンプルからのクローニングベクターが単離され、そしてタグ化されたｃＤＮＡフラグメントが切り出され、そして精製される。 上記のようなポリメラーゼでタグを一本鎖にした後、フラグメントはメチル化され、そして本発明によって微粒子上に分類される。 好適には、上記のように、クローニングベクターは、タグ化されたｃＤＮＡが、分類および微粒子への連結後に好適な単一塩基方法による即座の配列決定を可能にする、Ｆｏｋ Ｉ のようなエンドヌクレアーゼで切り出され得るように構築される。 次いで、段階的な配列決定が、本発明に従って、ライブラリー全体またはライブラリーの１つまたはそれ以上の大きな画分で同時に行われ、ついには、十分な数のヌクレオチドが、ライブラリーが由来する生物のゲノムに特有の表示のために各ｃＤＮＡについて同定される。 例えば、もし、ライブラリーが哺乳動物のｍＲＮＡに由来するなら、１４〜１５ヌクレオチドの長さのランダムに選択された配列が、典型的な哺乳動物のゲノムの２０００〜３０００メガベースの間で特有の表示を有すると予想される。 もちろん、細菌または他の下等生物に由来するライブラリーに特有の表示には、ずっと少ないヌクレオチドの同定で十分である。 好適には、少なくとも２０〜３０ヌクレオチドが、特有の表示を確実にし、かつ、以下に記載するように、適切なプライマーの構築を可能にするために同定される。 次いで、表にされた配列は、ユニークなｃＤＮＡを同定するために、既知の配列と比較され得る。 次いで、特有のｃＤＮＡは、従来の技術（例えば、プライム部位およびその配列が決定されたｃＤＮＡの部分に関するプライマーで製造されたＰＣＲアンプリコンからプローブを構築する技術）によって単離される。 次いで、プローブは、従来のスクリーニングプロトコルを用いてライブラリー中のｃＤＮＡを同定するために用いられ得る。 （実施例Ｉ） ｉは表Ｉで定義されるサブユニットを表し、用語「（ ＊＊ ）」はそれぞれの相補物を表す。 ｐＵＣ１９を、Ｓａｌ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、大きなフラグメントを精製し、そしてタグ１、タグ２およびタグ３で別々に連結して、それぞれ、ｐＵＣ１９−１、 ｐＵＣ１９−２、 ｐＵＣ１９−３を形成する。 この３つの組換え体を、別々に増幅し単離し、その後、ｐＵＣ１９−１を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＡａｔ Ｉで消化し、 ｐＵＣ１９−２をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＳｓｐ Ｉで消化し、ｐＵＣ１９−３を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｍｎ Ｉで消化する。 小さなフラグメントを従来のプロトコルを用いて単離して、それぞれ、約２５０、３７５および５７５塩基対の長さの３つの二本鎖フラグメントを得る。 それぞれは、タグに隣接する陥没した３'鎖および反対側の末端には平滑または３'突出鎖を有する。 およそ１２ｎｍｏｌの各フラグメントを、製造者が推薦する、３３μＭ デオキシシトシントリホスフェートを含有する反応緩衝液中で、５ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと混合する。 反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、氷の上に置くことによって反応を止める。 次いで、フラグメントを、従来の手段で精製する。 ＣＰＧ微粒子（粒子サイズ３７〜７４ｍｍ、孔サイズ５００オングストローム、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１６７９−１６８４ （１９９２）によって開示されたリンカーで誘導体化する。 ３つのアリコートに分離後、タグ１、タグ２およびタグ３の相補物を、従来の自動化されたＤＮＡ合成機（例えば、ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））を用いて、微粒子上で合成する。 異なって誘導体化された微粒子のそれぞれ約１ｍｇを、別個の容器に入れる。 ｐＵＣ１９−１、ｐＵＣ１９−２およびｐＵＣ１９−３から切り出されたＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理のフラグメントを、製造者推薦のＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のための緩衝液５０μＬに再懸濁する。 次いで、混合物を、誘導体化ＣＰＧ微粒子をそれぞれ１ｍｇ含有している３つの容器に等分する。 ５ユニットのＴａｑ ＤＮＡリガーゼを各容器に添加し、その後、それらを５５℃で１５分間インキュベートする。 氷の上に置くことによって反応を止め、そして微粒子を、繰り返し遠心分離およびＴＥに再懸濁することによって数回洗浄する。 最後に、微粒子をＮｄｅ Ｉ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で再懸濁し、結合したポリヌクレオチドを消化する。 微粒子からの分離後、Ｎｄｅ Ｉ消化によって放出されたポリヌクレオチドフラグメントを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼおよびフルオレセイン標識チミジントリホスフェート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でインキュベートすることにより、蛍光標識する。 次いで、そのフラグメントを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３７３ ＤＮＡ配列決定機を用いて、非変性ポリアクリルアミドゲル上で別々に分析する。 （実施例 ＩＩ） 次に、Ｆｏｋ Ｉ部位ならびにＥｃｏ ＲＩおよびＳｍａ Ｉ部位の一部を含有する、以下のアダプターを調製する： 別に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載のプロトコルに従って超音波処理により、ＳＶ４０ ＤＮＡを断片化する。 得られたフラグメントを標準的なプロトコルを用いて修復し、そしてサイズによって分離する。 ３００〜５００塩基対の範囲のフラグメントを選択し、上記のＳｍａ Ｉ消化Ｍ１３に連結してフラグメント−タグ結合体のライブラリーを形成し、次いで、増幅する。 数千の異なるフラグメント−結合体を含有するサンプルをライブラリーから取り出し、さらに増幅し、そしてフラグメント−タグ挿入物を、Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化することにより切り出す。 切り出されたフラグメント−タグ結合体を、実施例Ｉに記載のように、デオキシシチジントリホスフェートの存在下でＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して、特異的なハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドタグをＣＰＧ微粒子に曝露する。 実施例Ｉに記載のように、ハイブリダイゼーションおよび連結後、ロードされた微粒子をＦｏｋ Ｉで処理して、予め決定した配列の４−ヌクレオチド突出鎖を生成する。 以下のプローブの１０：１の混合物（プローブ１：プローブ２）を微粒子上のポリヌクレオチドに連結する。 次いで、ロードされた微粒子をアビジン化ガラススライドの表面上に堆積する。 試薬および洗浄溶液は表面上へ送達および表面上から除去され得る。 結合した微粒子を有するアビジン化スライドにより、走査型蛍光顕微鏡（例えば、Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｍｏｄｅｌ ＰＭ５００−Ｃモーションコントローラー 、４８８ｎｍの励起光を発生するＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ ２０２０アルゴンイオンレーザー、および５２０ｎｍ波長域発光フィルターなどの装置を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ）で検査する。 励起光および蛍光発光を、同じ対物レンズを通して、それぞれ、送達および収集する。 二色性ミラーによって励起光および収集蛍光を分離する。 二色性ミラーは、収集された蛍光を一連の帯域フィルターを介して、モニターされている蛍光物質に対応するフォトン計数デバイス（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｍｏｄｅｌ ９４０３−０２光電子増倍管、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ＳＲ４４５増幅器およびｍｏｄｅｌ ＳＲ４３０多重チャンネルスケーラーおよびデジタルコンピューター（例えば、４８６−ベースのコンピューター）を備える）へ指向する。 コンピューターは、微粒子の位置を記録するスライドの二次元マップを生成する。 最初のプローブを除去するためのＦｏｋ Ｉでの切断後、結合微粒子上のポリヌクレオチドを、以下に記載の好適な単一塩基配列決定方法に従い、プローブ連結、洗浄、検出、切断および洗浄工程を２０サイクル行う。 各検出工程において、走査システムが、各微粒子で同定された塩基に対応する蛍光発光を記録する。 一般に、以下の反応および洗浄を、特に記載されない限り、用いる酵素のための、製造者 （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ） の推薦する緩衝液で実施する。 標準的な緩衝液もまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されている。 以下の４組の混合プローブを、標的ポリヌクレオチドへの添加用に提供する： 上記のプローブを、約５モル過剰量の標的ポリヌクレオチド末端中で、以下のようにインキュベートする：プローブを、２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびアンカー化標的ポリヌクレオチドとともに６０分間１６℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中でインキュベートする：次いで、洗浄後、標的ポリヌクレオチドを、１００ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとともに３０分間３７℃で製造者の推薦する緩衝液中でインキュベートし、洗浄し、そして再度、２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびアンカー化標的ポリヌクレオチドとともに３０分間１６℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中でインキュベートする。 洗浄は、スライド上に洗浄緩衝液（例えば、ＴＥ）を大量に連続的に流すことによって達成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に開示されている）。 連結−リン酸化−連結のサイクルおよび最後の洗浄後、結合微粒子が、蛍光標識の存在について走査され、その位置および特徴が走査システムによって記録される。 次いで、標識された標的ポリヌクレオチド、即ち、連結複合体を、製造者の推薦する緩衝液中で３０分間３７℃で、１０ユニットのＦｏｒ Ｉとともにインキュベートし、その後、ＴＥ中で洗浄する。 その結果、標的ポリヌクレオチドは各鎖上で１つのヌクレオチド分短くされ、次の連結および切断サイクルのために準備される。 ２０のヌクレオチドが同定されるまでこのプロセスを続ける。 （配列表） |
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