Encoded microcarriers

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、１９９９年４月１６日に出願された米国仮出願第６０／１２９，５
５１号に対する優先権の利益を主張する。 該仮出願の内容は引用により本明細書に組み込まれる。

【０００２】 （発明の分野） 本発明はコード化されたマイクロキャリア、およびより具体的にはそれらの上に書かれたコードを有するマイクロキャリアに関する。 マイクロキャリア「上に」書かれたコードに対する本開示中のいかなる言及も、マイクロキャリアの表面上に書かれたコードならびにマイクロキャリアの内奥（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｄｅ
ｐｔｈ）に書かれたコードを包含する。 本発明はまた、マイクロキャリア上にコードを書く方法、コードを読取る方法およびコード化されたマイクロキャリアの使用方法にも関する。 マイクロキャリアの好ましい一コード化方法は、漂白可能な（ｂｌｅａｃｈａｂｌｅ）物質を担持するマイクロキャリアを高空間分解能光源に曝露させてマイクロキャリア上のコードを漂白することを伴う。 コード化されたマイクロキャリアは、例えば化学的および生物学的アッセイならびに合成における支持材料として使用することができる。

【０００３】 （関連技術の記述） 化学および生物学技術における薬物の発見および薬物スクリーニングは、非常に多数の化合物もしくは分子でアッセイを実施することを普遍的に必要とする。
これらのアッセイは、目的の化合物について化学物質ライブラリーをスクリーニングすること、試験サンプル中の特定の標的分子についてスクリーニングすること、および一般に分子間の目的の化学的および生物学的相互作用について試験することを典型的に包含する。 上述されたアッセイはしばしば数千もの別個の化学的もしくは生物学的反応を実施することを必要とする。 例えば、薬物発見アッセイは、特定の標的被検体に対し数千の化合物を試験することを必要とすることができる。 標的被検体と反応、結合もしくは別の方法で相互作用することが観察されるいかなる化合物も、観察された相互作用が意義あるものであると考えられるいずれかの数の利用性に対する見込みを保持することができる。

【０００４】 多数の実際的問題が、上述されたアッセイで必要とされる多数の個々の反応の取扱いにおいて存在する。 おそらく、最も重要な問題は各反応を標識しかつ追跡する必要である。 例えば、目的の反応が数千の反応の一群の１つのみで観察される場合、研究者は数千の最初の化合物もしくは分子のどの１つがその反応を生じたかを決定することが可能でなくてはならない。

【０００５】 反応体の本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の一慣習的追跡方法は、高密度アレイ内の別個の反応容器で各反応を物理的に分離すること、およびどの個別の反応体を各容器中で使用したかの記録を保管することによる。 従って、例えば、目的の反応が１０００個のうちの５番として標識された容器中で観察される場合、研究者は該容器中で使用された反応体の記録を参照することができ、そして容器５の記録から、どの特定の反応体が存在して目的の反応に至ったかを学ぶことができる。
上で言及される高密度アレイの例は、３８４、８６４、１，５３６、３，４５６
および９，６００ウェルのマイクロタイタープレート容器であり、ここではマイクロタイタープレートの各ウェルが小型の反応容器を構成する。 小型化された反応ウェルは空間を節約して使いかつアッセイで使用される試薬の費用を低減させるため、それらが使用される。

【０００６】 しかしながら、化学的および生物学的アッセイにおけるマイクロタイタープレート容器の使用は多数の欠点をもつ。 例えば、プレートの使用は、全部の反応が自由に、そしてしばしばより便宜的には１個の反応容器中で起こることを見込むよりはむしろ、非常に多数の別個の反応容器を慎重に分離することを必要とする。 さらに、反応容量が空間的に分離されるという要件は、それとともに、使用されるマイクロタイタープレートの大きさ、および従って該プレート上で実施することができる多様な反応の数に対する物理的制限をもつ。

【０００７】 マイクロタイタープレートの使用における上述された制限に鑑み、高スループットアッセイにおいて個々の反応を追跡する他の手段を開発するためのいくつかの試みがなされてきた。 これらの方法は、反応を空間的に分離するという概念を断念し、そして代わりに他の手段により個々の反応を追跡する。 例えば、支持体としてのマイクロキャリア上で高スループットアッセイおよび反応を実施するための方法が開発された。 各マイクロキャリアは、反応体として作用するようにその表面に結合された１種の特定のリガンドを含有することができ、また、マイクロキャリアは該マイクロキャリアを同定する「コード」を付加的に含有することができ、そして従ってその表面に結合された特定のリガンドを同定する。 上述されたこれらの方法は「ランダムプロセシング（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇ）」を見込み、これは、それぞれがそれらの表面に結合された１種のリガンドを有する数千の独特にコードにされたマイクロキャリアを全部混合しそして同時にアッセイにかけることができることを意味する。 その後、結合されたリガンドと標的被検体との間の目的の好都合な反応を示すマイクロキャリアは、それらのコードを読取らせることができ、それにより好都合な反応を生じさせたリガンドの本質に至る。

【０００８】 上述されたランダムプロセシングの実務はマイクロキャリアのそれぞれの正確なコード化を別個に必要とし、また、コードの正確かつ一貫した同定を必要とする。 ランダムプロセシングを使用するアッセイはそれらの結果についてマイクロキャリアをコードにすることに大いに頼っているため、アッセイの質は主にマイクロキャリア上のコードの質および読取り可能性に依存する。 マイクロキャリアをコードにする試みは、なお、示差的着色（ダイ−トラック（Ｄｙｅ−Ｔｒａｋ
）微小球）、蛍光標識（フルオロスフェア（Ｆｌｕｏｒｏｓｈｅｒｅｓ）；Ｎｕ
−フロー（Ｎｕ−ｆｌｏｗ））、いわゆる記憶をもつ遠隔プログラム可能なマトリックス（ＩＲＯＲＩ；米国特許第５，７５１，６２９号明細書）、オリゴヌクレオチドおよび小ペプチドのような脱着可能な標識（米国特許第５，５６５，３
２４号明細書；米国特許第５，７２１，０９９号明細書；米国特許第５，７８９
，１７２号明細書）ならびに応答体（ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）を担持する固相粒子（米国特許第５，７３６，３３２号明細書）に制限されている。 上に引用される特許の開示は引用により本明細書に組み込まれる。

【０００９】 マイクロキャリアをコードにするための上で同定されたこれらの既知の方法それぞれが欠点をもつ。 例えば、それらの大きさ、形状、色、蛍光強度もしくはそれらの組み合わせに基づいて単に識別されるマイクロキャリアは、しばしば、相応して多数の異なる分子の試験に付随するのに必要な多数の独特のコードを創製するためのそれらの変数の十分な独特の読取り可能な組み合わせを提供することができない。 加えて、脱着可能な標識もしくは蛍光マーカーのようなコードとして作用するためそれらの表面上に外来体を担持するいかなるマイクロキャリアも、結合された部分が、アッセイにおいて被検体に標的を向けるマイクロキャリア上でのリガンド結合性分子の結合もしくは反応を妨害するかもしれないという危険にさらす。 好都合な反応を表す目的のマイクロキャリアの分離後、脱着可能な標識でのマイクロキャリアのコード化方法もまた、しばしば、標識を切断しかつ分析して好都合な反応を生じさせたマイクロキャリア上の根底にあるリガンドの本質を最終的に学ぶという付加的段階を必要とする。 この切断段階は、自ずと、
試験の結果を決定するのに必要な時間および労力を延長させる。

【００１０】 上記に照らし、それ以外は同一のマイクロキャリアの巨大な集団中の単一のマイクロキャリアを同定するための単純な方法、とりわけマイクロキャリアの表面に外来体として結合される必要のないより多数の独特のコードをコード化するための方法に対する必要性が、当該技術分野で存続している。

【００１１】 （発明の要約） 本発明の一目的は、コードとして作用するようにマイクロキャリアの表面に外来物を結合する必要性なしにコード化されるマイクロキャリアを提供することである。 本発明の別の目的は、マイクロキャリア上に書きかつ読取ることができる多様な独特のコードに関する本質的に制限されない可能性を提供することができるマイクロキャリアのコード化方法を提供することである。

【００１２】 本発明は、書かれたコードを有するマイクロキャリアを提供することにより、
これらの目的を達成する。 好ましいマイクロキャリアは漂白可能な物質、例えば蛍光分子を含有するマイクロキャリアである。 マイクロキャリアの好ましい一コード化方法は、漂白可能な物質を担持するマイクロキャリアを高空間分解能光源に曝露させてマイクロキャリア上のコードを漂白することを包含する。 この方法は、蛍光のマイクロキャリア上のコードを漂白することを好ましく必要とすることができ、そこでは、漂白は、コードの漂白された部分内に同一かもしくは異なるかのいずれかの蛍光強度レベルを生じさせる。 マイクロキャリアのさらに好ましい一コード化方法は、マイクロキャリアの内奥にコードを書くことである。

【００１３】 別の好ましい態様において、多数の化合物もしくは生物学的分子を相応して多数の本発明のマイクロキャリアに結合し、マイクロキャリア結合性リガンドをスクリーニングもしくはアッセイプロトコルに従って同時に混合かつ反応させ、そして反応するリガンドをそれらが結合されているマイクロキャリア上のコードを読取ることにより同定する。

【００１４】 本発明のコード化された微小球は、単一のサンプルのアリコートを使用して、
単一の反応容器中での多数の被検体の同時分析を見込む。 従って、高スループットアッセイおよび反応における本発明のマイクロキャリアの使用は、慣習的なマイクロタイタープレート技術の使用に比較してはるかに優れている。

【００１５】 本発明のマイクロキャリアは、微小球上に書きかつ読取ることができる事実上制限されない数のコードもまた提供し、そして、従って、より制限された数のコードにする可能性をもつ、色もしくは蛍光標識でコードにされた既知のマイクロキャリアより優れている。 本発明のマイクロキャリアはまた、マイクロキャリアの表面に結合された部分でコードにされたマイクロキャリアよりも優れている。
これは、本発明のマイクロキャリア上への書き込み（ｗｒｉｔｉｎｇｓ）が、マイクロキャリアの表面上で起こる被検体／リガンドの相互作用を潜在的に妨害するという既知のマイクロキャリアに伴う危険をもたないためである。

【００１６】 本発明の付加的な特徴および利点は後に続く記述に示され、そして記述から部分的に明らかになるであろうか、もしくは本発明の実務から学ぶことができる。
本発明の利点は、コード化されたマイクロキャリアならびに書かれた記述および請求の範囲にとりわけ指摘される方法により実現かつ達成することができる。 本発明の前述の一般的記述および以下の詳細な記述の双方は例示かつ説明のみであり、そして特許請求される発明を制限しない。

【００１７】 （発明の詳細な記述） 一態様において、本発明は書かれたコードを有するマイクロキャリアに関する。 本発明のマイクロキャリアは、例えば、高スループットスクリーニング技術および診断学で慣例に使用されるいかなる材料から作成してもよい。 例えば、マイクロキャリアは固体、半固体、もしくは固体および半固体の組み合わせから作成してよい。 これらの材料の制限しない例は、ラテックス、ポリスチレン、架橋デキストラン、メチルスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロース、ポリアクリルアミドおよびジメチルアクリルアミドを包含する。 好ましい材料はラテックス、ポリスチレンおよび架橋デキストランを包含する。 マイクロキャリアはまた原核生物もしくは真核生物細胞であってもよい。

【００１８】 マイクロキャリアは、コード化およびマイクロキャリアの使用に役に立ついかなる形状および大きさのものであってもよい。 例えば、マイクロキャリアは球の形態、もしくは必ずしも球状でないビーズの形態であってよい。 マイクロキャリアは、例えば形状が筒状もしくは卵形であってよい。 形状が球状の場合、マイクロキャリアは例えば１ないし２００μｍの直径を有してよい。

【００１９】 マイクロキャリア上に書かれるコードは、マイクロキャリア上に書きかつ読取ることができるいかなる幾何図形的配列、デザインもしくは記号のものであってもよい。 例えば、コードは数字もしくは文字として、または記号、絵、バーコード、リングコードもしくは三次元コードの形態のコードとして書くことができる。 リングコードは、直線よりもむしろ同心円を使用することを除きバーコードに類似である。 １個の環は、例えば１本の棒と同一の情報を含有することができる。 コードはマイクロキャリアの表面上に、もしくはマイクロキャリアの内奥に書くことができる。 例えば、コードは、マイクロキャリアの内奥に、そしてより具体的にはマイクロキャリアの中心面に書くことができる。 マイクロキャリアの形状に依存して、中心面はコードを書くための好ましい場所であることができる。
なぜなら、それは書くために利用できる最大の表面積を提供することができるからである。 さらに、湾曲した表面を有するマイクロキャリアに関しては、コードを湾曲した表面上よりもむしろ内奥に書くことがより有利でありある。 これは、
湾曲した表面上よりもむしろ平坦面上にコードを書きかつ読取ることがしばしばより便宜的であることができるからである。

【００２０】 本発明のマイクロキャリアは漂白可能な物質を含有することができ、また、マイクロキャリア上のコードは、マイクロキャリアの漂白可能な部分内に漂白されたパターンの形態であることができる。 マイクロキャリアは、マイクロキャリアの表面上もしくはまたマイクロキャリアの本体内のいずれかに漂白可能な物質を含有することができる。 マイクロキャリア「上の」物質の漂白に対する本明細書中のいかなる言及も、マイクロキャリアの表面での漂白ならびにマイクロキャリアの内奥での漂白を包含する。 好ましい漂白可能な物質は、漂白可能な蛍光もしくは電磁放射吸収物質を包含する。 マイクロキャリアは漂白可能な発光団を含有してよい。 使用することができる発光団の例は、蛍光剤、リン光剤もしくはシンチレーターを包含する。 漂白可能な化学ルミネセンス物質、生物ルミネセンス物質もしくは着色物質を使用してよい。 漂白可能な物質は、より具体的には、フルオレセインイソチオシアナート（「ＦＩＴＣ」）、フィコエリトリン、クマリン、ルシファーイエローおよびローダミンであることができる。 漂白可能な物質は、漂白が起こる場合に、マイクロキャリアの使用およびコードのいかなる必要な読取りにも望ましい時間の期間の間、コードがマイクロキャリア上にとどまるように選ぶべきである。 従って、漂白された領域への漂白されない分子のある量の拡散は、コードの有用な寿命が保たれる限りは許容できる。

【００２１】 マイクロキャリア上で漂白されるコードはまた、マイクロキャリアの漂白される領域内に多様な強度の蛍光もしくは色を有するよう書くことができる。 例えば、漂白されたコードは数種の異なる程度の漂白を含有することができ、それにより漂白された領域内に全体として数種の異なる強度の蛍光を有する。 従って、マイクロキャリアは、マイクロキャリア上で漂白されるパターンの幾何図形的配列によってのみならず、しかしまたパターン内の多様な蛍光強度の使用によってもコード化することができる。

【００２２】 別の態様において、本発明はマイクロキャリア上にコードを書く方法に関する。 該方法を使用して、マイクロキャリアの表面上もしくはマイクロキャリアの内奥のいずれかにコードを書くことができる。 コードは、例えば、レーザー、ランプのような高空間分解能光源、またはＸ線、αおよびβ線、イオンビームもしくはいずれかの形態の電磁放射線を発射する発生源を使用することにより、マイクロキャリア上に書くことができる。 コードはまた、光互変（ｐｈｏｔｏｃｈｒｏ
ｍｉｎｇ）もしくは化学的エッチによりマイクロキャリア上に書くこともできる。 コードを書くための好ましい一方法は、共焦点顕微鏡と組み合わせた高空間分解能光源、およびとりわけレーザーもしくはランプの使用による。 コードを書くための別の好ましい方法は、マイクロキャリア上の漂白可能な物質中のコードを漂白することによる。 本方法において好ましい漂白可能な物質は、マイクロキャリアの記述中の上で同定された物質を包含し、また、蛍光分子を包含する。 マイクロキャリア内で漂白されることができる材料の容積に関して、こうした容積の一例は、マイクロキャリアの１立方ナノメートルと８立方ナノメートルとの間である。

【００２３】 マイクロキャリア上にコードを書くための好ましい一方法は、走査型微小光分解（「ＳＣＡＰＭ」）の使用による。 ＳＣＡＭＰの技術的特徴は、Ｐ． Ｗｅｄｅ
ｋｉｎｄら、“Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ：ａ ｎｅ
ｗ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｆａｓｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｃａｎｎ
ｅｄ ｌａｓｅｒ ｂｅａｍ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ”，
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ｖｏｌ． １７６、ｐｐ． ２３−
３２（１９９４）（その内容は引用により本明細書に組み込まれる）に最初に記述された。 上の論文は、マニキュア液の薄い蛍光層中のパターンの漂白および可視化のためのＳＣＡＭＰの使用を開示している。 該論文はマイクロキャリアのコード化のためのＳＣＡＭＰの使用を示唆していない。

【００２４】 われわれは、マイクロキャリア内の蛍光分子を漂白することによりマイクロキャリア上にコードを書くためにＳＣＡＭＰを使用した。 光退色（ｐｈｏｔｏｂｌ
ｅａｃｈｉｎｇ）は、ある波長の光を所定の色素上に照射した場合に色素の分子を共鳴させそして徐々に分解させることができるという事実による光の消失を指す、公知の現象である。 これはまた、蛍光分子が特定の波長の強力なレーザービームにより励起される場合にしばしば漂白する傾向がある理由でもある。

【００２５】 長年の間、蛍光微小光分解（「ＭＰ」）技術（光退色後の蛍光の回復（「ＦＲ
ＡＰ」）ともまた呼ばれる）が、細胞および組織のような生物学的媒体および非生物学的媒体双方の中の蛍光分子の移動度を研究するのに使用された。 Ｐｅｔｅ
ｒｓとＳｃｈｏｌｔｚ、Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｒ．
Ｊ． Ｃｈｅｒｒｙ（編）、マクミラン（ＭａｃＭｉｌｌａｎ）、ニューヨーク中、“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ”、ｐｐ．１９９−２２８（１９９１）；Ｄｅ Ｓｍｅｄｔら、“Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｓ Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｂｅ Ｄｉ
ｆｆｕｓｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ”、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、
ｖｏｌ． ２７、ｐｐ． １４１−１４６（１９９４）；Ｄｅ Ｓｍｅｄｔら、“Ｄ
ｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｄｅｘｔｒａ
ｎ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｇｅｌｓ ａｓ
Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｌａｓｅｒ
Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｖｏｌ．３０、ｐｐ
． ４８６３−４８７０（１９９７）。

【００２６】 蛍光分子の移動度は、光線（とりわけレーザービームであることができる）の焦点領域中で動く蛍光分子を漂白する（光分解する）ことにより測定することができる（図１：Ａ、Ｂ）。 短い漂白過程（典型的には約１０ミリ秒）の直後、高度に減弱されたレーザービームが、周囲の漂白されない領域から漂白された領域への蛍光分子の拡散により、光退色された領域中での蛍光の回復を測定する（図１：Ｂ、Ｃ）。 特徴的な拡散時間（拡散係数の尺度）ならびにそれぞれ不動のおよび移動性の蛍光分子の画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を、漂白された領域中での蛍光の回復から生じさせることができる（図１：Ｄ）。

【００２７】 移動性の画分Ｒは：

【００２８】

【数１】

【００２９】 として定義され、 ここで、Ｆ（ｉ）は漂白前の漂白スポットの蛍光強度であり、Ｆ（０）は漂白直後の漂白スポットの蛍光強度であり、そしてＦ（∝）は漂白後長時間での漂白スポットの蛍光強度である。

【００３０】 慣習的（非走査型）光学顕微鏡を使用する光退色実験において、静止した（レーザー）光線を、漂白過程ならびに回復期間双方の間、サンプルに集中させる。
漂白過程の間の（レーザー）光線の静止位置は、円形の幾何図形的配列を有する光退色された領域をもたらす。 非走査型光学顕微鏡は、技術的に直径２μｍもしくはそれ以下の照射領域を生じるが、静止したレーザービームによりしばしば漂白スポットの拡大が起こる。 これは、図１：Ｂ−ＩＩに図で具体的に説明されるような、典型的には直径が１０μｍ〜２０μｍもしくはなおより大きい大型の円形の漂白されたスポットを生じる。

【００３１】 レーザー光走査型顕微鏡の利用可能性は微小光分解法に新たな機会を開放した。 光分解、ビーム走査および共焦点顕微鏡の組み合わせはＳＣＡＭＰの開発に至る。 ＳＣＡＭＰにおいては、聴覚光学変調器（「ＡＯＭ」）のような強度調節装置を使用して１マイクロ秒未満で低いモニタリングのレーザー強度レベルと高い光退色のレーザー強度レベルとの間を切り替えることにより、サンプルを走査する間に漂白が起こる。 走査の間の漂白およびＡＯＭ（極めて短い漂白パルスを発生させる）の使用の組み合わせは、慣習的な微小光分解においてより長い光退色時間および静止したレーザービームにより生じる漂白スポットの拡大を予防する。 ＳＣＡＭＰはサンプル中の１マイクロメートル未満の漂白スポットを見込む。

【００３２】 図１は、蛍光分子の移動度を測定するのにＳＣＡＭＰがどのように進行するかを図で具体的に説明する。 最初に、サンプル中の目的の面の１本のｘ線に沿った蛍光を、この線を走査することにより測定する（図１：Ａ−点線）。 ２番目に、
このｘ線（ここで拡散を検討しなければならない）上の小区分（例えば３μｍ）
を漂白されるよう選択する（図１：Ｂ−Ｉ）。 長さ、位置ならびに区分の数はＳ
ＣＡＭＰソフトウェアにより自由に選択可能である。 レーザービームの強度の一時的な強い増大に伴いこの区分にわたってレーザービームが走査する時点で、この区分の光退色が起こる。 典型的には、レーザービームの光退色強度レベルとモニタリング強度レベルとの間の比は１００より大きい。

【００３３】 ＳＣＡＭＰは共焦点顕微鏡を利用するため、蛍光の検出は、サンプルの表面でのみならずしかしまた（慣習的な顕微鏡で遭遇されるような）試料の焦点からはずれたレベルからの散乱された放射による干渉をほとんど伴わずにサンプル中の自由裁量の深さでもまた可能にされる。 対照的に、照明のための蛍光灯および慣習的な（非焦点）顕微鏡を使用する場合には、ビーズの表面のみが典型的に観察される。 従って、内奥でのコード化は一般に通常の顕微鏡で観察することが困難であるが、しかし共焦点の光学的構成部分を用いて良好に目に見えるようになる。 顕微鏡の共焦点および走査の双方の特徴が、マイクロキャリア内の十分に規定された場所の微小領域の光分解および読取りを可能にする。 本発明は、例えばＳ
ＣＡＭＰの高空間分解能の使用が特定の深さで内側で微小球に不可逆的に印をつけることができそしてそのコード化を共焦点技術により読取ることができることにおいて、当該技術分野でこれまで記述された全部の他の応用と明瞭に識別される。

【００３４】 マイクロキャリア上にコードを書くための本発明の方法は、マイクロキャリアを漂白してコード中の漂白される物質中で多様なレベルの強度を生じさせることもまた必要とすることができる。 コードそれ自身のデザイン中で情報を運ぶことに加え、情報は漂白されたパターン内の多様な強度によってもまた運ぶことができる。 多様な強度でマイクロキャリアをコード化する能力は、マイクロキャリア上のより小さいコードを可能にすることができ、従って空間を節約するが、しかしなおマイクロキャリアをコードにするための同一の数もしくはより多い独特の識別子を運ぶ。 一例として、本発明により、ビーズ中で４つの異なる強度を漂白することが可能である。 これは、多数の方法で、例えば他者に関してビーズのある部分にわたる反復された漂白により、もしくは多様なレベルの音響出力をＡＯ
Ｍ中に放散させて、コードの各部分に使用されたレーザー光の力に基づき異なる強度を有する漂白されたパターンを創製することができる複数の異なるレーザーの力を生じさせることにより、達成することができる。 図２ａおよび２ｂは異なる強度を使用して漂白されたコードの二例である（一方は棒状のパターン、他方は環状のパターンで）。 コード中の異なる強度は図中の異なる色により表される。 異なるレベルの強度は、バーコード中の棒のようなコードにする要素の異なる幅ともまた組み合わせることができる。

【００３５】 本発明の別の態様は、本発明のコード化された微小球上のコードの読取りに関する。 コードの読取りは、コードがマイクロキャリアの表面上にある場合には通常の顕微鏡で、もしくはマイクロキャリアが十分に光を通過させる場合にはマイクロキャリアの内奥で実施することができる。 コードの読取りはまた共焦点顕微鏡を使用して実施してもよい。 とりわけ、コードは、マイクロキャリアを水性環境に懸濁すること、マイクロキャリアを２枚のスライドガラスの間に置くこと、
もしくはそれらを微小毛細管中に入れること、および顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡によりコードを観察することにより読取ることができる。

【００３６】 本発明の別の態様は本発明のコード化された微小球の使用方法に関する。 マイクロキャリアは、生物分子相互作用の測定、薬物の発見、受容体結合アッセイ、
治療薬、医学診断学、コンビナトリアルケミストリー、標的分子の単離および精製、分析の目的上の巨大分子の捕捉および検出、汚染物質の選択的除去、酵素的触媒反応、化学修飾、ハイブリダイゼーション反応ならびに法廷の応用のための支持体として使用することができる。

【００３７】 マイクロキャリアは、好ましくは化学的および生物学的アッセイならびに合成のための支持体として作用することができる。 この能力において、マイクロキャリアはマイクロキャリアの表面に結合された１種もしくはそれ以上のリガンドを含有してよい。 その後、リガンド結合性マイクロキャリアを、標的被検体と接触させて目的の特定の被検体の有無を決定することができるか、またはマイクロキャリア結合性リガンド上で実施されるコンビナトリアルケミストリーの反応のための支持体として作用することができる。 マイクロキャリア結合性リガンドのための標的被検体の例は、抗原、抗体、受容体、ハプテン、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、薬物、ホルモン、病原体、トキシン、またはいずれかの他の目的の化学物質もしくは分子を包含する。 マイクロキャリア結合性リガンドが標的被検体を結合もしくはそれと反応するのかもしくはしないのかどうかは、その決定のため当該技術分野で使用される慣習的技術により決定することができる。 例えば、反応は発光測定応答により示すことができる。 反応は、比色、化学発光測定もしくは蛍光測定応答により示すことができる。 目的のマイクロキャリア結合性リガンドは、それが標的を向けられる目的の被検体の存在下で微小球の光学的サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が変えられるように設計することができる。 例えば、光学的サインのこうした変化は、結合もしくは反応がリガンドと被検体との間で起こる場合に生じる光化学反応の結果であることができる。 その後、マイクロキャリアを顕微鏡下で観察して、光化学反応に伴う蛍光を検出することができる。

【００３８】 大きなスペクトルの化学的および生物学的官能基を、本発明のマイクロキャリアにリガンドとして結合することができる。 これらの官能基は、高スループットのスクリーニング技術および診断学で慣例に使用される全部の官能基を包含する。 リガンドは、共有結合によっておよび直接付着もしくはリンカーによる付着によることを包含する、一般にマイクロキャリアにリガンドを結合するのに慣習的に使用される手段によって、マイクロキャリアに結合することができる。 さらに、マイクロキャリアは多様な方法で官能基化されて最初の反応体の結合を可能にすることができる。

【００３９】 本発明のマイクロキャリアは、サンプル中の１種もしくはそれ以上の標的被検体の有無の検出方法で使用することができ、それは、マイクロキャリア結合性リガンドを最低１種の被検体と接触させること、被検体がリガンドと反応もしくは結合したかどうかを検出すること、およびその上でいずれかの反応もしくは結合が起こったいかなるマイクロキャリアのコードも読取ることを含んで成る。

【００４０】 より具体的には、本発明はサンプル中の１種もしくはそれ以上の標的被検体の有無の検出方法に関し、それは、１種もしくはそれ以上の被検体を結合もしくはそれと反応する１種もしくはそれ以上のリガンドを選ぶこと、リガンドを複数の本発明のマイクロキャリアに結合させること、リガンドの本質をリガンドが結合されているマイクロキャリア上のコードと相互に関連付けること、１種もしくはそれ以上の被検体をリガンド結合性マイクロキャリアと接触させること、その上で被検体がマイクロキャリア結合性リガンドを結合もしくはそれと反応したいずれかのマイクロキャリアを観察すること、およびマイクロキャリア上のコードを読取って１種もしくはそれ以上の被検体が反応したいずれかのリガンドを同定し、それにより１種もしくはそれ以上の被検体の有無を決定することを含んで成る。

【００４１】 上の方法の好ましい一態様は、標的被検体が核酸、とりわけＤＮＡもしくはＲ
ＮＡである場合、およびその中で最低１種のマイクロキャリア結合性リガンドが核酸の逆相補物である場合である。 従って、本発明のマイクロキャリアはＤＮＡ
ハイブリダイゼーションで有用である。 マイクロキャリアは酵素に基づくアッセイおよびイムノアッセイにもまた有用である。 マイクロキャリアはまた、サンプル中のある種の化合物についてスクリーニングするために実施されるアッセイで、ならびにそれらのサンプルから化合物を検出および単離するためにもまた有用であることができる。 マイクロキャリアは、コンビナトリアルケミストリーのライブラリーを創製もしくはそのメンバーを反応させるための支持体としてもまた使用することができる。

【００４２】 本発明のマイクロキャリアは、多数の成分の効率的かつ迅速なスクリーニングに使用される方法および装置でもまた使用することができ、ここで、多様性はマイクロキャリア結合性リガンドもしくは可溶性の被検体成分のいずれかもしくは双方にあることができ、ここで２成分間の相互作用の発生の決定に興味が持たれる。 装置は、例えばその上に結合されたリガンドが予め決められたレジストリ（
ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に配置されている固体の支持体のようなマイクロアレイおよび成分間の相互作用を検出するためのリーダーを包含する。 該方法は、例えばリガンドの結合のための固体支持体のようなマイクロアレイを調製すること、その後リガンドおよび被検体を組み合わせて成分間のいかなる相互作用も達成すること、ならびにその後成分と特定の部位との間の相互作用の存在を決定することを必要とすることができる。

【００４３】 マイクロアレイは、通常、複数の多様な成分を必要とすることができる。 理論上は、１成分のみにより必要であるが、しかし約１０ ⁵個存在してもよい。 成分の数は通常１０ ⁵を越えないことができるが、個々のコード化されたマイクロキャリアの数は実質的により大きいことができる。

【００４４】 結合されたリガンドは、例えば、単一分子もしくは分子の集団のような有機的実体、リガンドおよび受容体、核酸に結合された成分、ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖結合タンパク質（核酸に結合された結合するリガンドが存在することを必要としない）、オリゴヌクレオチド、タンパク質であることができる。

【００４５】 マイクロアレイ中のコード化されたマイクロキャリアはトラックに配置することができる。 部位を規定するためにヘッダが提供され、その結果特定の相互作用を迅速に検出することができる。 とりわけ、トラック上の部位を規定するヘッダのついた環状のトラックを有するディスク、その結果、陽性のシグナルは、ヘッダにより提供される情報に関して解釈することができる。 環状のトラックは好ましくは同心円状であり、そして５ないし５０００μｍの範囲の横断面を有する。
その後アッセイのためディスクに結合することができる予め調製された区分のような多様な改変が可能である。

【００４６】 本発明は、当業者に本発明の実施の方法をさらに教示する以下の実施例によりさらに具体的に説明される。 以下の実施例は単に本発明の具体的説明であり、そして本発明のある態様の多様な有益な特性を開示する。 以下の実施例は、特許請求されるところの本発明を制限すると解釈されるべきでない。 実施例１ ｄｅｘ−ｍａ微小球を調製するのに使用されるデキストラン−メタクリレート（「ｄｅｘ−ｍａ」）は、Ｗ． Ｎ． Ｅ． ｖａｎ Ｄｉｊｋ−Ｗｏｌｔｈｉｕｓら、“Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｘｔｒａｎ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｉｄｙｌ
Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ：Ａｎ Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｔｒａｎｓｅｓｔｅ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｖｏｌ．３０、ｐｐ
． ３４１１ないし３４１３（１９９７）（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）に詳細に記述されるとおり合成かつ特徴づけした。 ｄｅｘ ｍａ微小球は、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチレンエチレンジアミンおよび過硫酸カリウムを使用してｄｅｘ−ｍａ／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）エマルションからラジカル重合により調製した。 Ｓｔｅｎｅｋｅｓら、“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａ
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｉｎ ａｎ
Ａｌｌ−Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏ
ｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ”、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ、ｖｏｌ． １５、ｐｐ． ５５７−５６１（１９９８）（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。 ｄｅｘ−ｍａ溶液（ｐＨ７のリン酸緩衝液中）の濃度は１０％（ｗ／ｗ）であった。 １００グリコピラノシル単位あたりのメタクリレート分子の数であるｄｅｘ−ｍａの置換度は４であった。 ｐＨ
７のリン酸緩衝液中のＰＥＧ溶液の濃度は２４％ｗ／ｗであった一方、ＰＥＧの平均分子量は１０，０００ｇ／モル（メルク（Ｍｅｒｃｋ））であった。 １バッチの微小球（ＦＤ１４８−ｄｅｘ−ｍａ微小球）を、フルオレセインイソチオシアナート標識されたデキストラン（１４８．０００ｇ／モルの分子量を有する）
の存在下で調製した。 第二のバッチの微小球は、完全な調製後のＦＩＴＣ溶液（
ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中０．０１ｍｇ／ｍｌ）中でのｄｅｘ−ｍａ微小球の水没により、フルオレセインイソチオシアナート（「ＦＩＴＣ」）で負荷した。
ＦＤ１４８およびＦＩＴＣの双方をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。 ＳＣＡＭＰ
実験は、実施例２に説明されるとおり双方のバッチの微小球で実施した。 実施例２ ＳＣＡＭＰは、Ｗｅｄｅｋｉｎｄら、“Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｐｈｏ
ｔｏｌｙｓｉｓ：ａ ｎｅｗ ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆａｓｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ ａ ｓｃａｎｎｅｄ ｌａｓｅｒ ｂｅａｍ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃ
ａｌ ｉｍａｇｉｎｇ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ｖｏ
ｌ． １７６、ｐｐ． ２３−３２（１９９４）およびＷｅｄｅｋｉｎｄら、“Ｌｉ
ｎｅ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｄｉｆｆ
ｒａｃｔｉｏｎ−Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌａｔｅ
ｒａｌ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ”、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、ｖ
ｏｌ． ７１、ｐｐ． １６２１−１６３２（１９９６）（それらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）の業績に従って、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
ＭＲＣ１０２４共焦点レーザー走査型顕微鏡（「ＣＬＳＭ」）に設置した。 極めて短い光退色時間の間に十分な光退色を得るために使用された、４０倍油浸レンズおよび強力２Ｗ（最大の可能な出力を表す）アルゴンレーザー（スペクトラ
フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）２０１７）を、実施例１に従って作成されたｄｅｘ−ｍａ微小球上でのＳＣＡＭＰ実験で使用した。 レーザービームの波長は、漂白の間もまた４８８ｎｍであった。

【００４７】 本実施例において、ＳＣＡＭＰ実験はｄｅｘ−ｍａ微小球の表面のおよそ１０
μｍ下で実施した。 それは実験的に以下のとおり生じた。 最初に、ｄｅｘ−ｍａ
微小球の中央面の１本のｘ線に沿った蛍光を、４００ミリ秒でこの線を走査することにより測定した（図１：Ａ−点線）。 ２番目に、このｘ線上の３μｍ区分を漂白されるよう選択した（図１：Ｂ−Ｉ）。 長さ、位置ならびに区分の数はＳＣ
ＡＭＰソフトウェアにより自由に選択可能である。 この区分の光退色は、レーザービームの強度の一時的な強い増大により付随されてこの区分にわたってレーザービームが走査した時点で発生した。 レーザービームのモニタリング強度レベルと光退色強度レベルとの間の比は１：５００であった。 漂白された線中の蛍光の回復を測定するため、強く減弱されたレーザービームは選択されたｘ線に沿っておよそ４秒間走査した。

【００４８】 図３ａおよび３ｂは、３μｍ区分のそれぞれ漂白前および２分後のＦＤ１４８
−ｄｅｘ−ｍａ微小球の中央面の共焦点像を示す。 微小球の直径はおよそ２５μ
ｍである。 後者の像は漂白スポットが黒色のままであることを示し、２分後に微小球の漂白された領域中で蛍光の回復が起こらなかったことを示す。 図４（曲線Ａ）は、この実験の漂白された区分の蛍光が回復しなかったことを示し、該実験の時間尺度内では「大型の」ＦＤ１４８鎖が検討中のｄｅｘ−ｍａ微小球の領域中で完全に固定されたと結論することを可能にした。

【００４９】 ＦＤ１４８鎖は、それらが微小球の形成の間に存在していたため、ｄｅｘ−ｍ
１ポリマー網状構造中に空間的に捕捉されることができた一方、これは、十分に重合されたｄｅｘ−ｍａ球のＦＩＴＣ溶液への水没によりｄｅｘ−ｍａ微小球中に負荷された場合に、小型のＦＩＴＣ分子について発生することができなかった。 この場合、完全な蛍光の回復が期待されかつ実験的に確認された。 図４（曲線Ｂ）は、微小球の表面の約１０μｍ下に配置されたＦＩＴＣ分子が可動性のままであることを示す。

【００５０】 サンプル中の小区分を光退色する技術的能力を除き、走査型顕微鏡の使用は、
レーザービームの位置を局所的に定めることができるため、漂白が起こるはずであるサンプル中の微小領域を特異的に選択するのに直接的である。 さらに、長さ、位置ならびに区分の数はＳＣＡＭＰ実験で自由に選択可能であるため、サンプル中のいかなる種類の幾何図形的配列も光退色することができる。 図５は、微小球中で十文字、円および長方形を漂白した２分後のＦＤ１４８−ｄｅｘ−ｍａ微小球の中央面の共焦点像を示す。 実施例３ ＳＣＡＭＰ実験を、ベルギー・アントワープのポリラブ（ＰｏｌｙｌａＢ）から購入された４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ上でもまた実施した。 Ｓ
ＣＡＭＰは、Ｗｅｄｅｋｉｎｄら（１９９４）およびＷｅｄｅｋｉｎｄら（１９
９６）の業績に従って、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＭＲＣ１０２４ ＣＳ
ＬＭに設置した。 極めて短い光退色時間の間に十分な光退色を得るために使用された、１００×対物レンズおよび強力アルゴンレーザー（スペクトラ フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）２０１７）を、４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズ上でのＳＣＡＭＰ実験で使用した。 スペクトラ フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）レーザーの強度は３００ｍＶで設定し、
これはそれぞれ７５＿Ｗおよび２０ｍＷ（レーザービームを共焦点走査型レーザー顕微鏡中に発射する光ファイバーの端で測定された）のモニタリングおよび光退色レーザー強度をもたらした。 結果として、モニタリングレーザー強度と光退色レーザー強度との間の比は１：２６６に等しかった。 レーザービームの波長は、漂白の間もまた４８８ｎｍであった。

【００５１】 ＳＣＡＭＰ測定を４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面で実施した。 それは以下のように生じた。 最初に、ラテックスビーズが画像を完全に覆うまで像をズームさせた。 ２番目に、目的の標識を規定し、そしてＳＣＡＭＰソフトウェアにより、ラテックスビーズ上のどこで標識が漂白されなければならなかったかが示された。 標識は、レーザービームが４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面にわたって走査した時点で起こった。 目的の標識を創製するため漂白されなければならなかった区分にわたってレーザービームを走査した場合に、レーザービームの強度の一時的な強い増大（７５＿Ｗから２０ｍＷまで）が起こった。 走査は「ｘ線」あたり６ｍｓに等しかったため（図１Ａ）、また、共焦点面（すなわちラテックスビーズの中央面）の１画像は５１２本の「ｘ線」より成るため、１個のラテックスビーズを標識するのに３．０７２秒かかった。

【００５２】 図６ないし９は、バーコード（図６ａ）、バーコードおよび数字（図６ｂ）、
数字Ｒ１２４７（図７）、ゲント（Ｇｈｅｎｔ）大学のロゴ（図８）ならびにタイボテック カンパニー（Ｔｉｂｏｔｅｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）のロゴ（図９）の漂白１時間後の４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面の共焦点像を示す。 像は、漂白された区分が黒色のままであり、ラテックスビーズの漂白された区分中で有意の蛍光の回復が起こらなかったことを示す。

【００５３】 バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＭＲＣ１０２４共焦点走査型レーザー顕微鏡のズームの選択肢の値は以下のとおりであった：図６ａで１．６１、図６ｂで１
． ００、図７で３．０７、図８で１．００および図９で１．００。 漂白標識までのＳＣＡＭＰの高空間分解能は図６ａおよび６ｂで観察される。 図６ａの標識は３つの異なる線のタイプ、すなわち大きな幅（２．５μｍ）をもつ１つ、中程度の幅（１．２５μｍ）をもつ１つおよび小さな幅（０．６２μｍ）をもつ１つより構成される。 全部の線は相互から１．２５μｍに位置を定められる。 実施例４ 以下の実験は蛍光マイクロキャリア中でのコードの漂白方法を立証し、ここでコードは多様な程度の漂白による多様なレベルの強度を含有する。 以下の実験で使用されたマイクロキャリアは、ベルギー・アントワープのポリラブ（Ｐｏｌｙ
ｌａＢ）から購入された４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズであった。

【００５４】 一組の漂白実験には、６０倍の拡大率および３００ｍＷのレーザー力を使用して、図１０ａに示されるパターンを生じさせた。 図の上の列中の正方形はソフトウェア中の３２画素（＝２．４６μｍ）の幅を有し、そして別の３２画素だけ分離されている。 漂白は実際にそれらを拡大した。 図の下の列中の正方形はこの大きさの半分である。

【００５５】 図１０ａに示されるとおり、いくつかの強度の漂白が可能である。 例えば、２
００ＡＤ単位（ａｎａｌｏｇｕｅ ｔｏ ｄｉｇｉｔａｌ ｕｎｉｔ）（「ＡＤ
Ｕ」）の平坦部のレベルを想定すれば、漂白は少なくともおよそ５０ないし２０
０ＡＤＵのレベルから可能である。 従って、元の蛍光強度の約２５％の間隔にわたってレベルを漂白することができる。 図１０ａの写真は、例えば６レベルの漂白が確かに可能であることを示す。 これらの６レベルの漂白は図１０ａの上の列中の漂白された６個の正方形から明らかである。 それらの正方形の蛍光強度を図１０ｃのグラフに示す。 多様な蛍光強度の６個の正方形が、反復された漂白（１
ないし６回）により得られた。 ６種の異なるレベルの蛍光強度を有する６個のコードにする部位を使用することは、６ ⁶もしくは４６６５６個の異なるコードを見込む。

【００５６】 図１０ａに示される１０個のより小さい漂白された正方形の連続は、反復された走査による漂白が線形でないことを明瞭に示す。 これらの正方形は以前のものの半分しか幅広くないが、しかし明瞭に識別可能なままである。 それらのマーキング（ｍａｒｋｉｎｇ）の強度レベルを図１０ｄのグラフに示す。 最後に、６個と１０個のコードにする部位の２列の間の単一の漂白スポットの強度を図１０ｂ
に示す。

【００５７】 第二の実験は、８個のコードにする部位（１本の棒のソフトウェア幅＝２４画素×０．０６９μｍ／画素＝１．６６μｍ；別の２４画素だけ分離される）および８種の異なる強度（８ ⁸ ＝１６７７７２１６個の異なるコードを見込む）を用いてコードを効果的に漂白するために実施した。 レーザー出力は２００ｍＷであるように選択した。 本実験のマイクロキャリアの写真を図１１ａで具体的に説明し、また、個々のコードの多様な強度レベルを示すグラフを図１１ｂに示す。 多様な強度が明瞭に目に見える。 図１１ａのこのコードは数字１５２６３７４８である。

【００５８】 図１２ａおよび１２ｂは、８種の異なる強度を有する８個のコード化部位の別の例を具体的に説明する。 この場合、漂白は、前の例でのような２００ｍＷの代わりに２５０ｍＷを用いて実施し、そして０．０５６ｍｍ／画素を使用して実施した。 本実施例におけるコードは１３２６５８７４であった。 コードの写真および多様な強度のコードのグラフをそれぞれ図１２ａおよび１２ｂに示す。

【００５９】 本発明の他の態様は、明細の考慮および本明細書に開示される本発明の実施から当業者に明らかになるであろう。 明細および実施例は例示のみとして考慮されることを意図しており、本発明の真の範囲および技術思想は以下の請求の範囲により示される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 発明にかかる、慣習的微小光分解およびＳＣＡＭＰの多数の原理を具体的に説明する。

【図２ａおよび２ｂ】 発明にかかる、多様な強度を使用するバーコードおよびリングコードを具体的に説明し、各強度は図中に示される異なる色により示される。

【図３ａおよび３ｂ】 発明にかかる、漂白前（上）および後（下）のＦＤ１４８−ｄｅｘ−ｍａ微小球の中央面の共焦点像を具体的に説明する。 微小球表面のおよそ１０μｍ下の３μ
ｍの線。

【図４】 発明にかかる、１４８−ｄｅｘ−ｍａ微小球中のＦＤ１４８の蛍光回復曲線（Ａ
）およびＦＩＴＣ溶液中の水没によるＦＩＴＣで負荷されたｄｅｘ−ｍａ微小球中のＦＩＴＣ（Ｂ）を具体的に説明する。

【図５】 発明にかかる、漂白後のＦＤ １４８−ｄｅｘ−ｍａ微小球の中央面の共焦点像を略図的に説明する。 ＳＣＡＭＰによる自由裁量の幾何図形的配列。

【図６ａおよび６ｂ】 発明にかかる、バーコード（図６ａ）ならびにバーコードおよび数字（図６ｂ）
の漂白１時間後の４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面の共焦点像を略図的に説明する。

【図７】 発明にかかる、コードＲ１２４７の漂白１時間後の４５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面の共焦点像を略図的に説明する。

【図８】 発明にかかる、ゲント（Ｇｈｅｎｔ）大学のロゴの漂白１時間後の４５μｍのＦ
ＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面の共焦点像を略図的に説明する。

【図９】 発明にかかる、タイボテック（Ｔｉｂｏｔｅｃ）会社のロゴの漂白１時間後の４
５μｍのＦＩＴＣ標識ラテックスビーズの中央面の共焦点像を略図的に説明する。

【図１０ａ】 発明にかかる、多様な強度に漂白されたコードの共焦点像を略図的に説明する。

【図１０ｂないし１０ｄ】 発明にかかる、コード内の多様な強度をグラフで略図的に説明する。

【図１１ａおよび１２ａ】 発明にかかる、多様な強度に漂白されたコードの共焦点像を略図的に説明する。

【図１１ｂおよび１２ｂ】 発明にかかる、それぞれのコード内の多様な強度をグラフで略図的に説明する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年６月２０日（２００１．６．２０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項１８】 マイクロキャリアが原核生物もしくは真核生物細胞であることを特徴とする、請求項７、８および１２のいずれか１つに記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１２月１２日（２００１．１２．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項７ 】 コードがマイクロキャリアをＸ線、α線、β線もしくはイオ ン線を放射する発生源に曝露することにより書かれたことを特徴とする、請求項 ６に記載のコード化されたマイクロキャリア 。

【請求項８ 】 コードがマイクロキャリアを高空間分解能光源に曝露するこ とにより書かれたことを特徴とする、請求項６に記載のコード化されたマイクロ キャリア 。

【請求項９ 】 コードがフォトブリーチング、フォトクロミングもしくはケ ミカルエッチングにより書かれたことを特徴とする、請求項１ないし ８ のいずれ か１つに記載のコード化されたマイクロキャリア 。

【請求項１０ 】 マイクロキャリアの表面上もしくはマイクロキャリアの内 奥に保存コードを書き込むことを特徴とする 、マイクロキャリアのコード化方法。

【請求項１１ 】 コードがマイクロキャリアの内奥に書かれることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

【請求項１２ 】 コードがマイクロキャリアの中心面に書かれることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

【請求項１３ 】 マイクロキャリアが微小球であることを特徴とする、請求項１０ないし１２のいずれか１つに記載の方法。

【請求項１４ 】 微小球が１ないし２００μｍの直径を有することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。

【請求項１５ 】 電磁源にマイクロキャリアを曝露してマイクロキャリア上にコードを書き込むことを特徴とする 、請求項１０ないし１４のいずれか１つに記載の方法。

【請求項１６ 】 Ｘ線、α線、β線もしくはイオンビームを放射する発生源 にマイクロキャリアを曝露してマイクロキャリア上にコードを書き込むことを特 徴とする、請求項１５に記載の方法 。

【請求項１７ 】 高空間分解能光源にマイクロキャリアを曝露してマイクロキャリア上にコードを書き込むことを特徴とする 、請求項１５に記載の方法。

【請求項１８ 】 光源がレーザーもしくはランプであることを特徴とする、
請求項１７に記載の方法。

【請求項１９ 】 コードがフォトブリーチング、ブリーチング、フォトクロ ミングもしくはケミカルエッチングにより書き込まれる請求項１０ないし１８の いずれか１つに記載の方法 。

【請求項２０ 】 コードがマイクロキャリアをブリーチングすることによりマイクロキャリア上に書き込まれることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。

【請求項２１ 】 マイクロキャリアが蛍光分子を含んで成ることを特徴とし、しかも、コードが蛍光分子をブリーチングすることにより書き込まれることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。

【請求項２２ 】 コードが、蛍光分子をブリーチングすることによりコードの漂白部分において得られる蛍光強度が２種以上の異なるレベルを生じさせるように書き込まれることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。

【請求項２３ 】 マイクロキャリアが、固体、半固体、ならびに固体および半固体の組み合わせより成る群から選択される材料を含んで成ることを特徴とする、請求項つ１０ないし２２のいずれか１つに記載の方法。

【請求項２４ 】 マイクロキャリアが原核生物もしくは真核生物細胞であることを特徴とする、請求項１０、１１、１２および１５ないし２３のいずれか１
つに記載の方法。

【請求項２５ 】 共焦点顕微鏡でコードを観察することを含んで成る、請求項１ないし９のいずれか１つに記載のコード化されたマイクロキャリアの読取り方法。

【請求項２６ 】 １種もしくはそれ以上の被検体と結合もしくはそれと反応する１種もしくはそれ以上のリガンドを選ぶこと、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の複数のコード化されたマイクロキャリアにリガンドを結合すること、リガンドの本質をリガンドが結合されているマイクロキャリア上のコードと相互に関連付けること、１種もしくはそれ以上の被検体をリガンド結合性マイクロキャリアと接触させること、被検体がマイクロキャリア結合性リガンドと結合もしくはそれと反応しているいずれかマイクロキャリアを観察すること、およびマイクロキャリア上のコードを読取って１種もしくはそれ以上の被検体が反応したいずれかのリガンドを同定し、それにより１種もしくはそれ以上の被検体の有無を決定することを含んで成る、サンプル中の１種もしくはそれ以上の標的被検体の有無の検出方法。

【請求項２７ 】 標的被検体が核酸であることを特徴とし、しかも最低１種のマイクロキャリア結合性リガンドが核酸の逆相補物であることを特徴とする、
請求項２６に記載の方法。

【請求項２８ 】 Ｄ ＮＡハイブリダイゼーションを包含することを特徴とする、請求項２７に記載の方法。

【請求項２９ 】 マイクロキャリア結合性リガンドを最低１種の被検体と接触させること（ここで、マイクロキャリアは請求項１ないし９のいずれか１つに記載のコード化されたマイクロキャリアである）、被検体がリガンドと反応もしくは結合したかどうかを検出すること、およびいずれかの反応もしくは結合が起こったいずれかのマイクロキャリアのコードを読取ることを含んで成る、サンプル中の１種もしくはそれ以上の標的被検体の有無の検出方法。

【請求項３０ 】 マイクロキャリア結合性リガンドを有する請求項１ないし ９のいずれか１つに記載のコード化されたマイクロキャリアを備える 、リガンド結合性マイクロキャリア。

【請求項３１ 】 請求項１ないし９のいずれか１つに記載の複数のコード化されたマイクロキャリアに結合されたライブラリーの個々のメンバーを含んで成る化学物質ライブラリー。

【請求項３２ 】 ライブラリーがコンビナトリアル化学物質ライブラリーであることを特徴とする、請求項３１に記載の化学物質ライブラリー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドメースター，ジヨセフ ベルギー・ビー−9040ゲント・サン−バー フコウターストラート14 (72)発明者 ローラント，クリステイアン・フベルト・ シモン ベルギー・ビー−3000リユーベン・スヘル トゲンラーン115 (72)発明者 パウエルス，ルデイ・ビルフリート・ジヤ ン ベルギー・ビー−2820ボンハイデン・ベレ ントローデドレーフ27 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03 CC13 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ42 QQ52 QR56 QR83 QS34 QX02 4H006 AA02 AC90