The apparatus and method of a cleavable signal factor

【発明の詳細な説明】 切断可能なシグナル因子の装置および方法１． 序論 本発明は、流体中の少量の物質を診断および検出する分野に関する。 さらに詳しくは、本発明は、アッセイ装置において使用するための、切断可能(cleavable )なシグナル因子、特に切断可能な反射シグナル因子に関する。 このようなシグナル因子を使用するアッセイ装置は、本発明の好ましい態様において、標準的レーザーをベースとする検出システム、例えば、ＣＤ−ＲＯＭのリーダー、ＤＶＤ のリーダー、およびその他を使用する検出に適合する。 さらに、本発明は、本発明のアッセイ装置を使用する検出分析の分析方法を包含する。 本発明のシグナル発生因子、アッセイ装置およびアッセイ方法は、検定試料中の多数の異なる分析物の検出および多数の試料中の単一の分析物の検出の双方に有用である。 ２． 発明の背景２．１ 小規模臨床的アッセイ最近まで、流体中の少量の分析物の検出のための大部分の臨床的診断アッセイは個々の検定として、すなわち、個々の分析物を検出するために単一の試料について実施される単一の検定として、構成されてきている。 より最近において、多数の試料を調製する装置および自動化試薬添加装置を設計し、そして、平行にまたは急速な順次のプロセスにおいて、多数の検定試料を急速に分析する装置を設計することによって、効率および経済性が得られてきている。 しばしば、このような自動化試薬調製装置および自動化多重系分析装置は単一の装置の中に組込まれる。 この型の大きい臨床実験室用分析装置は、１時間で、数百のアッセイを、自動的に、または半自動的に、精確に実行することができる。 しかしながら、これらの分析装置は高価であり、そして集中化された研究所および大きい病院のみがそれらを有することができる。 このような集中化は試料の輸送装置を必要とし、そして時間−臨界的試料の緊急または応急の分析をしばしば排除する。 したがって、このような手の込んだ分析装置およびそれ以上の分配のコストを減少する、簡素化された臨床的アッセイが強く要求されている。 このような努力の限界は、手の込んだ検出器を使用しないで、患者の枕もとにおいて、または患者の家庭において使用するために適当な臨床検定の設計である。 血糖および妊娠の検定はことはよく知られている例である。 この種類の有効な検定は多年にわたって提供されてきているが、主要な大躍進は、ほぼ１９８０年以来の固相イムノアッセイおよび他のストリップ検定の導入であった。 最も顕著なものは次の通りである：Advance ^TM検定(Johnson & Johnso n)、RAMP ^TM hCGアッセイ（Monoclonal Atibodies，Inc.）、Clear Blue Easy ^TM (U nipath Ltd.)およびICON(Hypritech)。 Clear Blue Easy ^TMは、積層膜の中にすべての試薬を有し、そしてシグナル試薬として複合着色ラテックスマイクロビーズを使用する。 それは毛管移動免疫濃度フォーマットを使用する。 ICONは二重モノクローナルサンドイッチ免疫濃度アッセイである。 このアッセイは、小型の反射計器の使用により定量的とされた。 そうでなければ、すべての方法は定性的であるのみである。 移動距離を定量的アッセイの基礎として使用することができる。 商業的に入手可能なものは次の通りである：Quantab ^TM (Environme ntal Test Systems)、AccuLeval ^TM (Syva)、AccuMeter ^TM (ChemTrak)、Clinimeter ^TM (Crystal Diagnostics)およびQ． E． D． ^TM (Enzymatics)。 最も新しいものの１ つは、温度計型アッセイ装置(Ertinghausen G.、米国特許第5,087,556号)であり、これはまだ商業的に入手可能ではない。 これらのシステムを使用して、一般的に化学的な分析物、例えば、コレステロール、ならびに治療用薬物の血液レベルをアッセイすることができる。 しかしながら、これらのフォーマットの各々の１つの欠点は、ただ１つの、または非常に制限された数の、アッセイを好都合に同時に実施できることである。 大きい分析装置とストリップとの間のギャップを満たすために、いくつかの小型の計器が開発されてきている。 最も顕著なものはEclipse ICA ^TM (Biotope，Inc .)である。 この装置は卓上、ランダム−アクセス型、自動化遠心イムノアッセイおよび化学的システムである。 患者の試料をカセットの中にピペットで入れ、カセットを回転子の中に配置する。 １６の検定をほぼ１７分で実施することができる。 結果をＵＶ／可視スペクトルまたは蛍光測定により測定する。 ４つの異なる型のカセットを必要とする。 各カセットは比較的複雑な構造を有する。 これらの開発にかかわらず、多数の定量的アッセイに容易に使用することができ、好ましくは特殊化検出器の計装を必要としない、簡単な装置がなお要求されている。 ２．２ 空間的にアドレス可能なプローブ配列最近、異なる生物物質の空間的にアドレス可能な配列が固体の支持体上に製作されてきている。 これらのプローブの配列は、多数の分析物の同時の分析を可能とする。 例は、固体の支持体に固定されかつ相補的分析物を捕捉するオリゴヌクレオチドまたはペプチドの配列である。 １つのこのようなシステムは、Fodor et al.、Nature、Vol． 364、 August 5、1993。 固体の支持体に取り付られた短いオリゴヌクレオチドのプローブは、液状試料中のＤＮＡのより長い鎖の中に含有される相補的配列に結合する；次いで、そのように集められたハイブリダイゼーションのデータに基づいてコンピューターにより、試料の核酸の配列を計算する。 Fodor et al.が記載するアッセイシステムにおいて、配列を標識化ターゲット分子を含有する溜に対して温度調節フローセル上に倒立させる。 表面結合分子を区別するために、このシステムは正確に感受性の検出器を必要とする。 したがって、流体検定試料中の多数の検定物質（すなわち、分析物）を単一工程において、または最小数の工程においてアッセイするか、あるいは多数の流体検定試料中の単一の検定物質または分析物をアッセイする、容易な検出および能力の双方を提供する、簡素化されたフォーマットの空間的にアドレス可能なプローブ配列を製作する経済的なシステムが要求されている。 ２．３ 空間的にアドレス可能なレーザーをベースとする検出システム消費者の電気的使用のためのいくつかの装置は、ディジタル情報の空間的にアドレス可能な検出を可能とする。 特に、示差的反射および透過のポテンシャルを記録する情報をベースとする、いくつかのフォーマットが開発された。 従来のオーディオまたはＣＤ−ＲＯＭのコンパクトディスクにおいて、ディジタル情報−−またはディジタル的にコード化されたアナログ情報−−は、ディスク中のくぼみにより円形のプラスチックディスク上にコード化される。 典型的には、このようなくぼみは、ディスク上に存在する情報を読取るために使用されるレーザーの入射ビームの波長の１／８〜１／４の程度である。 ディスク上のくぼみは、反射されたビーム内の破壊的干渉を引き起こし、これは「ゼロ」の値を有するビットに対応する。 ディスクの平坦な区域は、レーザー光を検出器に反射し、そして検出器は「１」の値を対応するビットに与える。 他のコンベンションにおいて、反射された光の強度の変化は１の値を取るが、 一定の強度はゼロに対応する。 くぼみは、「ゼロ」のビットおよび「１」のビットの前もって決定された分布を含有するマスターコピーから、ディスクの中に規則的なパターンで形成されているので、マスターディスクの中にコード化されたのと同一の情報を再現するように、検出器が受取る生ずるシグナルをプロセシングすることができる。 標準的コンパクトディスクは、１２ｃｍのポリカーボネート基板、反射性金属化層、および保護のラッカーコーティングから形成される。 現在のＣＤおよびＣ Ｄ−ＲＯＭのフォーマットは、ＩＳＯ９６６０工業規格（引用することによって本明細書の一部とされる）により記載されている。 ポリカーボネート基板は、光学的品質の透明なポリカーボネートである。 標準的なプレスされたＣＤ、または大量複製されたＣＤにおいて、データ層はポリカーボネート基板の一部分であり、そしてデータは射出成形プロセスの間にスタンパーにより１系列のピットの形態でインプレスされる。 このプロセスの間に、溶融したポリカーボネートを金型の中に、通常高圧下に射出し、次いで冷却して、 ポリカーボネートが金型、または「スタンパー」または「スタンプ」の鏡像の形状を取るようにする；したがって、ディスクの基板上の２進データを表すピットは、マスタリングプロセスの間につくられたスタンパーのピットの鏡像として、 ポリカーボネート基板によりつくられかつ維持される。 スタンピングマスターは典型的にはガラスである。 ピットはＣＤ基板の中に連続的らせんでインプレスされる。 その上に適用される反射性金属層、典型的には、アルミニウムは、固体のポリカーボネート基板の形状を取り、そして「ピット」の存在または非存在に依存して、読取りアセンブリーにレーザービームに示差的に反射する。 アクリルのラッカーを金属の反射層の上部上に薄層で回転コーティングして、金属の反射層を摩耗および腐蝕から保護する。 同様な概念においてかつＣＤリーダーと適合的に、情報は記録可能なコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）の中に示差的に記録される。 ＣＤ−Ｒにおいて、データ層はポリカーボネート基板から分離される。 その代わりに、ポリカーボネート基板は入射レーザーの案内のためのアドレスとして連続的らせん状みぞをその上にインプレスして有する。 有機色素を使用して、データ層を形成する。 シアニンはこれらのディスクに使用された最初の材料であったが、金属安定化シアニン化合物が「原料」シアニンの代わりに一般に使用される。 別の材料はフタロシアニンである。 １つのこのようなメタロフタロシアニン化合物は米国特許第5,580,696 号明細書に記載されている。 ＣＤ−Ｒにおいて、有機色素層はポリカーボネート基板と金属安定化反射層との間にサンドイッチされ、金属安定化反射層は通常２４カラットの金であるが、 また、銀の基材である。 情報は−−色素中の燃焼孔よりむしろ−−色素層の中に「ピット」を選択的に溶融する、適当に前もって選択された波長の記録レーザーにより記録され、レーザーは色素をわずかに溶融し、例えば、標準的なプレスされたＣＤにおける物理的ビットによるように、それを非半透明になるようにするので、読取りレーザービームはリーダーのセンサーに反射して戻るよりむしろ屈折する。 標準的ＣＤにおけるように、ラッカーのコーティングが情報を有する層を保護する。 情報を記録しかつ記憶する他の物理的フォーマットは、コンパクトディスクと同一の概念：レーザーにより読取るべき基板上の示差的反射または輸送の発生に基づいて開発されている。 １つのこのようなフォーマットはディジタルビデオディスク（ＤＶＤ）である。 ＤＶＤは標準的ＣＤと同様に見える：それは銀のプラッターとして見える１２ ０ｍｍ（４．７５インチ）のディスクであり、回転可能な駆動メカニズムとかみ合う中央の孔を有する。 ＣＤと同様に、データを小さいピットのらせん状跡でディスク上に記録し、そしてレーザービームを使用してディスクを読取る。 ＩＳＯ ９６６０標準規格下にディジタルデータのほぼ６８０×１０ ⁶バイトを記憶できるＣＤと対照的に、ＤＶＤは４．７×１０ ⁹ 〜１７×１０ ⁹バイトのディジタルデータを記憶できる。 ＤＶＤのより大きい容量は、ピットをより小さくし、そしてらせんをより緊密にし、すなわち、らせんのピッチを減少し、そしてディスクの各側の２つの、４層で、データを記憶することによって、達成される。 より小さいピット大きさおよびより緊密なピッチは、読取りレーザーの波長をより小さくすることを必要とする。 より小さい波長は標準的なプレスされたＣＤと逆方向適合性であるが、それは色素をベースとするＣＤ−Ｒの現在のバージョンと非適合性である。 下記表において、ＤＶＤおよびＣＤの特性を比較する：

したがって、単一側／単一層のＤＶＤは、４．７ＧＢのディジタル情報を含有することができる。 単一側／二重層のＤＶＤは、８．５ＧＢのディジタル情報を含有することができる。 二重側／単一層のＤＶＤは９．４ＧＢのディジタル情報を含有することができるが、二重側、二重層のＤＶＤは１７ＧＢのディジタル情報を含有することができる。 変動の各々は一緒に結合された２つの０．６ｍｍの基板から成る。 容量に依存して、ディスクは１〜４の情報層を有することができる。 ８．５ＧＢおよび１７ ＧＢのオプションにおいて、ディスクの１つの側から２つの情報層にアクセスするために、半反射器を使用する。 ８．５ＧＢおよび１７ＧＢのオプションについて、第２情報層／側を第２基板の中に成形することができるか、あるいはフォトポリマー層として添加することができる。 いずれの場合においても、半反射層はディスクの１つの側からの双方の情報層の読取りを可能とする。 １７ＧＢのＤＶＤについて、２つの二重層の基板を製造し、それらを一緒に結合することを必要とする。 ＤＶＤレーザーリーダーの各層の深さに対する収束を調節し、それらの双方を急速にかつ自動的にアクセスできるように、それを設計する。 すべての３つの前述のフォーマットはプラッターの回転を必要とする。 ＤＶＤ システムの公称一定線速度は３．５〜４．０ｍ／秒であり（二重層のバージョンにおけるより大きいピットについてわずかにより速い）、これは１．２ｍ／秒である標準的ＣＤの速度より３倍以上である。 ３． 発明の要約 本発明の１つの面は、定量的および定性的アッセイ装置および方法において使用するための切断可能(cleavable)なシグナル因子を提供することである。 切断可能なシグナル因子は、基板取付け端と、シグナル応答端と、および基板取付け端とシグナル応答端との中間の切断部位とを有する切断可能なスペーサーからなる。 さらに、切断可能なシグナル因子は、切断可能なスペーサーにそのシグナル応答端において取付けられたシグナル応答部分を含む。 第１部位を選択された分析物に結合できる第１側面メンバー、および同一分析物の第２部位に結合できる第２側面メンバーは、シグナル因子上に存在する。 第１および第２の側面メンバーは、切断可能なシグナル因子に分析物特異性を付与する。 第１側面メンバーを切断可能なスペーサーに前記シグナル応答端と前記切断部位との中間において取付け、そして第２側面メンバーを切断可能なスペーサーに前記切断部位と前記基板取付け端との中間において取付ける。 選択された分析物を切断可能なシグナル因子の第１および第２の側面メンバーに対して同時に結合すると、第１および第２の側面メンバーの中間に横たわる切断部位における引き続く切断にかかわらず、シグナル応答部分はシグナル因子の基板取付け端につながれる；逆に、選択された分析物が切断可能なシグナル因子の第１および第２の側面メンバーに対して同時に結合されないと、切断により、 シグナル因子のシグナル応答部分が失われる。 試料との接触および切断剤との接触後における、シグナルの存在または非存在は、それぞれ、分析物の存在および非存在のシグナルを発生する。 他の面において、本発明は、切断可能なシグナル因子を空間的にアドレス可能なパターンで取付ける固体の支持体の基板からなるアッセイ装置を提供する。 アッセイ装置のある態様において、固体の支持体は好ましくはプラスチックであることができ、これらの態様において、最も好ましくはポリカーボネートである。 ある態様における固体の支持体は、ディスクの方式であり、好ましくは現存するレーザー反射に基づく検出器、例えば、オーディオコンパクトディスク（ＣＤ） のリーダー、コンパクトディスク−読取り専用記憶装置（ＣＤ−ＲＯＭ）のリーダー、ディジタルビデオディスク（ＤＶＤ）のリーダー、またはその他による検出と適合性の寸法である。 アッセイ装置のある好ましい態様において、取付けられた切断可能なシグナル因子のシグナル応答部分は、入射光、特に入射レーザー光を反射または散乱することができる。 これらの切断可能な反射シグナル因子の態様において、シグナル応答部分は金属微小球、好ましくは金から本質的に成る微小球、好ましくは１〜 ３μｍの金の微小球であることができる。 これらの態様は、現存する反射に基づく装置、例えば、オーディオＣＤ、ＣＤ−ＲＯＭまたはＤＶＤのリーダーによる検出に適する。 本発明の他の面は、現存する方法に適合させて、本発明の切断可能なシグナル因子をベースとするアッセイ装置を使用することである。 一般に、本発明の切断可能なシグナル因子をベースとするアッセイ装置を使用するように適合されたアッセイは、下記の工程からなる：アッセイ装置を液状試料と接触させ、前記複数の取付けられた切断可能なシグナル因子を切断するように適合された切断剤とアッセイ装置とを接触させ、前記切断されたシグナル因子のシグナル応答端を除去し、そして固体の支持体の基板に接着する分析物拘束切断されたシグナル因子のシグナル応答部分の存在を検出する。 アッセイ装置上のシグナル因子の空間的にアドレス可能性は、単一のアッセイにおける多数の分析物の同定を包含する、示差的シグナル因子に結合した分析物の同定を可能とする。 したがって、本発明は、１つの態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供し、ここで第１および第２の側面因子はオリゴヌクレオチドを含む。 切断可能なシグナル因子の第１および第２の側面因子に対するアッセイ試料の中に存在する核酸の同時結合は、シグナル因子のシグナル応答端の、切断による、損失を防止する。 他の面において、本発明は複数の核酸配列に対して応答性の切断可能なシグナル因子からなるアッセイ装置を提供する。 本発明のこの面は、核酸を含有する試料と接触したとき発生するシグナルの空間的アドレス可能性により、核酸の配列決定に適当な装置および方法を提供する。 さらに、本発明はイムノアッセイを提供する。 これらの態様において、切断可能なシグナル因子の特異性を付与する側面因子は、抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体を包含する。 第１側面因子の抗体および第２側面因子の抗体に対する分析物の同時結合は、シグナル因子のシグナル応答端の、切断による、損失を防止する。 他の面において、本発明は、固体の支持体の基板からなるアッセイ装置を提供し、この基板には複数の切断可能なシグナル因子が取付けられており、かつ、また、その上にコンピューターのソフトウェアの形態のディジタル情報をにコード化する。 ４． 図面の簡単な説明 本発明は、下記図面を参照する説明によりよりよく理解されるであろう。 第１Ａ図は、アッセイ装置の基板上の誘導化された部位に、それらの表面取付け端において共有結合した、複数の切断可能なスペーサーの概略的表示である。 第１Ｂ図は、複数の切断可能なスペーサーのシグナル応答端に、反射シグナル発生手段、金属微小球を取付けて、切断可能な反射シグナル因子をつくることを図解する。 第２Ａ図は、核酸を含有する試料の導入後、本発明の切断可能な反射シグナル因子を使用できる核酸のハイブリダイゼーションアッセイの概略的表示である。 第２Ｂ図は、第２Ａ図のアッセイ手順の後の段階の概略的表示であり、ここで試料の中に存在するオリゴヌクレオチドは第１切断可能なシグナル因子の相補的オリゴヌクレオチドの側面因子に結合しているが、第２切断可能なシグナル因子のオリゴヌクレオチドの側面因子の第２の、異なる、組に結合していない。 第２Ｃ図は、スペーサー分子の切断後、第２Ａ図および第２Ｂ図のアッセイ手順の後の段階の概略的表示である。 検定試料からの相補的オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションにより束縛されない反射性金微小球は、アッセイ装置の表面から除去され、空間的にアドレス可能な、示差的に反射性のシグナルを提供する。 第２Ｄ図〜第２Ｅ図は、検定試料に添加された可溶性オリゴヌクレオチドが核酸のハイブリダイゼーションアッセイにおいて感度を増加する、本発明の１つの面の概略的表示である。 第２Ｆ図は、本発明の切断可能な反射シグナル因子を使用できる核酸の検出アッセイにおける、ＤＮＡリガーゼを使用して、アッセイ装置の誘導化された基板への切断可能なスペーサーのシグナル応答端に接着する分析物特異的結合の強さを増加し、こうして洗浄のストリンジェンシイの増加およびアッセイ特異性の増加を可能とすることの概略的表示である。 第３Ａ図は、本発明の切断可能な反射シグナル因子の使用に適合したイムノアッセイを概略的に表示する。 第３Ａ図は、検定試料の中に存在することが推測される分析物のエピトープ部位に結合することができ、複数のシグナル因子の切断可能なスペーサーの側面因子に取付けられた抗体を図解する。 第３Ｂ図は、第３Ａ図に表されているアッセイプロセスにおける後の段階の概略的表示であり、そして試料からの抗原が１つの切断可能なシグナル因子の２つの抗体に結合するが、試料からの抗原が第２切断可能なシグナル因子に取付けられた抗体の側面因子の第２組に結合できないことを図解する。 第３Ｃ図は、シグナル因子のスペーサーの切断後の、アッセイプロセスにおけるなお後の段階における、第３Ａ図および第３Ｂ図のアッセイの概略的表示である。 試料からシグナル因子の抗体への特異的架橋のアソシエーションにより束縛されない反射性金微小球は、アッセイ装置の表面から除去され、空間的にアドレス可能な、示差的反射シグナルを提供する。 第４Ａ図〜第４Ｇ図は、切断可能な反射シグナル因子をその上に前もって決定されたパターンで析出されて、本発明の空間的にアドレス可能なアッセイ装置をつくる、固体の支持体の基板の製造を概略的に図解する。 第５Ａ図は、アッセイ装置の誘導化プラスチック表面に取付け後であるが、オリゴヌクレオチドの側面因子で誘導化する前における、本発明の切断可能な反射シグナル因子の典型的な切断可能なスペーサー分子の化学構造の概略的表示であり、ここでｐｉｖはピバロイルイ保護基を意味し、ＭＭＴはモノエトキシトリチルを意味し、そしてｎおよびｍの各々は独立して１より大きいか、あるいはそれに等しい整数を表す。 第６図は、切断可能なスペーサー分子の他の概略的表示であり、特に切断に対して感受性であるスペーサー分子上の部位を図解し、さらにＰｉｖおよびＭＭＴ 基により保護されていることが示される、側面メンバーの取付けの部位を示す。 第７Ａ図〜第７Ｃ図は、アッセイ装置の基板の活性化された表面への切断可能なスペーサー分子の取付け手段を概略的に図解する。 図解される例において、第７Ａ図に示す基板のアミン化表面は第７Ｂ図に示すように活性エステルに変換されている。 第７Ｃ図に示すように、切断可能なスペーサー分子は、活性化エステルを介して、固体の支持体に取付けられている。 第８Ａ図および第８Ｂ図は、複数の切断可能なスペーサー分子の切断部位の表面取付け側面への第１オリゴヌクレオチド側面メンバーの取付けの間の中間工程を図解する。 第９Ａ図および第９Ｂ図は、複数の切断可能なスペーサー分子の切断部位のシグナル応答側面への第２オリゴヌクレオチドメンバーの取付けにおける中間工程を図解する概略的表示である。 第１０Ａ図は、アッセイ装置の固体の基板に取付けられた、切断可能なスペーサー分子のシグナル応答端に対する微小球の取付け前の、本発明の切断可能な反射シグナル因子の実質的に完全な切断可能なスペーサー分子を図解する概略的表示である。 第１０Ｂ図は、単一の反射性粒子を第１０Ａ図の切断可能なスペーサーのシグナル応答端に取付けて、本発明の切断可能な反射シグナル因子を完結することを図解する。 第１１Ａ図〜第１１Ｇ図は、円形の、平面のディスク基板上の、切断可能な反射シグナル因子の空間的にアドレス可能な析出の種々のパターンを図解する：ここで 第１１Ａ図は、ディスク基板上にコード化可能な、アドレスラインを特に同定し、これから切断可能スペーサーの位置を測定することができる。 第１１Ａ図において、切断可能なスペーサー分子は環状トラックで析出される。 第１１Ｂ図は、切断可能なシグナル因子のらせん状析出を明らかに示し、そして特に回転駆動手段とかみ合うことができるディスク環の中央のボイドを特に同定する。 第１１Ｃ図は、中央のトラック上のインタープリティブ・ソフトウェアを同時にコード化する、多数の試料を平行にアッセイするために適当なパターンの、切断可能なシグナル因子の析出を明らかに示す。 第１１Ｄ図は、アッセイ装置の基板が個々のアッセイのセクターを分離するようにさらに微小製作され、これにより試料を混合しないで試料の添加の間のアッセイ装置の回転を可能とする、態様を概略的に表示する。 第１１Ｅ図は、アッセイ装置の基板がアッセイ装置の回転の間の１方向の試料の流れるようにさらに微小製作された、態様を概略的に表示する。 第１１Ｆ図は、５０の異なる分析物の各々について２０の試料をアッセイするために適当な空間的構築における切断可能なシグナル因子の析出を明らかに示す。 第１１Ｇ図は、反対の方向またはキラリティーのらせん状アームをもつらせん状パターンの重ねによりつくられた、直交する交差を明らかに示す。 第１２図は、第１１Ａ図のアッセイ装置により発生された分析物特異的シグナルの検出の概略的表示である。 第１３図は、固体の基板に前もって取付けられた切断可能なスペーサー上にオリゴヌクレオチドの側面メンバーをプリントするとき使用するスタンプの概略的例である。 示されているスタンプは２片、すなわち、スタンプ片および供給片、 から作られている。 スタンプ片は孔を含有し、これらの孔は供給片が含有するチャンネルを通して必要な化学物質により充填される。 次いでチャンネルはガラスの毛管配列に接続されている。 この配置において、１列の孔は同一化学物質で充填される。 異なる孔およびチャンネルのパターンを必要に応じて使用することができる。 第１４図は、第１３図に描写するスタンプを使用する２段階の直交プリントから生ずるオリゴヌクレオチドの側面因子の析出パターンの概略的表示である。 数字１、２、３および４は、合成において使用する異なるホスホルアミダイトの配列を表す。 例えば、トリマーを使用するオリゴヌクレオチドの合成において、数字１はＡＡＡであり、数字２はＡＡＣであり、数字３はＡＡＧであり、そして数字４はＡＡＴであることができる。 各スポットにおける最初の数字は、切断可能なスペーサーの主鎖に最も近接するオリゴヌクレオチドの構築ブロックを与える；第２の数字（存在する場合）は次の構築ブロックを表す。 ディスクとして造形された基板上に本発明の切断可能な反射シグナル因子を析出するとき、直交プリントは特に有利である。 第１５図は、固体の基板上に前もって取付けられた切断可能なスペーサー上に多数のオリゴヌクレオチドの側面メンバーを同時にプリントする、相補的な凹形プリント法の概略的表示である。 切断可能なスペーサーはそれら自体示されていない。 第１６図は、アッセイ装置の４つの明確なセクターの中に平行に単一の試料が流れる、１つの配置を明らかに示す。 ４つのセクターにおけるバイオビットの密度またはアフィニティーが異なる場合、試料の適用部位から最も遠位の陽性の切断可能なシグナル因子の各セクターにおける位置を検出することによって、濃度の大きい動力学的範囲を決定することができる。 第１７図は、切断可能なスペーサーを計量分配する別のアッセイ装置の配置を明らかに示し、ここで第１分析物特異的側面因子はアッセイ装置の基板に直接的に取付けられているが、第２分析物特異的側面因子は、ここでプラスチックの微小球として示されている、シグナル応答部分に直接的に取付けられている。 第１８図は、切断可能なスペーサーを計量分配するさらに別のアッセイ装置の配置を明らかに示し、ここで第１側面因子はアッセイ装置の基板に直接的に取付けられているが、第２側面因子はシグナル応答部分に直接的に取付けられており、 そして分析物はシグナル応答部分の凝集を引き起こす。 ５． 発明の詳細な説明 本発明のアッセイ装置およびアッセイ方法は、流体検定試料中の分析物を検出するために切断可能なシグナル因子を利用する。 検出のために前もって選択した分析物の結合は、シグナル因子のシグナル応答部分の−−切断による−−損失を防止する。 次いで、拘束されたシグナル因子のシグナル応答部分からのシグナルの発生を使用して、試料中の分析物の存在のシグナルを発生する。 好ましい態様において、シグナル応答部分は入射光を反射または散乱させるか、あるいはそうでなければ光アドレス可能である。 検出のために前もって選択した分析物の結合は、シグナル因子のシグナル応答部分の−−切断による−−損失を防止する。 次いで、拘束されたシグナル因子のシグナル応答部分からの、入射光、好ましくは入射レーザー、の反射または散乱を使用して、試料中の分析物の存在のシグナルを発生する。 本発明の切断可能な反射シグナル因子は、オーディオコンパクトディスク（Ｃ Ｄ）のリーダー、ＣＤ−ＲＯＭ（コンパクトディスクの読取り専用記憶装置）のリーダー、ＤＶＤ（ディジタルビデオディスク）のリーダー、およびその他を包含する、現存するレーザーの反射に基づく検出器を使用する検出に特に適合する。 したがって、本発明の切断可能な反射シグナル因子の使用は、現存するレーザーの反射に基づく検出器の大きい設置されたベースを使用する検出に、現存するアッセイの化学および現存するアッセイのスキームの容易な適合を可能とする。 これは、手の込んだ検出器を使用する標準的アッセイを越えた、実質的なコストの節約／アッセイに導く。 さらに、レーザーの反躬に基づく検出装置の広い、普遍的な分布は、−−本発明の切断可能な反射シグナル因子に使用に適合するように−−サービス使用、すなわち、手の込んだ検出器の存在により決定される位置において実施しなくてはならないアッセイ、の時点のための分布を可能とする。 これらのアッセイの例は、イムノアッセイ、細胞の計数、ハイブリダイゼーションに基づく遺伝的検出アッセイ、核酸の配列決定に基づく遺伝的検出アッセイ、核酸の配列決定それ自体、およびその他である。 したがって、本発明はアッセイ装置の研究所、医院、および集中化された位置において現在実施しなくてはならない個々の家庭への分布を可能とする。 前述のレーザーの反射に基づく検出器の各々−−ＣＤ−ＲＯＭのリーダー、Ｄ ＶＤのリーダーおよびその他を包含する−−は、それらのそれぞれの媒体上の空間的にアドレス可能なディジタル情報の検出、識別、および解読に適合する：オーディオＣＤのリーダーは個々のディジタル的にコード化されたオーディオトラックを特異的にかつ別々にアドレスすることができる：ＣＤ−ＲＯＭのリーダーは、コンピューターのプログラムをコード化する２進ファイルを包含する、多数の２進ファイルを特異的にかつ別々にアドレスすることができる（ＩＳＯ９６６ ０は共通のアドレス可能なファイル構造を規定する、これは引用することによって本明細書の一部とされる）；そのように、また、ＤＶＤのリーダーは２進ファイルおよびＭＰＥＧコード化ディジタルビデオシグナルを特異的にかつ別々にアドレスすることができる。 ＣＤおよびその他の上にコード化された情報を検出および解読するために現在使用されているレーザーの反射に基づく検出器の空間的にアドレス可能な能力は、本発明の切断可能な反射シグナル因子の使用に適合するアッセイに特定の利点を付与する。 したがって、単一の支持メンバーまたは基板上の多数のシグナル因子のパターン化された析出は、これらの個々のシグナル因子の空間的位置をアドレスすることができる検出器の使用と組み合わせて、単一の試料を多数の異なる分析物について同時にアッセイすることを可能とする。 したがって、本発明は、異なる分析特異性の切断可能な反射シグナル因子の空間的にアドレス可能な組合わせからなる、本明細書においてディスクと普通に呼ぶ、アッセイ装置、バイオ−コンパクトディスク、バイオ−ＣＤに関する。 このような有用な組合わせの例は、個々のアッセイの各々の予測的値または特異性を増加するもの、異なる診断における特定の診断を認否する組合わせ、広い一般的スクリーニングの道具を提供する組合わせ、およびその他である。 同一の特異性を有する多数のシグナル因子のパターン化された析出は、単一のアッセイ装置を使用して、大きい濃度範囲の単一の分析物の検出をさらに可能とする。 したがって、本発明の他の面は、同一の特異性の空間的にアドレス可能な切断可能な反射シグナル因子からなり、その物理的位置が濃度の情報の伝達を可能とする、アッセイ装置を提供することである。 レーザーの反射に基づくディジタル検出器の空間的にアドレス可能な能力は、 インタープリティブ・ソフトウェアと単一のアッセイ装置上のアッセイ因子それら自体との組合わせを可能とする。 したがって、本発明の他の面は、切断可能な反射シグナル因子のパターン化された析出から空間的に明確な区域において、ソフトウェアがコード化されたアッセイ装置である。 ソフトウェアは、入射レーザーによる正しいトラッキング、インタープリティブ・アルゴリズム、標準的コントロール値、自己診断、およびその他のために重要な情報を包含することができる。 ソフトウェアは、装置の駆動、および診断の情報を遠隔位置にアップロードすることができるソフトウェアを包含することができる。 ソフトウェアは、臨床的アッセイのための患者の教育を包含し、そして選択された聴衆に適合させることができる。 本発明の切断可能な反則シグナル因子によりシグナル発生されたアッセイのデータの実質的に２進の特質は、計装の雑音に対して実質的に抵抗性の使用にアッセイを適合性とさせるとう他の利点を表す。 例えば、 光の反射の小さい変動−−レーザー源により提供される光強度の小さい変動および反射粒子の大きさの小さい変動から生ずるような−−は、一般に、アッセイの結果に影響を与えない。 なぜなら、光の反射が限界に到達したときのみ、検出器はシグナルを登録するからである。 同様に、検出装置それ自体の電子的雑音およびアナログ／ディジタル変換に関連する雑音はアッセイの結果に影響を与えない。 この利点は、フィールドテストに有用であるか、あるいは困難な環境的操作条件下にアッセイを実行するために有用である、耐久力の大きい検出計器の設計および製作において、特に認められる。

５．１

空間的にアドレス可能な、切断可能な反射シグナル因子本発明の切断可能な反射シグナル因子、また、バイオービットと呼ぶ、の一般的操作は、本発明の２つの態様を概略化する、第１図〜第３図を参照することによってさらに詳しく理解することができる。 第１図を参照すると、基板２０は切断可能なスペーサー分子３０が取付けられている誘導化表面２１を有し、各切断可能なスペーサーは、表面取付け端に加えて、金属微小球４０に近接して示されている、シグナル応答端を有する。 基板は、多孔質であるか、あるいは充実であることができるが、充実が現在好ましく、種々の材料、例えば、プラスチック、 ガラス、雲母、シリコン、およびその他から選択することができる。 しかしながら、プラスチックは、経済性、表面へのスペーサー分子の取付けのための誘導化の容易さ、および現存するレーザーの反射に基づく検出器、例えば、ＣＤ−ＲＯ ＭおよびＤＶＤのリーダーとの適合性の理由で好ましい。 使用できる典型的なプラスチックは、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレートおよびポリカーボネートである。 現在ポリプロピレンおよびポリカーボネートは好ましく、ポリカーボネートは最も好ましい。 基板２０の表面２１は、好都合に誘導化して、切断可能なスペーサー分子３０ の各々に対する共有結合を形成することができる。 金属球は、アッセイ装置の基板２０に結合したスペーサー分子の存在を検出する、好都合な反射シグナル発生手段を提供する。 典型的な材料は、金、銀、ニッケル、クロム、白金、銅、およびその他であり、金は、例えば、共有結合を介して、切断可能なスペーサーのシグナル応答端における遊離ＳＨ基へ容易にかつ緊密に結合する能力を有するので、現在好ましい。 金属球は充実金属であるか、あるいはプラスチックまたはガラスのビーズまたはその他から形成されることができ、それらの金属球の上に金属のコーティングを析出させることができる。また、他の反射材料を金属の代わりに使用することができる。現在好ましい金球は、切断可能なスペーサーのシグナル応答端のチオ基に直接的に結合５１する。切断可能なスペーサー分子の各々は、１端３１において、例えば、アミドリンケージを介して、支持表面２１に取付けられ、そして他端３２においてシグナル発生手段（また、シグナル応答部分と呼ぶ）に、例えば、チオ基を介して、反射金属微小球４０に取付けられる。スペーサー分子は切断部位３３を有し、切断部位３３は、切断部位の特質に依存して、アッセイ手順の間に化学的または酵素的手段、熱、光またはその他による切断に対して感受性である。化学的手段は現在好ましく、典型的には、化学的切断部位およひ化学的切断剤の、それぞれ、シロキサン切断基およびフッ化ナトリウムの溶液を使用する。切断に対して感受性の他の基、例えば、エステル基またはジチオ基を使用することもできる。金球をスペーサーの切断後に添加する場合、ジチオ基は特に有利である。切断部位３３は、切断可能なスペーサー分子３０の第１の表面取付け端３１と、切断可能なスペーサー分子３０の第２のシグナル応答端３２との間に存在する。スペーサーは、すべてのスペーサーの完全な切断を最適化するために２またはそれ以上の切断部位を含有することができる。切断部位３３の反対側に位置する；すなわち、それぞれ、表面取付け端に対して近接にかつ切断可能なスペーサー分子３０のシグナル応答端に対して近接に位置する、側面メンバー３４ａおよび３４ｂ、また、側面アームと呼ぶ、により、 分析物特異性は切断可能なスペーサーに付与される。側面メンバー３４ａおよび３４ｂは、それらの典型的な立体配置において、典型的には５〜２０マー、好ましくは８〜１７マー、最も好ましくは８〜１２マーのオリゴヌクレオチドを包含するが、これより長いオリゴヌクレオチドを使用することができる。また、側面メンバーは、限定なしに、必要に応じて、ペプチドまたはタンパク質に対する有機リンカー、またはその他を含むことができる。アッセイ装置、また、ディスクと呼ぶ、バイオ適合性ディスク、またはＢＣＤの固体の表面２１上の任意の特定の誘導化部位に、多数の切断可能なスペーサー分子３０は存在するであろう。本発明の１つの面において、オリゴヌクレオチドの側面メンバーは、検定試料の中に存在することがある核酸の相補的一本鎖に結合することができる。相補的オリゴヌクレオチドは、特異的結合対のメンバーを含んでなる、すなわち、１つのオリゴヌクレオチドは第２相補的オリゴヌクレオチドに結合するであろう。第２Ａ図〜第２Ｃ図においてさらに詳しく説明するように、アッセイ装置の表面上の異なる部位における切断可能なスペーサー分子３０は異なるオリゴヌクレオチドの側面メンバーを有するであろう。第２Ａ図に示すように、１つのこのような切断可能なシグナル因子はオリゴヌクレオチドの側面メンバー３４ａおよび３４ｂを有し、これに対して第２切断可能なシグナル因子はオリゴヌクレオチドの側面メンバー３５ａおよび３５ｂを有する。第２Ａ図〜第２Ｃ図においてさらに描写するように、オリゴヌクレオチド３６ を含有する検定試料と接触するとき、相補的オリゴヌクレオチドの側面メンバー３４ａおよび３４ｂは試料の中に存在するオリゴヌクレオチドと結合して、第２ Ｂ図に示すように、二重らせんを形成するであろう。オリゴヌクレオチド３６とオリゴヌクレオチドの側面メンバー３５ａおよび３５ｂとの間に相補性は存在しないので、第２Ｂ図においてさらに図解するように、それらの基の間の結合は存在しない。二重らせん連結されたオリゴヌクレオチドにより結合の切断部位を除外して、 切断部位３３を切断するとき、金属微小球４０は表面から離れ、表面から除去される。これは第２Ｃ図にいっそう完全に図解されている。多数の試料を単一のオリゴヌクレオチドについてアッセイしようとする場合、異なる部位におけるスペーサー分子は一般に同一のオリゴヌクレオチドの側面メンバーを有するであろう。次いで金属微小球４０の存在および非存在は、入射光、特に入射レーザー光の反射または反射の非存在として検出することができる。第２Ｆ図は、本発明の核酸の検出の態様のそれ以上の態様においてＤＮＡリガーゼを使用する概略的表示であり、このＤＮＡリガーゼは、分析物特異的結合がアッセイ装置の誘導化基板に対する切断可能なスペーサーのシグナル応答端に接着する強さ増加し、こうしてこの態様において洗浄のストリンジェンシイの増加を可能とし、アッセイの特異性を増加するために使用される。核酸の検出における当業者は理解するように、本発明の切断可能な反射シグナル因子は、規定された大きさの増幅された核酸、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用する増幅スキーム、およびその他を使用して増幅された核酸、を検出するために特によく適する。第３Ａ図〜第３Ｃ図に記載する本発明の他の態様において、オリゴヌクレオチドの側面メンバー３４ａ、３４ｂ、３５ａおよび３５ｂを修飾された抗体３８ａ 、３８ｂ、３８ｃおよび３８ｄに共有結合させてイムノアッセイを可能とする。側面メンバーへの修飾された抗体の非共有結合の取付けは、切断可能なスペーサーの側面メンバーのオリゴヌクレオチドおよび抗体に共有結合で取付けられたオリコヌクレオチドの相補性を通して仲介される。超分子構造の非共有結合の、組合わせアセンブリーを実現するための相補的核酸分子の使用は、共同所有された、同時継続米国出願第08/332,514号、1994年10月31日提出、第08/424,874号、19 95年４月19日提出、および第08/627,695号、1996年３月29日提出の明細書（引用することによって本明細書の一部とされる）に詳細に記載されている。他の態様において、慣用の交差結合因子を使用して、直接的にまたはリンカーを介して、 切断可能なスペーサーに抗体を共有結合的に取付けることができる。抗体は、第１特異的結合対の第１メンバーと、第２特異的結合対の第１メンバーとからなる。第１特異的結合対の第２メンバーおよび第２特異的結合対の第２ メンバーは、問題の抗原の異なるエピトープ部位であろう。さらに詳しくは、オリゴヌクレオチドの側面メンバー３５ａは抗体−オリゴヌクレオチド３８ｃに取付けられ、そしてオリゴヌクレオチドの側面メンバー３５ｂは抗体−オリゴヌクレオチド３８ｄに取付けられている。抗体３８ｃおよび３８ｄは、検定試料の中に存在できる抗原上の異なるエピトープ部位に結合するように適合させる。抗原上の異なるエピトープ部位とは、同一エピトープまたは明確な部位に存在する異なるエピトープの異なる、空間的に分離された存在を意図する。第２アッセイ因子において、オリゴヌクレオチドの側面メンバー３４ａおよび３４ｂは異なる抗体３８ａおよび３８ｂに取付けられ、再びこのような抗体の各々は抗原の異なるエピトープ部位に結合するように適合させる。第３Ａ図〜第３Ｃ図に概略的に示すイムノアッセイをさらに参照すると、第３ Ａ図に図解される切断可能な反射シグナル因子の収集物に抗原３９を含有する検定溶液を適用すると、抗原３９は抗体３４ａおよび３４ｂに結合し、こうして切断部位３３が、例えば、化学的切断剤と接触するとき、アッセイ装置の表面２０ から金属球４０が分離するのを防止する。対照的に、第２切断可能なシグナル因子は、抗原３９に対する抗体３５ａおよび３５ｂのアフィニティーの欠如のために、抗原３９により結合されていず、金属微小球４０を固体の支持体から分離させ、試料から除去させる。次いで、金属微小球４０の存在および非存在を、入射光、特に入射レーザー光の反射または反射の非存在として検出することができる。明らからかなように、描写するように抗体のカップリングは、本発明の切断可能な反射シグナル因子とともに使用するための標準的イムノアッセイ化学およびイムノアッセイのジオメトリーの容易な適合を可能とする。これらの古典的イムノアッセイのジオメトリーのいくつかは、米国特許第5,168,057号明細書（１９ ９２年１２月１日発行）（引用することによって本明細書の一部とされる）にさらに記載されている。したがって、第３図に概略的に示す分析物の直接的検出は、本発明の切断可能な反射シグナル因子およびアッセイ装置に適合可能なイムノアッセイのジオメトリーのほんの１つであることは明らかであろう。本発明は、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ 型肝炎ウイルス、およびヒトヘルペスウイルスについてスクリーニングするイムノアッセイにおいて特に価値があることが証明されるであろう。さらに理解されるように、抗体は特異的結合対のより広い概念の典型であり、 ここで抗体は特異的結合対の第１メンバーであり、そしてそれが結合する抗原は特異的結合対の第２メンバーである。一般に、特異的結合対は、本発明の実施を可能とするために十分な結合活性および特異性を有する相互のアフィニティーを有する２つの分子として定義することができる。したがって、本発明の反射性切断可能なシグナル因子は、側面メンバーとして他の特異的結合対を包含することができる。このような態様において、切断可能なシグナル因子の第１側面メンバーは第１特異的結合対の第１メンバーを包含し、切断可能なシグナル因子の第２ 側面メンバーは第２特異的結合対の第１メンバーを包含し、ここで前記第１特異的結合対の前記第２メンバーおよび前記第２特異的結合対の前記第２メンバーは互いに接続的に取付けられ、下記の一般式の束縛ループの形成を可能とする：第１特異的結合対の第１メンバー第１特異的結合対の第２メンバー第２特異的結合対の第２メンバー第２特異的結合対の第１メンバー。この分野においてよく知られている特異的結合対の例は、生物学的レセプターおよびそれらの自然のアゴニストおよびアンタゴニストのリガンド、タンパク質およびコファクター、ビオチンおよびアビジンまたはストレプチアビジン、アルファスペクトリンおよびベータスペクトリンのモノマー、および抗体Ｆｃ部分およびＦｃレセプターである。上記に例示した態様−−核酸の分析物の直接的検出および検出イムノアッセイ−−を、アッセイを実施する前に切断可能なスペーサー分子に取付けられた反射性金属球を使用して説明したが、これらの態様およびさらに本明細書において記載する他の態様において、シグナル発生手段を欠如する切断可能なスペーサー分子は最初に試料に暴露し、次いで切断し、そして後にスペーサー分子を添加して表面上に残留するスペーサー分子のみに取付けることが考えられる。金属球の添加後、表面を適当な検出器で読取り、結合したスペーサー分子およひ分析物を同定することができる。本発明のアッセイ法の態様の各々において、検定すべき試料を最初に導入しなくてはならない。 １つの面において、アッセイ装置を回転し、流体試料を、好ましくは希釈して、円形アッセイ装置の基板の中心付近に適用する。アッセイ装置のディスクの回転に関連する遠心力は、固体の基板ん平面を横切って流体試料を分配する。この方法において、基板の表面は一定の、均一に分配された流体試料でカバーされる。この試料適用方法において、検定試料は、最初に約１００μｌであり、プロセシングのために約１ｍｌに希釈される。この溶液を回転するディスクの中心付近に滴下する。アッセイ部位および可能ならばディスクの表面は親水性であり、そして流体は回転するアッセイ装置のディスク上に非常に薄い層を形成するであろう。流体層の厚さは、滴の添加の頻度およびディスクの回転の頻度により調節することができる。好ましい厚さは１０μｍより小さい。なぜなら、次いで、試料中のすべての分子は、スペーサーにより結合された静止分子と相互作用することができるからである。ディスクをカバーするために、約１０μｌの試料溶液を必要とする。本発明の切断可能な反射シグナル因子およびアッセイ装置とともに、他の試料適用方法を使用することができる。特に、前述の回転適用は単一の試料／アッセイ装置の適用のために原理的に適する。本発明の他の面において、別の試料を静止ディスクの離散区域に適用することができる。この面において、アッセイ系はほぼ１０００の異なる試料をアッセイすることができる。ディスク上の前もって決定した区域上に適用された、ほぼ１×１０６の金球を、各試料について使用することができる。第１１Ｄ図は、１６の別々のアッセイセクターを有する本発明のアッセイ装置を示す。第１１Ｅ図は、ラインとして示す流体流れのバリヤーを使用する、試料の流れについて可能な方向を示す。したがって、本発明の１つの態様において、アッセイ装置は、例えば、１０２ ４の患者の試料、１分析物／アッセイ装置（すなわち、／ディスク、各ディスクは複数の切断可能なスペーサーからなり、各スペーサーは同一の分析物特異性を付与する同一の側面メンバーを有する）を同時にアッセイするように設計される。このような態様において、ディスク上のスペーサー分子の各々は、同一分析物についてアッセイするように、同一であることができる；ディスク上の特定の位置におけるスペーサー分子は、ディスク上の他の位置におけるスペーサー分子と同一であろう。この適用は臨床研究所において実施される大量の分析において特に有効であり、ここで多数の患者の試料が同時に単一の分析物の存在または非存在について分析される。また、理解されるように、種々の分析物特異性を有する切断可能な反射シグナル因子からなる、単一のアッセイ装置上で、多数の試料を多数の分析物についてアッセイすることができる。第１１Ｆ図は、２０の試料を５０の異なる生物分子についてスクリーニングするために使用できるアッセイ装置を示す。後者の場合において、多数の検定試料中の制限された数の同一分析物についてアッセイすることが可能である。既知の方法、例えば、インク噴射プリントおよび使い捨て先端を有するマイクロピペットの配列、またはそれらの組合わせにより、ディスクの特定の位置に患者の試料を適用することができる。大きい処理量の操作のために、アッセイディスクをカセットの中に装填し、そして検定試料を直接的にディスク上に、あるいは円形プレート中のウェルの中に気密的に負荷することができる。適当なインキュベーション期間は、試料が支持体の表面を横切るようにさせるために数秒であることができ、このインキュベーション期間後、洗浄工程（これは、ある態様において、不必要であることがある）を実施して非結合の試料を除去することができる。洗浄のストリンジェンシイを慣用のアッセイにおいて調節して、感受性および特異性を調節することができる。例えば、核酸検出の態様において、洗浄溶液の塩濃度を減少させて洗浄のストリンジェンシイを増加させ− −こうして分析物と特異性を付与する側面メンバーとの間の不一致を減少する− −か、あるいは増加させ、洗浄のストリンジェンシイを減少させ、これにより不一致を発生させることができる。本発明の核酸のハイブリダイゼーションおよびイムノアッセイの態様における洗浄のストリンジェンシイの調節は、この分野においてよく知られている。 １つの面において、必要に応じて、回転するディスクの中心付近に洗浄溶液を添加することによって、円形ディスクの表面を洗浄する。試料溶液がディスクの周囲から去るとき、それを除去し、集める。ディスクの回転のために、流体試料がディスクから通常の遠心力により適切に除去され、ストリンジェンシイに対する調節が不必要である場合、洗浄工程を排除することができる。洗浄工程後、存在する場合、切断剤を含む溶液を添加し、ディスクの表面の上に再び分配する。第１図〜第３図を参照すると、スペーサー分子は切断部位３３ を有し、切断部位３３は、切断部位の特質に依存して、化学的または酵素的手段、熱、光またはその他による、アッセイ手順の間の切断に対して感受性である。シロキサンの切断基を使用する化学的手段は現在好ましく、そしてフッ化ナトリウムの溶液はシロキサン基についての化学的切断剤として典型である。切断に対して感受性の他の基、例えば、エステル基またはジチオ基を使用することができる。金球をスペーサーの切断後に添加する場合、ジチオ基は特に有利である。自発的加水分解に対して安定とすることができるが、温和な条件下にフッ化物イオンにより容易に切断されるシロキサン部分である切断部位の場合において、 フッ化ナトリウム溶液を１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭ（０．１Ｍ）の濃度で導入する。切断工程はわずかに数秒持続するだけであろう。この工程の間に、すべてのスペーサーは切断されるが、 切断可能なスペーサーとアッセイ装置の誘導化表面との間のアミド結合はこれらの条件に対して安定に止まる。試料を適用しそしてスペーサーを切断した後、分離したシグナル発生分子、好ましくは反射性部分、より好ましくは金属球、最も好ましくは金球を除去して、 検出の間に示差的シグナルを提供しなくてはならない。除去工程は第２洗浄工程を含み、この工程は洗浄溶液の導入を含むことができる。示差的洗浄ストリンジェンシイをアッセイのこの段階において発生させ、これにより種々のアッセイ方法の特異性および感受性の変動を可能とする、いくつかの手段が存在する。 １つの面において、洗浄溶液を添加するか、あるいは添加しないで、アッセイ装置を回転することによって、分離した反射性部分を除去することができる。 ３ つのパラメーターを変化させて示差的ストリンジェンシイを提供することができる：金粒子の大きさ、回転速度、およびスペーサーの取付けの原子価。本発明の切断可能な反射シグナル因子およびアッセイ装置において使用するために適当な金球は、アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Co mpany)、ブリティッシ・バイオセル・インターナショナル・ナノプローブス・インコーポレーテッド(British Bio Cell International，Nanoprobes，Inc.)、およびその他から、直径１ｎｍから０．５〜５マイクロメートルを含む範囲の変化する直径で容易に入手可能である。本発明において要求されるより小さいか、あるいはより大きい直径の金球をつくることは当業者の技量の範囲内である。所定の回転速度において、最大の金球はより大きい遠心力（ｒ３に関して）および抵抗力（ｒに関して）を経験し、そして等しい結合を有するより小さい球の前に除去される。これは洗浄および、また、定量的分析のための示差的ストリンジェンシイのための基準を提供する。金球に影響を与える遠心力は、また、解放されたおよび弱く結合した金球が除去されるように、回転頻度により調節することができる。試料から相補的分子に結合したスペーサーのみは、金球を基板に結合し続けるであろう。さらに、単一の切断可能なスペーサーのシグナル応答端に取付けられた単一の金属球を使用して、本発明の上記の態様を説明したが、金を本発明の好ましい態様において使用するとき、金球の直径に依存して、数千のスペーサーが１つの金球に結合できることを理解すべきである。したがって、任意の所定の速度において、金球の直径を変化させ、そして金球に対する切断可能なスペーサーの相対密度をさらに変化させることによって、アッセイの洗浄のストリンジェンシイを調節することができる。したがって、ある種の金球の下の事実上すべてのスペーサーを相補的分子により接続する場合、結合は非常に強い。スペーサーをある種の金球の下において部分的にのみ固定する場合、球の半径および回転の頻度に依存して、球を止まらせるか、あるいは除去することができる。極端な場合において、すべての球は固定されるか、あるいは除去される。これらはＤＮＡ分析の代替方法であることが期待される。イムノアッセイにおいて、 中間的場合が好ましい。したがって、正常のコントロールレベルが金球の５０％ の固定に相当するように、このシステムは最適化されるべきである。第３図に図解するように、結合のために２つの抗体を使用するとき、より高いか、あるいはより低い固定は、それぞれ、より高いか、あるいはより低い分析物の濃度に相当する。強い遠心力を使用して、弱く結合した金球を除去することができる。 １つの金球を引く遠心力は０．１ｎＮ程度であるが、金球の質量およびディスクの回転頻度に依存する大きい限界内で、この力を変化させることができる。遠心力は、抗体の非特異性結合を破断しかつ不一致のオリゴヌクレオチドを機械的に変性するために十分に強い。これは、分析物と本発明の切断可能なシグナル因子との間の特異性を増加するための非常に強い因子である。切断可能なスペーサーの反射性部分が強磁性体である、例えば、反射性部分が金で被覆された鉄のビーズまたは鉄合金である、本発明の態様において、切断により分離されかつ分析物によりアッセイ装置の基板に固定されない反射性部分を、磁場の適用により除去することができる。このような態様において、アッセイ装置（ディスク）の基板に取付けられたままであるシグナル因子は、また、磁場に対して応答性であるが、 これらの運動は第１側面メンバー−分析物−第２側面メンバーにより形成されたループの長さおよび柔軟性により拘束されるであろう。すべての取付けられたシグナル因子を外部の磁場の適用によりシフトする能力は、このシフトが第１側面メンバー−分析物−第２側面メンバーのループの長さおよび柔軟性により必然的に拘束される場合でさえ、この態様において、追加の情報を付加することができる。特に、磁場の短時間の適用は、分析物誘導シグナルとランダム雑音との識別を促進し、雑音は外部の磁場の適用に対して非応答性である。分析物の特異的結合により保護されない切断された反射性シグナル部分を除去した後、ディスクを直接的に読取ることができる。また、ディスクをまず消毒した後、読取ることができる。なお他の態様において、紫外線で重合する重合性ラッカーで回転コーティングすることによって、ディスクを光学的に透明なコーティングによりカバーして、金球のそれ以上の除去を防止することができる。コンパクトディスクの回転コーティングは、この分野においてよく確立されている。アッセイディスクは、１０年をかなり越えた貯蔵寿命を有することが期待される。引き続いて、種々の空間的に前もって決定された位置における微小球または他の反射性因子の存在を、反射により、検出するレーザーリーダーにより、ディスクを走査することができる。ディスクの回転軸からの微小球の距離およびディスク上に半径方向のラインを形成するアドレスラインからの角方向の距離に基づいて、特定の金属球の位置を特異的に決定することができる。特異的結合対の特定の位置および前もって決定された位置に基づいて、結合した物質の同一性を同定することができる。こうして、前述の方法において、１つの流体試料中の数千、またはなおそれより大きい数の分析物を同時に分析することが可能である。

５．２

支持体の誘導体化図４Ａ〜４Ｇは、切断反射シグナル要素が本発明のアッセイ装置を創造するために付着される固体支持体の調製を図的に示す。一般的に平面の固体支持体の部分が図４Ａに示される。図４Ｂに示されるように、支持体の表面がレジスド２２ 、たとえば高溶融点のワックス又は同様のものにより被覆される。次に、前記レジストにおけるくぼみ又は穴２５のパターンが、図４Ｃに示されるように、突起２４を含むスタンプ２３により型押することによって創造される。そのパターンは非常に規則的であり、そしてくぼみは、切断スペーサー分子が所望には支持体の表面上に位置するであろうすべての部位において製造される。図４Ｄに示されるように、くぼみの底部で残存するすべてのレジストは、図４Ｅに示されるように除去される。例４Ｅに示されるように、支持体２１の暴露された領域は、図４ Ｆに示されるように、支持体の表面及びいづれかの残存するレジスト２２への結合基（たとえばアミノ基）の結合を供給するために活性化され、又は誘導体化される。最後に、残存するレジストは、アミノ基が図４Ｇに示されるように、一定の予定された部位で結合される支持体の原表面を暴露するために除去される。ブランクディスクは、Disk Manufacturing，Inc． (Wilmington，Delawave)から入手できる。アミノ誘導体化は、高周波プラズマ発生器(ENI，Rochester，NY) を用いてアンモニアプラズマにより実施され得る。

５．３

切断スペーサーの合成及び結合図１、及び図５及び６に関しては、代表的な切断スペーサー分子が記載されている。主鎖と称するスペーサーのほとんどは、４００〜１０，００ ０、好ましくは４００〜２０００の分子量を有するポリ（アルキレングリコール）、たとえばポリエチレングリコールである。前記主鎖は、支持体２０の表面２ １上に存在する誘導体化されたアミン基に結合されるよう適合される第１の末端３１、及びチオール結合５１を通して金属微小球４０の表面４１と結合するよう適合される第２の末端３２を有する。主鎖は、スペーサー分子の第１末端３１と第２末端３２との間に切断部位３３を含む。さらに、末端３１と切断部位３３との間に、オリゴヌクレオチドから通常構成される側員３４ａが存在し、そして切断部位３３と末端３２との間、オリゴヌレクオチドから通常構成されるもう１つの側員３４ｂが存在する。他方では、そのような側員は、ペプチド又は他の有機分子であり得る。 ２つ以上の側員が供給され得るが、しかし２種の側員が切断部位での切断の後、支持体の表面にスペーサー分子を結合するために切断部位のまわりに結合分子ループを形成できることが単に必要である。それらの側員は、リンカー、たとえばポリエチレングリコールによりスペーサー主鎖に結合され得る。図５に例示される切断スペーサー分子３０の合成の１つのモードは、実質的に及び一般的に次の通りである：クロロジメチルシランがポリエチレングリコール分子の両端に結合される。前記分子中に組込まれたシラン基が、Ｎ−アクリロイルセリンと触媒量のクロロ白金酸の存在下で反応する。両セリン成分のヒドロキシル基は、オリゴヌクレオチド側員の構成のための合成に後で使用される。 １つのヒドロキシル基がまず、モノメトキシトリフェニルメチル基により保護され、 そして生成物が液体クロマトグラフィーにより精製される。次に、他のヒドロキシル基がピバロイル又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基により保護される。セリンカルボキシル基がアミノ基を末端に有するポリ（エチレングリコール）により結合される。他の端でのアミノ基がさらに、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより誘導体化される。他のアミノ基は、反応されないが、しかし誘導体化された支持体と後に、自由に反応する。スペーサー分子合成の他の、しかし実質的に類似し、そしてより詳細な記載が下記に、及び次のような調製に提供される。スペーサー分子の構造は、図５に図示されている。その合成は、まず、スペーサー分子の中心部分を構成することによって始められる。次に、ポリ（エチレングリコール）の両端が、たとえばクロロジメチルシランによりシラン処理され、化合物Ｉの式の化合物が付与される。次に、シラン基が、化合物IIの構造式を有する化合物を形成するために、末端二重結合を有する、直鎖又は枝分れ鎖のアルケン酸（たとえば、ＣＨ＝ＣＨ（Ｃ Ｈ

₂ ）

_n ＣＯＯＨ（ｎ＝１〜１１但し、炭素原子の数は重要ではない）、たとえばビニル酢酸、アクリル酸及び同様のもの）、たとえばビニル酢酸により誘導体化され、そして化合物IIIの構造式を有する化合物により例示されるように、オリゴヌクレオチドの後での結合を提供するためにシランの個々の側基上に保護されたヒドロキシル基をさらに供給するよう反応せしめられる。種々の通常の反応体がこの目的のために使用され得、そして触媒、たとえばクロロ白金酸の存在下で反応せしめられる場合、Ｎ−アクリロイルセリン及びＴＭ Ｔ−セリンメチルエステルが好ましい反応体の例示である。得られるエステルが、アルコール溶媒下で、アルカリ金属水酸化物、たとえば水酸化ナトリウムの添加により部分加水分解され、そして隣接する保護されたヒドロキシ基が化合物IV の構造式により表わされる化合物を得るために選択的に加水分解される。アミノ基を末端に有するポリ（エチレングリコール）が、チオエステル、たとえば３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにより１つの末端で誘導体化され、そして化合物VIの構造式により表わされる化合物を得るために化合物IVにより結合される。前記末端エステル基が加水分解され、酸が生成され、これがさらにメトキシ酢酸により反応せしめられ、化合物VIIIの構造式により表わされる化合物が付与される。その化合物がアミノ化されたポリ（エチレングリコール）により処理され、図５に実質的に例示されるような完結されたスペーサー分子が形成される。

調製１ ：化合物Ｉ ジクロロメタン（ＤＣＭ）１００ｍｌ中、ポリ（エチレングリコール）（１０ ｇ，１０ｍモル、平均分子量１，０００、Aldrich ChemIcal Company）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（２．１ｇ，２１ｍモル）の混合物に、ＤＣＭ２０ｍｌ 中、クロロジメチルシラン２．０ｇを、氷浴においで冷却しながら滴下する。 １ ０分後、その反応混合物を濾過し、そして濾液を２００ｇのシリカカラムに適用する。カラムをＤＣＭ／ＭｅＯＨ １９：１により溶出し、そして溶離剤がポリ（エチレングリコール）、ジ（ジメチルシリル）エーテル、すなわち下記化合物IIの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製２ ：化合物II 化合物Ｉ（１０ｇ，９ｍモル）及びビニル酢酸（１．７２ｇ，２０ｍモル）を、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）６０ｍｌに溶解する。 触媒量（４０ｍｇ）のクロロ白金酸を添加し、そしてその混合物を煮沸まで加熱し、そして１時間、煮沸する。 冷却の後、その溶液を２００ｇのシリカカラム中に直接適用する。 カラムをＥ ｔＯＡ及びＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ ９：１により溶出し、そして溶離剤がポリ（ エチレングリコール）、ジ(2−カルボキシエチルジメチルシリル）エーテル、すなわち下記化合物IIの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製３ ：化合物III 化合物II（９．５ｇ，８ｍモル）及びトリメトキシトリチルセリンメチルエステル（７．０ｇ，１６ｍモル）をＤＣＭ１００ｍｌ中に溶解する。 ＤＣＭ３０ｍ ｌ中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３．２５ｇ，１６ｍモル） を室温で滴下する。 １時間後、その反応混合物を濾過する。 濾液を３００ｇのシリカカラム中に直接に適用する。 カラムをＤＣＭ／ＴＥＡ ９９：１及び次にＤ ＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ ９４：５：１により溶出する。 溶離剤は、下記化合物IIIの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製４ ：化合物IV 化合物III（１０ｇ，５ｍモル）を１００ｍｌのＥｔＯＨに溶解し、そしてＥ ｔＯＨ中、０．５ＭのＮａＯＨ溶液１０ｍｌの添加により部分加水分解する。 その混合物を、酢酸３００ｍｇ（５ｍモル）を添加することによってわずかに酸性にする。 カルボキシレート基に隣接するＴＭＴ−基を選択的に加水分解する。 ３ ０分後、その混合物を、テトラエチルアミン（ＴＥＡ）０．５ｍｌの添加によりわずかに塩基性にする。 ＥｔＯＨ溶液を、ＥｔＯＨ／水／ＴＥＡ ９０：９：１ により溶出される逆相カラムを用いてＨＰＬＣにより分別する。 溶離剤は下記化合物IVの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製５ ：化合物Ｖ ０，０'−ビス（アミノプロピル）ポリエチレングリコール（９．５ｇ，５ｍ モル、平均分子量１９００）、トリエチルアミン（０．５ｇ，５ｍモル）及び３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．７７ｇ，２．５ｍモル）を、ＤＣＭ１５０ｍｌに溶解する。 その混合物を室温で１時間、撹拌し、半分の体積に濃縮し、そして２００ｇシリカカラムにおいて分別する。 カラムをＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９５．５により溶出し、下記化合物Ｖの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製６ ：化合物VI 化合物IV（３．５ｇ，２ｍモル）及び化合物Ｖ（４．４ｇ，２ｍモル）をＤＣ Ｍ１００ｍｌに溶解し、そしてＤＣＭ５ｍｌ中、４５０ｍｇ（２．２ｍモル）のＤＣＣを添加する。 １時間後、その混合物を濾過し、そして１５０ｇシリカカラムにおいて分別する。 カラムをＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＴＥＡ ９４／５／１により溶出し、下記化合物VIの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製７ ：化合物VII 化合物VI（６．０ｇ，１．５ｍモル）をＥｔＯＨ５０ｍｌに溶解し、そしてＥ ｔＯＨ中、０．５ＭのＮａＯＨ溶液３ｍｌを添加する。 ３０分後、生成物を、溶離剤としてＥｔＯＨ／水／ＴＥＡ ９０：９：１を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製し、下記化合物VIIの構造式により表わされる化合物を付与する：

調製８ ：化合物VIII 化合物VII（４．０ｇ，１ｍモル）を、ＤＣＭ８０ｍｌに溶解する。 ＤＣＭ５ ｍｌ中、メトギシ酢酸無水物３２０ｍｇ（２ｍモル）及びトリエチルアミン２０ ２ｍｇ（２ｍモル）の混合物を添加する。 その混合物を溶離剤としでＥｔＯＨ／ 水／ＴＥＡ ９０：９：１を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製し、下記化合物VIII の構造式により表わされる化合物を付与する：

調製９ ：化合物IX 化合物VIII（４．０ｇ，１ｍモル）及び０，０'−ビス（アミノプロピル）ポリ−エチレングリコール（４．８ｇ，２．５ｍモル、平均分子量１９００）を、 ＤＣＭ１００ｍｌに溶解し、ＤＣＭ５ｍｌ中、２３０ｍｇ（１．１ｍモル）のＤ ＣＣを添加する。 １時間後、その混合物を濾過し、そして溶離剤としてＤＣＭ／ ＭｅＯＨ／ＴＥＡ ９４：５：１を用いで１００ｇシリカカラムにおいて分別し、図５に実質的に図示されるような下記化合物IXの構造式により表わされる化合物を付与する：

５．４

支持体への切断スペーサーの結合スペーサー分子の個々を、たとえばアミド結合を通して支持体表面２１に一端３１で結合する。 アミノ活性化された支持体にスペーサー分子を結合するためには、図７Ａ及び７Ｂにより特定して示されるように、無水グルタミン酸とアミノ基とを反応せしめ、カルボキシレート基を暴露する。 カルボキシレート基をペンタフルオロフェノールによりエステル化できる。 スペーサー分子上の遊離アミノ基は、この活性エステルと結合するであろう。 スペーサー分子、及び固体支持体表面２１への別々の部位でのそれらの結合が図７Ｃに特に示される。 加工におけるこの段階で、ヒドロキシル基は保護されたままである。 オリゴヌクレオチド側員は固体支持体表面２１への結合の前、スペーサー上で予備合成され得るが、好ましくは、それらは、スペーサー分子３０が固体支持体上に結合された後、結合される。

５．５

シグナル応答成分の企画及び結合本発明の１つの特徴は、アッセイ装置の表面上に予定された空間的に取扱いできるパターンで付着される切断スペーサー分子に関係するシグナル応答成分の検出である。 従って、本発明は、シグナル応答成分を結合し、そして切断スペーサー分子に関係するシグナルを検出するための方法、組成物及び装置を提供する。

５．５．１

シグナル応答成分としての金粒子本発明のいくつかの好ましい態様においては、光を反射し、又は散乱する粒子がシグナル応答成分として使用される。 光反射及び／又は散乱粒子は、入射光の反射又は散乱を弾性的に、すなわち光エネルギーを実質的に吸収しないで引き起こす分子又は材料である。 そのような光反射及び／又は散乱粒子は、たとえば金属粒子、コロイド金属、たとえばコロイド金、コロイド非金属ラベル、たとえばコロイドセレニウム、及びラテックス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート又は類似する材料から製造された着色されたプラスチック粒子を包含する。 そのような粒子のサイズは、１ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは５００ｎｍ〜５μ ｍ、及び最とも好ましくは１〜３μｍの範囲である。 より大きな粒子ほど、光散乱の効果を高める。 しかしながら、これは結合された及び大量の溶液粒子の場合、真実であろうから、バックグラウンドはまた、散乱シグナルのために使用される粒子サイズと共に上昇することができる。 直径１ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、最とも好ましくは１〜３ μｍの金属微小球が、本発明の光反射／光散乱態様において現在好ましい。 金属球体はディスクに結合される、切断されているが、まだ分析物−拘束されているスペーサー分子の存在の検出のための便利なシグナル応答成分を供給する。 典型的な材料は、金、銀、ニッケル、クロム、白金、銅及び同様のもの、又はそれらのアロイであり、そして金が現在、好ましい。 金属球体は固体金属であり得、又はプラスチック又はガラスビーズ又は同様のものから形成され、この上に金属が付着されている。 同様に、光反射性金属表面は、異なった組成物の金属微小球上に付着され得る。 金属球体はまた、アロイ又は凝集体でもあり得る。 本発明の切断反射シグナル要素及びアッセイ装置への使用のために適切な金球体は、Aldrich Chemical Company，British Bio Cell International，Nanoprob es，Inc． 及び他から、直径１ｎｍから及び０．５μｍ（５００ｎｍ）〜５μｍ の種々の範囲の直径で容易に入手できる。 本発明における必要に応じて、より小さな又はより大きな直径の金球体を創造することは、当業者の範囲内である。 より小さな球体は、読取りが近視野光顕微鏡、ＵＶ光、電子ビーム又は走査プローブ顕微鏡により行なわれる場合、都合良く使用され得る。 より小さな球体は、より切断できるスペーサーが支持体の一定の領域において識別され得るので、それらの後者の態様において好ましい。 球状粒子が現在好ましいが、非球状粒子もまた、いくつかの態様において有用である。 生物学的用途においては、シグナル応答成分、特に金又はラテックス球体は、 界面活性剤により被覆され、又はそれらが表面電荷を有するように誘導体化されるであろう。 これは、表面による又はお互いによるそれらの粒子の非特異的結合を妨げるために行なわれる。 現在好ましい金球体は、切断スペーサーのシグナル応答末端のチオ基に直接的に結合し、非常に強い結合を生成する。 オリゴヌクレオチド側アーム合成が完結された後、下記にさらに記載されるように、スペーサー分子３０のシグナル応答末端で存在するピリジルジチオ基がジチオエリトリトール又は同様のものにより還元される。 反応は非常に早く且つ定量的であり、そして得られる還元されたチオ基は金に対して高い親和性を有する。 ハロ基は同様に、金に対して高い親和性を有する。 従って、金球体は、液体（ たとえば蒸留水）における懸濁液として、固体支持体２１の表面にその懸濁液を添加することによって広げられる。 金球体は、チオ基を末端に有するスペーサーにより被覆される部位に対してのみ結合し、そして支持体の残りの表面に対しては結合しないであろう。 さらに、本発明の上記態様は単一の切断スペーサーのシグナル応答末端に結合される単一の金属球体に関して記載されて来たが、金が本発明の好ましい態様に使用される場合、多くのスペーサーがその直径に依存して、１つの金球体を結合できることが理解されるべきである。 １〜３μｍの１つの球体が約１，０００〜１０，０００の切断スペーサーにより結合され得ることが推定される。 結果として、アッセイ洗浄の厳格性が、金球体の直径のみならず、また金球体に対する切断スペーサーの相対的密度を変えることによって、いづれかの与えられた回転速度で調節され得る。 従って、一定の金球状体下での実質的にすべての球体が相補的分子により連結される場合、その場合は非常に強い。 スペーサーが一定の金球体下でのみ部分的に固定される場合、前記球体はその球体の半径及び回転数に依存して、残存するか又は除去され得る。

５．５．２

他の光応答性シグナル応答成分本発明の切断シグナル要素及びアッセイ装置のいくつかの他の態様においては、光反射性材料よりもむしろ光吸収性材料がシグナル応答成分として使用され得る。 この態様においては、取扱かわれる位置からの反射光の存在よりもむしろその不在が分析物の捕獲を示す。 このアプローチは、記録できるコンパクトディスクに使用されるアプローチとはいくぶん異なるけれども、それに類似する。 概念的に類似し、そしてＣＤリーダーと適合できるけれども、情報は、標準のプレスＣＤにおけるピットを通しての情報のコードに比較して、記録可能なコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）においては、異なって記録される。 ＣＤ−Ｒにおいては、データ層がポリカーボネート支持体とは異なる。 代わりに、ポリカーボネート支持体は、入射レーザーのための基準整合ガイドとして連続螺旋溝をその上に型押しされている。 有機染料が、データ層を形成するために使用される。 シアニンがそれらのディスクのために使用された最初の材料であったが、金属−安定化されたシアニン化合物が一般的に、“原”シアニンの代わりに使用される。 他の材料は、フタロシアニンである。 １つのそのような金属フタロシアニン化合物は、アメリカ特許第5,580,696号に記載されている。 ＣＤ−Ｒにおいては、有機染料層が、ポリカーボネート支持体と媒体の金属化された反射層、通常２４カラットの金（但し、他方では、銀でもあり得る）との間にサントイッチされる。 情報は、染料層中への“ピット”を選択的に溶融する適切な予備選択された波長の記録レーザーにより記録され−染料に穴を燃焼せしめるよりもむしろ、それは単純にわすかにそれを溶融し、その非半透明化を引き起こし、その結果、読取りレーザービームが、標準のプレスＣＤにおける物理的ピットによってのように、リーダーのセンサーに反射されるよりもむしろ屈折される。 標準のＣＤにおけるように、ラッカー被膜が情報を担持する層を保護する。 ＣＤ−Ｒに使用され得る多くの数の光吸収性染料が本発明のこの態様に使用され得る。 光吸収性染料は、理想的には、光源の波長に対応する波長で、電磁スペクトルからのエネルギーを吸収するいづれかの化合物である。 当業界において知られているように、染料は一般的に、接合された複素環式構造体から成り、次の種類の染料により例示される：アゾ染料、ジアゾ染料、トリアジン染料、食品着色剤又は生物学的染料。 特定の染料は次のものを包含する：クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染料(Biorad Labs，Richmond，Calif.);Reactive Red ２( Sigma Chemical Company，St．Louis，MO)；ブロモフェノールプルー(Sigma)； キシレンシアノール(Sigma)；及びフェノールフタレイン(Sigma)。 Aldrich Chem ical Company，Inc.，(Milwaukee，Wis.)により出版されたFloyd J． GreenによるSigma-Aldrich Handbook of Stains，Dyes and Indicatorsは、他の染料についての多くのデータを提供する。 それらのデータによれば、適切な光吸収性質を有する染料は、光源により放される波長と一致するよう選択される。 それらの態様においては、反射性粒子よりもむしろ、不透明染料を含む粒子が光応答シグナル成分として使用され、それにより、コードされた情報の相を逆にする。 ラテックス球体は、直径１〜１００μｍ、好ましくは１０〜９０μｍ及び最とも好ましくは１０〜５０μｍであり得る。 染料は、ディスク支持体の金属層からのレーザー光の反射を妨げるであろう。 さらなる他の態様においては、シグナル応答要素は、入射光に応答する螢光剤、たとえばフルオレセイン、ヨウ化プロピジウム、又はフィコエリトリン、又は化学発光剤、たとえばルシフェリン、又は可溶性螢光基質を不溶性形に分解するインジケーター酵素であり得る。 この態様において有用な他の螢光染料は、テキサスレッド、ローダミン、グリーン螢光タンパク質及び同様のものを包含する。 螢光染料は、ブルーレーザーが広く利用できる場合、特に有用であることがわかっている。 本発明の光反射、光散乱、及び光吸収態様は、切断シグナル要素のパターン化された付着のための支持体として円形アッセイ装置を選択的に使用する。 特に好ましい態様においては、アッセイ装置は、存在する光学ディスクリーダー、たとえばコンパクトディスク（ＣＤ）リーダー又はディジタルビデオディスク（ＤＶ Ｄ）リーダーと適合でき、そして従って、好ましくは、約１２０ｍｍの直径及び約１．２ｍｍの厚さのディスクである。 ディスクはまた、環状でもあり得る。 しかしながら、本発明の切断反射シグナル要素は、環状でなく、そして実質的に平面である支持体上に空間的に取扱いできるパターンで付着され、そしてそのようなアッセイ装置は支持体の形状に適切に適合される検出器により必ず読取られることが理解されるであろう。 光学ディスク上で空間的に識別され得る最大数の切断シグナル要素、又はバイオビットは、対物レンズの波長及び開口数の関数である。 光学記憶ディスク、たとえばＣＤ−ＲＯＭ，ＷＯＲＭ（Write Once Read Many）ディスク、及びマグネト−光学ディスクのすべての種類における記憶容量を高めるための１つの既知の手段は、光学記憶ディスクのデータトラックを照射する二極管レーザーにより放される光の波長を下げることである。 より低い波長は、ディスク上の小さなデータスポットの識別、すなわち高い分解能、及び従って、増強されたデータ密度を可能にする。 現ＣＤ−ＲＯＭは、７８０ｎｍの波長を有するレーザーを使用する。 現ＤＶＤは、６３５〜６５０ｎｍの波長を有するレーザーを使用する。 たとえば青色光（４８１ｎｍ近く）を放す新しい二極管ダイオードは、本発明の単一アッセイ装置ディスク上で空間的に取扱われ得るシグナル要素の数を高めるであろう。 青色放射線を達成するためのもう１つの手段は、非線状光学材料による赤外線レーザーの周波数の倍増による。 現ＣＤ−ＲＯＭリーダーは、反射読取り及び透過読取りの両者を使用する。 両データが、本発明と適合できる方法に接近せしめる。 金粒子は、反射タイプのＣ Ｄ−ＲＯＭリーダーのためのシグナル応答成分としての使用のために特に適切である。 光吸収性染料は、透過タイプのリーダー、たとえばアメリカ特許第４，０ ３７，２５７号に論ぜられるリーダーのためにより適切である。

５．５．３

他のシグナル応答成分本発明の切断スペーサーへの適合のために適切なシグナル応答成分が、光反射又は光吸収性金属粒子又は染料に限定されないことは、当業者に明らかであろう。 適切なシグナル応答成分は、分光分析、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学又は化学的手段により検出できるいづれかの組成物を包含するが、但しそれらに限定されない。 いくつかの好ましい態様においては、適切なシグナル応答成分は、比色ラベル、たとえばコロイド状金又は着色されたガラス又はプラスチック（たとえば、 ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビース、ラベルされたストレプタビジン接合体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（たとえばDynabeads

^T

^M ）、放射性ラベル（たとえば

³ Ｈ，

¹²⁵ Ｉ，

³⁵ Ｓ，

¹⁴ Ｃ又は

³² Ｐ）、及び酵素（ たとえばホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬ ＩＳＡに通常使用される他のもの）を包含する。 シグナル応答成分の多くの変動が本発明の切断スペーサーに適合され得ることは当業者に明らかであろう。 たとえば、多くの特許は、生物学的アッセイにおいて検出できるシグナルを生成するための多くの種類の技法の広範な教授を提供する。 そのようなシグナル応答成分は一般的に、本発明のいくつかの態様への使用のために適切である。 限定的ではないが、次のものは、本発明のいくつかの態様のために適切ないくつかのシグナル応答成分を教授するアメリカ特許の列挙である：アメリカ特許第3,646,346号、放射性シグナル生成手段；アメリカ特許第3,6 54,090号、第3,791,932号及び第3,817,838号、酵素結合のシグナル発生手段；アメリカ特許第3,996,345号、螢光剤−消光剤関連シグナル発生手段；アメリカ特許第4,062,733号、螢光剤又は酵素シグナル発生手段；アメリカ特許第4,104,029 号、化学発光シグナル発生手段；アメリカ特許第4,160,645号、非酵素的触媒発生手段；アメリカ特許第4,233,402号、酵素対シグナル発生手段；及びアメリカ特許第4,287,300号、酵素アニオン性電荷ラベル。 上記に引用されたすべてのアメリカ特許は、引用により本明細書に組込まれる。 他のシグナル発生手段はまた、たとえばアメリカ特許第5,021,236号及び第4,4 72,509号（両者とも引用により本明細書に組込まれる）において、当業界に知られている。 金属キレート複合体が、切断スペーサー分子に又はスペーサー分子に側員として結合される抗体にシグナル発生手段を結合するために使用され得る。 抗体に結合されるＤＴＰＡのような有機キレート化剤を用いる方法は、アメリカ特許第4,472,509号（引用により本明細書に組込まれる）に開示される。 さらに他の態様においては、磁気球体が反射性球体の代わりに使用され得、そして十分な強さのものである磁場によりディスクを処理することによって配向され得る。 空の部位は存在するいづれの磁気材料も有さないので、残存するスペーサー分子の位置が検出され得、そしてその情報が試験サンプルにおける前記材料を同定するために処理される。 さらに、反射又は磁気材料が、シグナル発生手段を供給するために、サンブルのハイブリダイゼーションの後に添加され得る。 常磁性イオン、たとえばクロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II ）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II） 、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）及びエルビウム（III）が、シグナル発生手段として使用され得、そしてガドリニウムが特に好ましい。 他の内容、たとえばＸ−線イメージングにおいて有用なイオンは、 ランタニウム（III）、金（III）、鉛（II）及び特にビスマス（III）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。 そのようなラベルを検出するための手段は当業者に良く知られている。 従って、たとえば放射性ラベルは写真フィルム又はシンチレーションカウンターを用いて検出され得、螢光マーカーは放された光を検出するために光検出器を用いて検出され得る。 酵素ラベルは典型的には、酵素に基質を供給し、そして基質に対する酵素の作用により生成される反応生成物を検出することによって検出され、そして比色ラベルは着色されたラベルを単に可視化することによって検出される。 コロイド状金ラベルは、散乱された光を測定することによって検出され得る。 好ましい非反射性シグナル発生手段は、アビジン又はストレプタビジン化合物を用いて検出され得るビオチンである。 そのようなラベルの使用は、当業者に良く知られており、そしてたとえばアメリカ特許第3,817,837号；第3,850,752号； 第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；及び第4,366, 241号（それらは、引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。

５．６

切断スペーサー側員の結合切断スペーサーの側員は、分析物特異性を付与する。 好ましい態様においては、その側員はオリゴヌクレオチドである。 オリゴヌクレオチドは、アッセイ装置（ディスク）の誘導体化された支持体へのスペーサーの結合の前、その切断スペーサーに対して段階的合成により付加され得る。 他方では、十分に調製されたオリゴヌクレオチドが、アッセイ装置支持体へのスペーサー分子の結合の前、そのスペーサー分子に直接的に、単一の段階で付加され得る。 そのような情況において、スペーサー分子は、２つの保護されたヒドロキシル基の代わりに、保護されたアミノ−及び／又はチオール基を有する。 １つの保護基は除去され、そしてたとえば、一端でイソシアネート基を有するオリゴヌクレオチドが付加される。 第２のオリゴヌクレオチドは、切断スペーサー分子に第２の側員として同様にして結合される。 他方では、側員のオリゴヌクレオチドは、十分に調製されたオリゴヌクレオチドを用いて一段階で、又は段階的な付加により、支持体上への切断スペーサーの結合の後に合成され得る。 後者の方法は、単一のアッセイ装置支持体上に異なった分析物特異性を有する多数のアッセイを組込む場合、好ましいことが予測される。 側員が支持体上に前もって固定された切断スペーサーに、一段階で又は段階的付加により結合される一般的な方法は、本明細書においては、スタンピングと呼ばれる。 ホスホラミジット化学が、他の化学も使用され得るが、オリゴヌクレオチド側員を調製するために好ましい。 従来の固相合成においては、オリゴヌクレオチドは、モノマーホスホラミジットを用いて調製される。 従来の合成の後、オリゴヌクレオチドは樹脂性支持体から分離され、そして反応体、たとえば溶媒及び未反応モリヌクレオチドを除去するために、及び不完全な合成に起因する短いオリゴヌクレオチドを除去するために、液体クロマトグラフィーにより精製される。 ある場合、オリゴヌクレオチドはそのようにして精製され得ず、そして短いオリゴヌクレオチドが所望するオリゴヌクレオチドを汚染する。 これは所望しないハイブリダイゼーションを導びく。 所望する生成物に関してわずか１つのヌクレオチドを欠いているオリゴヌクレオチド汚染物は、それらの結合が正しい配列を有するオリゴヌクレオチドの結合に対して強度においてほとんど等しいので、対処するのに最とも困難である。 本発明の切断反射シグナル要素への側員としての使用のためのオリゴヌクレオチドの調製においては、その合成におけるトリマー又はテトラマーホスホラミジットの使用が、好都合であり、且つ好ましい。 テトラマー出発材料を使用すれば、１２−マーが３段階で合成され得る。 不完全合成の避けられない生成物は、この場合、それぞれ１又は２の合成段階の失敗を示す８−マ及び４−マーであろう。 ８−マーの結合は１２−マーの結合よりもより弱いので、それらの汚染物は、 いづれの有意な妨害をも引起こさない。 アッセイ装置支持体の表面上に固定されるスペーサーへの段階的な付加による切断スペーサーへの側員の適用においては、オリゴヌクレオチドは好都合には、 固体支持体上でのスペーサー分子分布に対して相補的であるプリントスタンプに基づいての所望するオリゴヌクレオチド化学溶液の形成を利用する化学プリントにより切断スペーサーに結合され得る。 プリント化は急速且つ経済的である。 それはまた、非常に高い分解能を提供することができる。 単純なプリント方法は、 たとえばScience，Vol.269，pg664-665(1995)に記載されている。 このプリント方法においては、保護基の１つがアッセイ装置支持体上のスペーサー分子から除去される。 所望するオリゴヌクレオチドが、スタンプ上の特定の予備決定された位置で特定のオリゴヌクレオチドを供給し、そしてスタンプ表面がスペーサー被覆された支持体表面に適用され、それにより、スペーサー分子が存在する別々の領域に所望するオリゴヌクレオチドを付着せしめる態様でスタンプ表面に適用される。 続いて、第２の保護基が除去され、そして異なったオリゴヌクレオチドが化学スタンピングにより再び、活性化された領域に適用される。 それらの段階は、図８Ａ，８Ｂ，９Ａ，９Ｂ，１３及び１４に特に例示されている。 他方では、それぞれのオリゴヌクレオチドがインキージェットプリンにより、 たとえばアメリカ特許第４，８７７，７４５号及び第５，４２９，８０７号（それらの開示は引用により本明細書に組込まれる）に記載される方法により適用され得る。 それらの直接的なプリント法のいづれかは急速である。 トリマー又はテトラマーがオリゴヌクレオチドを構築するために使用される場合、２回のプリントサイクルが６−マー〜８−マーの整列したすべての可能なオリゴの創造を可能にする。 すべての８−マーを含むためには、アッセイ装置は２５６×２５６の異なったオリゴを含むべきである。 さらなるプリントサイクルは、オリゴヌクレオチドの長さを急速に長くするが、但しすべての組合せは合理的にサイズ分けされた表面上に適合できず、そしていくつかのアッセイ装置がすべてのそのような組合せを表わすために使用されるべきである。 本発明において有用な他のプリント法、すなわち凹形相捕的プリント法が図１ ５に示されている。 わずか２つの段階が示されているが、非常に多数のオリゴヌクレオチドが同時にプリントされ得る。 オリゴヌクレオチドの混合物が合成され；たとえば１２−マーが個々の段階において４種のホスホラミジットの混合物を用いて合成され得、そして合成の最終段階として、非常に長いスペーサーが個々のオリゴヌクレオチドに結合される。 他の端上に、反応性基、たとえばイソチオシアネートが供給される。 オリゴヌクレオチドの混合物が、定義された部位で相補的なオリゴヌクレオチドを結合するであろうスタンプと共にインキュベートされる。 プリント工程の間、スペーサーが支持体と結合するであろう。 二重ヘリックスはたとえば加熱することによって変性され、スタンプ及び支持体が分離され得る。 オリゴヌクレオチドの合成のための及び特に、固体表面上でのオリゴヌクレオチドの空間的に取扱いできる合成のための多くの他の方法が開発されており、そして当業者により知られている。 本発明において特に有用であることがわかっている方法は、アメリカ特許第4,542,102号；第5,384,261号；第5,405,783号；第5 ,412,087号；第5,445,934号；第5,489,678号；第5,510,270号；第5,424,186号； 及び第6,624,711号（それらの開示は引用により本明細書に組込まれる）にさらに記載される。 本発明に有用であることがわかっている他の方法は一般的に、（１）段階的光化学合成、（２）段階的ジェット化学合成、及び（３）予備調製されたオリゴヌクレオチドの固定化を包含する。 また、ガラス細管アレイが使用され得る。 この後者の場合、合成は、自動化されたＤＮＡ合成機において行なわれるように、すべての細管において平行して実施され得る。 オリゴヌクレオチド側要素は標準のデオキシリボヌクレオチドホスホラミジットを用いて合成されるＤＮＡオリゴヌクレオチドとして本明細書において記載されて来たが、一定のオリゴヌクレオチド類似体、たとえばピラノシル−ＲＮＡ(E ．Szathmary，Nature 387:662-663(1997))及びペプチド核酸が天然のオリゴヌクレオチドよりも高い適合度のより強い複合体を形成することは知られている。 従って、それらの人工類似物は、オリゴヌクレオチド側要素の構成に使用され得る。オリゴヌクレオチド側員は相補的オリゴヌクレオチドに結合するより適合され、そして従って、核酸プローブアッセイに直接的に有用であると共に、他のアッセイにおいて有用な特定の結合対メンバーをそれらのオリゴヌクレオチド側員に接合することは、本発明のさらなる観点である。それらの後者の態様においては、側員オリゴヌクレオチドへの結合対メンバー、たとえば抗体の非共有結合は、側員オリゴヌクレオチド、及び結合対メンバーに共有結合されるオリゴヌクレオチドの相補性を通して仲介される。超分子構造の非共有組合せアセンブリーを実現するためへの相補的核酸分子の使用は、１９ ９４年１０月３１日に出願された継続出願のアメリカ特許出願番号08/332,514号、１９９５年４月１９日に出願されたアメリカ特許出願番号08/424 ,874号；及び１９９６年３月２９日に出願されたアメリカ特許出願番号08/627,6 95号（それらは、引用により本明細書に組込まれる）にさらに詳細に記載される。図３Ａ〜３Ｃに図示され，るように、オリゴヌクレオチド側員３４ａ，３４ｂ ，３５ａ及び３５ｂは、イムノアッセイを可能にするために、修飾された抗体３ ８ａ，３８ｂ，３８ｃ及び３８ｄに非共有結合される。側員への修飾された抗体の非共有結合は、側員オリゴヌクレオチド、及び抗体に共有結合されるオリゴヌクレオチドの相補性を通して仲介される。抗体は図３に例示されているが、抗体フラグメント及び誘導体、たとえばＦａ ｂフラグメント、一本鎖抗体、キメラ抗体及び同様のものもまた有用であることがわかっていることは、理解されるのであろう。一般的に、この態様において有用な結合対メンバーは一般的に、それぞれ抗原、リガンド、等に結合するであろう、抗体、受容体、等により例示される、第１及び第２の特異的結合対の第１のメンバーであろう。

５．７

アッセイ装置上への切断反射シグナル要素のパターン化された付着アッセイ装置（ディスク支持体）上での分析物−応答切断反射シグナル要素の空間的分布が２つのレベルで、すなわち切断スペーサー自体を結合するレベルで及びさらに、スペーサー側員を結合するレベルで決定され得ることは、上記議論から理解されるであろう。分析物感度の空間的分布がまた、前記２つの組合せにより決定され得ることは、さらに理解されるであろう。第１のそのような段階における切断スペーサーの分布を調節するための１つの方法は、親水性及び疎水性ドメインを有する支持体のパターン化を通してである。最初に、疎水性表面が活性化され、そして親水性表面が不活性化され、その結果、疎水性未反応網状構造により分離される親水性及び機能的スポットマレイが創造される。支持体材料がガラス、マイカ、珪素、親水性プラスチック又は類似材料である場合、その全表面がまず、酸又は塩基による処理により反応性にされる。スポット間の中間の空間がシラン化される。これは、スタンプとしてグリッドを用いることによって最良に行なわれる。他方で、支持体が疎水性プラスチックである場合、それはアンモニアの存在下でプラズマ処理により活性化され、そして次に、親水性支持体としてシラン化され得る。所望する部位でレジストを除去するために石版又は機械的プリントに関してレジスト材料を使用する場合、活性化がそれらの部位で実施され得る。反応性スポットに、親水性スペーサー、たとえばポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）が好ましくは結合される。支持体かアミノ又はチオール基を含む場合、Ｐ ＥＧは、アミノ又はチオール基と結合することが知られている種々の官能基により他の端で予備活性化され得る。それらは、イソシアネート、マレイミド、ハロゲノアセチル及びスクシンイミドエステル基を包含する。フォトレジストはまた、切断シグナル要素の付着をパターン化するために有利に使用され得る。そのレジストは、加工の間、入射レーザー光により部分的に分解され、そしてそれらの領域から溶解され得る。暴露されたプラスチック又は金属化されたプラスチックは、化学的に処理され、たとえばアンモニアプラズマによりアミノ化される。レジストが除去された後、スペーサー、側員、及びシグナル成分が、必要な場合、処理された領域に連結される。マスターディスクのパターン化のためへのフォトレジストの使用は、コンパクトディスク加工業界において良く知られている。あるいは、レジストを使用する代わりに、小さな穴及び他の必要な特徴を含む固体マスクが、アンモニアプラズマ処理の間、使用され得る。前記穴は、約１〜３μｍの直径を有する。穴はマスクにおいて環状に位置し、螺旋及び環状物の組合せである螺旋トラック又はパターンを形成する。マスクは金属又はプラスチックであり得る。いくつかの金属、たとえばアルミニウム、ニッケル又は金が使用され得る。ポリカーボネートは、それが形状を十分に保持するので、好ましいプラスチックである。しかしながら、プラスチックはアンモニアプラズマと反応性であり、そして従って、プラスチックマスクを用いるための好ましい方法は、蒸発、スパター又は当業界において知られている他の方法により、プラスチック上に金属層を付着することを包含する。穴は、レーザーにより、マスクにおいて製造され得る。当業者は、薄い金属又はプラスチックプレートに１度に、１０００個の１μｍサイズの穴を創造することが可能であることを理解するであろう。他方では、穴は半導体産業において知られている従来の方法を用いることによってエッチングされ得る。シグナル要素の付着をパターン化するためへのマスクアプローチにおいては、マスクは支持体に対して圧縮され、そしてアンモニアプラズマが適用される。マスクは反復して使用され得る。評価されるべきことには、分析物感度の空間的分布はまた、スペーサー側アームのパターン化された適用により付与され得る。上記プリント方法に関しては、１つの可能なオリゴヌクレオチドスタンプの略図が図１３に示されている。スタンプは、合成されるオリゴヌクレオチドの所望する構築ブロックを供給するために使用されるであろう一定の化学物質により満たされる穴を有する。図１３においては、個々の横列は同じ化学物質により満たされ、そして従って、４種の異なった化学物質が、図１３に与えられる例における１つのスタンピングサイクルの間、使用され得る。商業的なシステムにおいては、横列の数は相当に多く、典型的には６４〜２５６であるが、但しより少ない数及びより多くの数の横列が特定の場合、使用され得る。線状スタンプは、一定サイズのすべての可能なオリゴヌクレオチドがアッセイ装置支持体上に加工される予定である場合、好都合である。この場合、与えられた一組のオリゴヌクレオチド構築ブロックのすべての可能なヘキサマー組合せが調製され得る。たとえば、トリマーホスホラミジットは、 ６４−列の線状スタンプを用いることによって、２回の反応サイクルにより形成され得る。 ６４の異なったトリマーホスホラミジットの個々は、１つの列の穴中に供給される。ホスホラミジットをプリントした後、酸化剤、開除剤及びキャップ試薬がプリントされる。それらの化学物質は個々のスポットで同じものであるので、スタンプは平らなプレートであり得、又は完全な支持体が試薬溶液中に単に浸漬され得る。支持体が９０°回転され、そして同じサイクルが反復される。この場合、トリマーのすべての可能な組合せが加工される。同様に、いづれかの組のオリゴヌクレオチドアミジットのすべての組合せが加工され得る。図１４においては、４種の異なったオリゴヌクレオチドアミジットのすべての可能な組合せの加工を示す例が存在する。最初のプリントサイクルの後、個々の水平列におけるすべてのスポットは、同じオリゴヌクレオチドを含むが、しかし個々の列は異なったオリゴヌクレオチドを有する。それらのオリゴヌクレオチドフラグメントは、図１４においては、数字１，２，３及び４により示されている。スタンプが９０°回転され、そしてプリントサイクルが反復される場合、４種のオリゴヌクレオチドのすべての組合せが形成される。前述の直交プリント方法は、ディスクの態様における本発明のシグナル要素の生成において特に好都合である。直交プリントは、環状パターンでオージオ又はＣＤ−ＲＯＭコンパクトディスク上に配置される情報に類似する、 同心円のパターンでのスペーサー分子のアレイの分布を促進する。直交プリント方法の１つの好ましい変法は、反対のキラリティーを有する２組の螺旋スタンプの超配置を用いる。スタンプの配置は、約１μｍ内で正確であるべきである。これは２〜４の案内スパイク穴対を用いて、又は光電子工学的に案内されたマイクロトランスレーターにより機械的に達成され得る。除去しうる反射被膜が支持体及びスタンプの２ つの垂直な側面上に付着され、そしてそれらの相対的位置決定が干渉計により測定される。支持体及びスタンプはまた、光検出器中の光路のために順序よく完全に配置されるべきである一対のマイクロプリズムを有することができる。図１１Ａ〜１１Ｇは、環状、平面ディスク支持体上の切断反射シグナル要素の空間的にアドレス可能な付着の種々の有用なパターンを示す。図１１Ａは特に、 切断スペーサーの位置が測定され得る、ディスク支持体上にコードされるアドレスラインを同定する。図１１Ａにおいては、切断スペーサー分子は、環状トラックで付着される。図１１Ｂは、切断シグナル要素の螺旋付着を示し、そして特に、回転駆動手段に従事するよう特別に適合されたディスク環の中央の中空部分を同定する。図１１Ｃは、中央トラック上の解釈ソフトウェアの同時コードと共に、複数サンプルの同時アッセイのために適合できるパターンでの切断シグナル要素の付着を示す。図１１Ｄは、アッセイ装置支持体か個々のアッセイセクターを分離するためにさらにマイクロ加工され、それにより、サンプルの混合を伴わないで、サンプル添加の間、アッセイ装置の回転を可能にする態様を図示する。図１１Ｅは、アッセイ装置支持体が、アッセイ装置の回転の間、一方向性のサンプル流を強制するためにさらにマイクロ加工されている態様を図示する。固体表面をマイクロ加工するための技法は当業界において良く知られており、そして特に、アメリカ特許第5,462,839号；第5,112,134号；第5,164,319号；第5,278,0 48号；第5,334,837号；及び第5,345,213号（それらは引用により本明細書に組込まれる）に記載される。図１１Ｆは、それぞれ５０の異なった分析物のための２０のサンプルをアッセイするために適切な螺旋機構での切断シグナル要素の付着を示す。図１１Ｇは、 反対の方向性又はキラリティーの螺旋アームを有する螺旋パターンの超配置により創造される直交的に交差するパターンを示す。アッセイ装置の表面上での切断反射シグナル要素又はバイオビットの空間的分布は、分析物濃度の定量化を促進するよう企画され得る。従って、いくつかの態様においては、分析物捕獲が定量化のために用いられる。 １つの実施においては、アッセイ装置は、個々の選択された分析物のための均等な密度のバイオビットによりパターン化される。試験サンプルは、ディスクの中央のディスク上に導入される。回転力を適用することによって、試験サンプルは末端の方に放射状に拡散する。拡散の工程において、分析物は切断シグナル要素のそれぞれの同起源の側要素により捕獲され、サンプル前部での分析物の濃度を低める。入射濃度に対して十分な密度のバイオビットにより、すべての分析物は、サンプル前部がアッセイ装置の周囲に達する前に捕獲される。次に、個々の分析物の濃度が、サンプル導入部位から最とも遠くにある陽性バイオビットの位置に従って、決定され得る。より有力な範囲の分析物濃度が、より多くのバイオビットが検出される分析物に専念される場合、検出できるであろうが認識されるであろう。しかしながら、 バイオビットの密度は一定である必要はなく、そしてバイオビットの線状又は指数的に変化する密度が、より有力な範囲の濃度検出を変更するために、ディスクの中央から周囲に測定されるように、使用され得ることがさらに認識されるであろう。本発明の他の態様及び観点においては、選択された分析物のための異なった親和性を有するバイオビットが、類似する効果、すなわち有力な範囲の濃度検出を高めるためにアッセイ装置に結合され得る。他の幾何学が濃度情報を伝達するために使用され得ることが、さらに予期される。図１６は、単一サンプルがアッセイ装置の４つの明確なセクターに同時に向けられる１つの幾何学を示す。前記４つのセクターにおけるバイオビットの密度、バイオビットの親和性、又はバイオビットの両密度及び親和性のいづれかが異なる場合、有力な範囲の濃度が、サンプル適用部位から最とも遠位の陽性バイオビットの個々のセクターにおけるその位置を検出することによって決定され得る。他の態様においては、平衡アッセイが企画される。従って、濃度が、全ディスクをサンプリングし、そして分析物当たりの陽性バイオビットの百分率を決定することによって決定される。それらの態様の個々においては、一般的に多数のバイオビットが陽性及び陰性対照の検出に向けられる。他の態様においては、複数の異なった分析物に対して特異的な切断反射シグナル要素（バイオビット）が、多くの異なった型式でパターン化される。たとえば、明確な特異性のバイオビットがディスクの個々のセクターにおいて混合される。他方では、それらは異なったセクター中に分離され得る。特定のバイオビットを前もって定義された位置にパターン化する能力、及び検出器、たとえばＣＤ−ＲＯＭリーダーによりバイオビットの正体を解釈する能力は、柔軟な企画を可能にする。当業者は、そのパターンの企画が異なった濃度の既知の分析物を含む試験サンプルを用いて、試験され、そして調節されるべきであることを認識する。

５．８

他のアッセイ装置幾何学ウィルスは、典型的には０．５μｍ以下の直径を有するほぼ球状の粒子である。細菌は通常、球状又は棒状のいづれかであり；それらの最大直径は通常、鞭毛及び他の類似する外部繊維を含まないで、２μｍ以下である。それらの病原体は、本発明の切断シグナル要素に使用される金球体によりいく分小さいか、又はほぼ同じサイズである。従って、上記切断シグナル要素の２つの側員との同時のそれらの相互作用は、立体的に阻害され得る。従って、他の幾何学が切断スペーサーを全く不要にする。 １つの分析物特異的側員がアッセイ装置の支持体表面に、空間的にアドレス可能な態様で直接的に結合される。選択された分析物の第２部位に対して特異的な第２側員がシグナル応答成分に直接的に結合される。好ましい態様においては、その成分は金球体である。この他の幾何学においては、分析物の認識が次の式：支持体−第１側員一分析物−第２側員−シグナル応答成分の直接的なサンドイッチを創造する。この幾何学は、切断スペーサーのための式における“ｍ”がゼロである制限事例であると言われる。この特定の幾何学はまた、図１７に示されるように、核酸ハイブリダイゼーションの検出において有であることがわかっている。この他の幾何学においては、シグナル応答成分が反射性である場合、そのコード情報は前で示された幾何学における情報に類似し、すなわち分析物の存在は反射により表示される。他方では、シグナル応答成分が、たとえば染料の組込みにより不透明である場合、そのコードは逆にされ、すなわち分析物の存在は装置支持体の金属層からの反射の不在により表示される。磁気プラスチック球体は、この他の幾何学において特定の利点を提供する。それらは磁気粒子を内部に含むので、それらはラテックスを球体よりも低い透明性である。さらに、磁気は、それらの密度が水の密度に近く、そして遠心分離力が無効果であることがわかっているので、たとえばラテックス球体のように、除去するのが困難である弱く結合された球体を除去するために使用され得る。この他の幾何学のさらなる変異体は、図１８に示されるような反射アッセイにおける凝集の利点を取る。この変法においては、シグナル応答成分は好ましくは微小球である。それらの微小球は比較的小さく（３０〜６００ｎｍ）、その結果、１つのみでは、光を効果的にブロックしない。本発明は次の非制限的な例によりさらに良好に理解され得る。

６ ．

例１：核酸ハイブリダイゼーションアッセイの特異性の上昇直接的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、切断シグナル要素の側要素は、サンプルに検出される、選択され、予定された核酸上の明確な部位とハイブリダイズするよう企画されているオリゴヌクレオチドである。この方法論の多くの用途のために、単一のミスマッチのヌクレオチドさえ有するサンプルオリゴヌクレオチドとの交差反応性は最少にされるはずである。特に、点突然変異の検出、たとえば乳癌及び卵巣癌の素因を有するＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子における点突然変異の検出のためへの本発明の切断反射シグナル要素の使用のために適合された核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、単一のミスマッチのヌクレオチドを含む核酸サンプル間を識別することができるはずである。切断シグナル要素のオリゴヌクレオチド側要素が長いほど、及び従って、側要素と核酸サンプルとの間で相補的である配列が長いほど、ミスマッチの存在下でさえ、ハイブリダイゼーションの強さは適度に高いので、ミスマッチされたサンプルを誤って認識する可能性は高くなる。従って、ミスマッチされた核酸配列の誤った認識を減じるための１つの手段は、側要素オリゴヌクレオチドの長さを減じることである。特異性は、側−アームを８−マー又はさらに６−マーに短くすることによって高められる。それらは、 洗浄の強度、すなわち当業界において良く知られている条件に依存して、室温でまだ、ハイブリダイズするであろう。ミスマッチされたオリゴヌクレオチドは、 対合のために５個又はそれよりも少ないオリゴヌクレオチドを使用し、そして室温で非常に不安定な結合を形成するであろう。しかしながら、この解法は、次のそれ自体の問題を提供する：認識のために使用される全体的に比較的短い長さ、すなわち１２〜１６個のヌクレオチドは、切断されたシグナル要素のシグナル応答成分を抑制するために必要とされる、ハイブリダイゼーションの同時に減じられた全体の長さを導びく。図２Ｅ〜２Ｆに示されるようなリガーゼの使用は、この問題を一部解決する。連結は、より強い結合を提供するのみならず、また選択性を確保するようさらに作用するであろう。なぜならば、ＤＮＡリガーゼは、オリゴヌクレオチドの末端近くにミスマッチが存在する場合、オリゴヌクレオチドを連結しないであろうからである。オリゴヌクレオチドは短いので、ミスマッチされた塩基対は受容されない。リガーゼは、 オリゴヌクレオチドの適合のために非常に厳密な二重チェックとして作用する。他の及び相補的な解決法は、切断シグナル要素の側要素に対するハイブリダイゼーションのために利用できる試験サンプル配列を構造的に短くするために図２ Ｄ〜２Ｅに示される三成分認識原理を使用する。可溶性の特異性−増強オリゴヌクレオチド、たとえばサンプルオリゴヌクレオチドの中央部分に対して相補的である８−マーのオリゴヌクレオチドが、流体サンプルとアッセイ装置とを接触せしめる前、サンプル溶液に添加される。この８−マーは、この試験条件下で十分にハイブリダイズする。切断シグナル要素の側要素が予備形成された複合体のすぐ近くで６個のヌクレオチドを認識する。連結は、選択性を確保し、そしてまた、強い結合を提供するであろう。リガーゼは、オリゴヌクレオチドの末端近くにミスマッチが存在する場合、オリゴヌクレオチドを連結しないであろう。オリゴヌクレオチドは短いので、ミスマッチされた塩基対は許容されない。リガーゼは、オリゴヌクレオチドの適合のために非常に厳密な二重チェックとして作用する。試験サンプルに添加される、８−マーとして本明細書において示される可溶性の特異性−増強オリゴヌクレオチドは、ミスマッチが側要素への結合のために最とも好ましくないであろうサンプル末端近くにその可能性あるミスマッチを位置決定するよう企画され得る。さらに、リガーゼの添加は共有ループを確保するので、洗浄の厳格性がカオトロピック剤の添加により、及び／又はいづれかの任意のオリゴヌクレオチドを除去するために加熱することによって、高められ得る。しかしながら、側要素のために適切であり、且つその要素に正しく結合することができる“阻止された”サンプルオリゴヌクレオチドは、介在する８−マー配列を伴わないで、お互いに対して直接的に結合される必要な末端ヘキサヌクレオチド配列を有するサンプル核酸により模倣され得る。図２Ｄに示されるように、第１の側要素オリゴヌクレオチド配列及び第２の側要素オリゴヌクレオチド配列から同等にして得られた配列を有する１０−マーのサンプルへのさらなる添加は、本発明のアッセイ装置との接触に基づいてそのような結合を阻止するであろう。特異性−増強可溶性オリゴヌクレオチドの組合せ８＋１０＋８が、現在好ましいが、しかし他の組合も、たとえば７＋９＋７及び８＋８＋８も使用され得る。特異性を高めるためのさらなる方法は、弱く結合されたプローブを除去するために広範な洗浄を可能にする、環化されたオリゴヌクレオチドが連鎖される、いわゆる“南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）”プローブの使用を包含する。南京錠プローブは、相補的オリゴヌクレオチドと単一のミスマッチオリゴヌクレオチドとの間で５０：１の識別性を達成することができ（Ｎｉｌｓｓｏｎなど．，

Ｓｃｉｅｎ

ｃｅ ２６５：２０８５（１９９４））、ところが従来のプローブによれば、この比は典型的には、２：１〜１０：１の間である。下記配列を有するオリゴヌクレオチド側員を、切断スペーサー分子による結合部位（５'末端又は３'末端）に依存して、個々の側員が末端チオ（又は脂肪族アミノ）基を含むよう自動合成により調製する： 切断スペーサー分子は、上記の保護されたヒドロキシ基の代わりに２種の脂肪族アミノ基により合成され、そして１つの基はモノメトキシトリチル（ＭＭＴ、 酸不安定性）により保護され、そして他の基はフルオレニルオキシカルボニル（ ＦＭＯＣ、塩基不安定性）により保護されている。 ＦＭＯＣ基の除去の後、アミノ官能基を、水性条件下で、４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクローヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＭＣ）と反応せしめる。 チオール誘導体化されたＩａをスペーサー分子に添加し、そしてスペーサー分子に結合せしめる。 続いて、ＭＭＴを酢酸による処理により除去し、そして緩衝液（pH8）による洗浄の後、ＳＭＣＣを添加し、そしてオリゴヌクレオチドをスペーサー分子と結合せしめる。 上記で調製されたスペーサー分子をポリカーボネート支持体に結合せしめる。 ５'−GCCCACACCGCCGGCGCC−３'を含む試験サンプルを調製し、そして側員Ｉ ａ及びＩｂのＴｍに近い温度で、切断シグナル要素と接触せしめる。 サンプル溶液の温度を、前記Ｔｍよりも約２０℃高い温度に加熱する。 続いて、シグナル要素を０．１Ｍの弗化ナトリウム溶液により処理し、そして洗浄する。 スペーサー分子は表面シグナルに結合されたまま存続し、そして５'−GCCCACACCGCCGGCGCC −３'の存在を確かめる。 前述の方法は、それぞれ、側員IIａ及びIIｂ，IIIａ及びIIIｂ、並びにIVａ及びIVｂを組込むスペーサー分子を用いて、 ５'−GCCCACACTGCCGGCGCC−３'，５−GCCCACACGGCCGGCGCC−３'及び５'− GCCCACAGCCGGCGCC−３'の分析に適用される。

７ ．

例II：ＨＩＶ−Ｉの検出臨床サンプルからのＨＩＶ−１プロウィルスＤＮＡを、アメリカ特許第５，５９９，６６２号（引用により本明細書に組込まれる）に実質的に記載されるようにして、下記の通りに増幅する。 末梢血液単球を、標準のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度グラジエント方法により単離する。 細胞の単離に続いて、ＤＮＡを、Butcher and Spadoru，

Clin

．

Immunol．

Newsletter 12:73-76(1992)(引用により本明細書に組込まれる)に記載のように抽出する。 ポリメラーゼ鎖反応を１００μｌの反応体積で実施し、この５０μｌがサンプルに寄与される。 前記反応は、次の初期濃度で次の試薬を含む： １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（pH８．４）； ５０ｍＭのＫＣｌ； それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ； 下記に示される配列の２５ｐモルのプライマー１； 下記に示される配列の２５ｐモルのプライマー２； ３．０ｍＭのＭｇＣｌ

₂ ； １０％のグリセロール； ２．０単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）； ２．０単位のＵＮＧ（Perkin-Elmer） 増幅を、次の温度プロフィールを用いて、ＴＣ９６００ ＤＮＡ熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）において実施する：（１）プレーインキュベーション−５０℃で２分；（２）初期サイクル−９４℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の延長；（３）サイクル２ 〜４−９４℃で３０秒の変性、３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の延長、 ここでアニーリング温度は、サイクル１に比較して、２℃ごとに高まる（５８℃ まで）；（４）サイクル５〜３９−９０℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の延長。 温度サイクルに続いて、反応混合物を９０℃に２分間、加熱し、そして１ｍｌ に希釈する。 他方、サンプルを−２０℃で貯蔵し、そして融解の後、９０℃に２ 分間、加熱し、次に１ｍｌに希釈する。 シロキサン成分を有する切断スペーサーを合成し、そして上記セクション５． ２及び５．３に実質的に示されるような、誘導体化された１２０ｍｍのポリカーボネートディスク支持体に均等な密度で結合せしめる。 次に、次の側員を、切断スペーサー上にスタンプする： 直径１〜３μｍの金微小球の懸濁液をディスクに滴下し、これを軽く回転せしめ、金粒子を分配する。 金粒子を、溶出液が初期懸濁液と同じ密度の粒子を含むまで、従って切断スペーサーの飽和を確保するまで、添加する。 サンプルを、連続した速度で回転されるアッセイ装置の中心近くに、室温で適用する。 回転を、サンプル前部に達した後、停止し、そしてディスクを３〜５分間、室温で静止したままインキュベートする。 １ｍｌのサンプル緩衝液を、ディスクを回転しながら、洗浄液として滴下する。 １００ｍＭの弗化ナトリウム１ｍｌを添加し、そしてディスク回転により分配する。 ディスクを１〜２分間、静止したままインキュベートし、次に、サンプル緩衝液５ｍｌを、アッセイディスクの激しい回転の間、滴下する。 ディスクを乾燥せしめ、次に切断スペーサーが付着される個々の予定された部位をアッセイするようプログラムされたＣＤ−ＲＯＭリーダーにより直接的に読取る。 本発明は、典型的な態様及び例により本発明の個々の観点を例示するために記載されているが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。 実際、本明細書に示され、そして記載される例の他に、それに対する種々の修飾及び変更は、 当業者に明らかになるであろう。 そのような修飾は、本発明の範囲を意図するものであり、そして本発明の範囲内に含まれる。 本明細書に引用されるすべての出版物は、それらのすべてを引用により本明細書中に組込まれる。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１月２６日（１９９９．１．２６） 【補正内容】 請求の範囲 1. 切断可能なシグナル要素であって、 支持体−結合端、シグナル応答端、及び前記支持体−結合端及び前記シグナル応答端の中間の切断部位を有する切断可能なスペーサー； シグナル応答成分； 選択された分析物上の第１部位を結合するよう適合された第１の側員；及び 前記選択された分析物の第２部位を結合するよう適合された第２の側員； を含んで成り、ここで前記シグナル応答成分が前記シグナル応答端で前記切断スペーサーに結合され、前記第１の側員が前記シグナル応答端及び前記切断部位の中間の前記切断スペーサーに結合され、そして前記第２の側員が前記切断部位及び前記支持体結合端の中間の前記切断スペーサーに結合されていることを特徴とする切断シグナル要素。 2. 前記シグナル応答成分が、入射光を反射し、又は散乱するよう適合されている請求の範囲第１項記載の切断シグナル要素。 3. 前記シグナル応答成分が、金属微小球である請求の範囲第２項記載の切断シグナル要素。 4. 前記金属微小球が、金、銀、ニッケル、白金、クロム及び銅から成る群から選択された金属から実質的に成る請求の範囲第３項記載の切断シグナル要素。 5. 前記金属微小球が金から実質的に成る請求の範囲第４項記載の切断シグナル要素。 6. 前記金微小球が１ｎｍ〜１０μｍの直径を有する請求の範囲第５項記載の切断シグナル要素。 7. 前記金微小球が０．５〜５μｍの直径を有する請求の範囲第６項記載の切断シグナル要素。 8. 前記金微小球が１〜３μｍの直径を有する請求の範囲第７項記載の切断シグナル要素。 9. 前記切断部位が化学的切断に対して敏感である請求の範囲第１項記載の切断シグナル要素。 １０． 前記化学的に敏感な切断部位が少なくとも１つのシロキサン基を含む請求の範囲第９項記載の切断シグナル要素。 １１． 前記第１の側員及び前記第２の側員がオリゴヌクレオチドを包含する請求の範囲第１項記載の切断シグナル要素。 １２． 前記第１及び第２の側員のオリゴヌクレオチドが５マー〜２０マーである請求の範囲第１１項記載の切断シグナル要素。 １３． 前記第１及び第２の側員のオリゴヌクレオチドが８マー〜１７マーである請求の範囲第１２項記載の切断シグナル要素。 １４． 前記第１及び第２の側員のオリゴヌクレオチドが８マー〜１２マーである請求の範囲第１２項記載の切断シグナル要素。 １５． 前記第１の側員が、第１の特異的結合対の第１の員を含み、 前記第２の側員が、第２の特異的結合対の第２の員を含み、 前記第１の特異的結合対の前記第２の員、及び前記第２の特異的結合対の前記第２の員が、単一分析物の表面上にそれぞれ存在する請求の範囲第１項記載の切断シグナル要素。 １６． 前記第１の特異的結合対の前記第１の員が第１抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を含み、そして前記第２の特異的結合対の前記第１の員が第２抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を含む請求の範囲第１５項記載の切断シグナル要素。 １７． 前記第１の側員が第１の側員オリゴヌクレオチドを含み、 前記第２の側員が第２の側員オリゴヌクレオチドを含み、 前記第１の特異的結合対の前記第１の員が第１の結合対オリゴヌクレオチドを含み、 前記第２の特異的結合対の前記第１の員が第２の結合対オリゴヌクレオチドを含み、そして 前記第１の側員オリゴヌクレオチドが前記第１の結合対オリゴヌクレオチドに含まれる配列に対して相補的な配列を含み、前記第２の側員オリゴヌクレオチドが前記第２の結合対オリゴヌクレオチドに含まれる配列に対して相補的な配列を含み、そして前記相補的な配列が非共有結合される請求の範囲第１５項記載の切断シグナル要素。 １８． 固体支持体、及び請求の範囲第１項記載の多くの切断シグナル要素を含んで成るアッセイ装置であって、 前記切断シグナル要素がそれらの支持体−結合末端を通して、前記固体支持体に、空間的にアドレスできるパターンで結合することを特徴とするアッセイ装置。 １９． 固体支持体、及び請求の範囲第２〜１７のいづれか１項記載の多くの切断シグナル要素を含んで成るアッセイ装置であって、 前記切断シグナル要素がそれらの支持体−結合末端を通して、前記固体支持体に、空間的にアドレスできるパターンで結合することを特徴とするアッセイ装置。 ２０． 前記固体支持体が、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート及びポリカーボネートから成る群から選択されたプラスチックである請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ２１． 前記固体支持体がポリカーボネートである請求の範囲第２０項記載のアッセイ装置。 ２２． 前記固体支持体がディスクとして仕上げられている請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ２３． 前記ディスクが約１２０ｍｍの外径及び約１．２ｍｍの厚さを有する請求の範囲第２２項記載のアッセイ装置。 ２４． 前記切断シグナル要素の個々の前記シグナル応答成分が強磁性である請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ２５． 前記第１の側員が第１抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を含み、 そして 前記第２の側員が第２抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を含む請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ２６． 前記第１抗体及び前記第２抗体が、ヒト免疫欠損ウィルス、Ａ型肝炎、 Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎及びヒトヘルペスウィルスから成る群から選択されたウィルスの異なったエピトープ部位に対して特異的である請求の範囲第２５項記載のアッセイ装置。 ２７． 前記第１抗体及び前記第２抗体が、ヒト免疫欠損ウィルスのエピトープに対して特異的である請求の範囲第２６項記載のアッセイ装置。 ２８． 前記免疫欠損ウィルスがＨＩＶ−１である請求の範囲第２７項記載のアッセイ装置。 ２９． 前記免疫欠損ウィルスがＨＩＶ−２である請求の範囲第２７項記載のアッセイ装置。 ３０． 前記ウィルスがＣ型肝炎である請求の範囲第２６項記載のアッセイ装置。 ３１． 明確な分析物を認識するよう適合されたシグナル要素を多く含む請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ３２． 前記シグナル要素の空間パターンが、１又は複数の分析物の濃度を表示する請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ３３． 前記支持体上にコードされるコンピューターソフトウェアをさらに含んで成る請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置。 ３４． アッセイ方法であって、 請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置と液体サンプルとを接触せしめ、そして 前記切断されたシグナル要素のシグナル応答末端を除去し、そして 分析物−制御された、切断されたシグナル要素のシグナル応答成分の存在を検出する段階を含んで成るアッセイ方法。 ３５． アッセイ方法であって、 請求の範囲第１９項記載のアッセイ装置と液体サンプルとを接触せしめ、 分解剤により前記アッセイ装置のシグナル要素を切断し、そして 分析物−制御された、切断されたシグナル要素のシグナル応答成分の存在を検出する段階を含んで成るアッセイ方法。 ３６． 前記シグナル要素が１又は複数のシロキサン成分を含んで成り、そして前記分解剤が弗化ナトリウム含む請求の範囲第３４項記載のアッセイ方法。 ３７． 前記分解剤が１ｍＭ〜１Ｍの弗化ナトリウムを含む請求の範囲第３６項記載のアッセイ方法。 ３８． 前記分解剤が５０ｍＭ〜５００ｍＭの弗化ナトリウムを含む請求の範囲第３６項記載のアッセイ方法。 ３９． 前記分解剤が約１００ｍＭで弗化ナトリウムを含む請求の範囲第３６項記載のアッセイ方法。 ４０．１又は複数の洗浄段階をさらに含んで成る請求の範囲第３４項記載のアッセイ方法。 ４１． 前記アッセイ装置を回転する段階をさらに含んで成る請求の範囲第３４ 項記載のアッセイ方法。 ４２． 核アッセイハイブリダイゼーションアッセイであって、 請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置と核酸を含む液体サンプルとを接触せしめ、ここで少なくとも１つの前記結合されたシグナル要素の前記第１の側員及び第２の側員がオリゴヌクレオチドをそれぞれ含み、 前記アッセイ装置のシグナル要素を切断し、そして 分析物−制御された、切断されたシグナル要素を検出する段階を含んで成るアッセイ。 ４３． 核アッセイ配列決定法であって、 請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置と核酸を含む液体サンプルとを接触せしめ、ここで前記結合されたシグナル要素の前記第１の側員及び第２の側員がオリゴヌクレオチドをそれぞれ含み、 前記アッセイ装置のシグナル要素を切断し、そして 分析物−制御された、切断されたシグナル要素を検出する段階を含んで成り、 ここで前記側員オリゴヌクレオチド配列の空間的にアドレス可能なパターンがシグナル応答からの隣接する配列の計算できる再構成を可能にすることを特徴とする方法。 ４４． イムノアッセイであって、 請求の範囲第１８項記載のアッセイ装置と抗原分析物を含む液体サンプルとを接触せしめ、ここで少なくとも１つの前記結合されたシグナル要素の前記第１の側員及び第２の側員がそれぞれ抗体、抗体フラグメント、又は抗体誘導体を含み、 前記アッセイ装置のシグナル要素を切断し、そして 分析物−制御された、切断されたシグナル要素を検出する段階を含んで成るイムノアッセイ。 ４５． 前記第１及び第２抗体がヒト免疫欠損ウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、 Ｃ型肝炎及びヒトヘルペスウィルスから成る群から選択されたウィルスのエピトープ部位をそれぞれ認識する請求の範囲第４４項記載のイムノアッセイ。 ４６． 前記ウィルスがヒト免疫欠損ウィルスである請求の範囲第４５項記載のイムノアッセイ。 ４７． 前記ウィルスがＨＩＶ−１である請求の範囲第４６項記載のイムノアッセイ。 ４８． 前記ウィルスがＨＩＶ−２である請求の範囲第４６項記載のイムノアッセイ。 ４９． 前記ウィルスがＢ型肝炎である請求の範囲第４５項記載のイムノアッセイ。 ５０． 前記ウィルスがＣ型肝炎である請求の範囲第４５項記載のイムノアッセイ。 ５１． 前記ウィルスがヒトヘルペスウィルスである請求の範囲第４５項記載のイムノアッセイ。 ５２． 読取りできるように配置された分析物−特異的シグナル要素を有する光学ディスクを含んで成る、分析物を検出するためのアッセイ装置。 ５３． 前記分析物−特異的シグナル要素が切断できる請求の範囲第５２項記載のアッセイ装置。 ５４． 読取りできるように配置された分析物−特異的シグナル要素を有する光学ディスクを含んで成る、分析物を検出するためのアッセイ装置であって、 前記分析物−特異的シグナル要素が、請求の範囲第１〜１７のいづれか１項記載の切断シグナル要素であるアッセイ装置。 ５５． 光学ディスク上に配置された分析物−特異的側員を有する光学ディスクを含んで成る、分析物を検出するためのアッセイ装置。 ５６． 前記分析物−特異的側員が抗体、抗体フラグメント又は抗体誘導体を含む請求の範囲第５５項記載のアッセイ装置。 ５７． 前記分析物−特異的側員が核酸を含む請求の範囲第５５項記載のアッセイ装置。 ５８． 分析物をアッセイするための方法であって、 請求の範囲第５２項記載のアッセイ装置とサンプルとを接触せしめ、そして それから分析物−特異的シグナルを検出する段階を含んで成る方法。 ５９． 分析物をアッセイするための方法であって、 請求の範囲第５３項記載のアッセイ装置とサンプルとを接触せしめ、 前記アッセイ装置のシグナル要素を切断し、そして その上の分析物−抑制された、切断されたシグナル要素を検出する段階を含んで成る方法。 ６０． 分析物をアッセイするための方法であって、 請求の範囲第５５項記載のアッセイ装置とサンプルとを接触せしめ、そして それから分析物−特異的シグナルを検出する段階を含んで成る方法。 ６１． 分析物をアッセイするために光学ディスクリーダーを用いる方法であって、請求の範囲第５２項記載のアッセイ装置から分析物−特異的シグナルを、前記リーダーにより検出する段階を含んで成る方法。 ６２． 分析物をアッセイするために光学ディスクリーダーを用いる方法であって、請求の範囲第５３項記載のアッセイ装置から分析物−抑制された、切断されたシグナル要素を、前記リーダーにより検出する段階を含んで成る方法。 ６３． 分析物をアッセイするために光学ディスクリーダーを用いる方法であって、請求の範囲第５５項記載のアッセイ装置から分析物−特異的シグナルを、前記リーダーにより検出する段階を含んで成る方法。 ６４． 光学ディスク上に分析物−特異的シグナル要素を読取りできるように配置することを含んで成る、分析物を検出するためのアッセイ装置を製造するための方法。 ６５． 光学ディスク上に分析物−特異的切断シグナル要素を読取りできるように配置することを含んで成る、分析物を検出するためのアッセイ装置を製造するための方法。 ６６． 光学ディスク上に分析物−−特異的側員を配置することを含んで成る、 分析物を検出するためのアッセイ装置を製造するための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/576 Ａ 33/576 Ｂ Ｚ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (31)優先権主張番号 ０８／８８８，９３５ (32)優先日 平成９年７月７日(1997．7．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ